CN116655778A - 抗sars-cov-2-刺突蛋白抗体和抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与野生型SARS‑CoV‑2的刺突蛋白结合的分离抗体及其变体，例如α(B.1.1.7)、β(B.1.351)、γ(P.1))、delta(B.1.617.2)和omicron(BA.1或BA.2)。
Description
发明领域
本发明涉及与野生型SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的分离抗体及其变体，例如α(B.1.1.7)、β(B.1.351)、γ(P.1))、delta(B.1.617.2)和omicron(BA.1或BA.2)。
背景技术
SARS-CoV-2属于巢状病毒科冠状病毒科的冠状病毒属，在人类已知的所有 RNA病毒中具有最大的基因组，长度为27至32kb。SARS-CoV-2至少有四种主要结构蛋白，包括刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。病毒进入细胞取决于S蛋白和S蛋白的受体结合域(RBD)。S 蛋白有两个亚基S1和S2，RBD位于S1亚基上。RBD的功能是识别宿主细胞表面受体并介导与宿主细胞的融合。N蛋白是一种碱性磷蛋白，其中心区域与病毒基因组 RNA结合形成卷曲的核衣壳螺旋，是包膜病毒遗传物质的核心结构，是感染细胞中表达最高的病毒蛋白之一.
本领域需要RBD结构域刺突蛋白SARS-CoV-2中和抗体，特别是在体内具有延长的半衰期的抗体。
发明内容
一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO:106或SEQ IDNO:108或SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的SARS-CoV-2刺突蛋白，其中所述分离的抗体包含：
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和 LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，该轻链可变区(LVR)包含 LCDR1：SEQ ID NO：10、LCDR2：SEQ IDNO：11和LCDR3：SEQ ID NO:12，以及包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:13、HCDR2:SEQ ID NO:14的重链可变区(HVR)内的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和 HCDR3)和HCDR3：SEQID NO：15；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和 LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，该轻链可变区(LVR)包含 LCDR1：SEQ ID NO：20、LCDR2：SEQ IDNO：21和LCDR3:SEQ ID NO:22，和三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:23、HCDR2:SEQ ID NO:24的重链可变区 (HVR)内和HCDR3：SEQ IDNO：25；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和 LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，包括LCDR1：SEQ ID NO： 30、LCDR2：SEQ ID NO：31和LCDR3:SEQID NO:32，以及包含在包含 HCDR1:SEQ ID NO:33、HCDR2:SEQ ID NO:34的重链可变区(HVR)内的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和HCDR3：SEQ ID NO：35；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和 LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，包括LCDR1:SEQ ID NO:40、 LCDR2:SEQ ID NO:41和LCDR3:SEQID NO:42，和三个重链互补决定区 (CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)包含在包含HCDR1:SEQ IDNO:43、 HCDR2:SEQ ID NO:44的重链可变区(HVR)内和HCDR3：SEQ ID NO： 45。
本发明还提供了上述SARS-CoV-2RBD特异性单克隆抗体在检测或诊断或中和SARS-CoV-2的试剂或疫苗或药物中的应用，其中药物包括SARS-CoV-2RBD特异性单克隆抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；本发明还提供了编码上述 SARS-CoV-2RBD特异性单克隆抗体的核酸和含有上述核酸的表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系。本发明还提供了表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系在产品制备中的应用。
在各种实施例中，可以组合以上或本文所讨论的实施例的任何特征或组件，并且这样的组合包含在本公开的范围内。上述或本文讨论的任何特定值可以与上述或本文讨论的另一个相关值组合以列举一个范围，该范围的值表示该范围的上限和下限，并且这样的范围包含在本公开的范围内。
附图说明
图1抗体活性B.a通过ELIS测量，抗体B对不同RBD的检测。b抗体B中和假型SARS-CoV-2WT和不同变体。通过扫描荧光斑计算感染抑制率。c评估抗体B 对活SARS-CoV-2WT以及Delta和Omicron变体的中和活性。d抗体的结合区B. RBDs rom WT SRS-CoV-2与Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron变体对齐。红线表示抗体的结合区域B.e结合到SRS-CoV-2RBD上的抗体B Fab复合物的结构。在左侧，RD的二级结构元件和抗体B Fab的重链和轻链分别为绿色、青色和紫色。 RBD的表面是绿色的。Delta变体的突变残基为蓝色(中)，而来自Omicron的突变残基为红色(右)。
具体实施方式
为了可以更完整地理解本申请，以下阐述了几个定义。此类定义旨在涵盖语法等价物。
与参考数值有关的术语“约”可以包括数值本身和从该数值加减10％的值范围。例如，“约10”的数量包括10和从9到11的任何数量。例如，与参考数值有关的术语“约”还可以包括正负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2的值范围。％，或该值的1％。
在权利要求中使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言可以进一步限制在此公开的特定实施例。当在权利要求中使用时，无论是提交的还是根据修改添加的，过渡术语“由...组成”不包括未在权利要求中指定的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，以及那些不实质影响基本和新颖特性的材料或步骤。如此要求保护的本公开的实施例在本文中固有地或明确地描述和启用。
除非另有说明，否则在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一个”、“该”和类似的指称应解释为涵盖单数和复数在此或与上下文明显矛盾。
在描述本方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用整体并入本文。
术语“冠状病毒”或“CoV”是指冠状病毒家族的任何病毒，包括但不限于 SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV。SARS-CoV-2是指新出现的冠状病毒，它通过病毒刺突蛋白与人类宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。刺突蛋白还与 TMPRSS2结合并被TMPRSS2切割，从而激活刺突蛋白以进行病毒的膜融合。
术语“CoV-S”，也称为“S”或“S蛋白”，是指冠状病毒的刺突蛋白，可以指特定的S蛋白，如SARS-CoV-2-S、MERS-CoV S和SARS-CoV S.野生型SARS-CoV- 2-Spike蛋白是一种1273个氨基酸的I型膜糖蛋白，它组装成三聚体，构成包膜冠状病毒颗粒表面的尖峰或peplomers。该蛋白具有两个基本功能，即宿主受体结合和膜融合，这归因于S蛋白的N端(S1)和C端(S2)两半。CoV-S通过存在于S1亚基中的受体结合域(RBD)与其同源受体结合。野生型SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以 SEQ ID NO:100为例。α(B.1.1.7)SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO: 102为例。β(B.1.351)SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO:104为例。γ(P.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO:106为例。delta(B.1.617.2) SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO:108为例。omicron(BA.1)SARS- CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO:110为例。除非另有说明，否则术语“CoV-S”包括从不同CoV分离物中分离的CoV刺突蛋白的蛋白质变体以及重组 CoV刺突蛋白或其片段。术语“alpha CoV-S”或“alpha(B.1.1.7)CoV-S”是指alpha (B.1.1.7)SARS-CoV-2刺突蛋白的CoV刺突蛋白。术语“βCoV-S”或“β(B.1.351) CoV-S”是指β(B.1.351)SARS-CoV-2刺突蛋白的CoV刺突蛋白。术语“gamma CoV-S”或“gamma(P.1)CoV-S”是指gamma(P.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的CoV刺突蛋白。术语“delta CoV-S”或“delta(B.1.617.2)CoV-S”是指delta(B.1.617.2) SARS-CoV-2刺突蛋白的CoV刺突蛋白。术语“omicron CoV-S”或“omicron(BA.1) CoV-S”是指omicron(BA.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的CoV刺突蛋白。该术语还包括与例如组氨酸标签、小鼠或人Fc或信号序列如ROR1偶联的CoV刺突蛋白或其片段。
术语“RBD-CoV-S”，也称为“RBD-S”或“RBD-S蛋白”，是指冠状病毒的 RBD-domain尖峰蛋白，可以指RBD等S蛋白的特定RBD-domains-SARS-CoV-2-S、RBD-MERS-CoV S和RBD-SARS-CoV S。野生型SARS-CoV-2-Spike蛋白的RBD结构域促进S1亚基与其同源受体的结合.野生型SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:101为例。α(B.1.1.7)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:103为例。β(B.1.351)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:105为例。γ(P.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:107为例。delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2刺突蛋白的 RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:109为例。omicron(BA.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域的氨基酸序列以SEQ ID NO:111为例。除非另有说明，否则术语“RBD-CoV-S”包括从不同CoV分离物中分离的CoV刺突蛋白的蛋白质变体的RBD 结构域以及重组CoV刺突蛋白或其片段。术语“alpha RBD-CoV-S”或“alpha (B.1.1.7)RBD-CoV-S”是指alpha(B.1.1.7)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域。术语“βRBD-CoV-S”或“β(B.1.351)RBD-CoV-S”是指β(B.1.351)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域。术语“gamma CoV-S”或“gamma(P.1)CoV-S”是指gamma (P.1)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域。术语“delta CoV-S”或“delta(B.1.617.2) CoV-S”是指delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域。术语“omicron CoV-S”或“omicron(BA.1或BA.2)CoV-S”是指omicron(BA.1或BA.2)SARS- CoV-2刺突蛋白的RBD结构域。该术语还包括与例如组氨酸标签、小鼠或人Fc或信号序列如ROR1偶联的CoV刺突蛋白或其片段。
如本文所用，术语“冠状病毒感染”或“CoV感染”是指冠状病毒感染，例如 SARS-CoV-2、MERS-CoV或SARS-CoV。该术语包括冠状病毒呼吸道感染，通常发生在下呼吸道。症状可能包括高烧、干咳、呼吸急促、肺炎、胃肠道症状，如腹泻、器官衰竭(肾衰竭和肾功能障碍)、感染性休克，严重者死亡。
如本文所用，术语“α冠状病毒感染”或“αSARS-CoV-2感染”是指α冠状病毒感染，例如α(B.1.1.7)SARS-CoV-2。如本文所用，术语“β冠状病毒感染”或“β SARS-CoV-2感染”是指β冠状病毒感染，例如β(B.1.351)SARS-CoV-2。如本文所用，术语“γ冠状病毒感染”或“γSARS-CoV-2感染”是指γ冠状病毒感染，例如γ(P.1)SARS-CoV-2。如本文所用，术语“delta冠状病毒感染”或“delta SARS-CoV- 2感染”是指delta冠状病毒感染，例如delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2。如本文所用，术语“omicron冠状病毒感染”或“omicron SARS-CoV-2感染”是指感染omicron冠状病毒，例如omicron(BA.1或BA.2)SARS-CoV-2。
病毒
本发明包括治疗或预防对象病毒感染的方法。术语“病毒”包括其在受试者体内的感染可通过施用抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，表1)，(例如，其中病毒的传染性至少部分依赖于CoV-S)。在本发明的一个实施方案中，“病毒”是任何表达刺突蛋白(例如，CoV-S)的病毒。术语“病毒”还包括依赖于CoV-S的呼吸道病毒，该病毒是一种感染对象的呼吸道组织(例如，上呼吸道和/ 或下呼吸道、气管、支气管、肺)并且可以通过以下方法治疗或预防的病毒施用抗- CoV-S抗体或其抗原结合片段。例如，在本发明的一个实施例中，病毒包括冠状病毒、SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)、SARS-CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)和MERS-CoV(中东呼吸综合征(MERS))冠状病毒)。冠状病毒可包括α冠状病毒属、β冠状病毒属、γ冠状病毒属、δ冠状病毒属和/或微米冠状病毒属。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以结合和/或中和α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒、δ冠状病毒和/或微米冠状病毒。在某些实施方案中，这种结合和/或中和作用可以对特定的冠状病毒属或特定的属亚组是特异性的。“病毒感染”是指病毒在受试者体内的侵入和增殖。
冠状病毒病毒体呈球形，直径约为125nm。冠状病毒最突出的特征是从病毒体表面发出的棒状尖刺突起。这些尖刺是病毒体的一个决定性特征，使它们看起来像日冕，因此得名冠状病毒。在病毒粒子的包膜内是核衣壳。冠状病毒具有螺旋对称的核衣壳，这在正链RNA病毒中并不常见，但在负链RNA病毒中更为常见。SARS-CoV- 2、MERS-CoV和SARS-CoV属于冠状病毒家族。病毒粒子与宿主细胞的初始附着是由S蛋白与其受体之间的相互作用引发的。冠状病毒S蛋白S1区域内的受体结合域 (RBD)的位点因病毒而异，有些RBD在S1的C端。S-蛋白/受体相互作用是冠状病毒感染宿主物种的主要决定因素，也控制着病毒的组织嗜性。许多冠状病毒利用肽酶作为它们的细胞受体。在受体结合之后，病毒必须接下来进入宿主细胞的胞质溶胶。这通常通过组织蛋白酶、TMPRRS2或另一种蛋白酶对S蛋白进行酸依赖性蛋白水解切割，然后融合病毒和细胞膜来完成。
抗CoV-S抗体和抗原结合片段
本发明提供特异性结合冠状病毒刺突蛋白或其抗原片段的抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段。示例包括：与野生型冠状病毒刺突蛋白特异性结合的野生型冠状病毒S抗原结合蛋白，例如野生型冠状病毒S抗体及其野生型冠状病毒S抗原结合片段或其抗原性片段；α-CoV-S抗原结合蛋白(α(B.1.1.7)-CoV-S抗原结合蛋白)，如α-CoV-S抗体(α(B.1.1.7)-CoV-S抗体))及其特异性结合α-CoV刺突蛋白或其抗原性片段的α-CoV-S抗原结合片段(α(B.1.1.7)-CoV-S抗原结合片段)；β- CoV-S抗原结合蛋白(β(B.1.351)-CoV-S抗原结合蛋白)，如β-CoV-S抗体(β (B.1.351)-CoV-S抗体)和β-与β-CoV刺突蛋白或其抗原片段特异性结合的CoV-S 抗原结合片段(β(B.1.351)-CoV-S抗原结合片段)；γ-CoV-S抗原结合蛋白 (gamma(P.1)-CoV-S抗原结合蛋白)，如γ-CoV-S抗体(γ(P.1)-CoV-S抗体)和γ-与γ-CoV刺突蛋白或其抗原性片段特异性结合的CoV-S抗原结合片段(γ(P.1)- CoV-S抗原结合片段)；delta-CoV-S抗原结合蛋白(delta(B.1.617.2)-CoV-S抗原结合蛋白)，如delta-CoV-S抗体(delta(B.1.617.2)-CoV-S抗体))及其delta-CoV-S抗原结合片段(delta(B.1.617.2)-CoV-S抗原结合片段)，其与delta-CoV刺突蛋白或其抗原片段特异性结合；omicron-CoV-S抗原结合蛋白(omicron(BA.1or BA.2)-CoV-S抗原结合蛋白)，例如omicron-CoV-S抗体(omicron(BA.1)-CoV-S抗体))及其特异性结合 omicron-CoV刺突蛋白或其抗原片段的omicron-CoV-S抗原结合片段(omicron(BA.1 或BA.2)-CoV-S抗原结合片段)。本发明提供了特异性结合CoV刺突蛋白的RBD结构域的抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的四个多肽链、两个重链(HC)和两个轻链(LC)的免疫球蛋白分子(即，“全抗体分子”)，以及作为其多聚体(例如IgM)。示例性抗体包括，例如，表1中列出的那些。每条重链包含重链可变区(“HVR”或“V”)和重链恒定区(由结构域C1、C 2和C 3组成)。每条轻链由轻链可变区(“LVR”或“V”)和轻链恒定区(C)组成。V和V区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个V和V包含三个CDR和四个FR，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链CDR也可称为HCDR或CDR-H，并如上所述编号(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3或CDR-H1、CDR-H2和CDR- H3)。同样，轻链CDR可称为LCDR或CDR-L，编号为LCDR1、LCDR2和 LCDR3，或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在本发明的一个实施方案中，每个结构域的氨基酸分配是根据免疫学感兴趣的蛋白质序列的定义，Kabat等。；美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达。；第5版。；美国国立卫生研究院出版。第91-3242号(1991 年)；卡巴特(1978)进阶。保护。化学。32:1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol。化学。252:66096616；Chothia等人，(1987)J Mol。生物学。196:901-917或Chothia,et al., (1989)Nature 342:878883。
在本发明的某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的FR与人种系序列相同，或者是天然或人工修饰的。示例性人种系序列包括但不限于VH3-66和Vk1-33。因此，本公开提供了在VH3-内包含表1的HCDR和LCDR序列的抗CoV-S抗体或其抗原结合片段(例如，抗SARS-CoV-2-S抗体或其抗原结合片段)66或Vkl-33可变重链或轻链区。
本公开进一步提供了包含表1的HCDR和LCDR序列的抗CoV-S抗体或其抗原结合片段(例如，抗SARS-CoV-2-S抗体或其抗原结合片段)。本公开进一步提供了包含表1的HVR和LVR序列的抗-CoV-S抗体或其抗原结合片段(例如，抗SARS-CoV-2-S抗体或其抗原结合片段)本文描述的轻链和本文描述的重链。
本发明包括单克隆抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段，以及包含多种分离的单克隆抗原结合蛋白的单克隆组合物。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群体，即构成该群体的抗体分子在氨基酸序列上是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变。组合物中这样的单克隆抗体和片段的“多个”是指相同的(即，如上所述，在氨基酸序列中，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变)抗体和片段的浓度。在自然界中通常会出现的物质，例如在宿主生物体(例如小鼠或人)的血液中。
在本发明的一个实施方案中，抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段包含重链恒定结构域，例如，IgA(例如，IgA1或IgA2)、IgD、IgE型、IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或IgM。在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段包含轻链恒定结构域，例如，κ或λ类型的。
如本文所用，术语“人”抗原结合蛋白，例如抗体，包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，无论是在人细胞中还是移植到非人细胞例如小鼠中细胞。参见例如US8502018、US6596541或US5789215。本发明的人mAb可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是，CDR3。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人FR序列上的mAb。该术语包括在非人类哺乳动物或非人类哺乳动物细胞中重组产生的抗体。该术语不旨在包括从人类受试者中分离或在人类受试者中产生的抗体。参见下文。
术语“重组”抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，是指通过本领域已知的技术或方法产生、表达、分离或获得的此类分子，如重组DNA技术，包括例如 DNA剪接和转基因表达。该术语包括在非人类哺乳动物(包括转基因非人类哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如，CHO细胞)表达系统或非人类细胞表达系统中表达的抗体，或从重组组合中分离的抗体。人抗体库。在一些实施方案中，重组抗体与分离自生物体(例如小鼠或人)的抗体共享序列，但已通过重组DNA技术表达。此类抗体可具有不同于从生物体中分离的抗体的翻译后修饰(例如糖基化)。
本文公开的重组抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体和抗原结合片段，也可以在大肠杆菌/T7表达系统中产生。在该实施方案中，编码本发明的抗-CoV-S抗体免疫球蛋白分子的核酸(例如，如表1中所见)可以插入基于pET的质粒中并在大肠杆菌/T7系统中表达。例如，本发明包括在宿主细胞(例如细菌宿主细胞，例如E.coli例如BL21或 BL21DE3)包括在细胞中表达T7 RNA聚合酶，该细胞还包括编码与T7启动子可操作连接的免疫球蛋白链的多核苷酸。例如，在本发明的一个实施方案中，细菌宿主细胞，例如E.coli,包括可操作地连接到lac启动子的编码T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸和聚合酶的表达，并且通过将宿主细胞与IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)温育来诱导该链。参见US4952496和US5693489或Studier&Moffatt，使用噬菌体T7 RNA聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达，J.Mol。生物学。1986年5月5日；189 (1)：113-30。
有几种方法可以产生本领域已知的重组抗体。US4816567中公开了重组产生抗体的方法的一个例子。
转化可以通过将多核苷酸(例如，DNA或RNA，包括mRNA)引入宿主细胞的任何已知方法进行。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域中是众所周知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封、脂质纳米颗粒技术、基因枪注射和直接将DNA显微注射到细胞核中。此外，核酸分子可以通过病毒载体如慢病毒或腺相关病毒引入哺乳动物细胞。转化细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利。第4,399,216 号；4,912,040；4,740,461和4,959,455。在一些实施方案中，可以将本公开的抗体或其抗原结合片段以核酸形式(例如，DNA或RNA，包括mRNA)引入受试者，使得受试者自身的细胞产生抗体。本公开进一步提供了对编码本文所述抗-CoV-S抗体的核苷酸序列的修饰，其导致抗体表达增加、抗体稳定性增加、核酸(例如，mRNA)稳定性增加，或抗体对CoV刺突蛋白。
因此，本发明包括用于制备抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本发明的抗体或其抗原结合片段，或其免疫球蛋白链的重组方法，包括(i)引入本文所述的一种或多种编码抗原结合蛋白的轻和/或重免疫球蛋白链或CDR的多核苷酸，其中所述多核苷酸在载体中；和/或整合到宿主细胞染色体中和/或可操作地连接到启动子；(ii)在有利于多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞(例如CHO或毕赤酵母或毕赤酵母)，并且，(iii)任选地，从宿主细胞和/或宿主细胞在其中生长的培养基中分离抗原结合蛋白(例如抗体或片段) 或链。例如，多核苷酸可以通过用载体如腺相关病毒(AAV)靶向插入而整合到宿主细胞染色体中，例如，在使用基因编辑系统(例如，CRISPR(例如，CRISPR-Cas9)、 TALEN、megaTAL、锌指或Argonaute)。例如，可以在宿主细胞基因座如白蛋白或免疫球蛋白基因组基因座处进行靶向插入。或者，可以在随机基因座处插入，例如，使用载体如慢病毒。当制备包含多于一条免疫球蛋白链的抗原结合蛋白(例如抗体或抗原结合片段)时，例如包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体，这些链在单一宿主中共表达细胞导致链的缔合，例如在细胞内或细胞表面或细胞外，如果这种链被分泌，则形成抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)。所述方法包括其中仅表达免疫球蛋白重链或仅免疫球蛋白轻链(例如，本文讨论的任何那些，包括其成熟片段和/或可变结构域)的方法。例如，此类链可用作表达包含此类链的抗体或抗原结合片段的中间体。例如，本发明还包括抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段，其包含由包含多核苷酸的多核苷酸编码的重链免疫球蛋白(或其可变域或包含其CDR)本文所述的核苷酸序列和由本文所述的核苷酸序列编码的轻链免疫球蛋白(或其可变结构域或包含其CDR)，它们是此类生产方法和任选地本文所述的纯化方法的产物。例如，在一些实施方案中，该方法的产物是抗CoV-S抗原结合蛋白，其是包含HVR和LVR的抗体或片段，该HVR包含表1所列氨基酸序列，LVR包含氨基酸序列在表1中列出，其中HVR和LVR序列选自表1中列出的单一抗体。在一些实施方案中，该方法的产物是抗-CoV-S抗原结合蛋白，其是包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的抗体或片段，其包含表1中列出的氨基酸序列和LCDR1、LCDR2和LCDR3，包括表1中列出的氨基酸序列，其中六个CDR序列选自表1中列出的单一抗体。在一些实施方案中，该方法的产物是抗-CoV-S抗原结合蛋白，其是包含包含表1中所列HC氨基酸序列的重链和包含LC氨基酸的轻链的抗体或片段顺序列于表1。
真核和原核宿主细胞，包括哺乳动物细胞，可用作表达抗CoV-S抗原结合蛋白的宿主。此类宿主细胞在本领域中是众所周知的并且许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。这些宿主细胞尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、 HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、 A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系(例如，Spodopterafrugiperda或Trichoplusia ni)、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、海藻毕赤酵母、科克拉马毕赤酵母、膜藻毕赤酵母、细粒毕赤酵母 (Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母、耐热毕赤酵母、唾液毕赤酵母、 Pichia guercuum、毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母。，酿酒酵母，Saccharomyces sp。，多形汉逊酵母，克鲁维酵母菌种。，乳酸克鲁维酵母，白色念珠菌，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，里氏木霉，金孢霉，镰刀菌。、禾谷镰刀菌、镶片镰刀菌、立球菌和粗糙脉孢菌。本发明包括分离的宿主细胞(例如CHO细胞)，其包含抗原结合蛋白，例如表1中的那些；或其编码这种多肽的多核苷酸。
术语“特异性结合”是指那些对抗原具有结合亲和力的抗原结合蛋白(例如 mAb)，例如CoV-S蛋白(例如SARS-CoV-2-S)或RBD结构域。一种CoV-S蛋白 (例如RBD-SARS-CoV-2-S)，以KD表示，至少约为10-8M，如通过实时、无标记生物层干涉测定法测量的，例如，在25℃或37℃，例如HTX生物传感器，或通过表面等离子体共振，例如BIACORETM，或通过溶液测量-亲和力ELISA。本发明包括特异性结合CoV-S蛋白或CoV-S蛋白的RBD结构域的抗原结合蛋白。
如本文所用，术语抗体或抗原结合蛋白等的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”包括任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程的多肽或糖蛋白，其特异性地结合抗原形成复合物。抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii) F(ab')2片段；(iii)Fd碎片；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和 (vii)由模拟抗体高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或受限FR3- CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其他工程分子，例如域特异性抗体、单域抗体、域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三体、四体、微型体、纳米体(例如，如WO08/020079或WO09/138519中所定义的))(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也包括在本文所用的表述“抗原结合片段”内。在本发明的一个实施方案中，抗原结合片段包含表1的抗体的三个或更多个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3；或LCDR1、 LCDR2和LCDR3)。
在本发明的一个实施方案中，抗体的抗原结合片段将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包含至少一个CDR，其与一个或多个框架序列相邻或在框内。在具有与V结构域结合的V结构域的抗原结合片段中，V结构域和V结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且包含V-V、V-V或V-V二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体V或 V结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以包含至少一个可变结构域，该可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(一)V-C 1；(ii)V-C 2；(iii)V-C 3；(iv)V-C1-C 2；(V)V-C 1-C 2-C 3；(vi)V-C 2-C 3；(vii)V-C；(八)V-C 1；(ix)V-C 2；(x)V-C 3；(xi)V-C 1-C 2；(xii)V-C 1-C 2-C 3；(十三)V-C 2-C 3；和(xiv)V-C。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上面列出的任何示例性构型，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过完全或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多)氨基酸组成。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含同源二聚体或异源二聚体。
“分离的”抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、多肽、多核苷酸和载体至少部分不含来自产生它们的细胞或细胞培养物中的其他生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白质、其他抗体或抗原结合片段、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段还可至少部分不含表达系统组分，例如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。一般而言，术语“分离的”并非意指完全不存在此类生物分子或不存在水、缓冲液或盐或包含抗体或片段的药物制剂的组分。在一些实施方案中，“分离的”抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、多肽、多核苷酸和载体基本上不含来自产生它们的细胞或细胞培养物中的其他生物分子。在一些实施方案中，“分离的”抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段、多肽、多核苷酸和载体不含来自产生它们的细胞或细胞培养物的其他生物分子。
术语“表位”是指与抗原结合蛋白的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇(例如，CoV-S多肽)，例如抗体分子的可变区，称为互补位。单一抗原可能具有多个表位。因此，不同的抗体可能与抗原上的不同区域结合，并可能具有不同的生物学效应。术语“表位”还指抗原上B和/或T细胞对其作出反应的位点。它还指被抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的子集，并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位可以是线性的或构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括作为诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面组的决定簇，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或具体的电荷特性。
确定抗原结合蛋白(例如抗体或片段或多肽)的表位的方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods Mol.生物学。248:443-63)、肽裂解分析、晶体学研究和NMR分析。此外，可以采用诸如表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法(Tomer(2000)Prot.科学。9:487-496).可用于鉴定多肽内与抗原结合蛋白 (例如抗体或片段或多肽)(例如覆盖蛋白)相互作用的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换法包括氘标记感兴趣的蛋白质，然后将抗原结合蛋白例如抗体或片段或多肽与氘标记的蛋白质结合。接下来，将CoV-S蛋白/抗原结合蛋白复合物转移到水中，受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比氨基酸内的可交换质子更慢的速率进行氘-氢反向交换。不是界面的一部分。结果，形成蛋白质/ 抗原结合蛋白界面的一部分的氨基酸可以保留氘，因此与不包括在界面中的氨基酸相比，具有相对较高的质量。在抗原结合蛋白(例如抗体或片段或多肽)解离后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示与抗原结合的特定氨基酸相对应的氘标记残基。结合蛋白相互作用。参见，例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267： 252-259；恩根和史密斯(2001)肛门。化学。73：256A-265A。
如本文所用，术语“竞争”是指与抗原(例如，CoV-S)结合并抑制或阻断与另一抗原结合的结合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)抗原的蛋白质 (例如抗体或其抗原结合片段)。该术语还包括两种抗原结合蛋白例如抗体之间在两个方向上的竞争，即第一抗体结合并阻断第二抗体的结合，反之亦然。在某些实施方案中，第一抗原结合蛋白(例如，抗体)和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以结合相同的表位。或者，第一和第二抗原结合蛋白(例如抗体)可以结合不同但例如重叠的表位，其中一个结合抑制或阻断第二抗体的结合，例如通过空间位阻。抗原结合蛋白 (例如抗体)之间的竞争可以通过本领域已知的方法来测量，例如通过实时、无标记的生物层干涉测定法。表位作图(例如，通过丙氨酸扫描或氢氘交换(HDX))可用于确定两个或多个抗体是否是非竞争性的(例如，在刺突蛋白受体结合域(RBD)单体上)，竞争相同的表位，或竞争但具有不同的微表位(例如，通过HDX鉴定)。在本发明的一个实施方案中，第一和第二抗CoV-S抗原结合蛋白(例如抗体)之间的竞争通过测量固定的第一抗CoV-S抗原结合蛋白(例如抗体)的能力来确定)(最初未与 CoV-S蛋白复合)以结合与第二种抗CoV-S抗原结合蛋白(例如抗体)复合的可溶性 CoV-S蛋白。相对于未复合的CoV-S蛋白，第一种抗CoV-S抗原结合蛋白(例如抗体)与复合CoV-S蛋白结合的能力降低，表明第一种和第二种抗CoV-S抗原结合蛋白 (例如抗体)竞争。竞争程度可以表示为结合减少的百分比。这种竞争可以使用实时、无标记的生物层干涉测定法来测量，例如，在Octet RED384生物传感器(Pall ForteBio Corp.)、ELISA(酶联免疫吸附测定)或SPR(表面等离子共振)上。
可以使用Octet RED384生物传感器(Pall ForteBio Corp.)上的实时、无标记生物层干涉测定法来确定抗CoV-S抗原结合蛋白(例如单克隆抗体(mAb))之间的结合竞争。例如，为了确定两种抗CoV-S单克隆抗体之间的竞争，可以首先将抗CoV-S mAb捕获到抗hFc抗体包被的Octet生物传感器尖端(Pall ForteBio Corp.，#18- 5060)上，方法是将建议使用抗CoV-S mAb(以下简称“mAb 1”)溶液。作为封闭的阳性对照，抗体捕获的生物传感器尖端可以通过浸入封闭mAb溶液中用已知的封闭同种型对照mAb(随后称为“封闭mAb”)饱和。为了确定mAb2是否与mAb 1竞争，随后可以将生物传感器尖端浸入CoV-S多肽和第二种抗CoV-S mAb(随后称为“mAb2”)的复合溶液中，预孵育一段时间，可以确定mAbl与CoV-S多肽的结合。生物传感器尖端可以在实验的每个步骤之间用缓冲液清洗。在实验过程中可以实时监测结合反应，并记录每一步结束时的结合反应。
例如，在本发明的一个实施方案中，竞争测定在25℃和约7，例如7.4的pH下进行，例如在缓冲液、盐、表面活性剂和非特异性蛋白质(例如，牛血清)的存在下白蛋白)。
通常，以某种方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段保留与CoV-S特异性结合的能力，例如保留其CoV-S结合活性的至少10％(当与亲本抗体相比时))当该活性以摩尔为基础表示时。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留至少20％、50％、 70％、80％、90％、95％或100％或更多作为亲本抗体的CoV-S结合亲和力。还旨在本发明的抗体或抗原结合片段可以包括不显着改变其生物学特性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守替代物”或“功能保守替代物”)活动。
多肽的“替代物”，例如免疫球蛋白链，是指包含至少约70-99.9％(例如， 70、72、74、75、76、79、80、81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95, 96,97,98,99,99.5,99.9％)与参考氨基酸相同或相似[0109]本文中列出的序列(例如， SEQ ID NO:2、10、18、20、22、30、38、40、42、50、58或60)；当通过BLAST算法执行比较时，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配(例如，期望阈值：10；字长：3；最大匹配在查询范围内：0； BLOSUM 62矩阵；差距成本：存在11，扩展1；条件组合得分矩阵调整)。
多核苷酸的“替代物”是指包含至少约70-99.9％(例如，至少约70、72、74、 75、76、79、80、81、82、83、84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98, 99,99.5,或99.9％)与本文所述的参考核苷酸序列相同(例如，SEQ ID NO:1、9、17、 19、21、29、37、39、41、49、57或59)；当通过BLAST算法执行比较时，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配(例如，期望阈值：10；字长：28；最大匹配在查询范围内：0；匹配/不匹配分数：1，-2；差距成本：线性)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段，包括具有至少70％(例如，80％、81％,82％,83％,84％,85％,86％, 87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％、99％或更高)氨基酸序列与表1中所列HVR氨基酸序列的同一性；和/或具有至少70％(例如，80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)的氨基酸序列与表1中所列LVR氨基酸序列的同一性。
此外，替代的抗-CoV-S抗原结合蛋白可以包括多肽，该多肽包含除一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)突变，例如错义突变(例如保守取代)、无义突变、缺失或插入。例如，本发明包括抗原结合蛋白，其包括包含表1中列出的LVR 氨基酸序列但具有一个或多个此类突变的免疫球蛋白轻链替代物和/或包含HVR氨基酸的免疫球蛋白重链替代物序列在表1中列出，但具有一个或多个这样的突变。在本发明的一个实施方案中，替代的抗-CoV-S抗原结合蛋白包括替代的免疫球蛋白轻链，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中一个或多个(例如，1个或2个或3个)这样的CDR具有一个或多个一种或多种此类突变(例如，保守取代)和/或包含HCDR1、HCDR2和 HCDR3的免疫球蛋白重链替代物，其中一种或多种(例如，1或2或3个)此类CDR具有一种或多种此类突变(例如，保守替代)。取代可以在CDR、框架或恒定区中。
本发明进一步提供了替代的抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个替代的CDR(例如，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)与本文所述的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％与例如表1的重链和轻链CDR具有、99％或 99.9％的序列同一性或相似性。
本发明的实施方案还包括替代抗原结合蛋白，例如抗CoV-S抗体及其抗原结合片段，其包含免疫球蛋白Viis和VL；或HC和LC，其包含具有70％或更多(例如， 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大) 与本文具体阐述的相应Vx、VL、HC或LC的氨基酸序列的总体氨基酸序列同一性或相似性，但其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3这些免疫球蛋白中的一种不是替代的并且包含表1中列出的CDR氨基酸序列。因此，在这样的实施方案中，替代抗原结合蛋白内的CDR本身不是替代的。
保守/功能保守修饰的替代抗-CoV-S抗体及其抗原结合片段也是本发明的一部分。“保守修饰的替代物”或“保守替代物”是指其中多肽中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链)的其他氨基酸取代的一个或多个替代物。构造和刚度等)。可以经常进行此类改变而不会显着破坏抗体或片段的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代不会显着改变生物活性(参见，例如，Watson et al.(1987)Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/卡明斯酒吧。警察。224(4'版))。此外，结构或功能相似的氨基酸的替代不太可能显着破坏生物活性。
具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等人公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。(1992)科学256:1443 45。
抗CoV-S抗体及其抗原结合片段的功能保守替代物也是本发明的一部分。抗 CoV-S抗体及其抗原结合片段的任何替代物(如本文所讨论的)可以是“功能保守替代物”。在某些情况下，这种功能保守的替代品也可以被描述为保守修改的替代品。如本文所用，“功能保守替代物”是指抗CoV-S抗体或其抗原结合片段的替代物，其中一个或多个氨基酸残基已被改变，而抗体的一个或多个功能特性没有显着改变或片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的功能保守替代抗-CoV-S抗体或其抗原结合片段包含替代氨基酸序列并表现出以下一种或多种功能特性：
·抑制冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV和/或MERS-CoV)在 ACE2和/或TMPRSS2表达细胞(例如，Calu-3细胞)中的生长；
·不显着结合不表达ACE2和/或TMPRSS2的MDCK/Tet-on细胞；
·在体外限制细胞(例如，Calu-3)的冠状病毒感染(例如，通过SARS-CoV- 2、SARS-CoV和/或MERS-CoV)的传播；和/或
·保护经过工程改造以表达人TMPRSS2和/或ACE2蛋白的小鼠免于由冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV)引起的死亡，例如，其中小鼠感染了其他病毒病毒的致死剂量，任选与第二种治疗剂组合时。
·保护经过工程改造以表达人TMPRSS2和/或ACE2蛋白的小鼠免受冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV或MERS-CoV)引起的体重减轻，例如，其中小鼠感染了否则会导致体重减轻的病毒剂量，任选与第二种治疗剂组合时。
·保护仓鼠免于由冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV或 MERS-CoV)引起的死亡，例如，其中动物被其他致命剂量的病毒感染，任选地与第二种治疗剂。
·保护仓鼠免于由冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV或 MERS-CoV)引起的体重减轻，例如，其中动物感染了会导致体重减轻的病毒剂量，任选地当与第二治疗剂组合时。
“中和”或“拮抗剂”抗CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段，是指将CoV-S的活性抑制到任何可检测程度的分子，例如，抑制CoV-S与受体(如 ACE2)结合，被蛋白酶(如TMPRSS2)切割，或介导病毒进入宿主细胞或病毒在宿主细胞中的繁殖。在一些实施方案中，中和性抗-CoV-S抗原结合蛋白将CoV-S结合受体例如ACE2的能力抑制约15％至约25％，或约25％至约35％，或约35％至约45％，或约 45％至约55％，或约55％至约65％，或约65％至约75％，或约65％至约80％，或约75％至约85％，或约85％至约95％，或约95％至约99％，或约90％至约99％，或约95％至 100％。
表1涉及抗原结合蛋白，例如抗体及其抗原结合片段，其包含如下所述的重链或VH(或其替代物)和轻链或VL(或其替代物)；或包含包含其CDR(HCDR1(或其替代物)、HCDR2(或其替代物)和HCDR3(或其替代物))的VH和包含其CDR的VL (LCDR1(或其替代物))、LCDR2(或其替代物)和LCDR3(或其替代物))，例如，其中免疫球蛋白链、可变区和/或CDR包含下文描述的特定氨基酸序列。
本文所述的抗体还包括其中VH融合至野生型IgG4(例如，其中残基108是S)或IgG4替代物(例如，其中残基108是P)的实施方案。
本发明的抗体和抗原结合片段包含免疫球蛋白链，包括本文所述的氨基酸序列以及抗体的细胞和体外翻译后修饰。例如，本发明包括特异性结合包含本文所述重链和/或轻链氨基酸序列(例如，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或 LCDR3)的CoV-S的抗体及其抗原结合片段)以及抗体和片段，其中一个或多个氨基酸残基被糖基化，一个或多个Asn残基被脱酰胺化，一个或多个残基(例如Met、Trp和/或 His)被氧化，N-末端Gln是焦谷氨酸(pyroE)和/或C末端赖氨酸缺失。
示例性抗SARS-CoV-2-刺突蛋白(SARS-CoV-2-S)抗体的氨基酸和核苷酸序列显示在下表1：示例性序列表中。
表1：示例性序列表
抗体管理
本发明提供了施用本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如表1中的那些的方法，包括将抗原结合蛋白引入受试者(例如，人)的身体中。例如，该方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体并将抗原结合蛋白注射到受试者的身体中，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织中。
本发明提供了包含本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如，具有盖子或色谱柱、空心针头或注射器筒)，例如，表1中的那些。
本发明还提供了一种注射装置，其包含一种或多种与CoV-S特异性结合的抗原结合蛋白(例如抗体或抗原结合片段)，例如表1中的那些，或其药物组合物。注射装置可以包装成套件。注射装置是通过肠胃外途径例如肌内、皮下或静脉内将物质引入受试者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预填充有药物组合物，例如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射流体(例如，包含抗体)的圆筒或筒或其片段或其药物组合物)、用于穿刺皮肤和/或血管以注射流体的针；和一个柱塞，用于将流体推出气缸并通过针孔。在本发明的一个实施方案中，包含来自本发明的组合的抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，或其药物组合物的注射装置是静脉内 (IV)注射装置.这种装置可以在套管或套管针/针中包括抗原结合蛋白或其药物组合物，该套管或套管针/针可以连接到管上，该管可以连接到用于容纳引入身体的流体(例如，盐水)的袋子或储存器上通过套管或套管针/针头对受试者进行检查。在本发明的一个实施方案中，一旦将套针和套管插入受试者的静脉中并且从插入的套管中取出套针，就可以将抗体或其片段或其药物组合物引入装置中。例如，IV装置可以插入外周静脉中(例如，在手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或在心脏的右心房内(例如，中央静脉)；或进入锁骨下静脉、颈内静脉或股静脉，例如，向心脏推进直至到达上腔静脉或右心房(例如，中心静脉线)。在本发明的一个实施例中，注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输液泵。射流注射器使用穿透表皮的高压狭窄液体射流将抗体或片段或其药物组合物引入受试者的身体。外部输液泵是将抗体或其片段或其药物组合物以受控量递送到受试者体内的医疗设备。外部输液泵可以电动或机械驱动。不同的泵以不同的方式运行，例如，注射泵将流体保持在注射器的容器中，可移动活塞控制流体输送，弹性泵将流体保持在可拉伸的球囊容器中，以及来自球囊弹性壁的压力驱动流体输送。在蠕动泵中，一组滚轮挤压一段柔性管，将流体向前推动。在多通道泵中，流体可以以多种速率从多个容器输送。
治疗方法
本发明提供了通过施用治疗有效量的抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段(例如，表1)来治疗或预防病毒感染(例如，冠状病毒感染)的方法施用于需要这种治疗或预防的受试者(例如人)。
通过向受试者施用本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白，可以在受试者中治疗或预防冠状病毒感染。
用于治疗或预防病毒感染的有效或治疗有效剂量的抗CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段(例如表1的)是指足够的抗体或片段的量减轻治疗对象中感染的一种或多种体征和/或症状，无论是通过诱导这些体征和/或症状的消退或消除，还是通过抑制这些体征和/或症状的进展。剂量可以根据要给药的受试者的年龄和大小、目标疾病、病症、给药途径等而变化。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的有效或治疗有效剂量，用于治疗或预防病毒感染，例如，在成人受试者中，为约0.01至约200mg/kg例如，高达约150mg/kg。在本发明的一个实施方案中，剂量高达约10.8或11克(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11克)。在一个示例性实施方案中，治疗有效量在约0.002mg/kg和100mg/kg之间。根据感染的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，可以以初始剂量施用本发明的抗原结合蛋白，然后施用一个或多个第二剂量。在某些实施方案中，可以在初始剂量之后以可以与初始剂量大致相同或更少的量施用第二次或多次后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中随后的剂量间隔至少1至3天；至少1周，至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、狗、牛、猪、绵羊、马、山羊、兔)，优选人，例如，需要预防和/或治疗疾病或病症，例如病毒感染或癌症。受试者可能患有病毒感染，例如流感感染，或易于发生感染。易发生感染的受试者或感染(例如冠状病毒或流感病毒)风险升高的受试者包括由于自身免疫性疾病而免疫系统受损的受试者、接受免疫抑制治疗的受试者(例如，继移植)、患有人类免疫缺陷综合征(HIV)或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的受试者、患有消耗或破坏白细胞的贫血症的受试者、接受放射或化学疗法的受试者或患有炎症性疾病的受试者。此外，非常年轻(例如，5岁或以下)或老年(例如，65岁或以上) 的受试者处于增加的风险中。此外，由于接近疾病的爆发，受试者可能处于感染病毒感染的风险中，例如，受试者居住在人口稠密的城市或靠近已确认或疑似感染病毒的受试者，或选择就业，例如医院工作人员、药物研究人员、前往感染地区的旅行者或常旅客。
“治疗”或“治疗”是指将抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本发明(例如，表1的) 的抗体或抗原结合片段，施用于具有一种或多种体征或症状的受试者。疾病或感染的症状，例如病毒感染，当以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时，抗原结合蛋白对其有效。
本发明还包括向有病毒感染风险的受试者预防性施用抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本发明(例如表1的)的抗体或其抗原结合片段，因此为了防止这种感染。基于被动抗体的免疫预防已被证明是预防对象病毒感染的有效策略。参见例如，Berry等人，被动广谱流感免疫预防。流感资源治疗。2014；2014:267594.Epub 2014年9月22日；和建强等人，预防和控制甲型流感感染的被动免疫中和策略，免疫疗法。2012年2月；4 (2)：175-186；Prabhu等人，Antivir Ther。2009；14(7):911-21，H5血凝素特异性嵌合单克隆抗体对致死性H5N1流感的预防和治疗效果。
“预防”或“预防”是指向受试者施用抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本发明(例如表1的)的抗体或抗原结合片段，以抑制病毒的表现。受试者体内的疾病或感染(例如，病毒感染)，当以有效或治疗有效量或剂量(如本文所讨论的)施用于受试者时，抗原结合蛋白对其有效。
在本发明的一个实施方案中，受试者中病毒感染的体征或症状是病毒在受试者体内的存活或增殖，例如，如通过病毒滴度测定法确定的(例如，冠状病毒在鸡胚中的繁殖或冠状病毒刺突蛋白测定)。本文讨论了病毒感染的其他体征和症状。
如上所述，在一些实施方案中，受试者可以是非人动物，并且本文讨论的抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段)可以在兽医方面用于治疗和/或预防疾病非人类动物(例如，猫、狗、猪、牛、马、山羊、兔子、绵羊等)。
本发明提供了一种用于治疗或预防病毒感染(例如冠状病毒感染)或用于诱导消退或消除或抑制病毒感染的至少一种体征或症状的进展的方法，例如：-发烧或感觉发烧/发冷；-咳嗽；-咽喉痛；--流鼻涕或鼻塞；——打喷嚏；——肌肉或身体疼痛；——头痛；--疲劳(疲倦)；——呕吐；-腹泻；--呼吸道感染；——胸部不适；-呼吸急促；-支气管炎；和/或--肺炎，其体征或症状继发于病毒感染，通过给予治疗有效量的抗 -CoV-S抗原结合蛋白(例如，表1)给受试者，例如，通过将蛋白质注射到受试者体内。
组合和药物组合物
为了制备抗-CoV-S抗原结合蛋白的药物组合物，例如抗体及其抗原结合片段 (例如表1的)，将抗原结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如 Remington'sPharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,Pa.(1984)；哈德曼等人。(2001)Goodman和Gilman的 ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，纽约，纽约；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,andWilkins,New York,NY；阿维斯等人。(eds.)(1993)药物剂型：肠外药物，Marcel Dekker，纽约；利伯曼等人。(eds.)(1990)药物剂型：片剂，Marcel Dekker，纽约；利伯曼等人。 (eds.)(1990)药物剂型：分散系统，Marcel Dekker，纽约；Weiner和Kotkoskie(2000) 赋形剂毒性和安全性，Marcel Dekker,Inc.，纽约，N.Y.在本发明的一个实施方案中，药物组合物是无菌的。这样的组合物是本发明的一部分。
本发明的范围包括干燥的例如冷冻干燥的组合物，其包含抗CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段(例如表1的)，或其药物组合物其包括药学上可接受的载体但基本上不含水。
给药方式可以变化。给药途径包括肠胃外、肌肉内和皮下。
本发明提供了施用抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段(例如，表1的)的方法，包括将蛋白质引入受试者体内。例如，该方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体并将抗原结合蛋白注射到受试者的身体中，例如，注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织中。
本发明提供了包含任何抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体的容器(例如，塑料或玻璃小瓶，例如，具有盖子或色谱柱、空心针头或注射器筒)或其抗原结合片段 (例如，表1的)、多肽(例如，HC,LC,表1的VH或VL)或本文所述的多核苷酸或载体或其包含药学上可接受的载体的药物组合物。
在本公开的一个实施方案中，本发明的抗体，例如本文描述的抗体(例如表1的抗体)与一种或多种其他治疗剂联合施用。
术语“联合”表示本发明的组分、抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，连同另一种药剂，可以配制成单一组合物，例如，用于同时递送，或分别配制成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。可以在与施用另一种组分时不同的时间将每种组分施用给受试者；例如，每次给药可以在给定的时间间隔内以非同时(例如，分开或顺序)给予。此外，单独的组分可以通过相同或不同的途径施用于受试者，例如，其中抗-CoV-S抗体或其抗原结合片段。
套件
进一步提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述组分包括但不限于抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如本文讨论的抗体或抗原结合片段(例如表1的)，在与一种或多种附加组分结合，任选地，包括进一步的治疗剂。
如果试剂盒包括用于对受试者进行肠胃外给药的药物组合物，则该试剂盒可以包括用于进行这种给药的装置(例如，注射装置)。例如，该试剂盒可以包括一个或多个皮下注射针头或如上所述的其他注射装置，其含有本发明的抗CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段(例如，表1的))。
试剂盒可以包括包装插页，其中包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息有助于患者和医生有效和安全地使用随附的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明组合的信息可以在插页中提供：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过量、适当的剂量和给药、如何提供、适当的储存条件、参考资料、制造商/分销商信息和专利信息。
抗体的诊断用途
本发明(例如表1)的抗-CoV-S抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，可用于检测和/或测量样品中的CoV-S。用于CoV-S的示例性测定可以包括，例如，使样品与本发明的抗CoV-S抗原结合蛋白接触，其中该抗CoV-S抗原结合蛋白用可检测的标记或报告分子标记，或用作捕获配体，从样品中选择性分离CoV-S。与CoV-S复合的抗CoV-S抗原结合蛋白的存在表明样本中存在CoV-S。或者，可以将未标记的抗 CoV-S抗体与本身可检测标记的二抗结合使用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，例如H，C P,S,或我；荧光或化学发光部分，例如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或一种酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中CoV-S的具体示例性测定包括中和测定、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、放射免疫测定(MA)和荧光激活细胞分选(FACS)。因此，本发明包括一种检测样品中刺突蛋白多肽存在的方法，该方法包括使样品与抗-CoV-S抗原结合蛋白接触并检测CoV-S/抗-CoV-S抗原的存在-结合蛋白，其中复合物的存在表明存在CoV-S。
本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白(例如，表1的)可用于Western印迹或免疫蛋白印迹程序，以检测样品中CoV-S或其片段的存在。这样的程序构成本发明的一部分并且包括例如以下步骤：
(1)提供包含待测试是否存在CoV-S的样品的膜或其他固体基质，例如，任选地包括从待测试是否存在CoV-S的样品(例如，来自PAGE或使用本领域已知的方法(例如，半干式印迹或罐式印迹)将样品中的蛋白质的SDS-PAGE电泳分离)到膜或其他固体基质上；以及将待测试是否存在CoV-S或其片段的膜或其他固体基质与本发明的抗CoV-S抗原结合蛋白接触。这样的膜可以采取例如硝酸纤维素或乙烯基(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF))膜的形式，在非变性 PAGE(聚丙烯酰胺)中待测蛋白质是否存在CoV-S凝胶电泳)凝胶或SDS- PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶已被转移(例如，在凝胶中进行电泳分离后)。在使膜与抗-CoV-S抗原结合蛋白接触之前，任选地例如用脱脂奶粉等封闭膜以结合膜上的非特异性蛋白结合位点。
(2)洗涤膜一次或多次以去除未结合的抗-CoV-S抗原结合蛋白和其他未结合的物质；和
(3)检测结合的抗-CoV-S抗原结合蛋白。
检测到结合的抗原结合蛋白表明CoV-S蛋白存在于膜或底物上以及样品中。结合抗原结合蛋白的检测可以通过使抗原结合蛋白与可检测地标记的二抗(抗免疫球蛋白抗体)结合，然后检测二抗标记的存在。
本文公开的抗-CoV-S抗原结合蛋白(例如，抗体和抗原结合片段(例如，表1 的))也可用于免疫组织化学。这种方法构成本发明的一部分并且包括，例如，
(1)用本发明的抗-CoV-S抗原结合蛋白接触待检测是否存在CoV-S蛋白的组织；和
(2)检测组织上或组织中的抗原结合蛋白。
如果抗原结合蛋白本身被可检测标记，则可以直接检测。或者，抗原结合蛋白可以被可检测标记的二抗结合，其中随后检测标记。
刺突蛋白序列
野生型SARS-CoV-2的刺突蛋白序列根据SEQ ID NO:100：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNG TKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNK SWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETK CTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TF]
野生型SARS-CoV-2的刺突蛋白RBD结构域的序列根据SEQ ID NO:101：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCY FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
α(B.1.1.7)SARS-CoV-2的刺突蛋白序列根据SEQ ID NO:102：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTK RFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYHKNNKSWM ESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVD LPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTL KSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFK CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPK KSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIDDTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTN TSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQT NSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPINFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLL LQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTL ADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMA YRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLN DILARLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFP QSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTHNTFVSGNCDV VIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL GKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
α(B.1.1.7)SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD结构域的序列根据SEQ ID NO: 103：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCY FPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKCVNF
β(B.1.351)SARS-CoV-2的刺突蛋白的序列根据SEQ ID NO:104：
MFVFLVLLPLVSSQCVNFTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNG TKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNK SWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTL KSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFK CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPK KSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTN TSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQT NSPRRARSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLL LQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTL ADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMA YRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLN DILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQS
LQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTA PAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELD KYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIV MVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
β(B.1.351)SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域的序列根据SEQ ID NO: 105：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCY FPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK
γ(P.1)SARS-CoV-2的刺突蛋白序列根据SEQ ID NO:106:
MFVFLVLLPLVSSQCVNFTNRTQLPSAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNG TKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNYPFLGVYYHKNNK SWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLSEFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEP LVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETK CTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYN YLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVC GPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP GTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQ TQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECS NLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAM QMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISS VLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAAIKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLM SFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGN CDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASFVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
γ(P.1)SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD结构域的序列根据SEQ ID NO:107：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCY FPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK
delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2的刺突蛋白的序列根据SEQ ID NO:108:
MFVFLVLLPLVSSQCVNLRTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPF FSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQS LLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDVYYHKNNKSWMESGVYSSANNCTFEYVSQP FLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGI NITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVD CALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFAS VYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDE VRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLK PFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHA PATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVR DPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRV YSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSRRRARSVASQSIIA YTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLL LQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSK PSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMI AQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQ FNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQNVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL DKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVS NGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKY FKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP WYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKL HYT
delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD结构域的序列根据SEQ ID NO:109：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFS TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCY FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
omicron(BA.1)SARS-CoV-2的刺突蛋白的序列根据SEQ ID NO:110:
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPF FSNVTWFHVISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASIEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLI VNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLDHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMD LEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPIIVREPEDLPQGFSALEPLVDLPIGINIT RFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCA LDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVY AWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFE RDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPA TVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLKGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRD PQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVY STGSNVFQTRAGCLIGAEYVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTKSHRRARSVASQSIIAY TMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLL QYGSFCTQLKRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKYFGGFNFSQILPDPSKP SKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFKGLTVLPPLLTDEMI AQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQ FNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNHNAQALNTLVKQLSSKFGAISSVLNDIFSRL DKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVS NGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKY FKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP WYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKL HYT
omicron(BA.1)SARS-CoV-2的刺突蛋白的RBD结构域的序列根据SEQ ID NO: 111：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFF TFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGC VIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCY FPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人所认为的范围他们的发明。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为平均分子量，温度以摄氏度为单位，室温为约25℃，压力为大气压或接近大气压。
实施例1
a)抗体B生成
抗体B是一种完全人源化的单克隆抗体，在哺乳动物细胞中表达，该细胞用携带其重链和轻链基因的质粒转染。抗体B由中国仓鼠卵巢细胞CHOK1Q表达。最终细胞库病毒安全性测试证明不存在外源性污染风险。
CHOK1Q细胞用CD02培养基复苏，扩增培养后冷冻保存，建立原代细胞库。
抗体B的重链和轻链氨基酸序列如下所示。相应的DNA序列分别在后面显示。
B单克隆抗体重链氨基酸序列
B单克隆抗体重链DNA序列
B单克隆抗体轻链氨基酸序列
B单克隆抗体轻链DNA序列
宿主细胞的质粒转染
μμμμ为了构建工程细胞，通过电转移将携带目的基因的质粒转染到宿主细胞中。细胞在含有4mM谷氨酰胺的BalanCD CHO GrowthA培养基中培养3天，稀释传代一次，连续培养3天后取样计数。活细胞密度为7.01×10个细胞/mL，细胞活力为 97.82％。准备电传输。取13mL的宿主细胞悬液，在室温下以200g离心5分钟。弃去上清液，重悬并与500L EX-CELLCD CHO Fusion混合以备后用。将250L EX- CELL CD CHO Fusion、10g PvuI消化的线性化B1 HC质粒和15g PvuI消化的线性化 B2 LC质粒添加到新的离心管中并充分混合。充分混合宿主细胞和质粒悬浮液，并将它们添加到电击杯中。电压为300V，电容为650μF，电阻为无穷大。
实施例2
方法
细胞和病毒
Vero E6细胞(目录号CRL-1586TM)在含有10％FBS(Gibco)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco)中于37℃和5％一氧化碳2.SARS-CoV-2WIV04毒株最初于2019年从一名COVID-19患者中分离出来(GISAID ，登录号EPI_ISL_402124)。从喉咙中分离出SARS-CoV-2Omicron病毒来自香港的患者的拭子(CCPM-BV-049-2112-18)。本研究中涉及真实SARS-CoV-2的所有过程都是pe在BSL-3设施中改造。
酶联免疫吸附试验
ELISA板(康宁96孔透明平底，货号9018)在0.05M PBS、pH 9.6、4℃中以4μg/ml的50μl/孔SARS-CoV-2RBD重组蛋白包被过夜。每孔加入连续稀释的抗体B溶液，37℃孵育1h。过氧化物酶缀合的小鼠抗人IgG Fc抗体[HRP]、mAb (GenScript,Clone ID 50B4A9)用作检测抗体。使用酶标仪在450nm处测量吸光度。
抑制假型SARS-CoV-2感染
实验按照Li T等人的描述进行。自然通讯12,6304(2021)。简而言之，将50μ l体积的连续稀释mAb与相同体积的含有假病毒(WT SARS-CoV-2、Delta和 Omicron)的Lenti-X293T细胞上清液在37℃下孵育1小时。将这些抗体B混合物添加到表达ACE2的Lenti-X293T细胞(293T/ACE2)中。72小时后，用Bright- Luciferase Reporter Assay System(Promega,E2650)检测受感染的293T/ACE2细胞的荧光素酶活性。使用Varioskan LUX微孔板分光光度计(ThermoFisher)测试评估的mAb 的IC值，并使用GraphPad Prism 8.0通过四参数逻辑回归计算。
中和针对真正SARS-CoV-2的活动
在BSL-3实验室(Zhao,S.et升.鉴定针对SARS-CoV-2的强效人类中和抗体对治疗和预防药物的开发具有重要意义。自然通讯12,4887,doi:10.1038/s41467-021- 25153-x(2021)。简而言之，将Vero细胞以每孔1.5×10接种在24孔培养板中过夜。抗体样品在含有2.5％FBS的DMEM中连续稀释三倍。加入等体积的600PFU/ml SARS-CoV-2，将抗体-病毒混合物在37℃下孵育1小时。然后，将混合物加入到含有Vero细胞的24孔培养板中。仅用300PFU/ml SARS-CoV-2感染的细胞和没有病毒的细胞分别用作阳性对照和未感染对照。在37℃下再次孵育1小时后，去除抗体-病毒混合物，并用含有2.5％FBS和0.9％羧甲基纤维素的DMEM补充培养基。平板用 8％多聚甲醛固定，3天后用0.5％结晶紫染色。
结果
抗体B与SARS-CoV-2S蛋白RBD中的保守区域结合
SARS-CoV-2S蛋白是主要的抗原蛋白，是开发中和抗体和疫苗的靶标(Walls 等人，2009年)。SARS-CoV-2刺突糖蛋白的结构、功能和抗原性。单元格181、 281-292e286(2020))。它利用人血管紧张素转换酶II(hACE2)作为其细胞受体，通过其受体结合结构域(RBD)进入宿主(Zhou P,et al.与可能是蝙蝠来源的新型冠状病毒有关的肺炎爆发。自然579,270-273(2020))。RBD中直接参与RBD和ACE2相互作用的区域称为受体结合基序(RBM)(Lan J,et al.与ACE2受体结合的SARS-CoV-2刺突受体结合域的结构。自然581,215-220(2020)；尚杰，等。SARS-CoV-2受体识别的结构基础。自然581,221-224(2020)；王Q，等。使用人类ACE2进入SARS-CoV-2的结构和功能基础。单元格181、894-904e899(2020))。尽管大多数突变发生在RBM中，但仍有机会识别识别RBD中某些保守区域的广泛nmAb(Cameroni E,etal.广泛中和抗体克服了SARS-CoV-2Omicron抗原转移。自然，(2021))。通过单B细胞分选方法，我们之前鉴定了一种人类单克隆抗体，该抗体可以与SARS-CoV-2WT以及Alpha、Beta 和Gamma变体的RBD结合(Li T。有效的SARS-CoV-2中和抗体，对新出现的突变变体具有保护作用。自然通讯12,6304(2021))。在这里，我们发现抗体B保留了其结合活性，Delta RBD的EC值分别为22.5ng/ml和SARS-CoV-2WT RBD的EC值为 24.3ng/ml，并且仍然与Omicron RBD紧密结合，具有EC为90.0ng/ml(图1a)。根据我们之前的研究，抗体B识别RBD中的两个主要区域(图1d和e)(Li T等人。有效的SARS-CoV-2中和抗体，对新出现的突变变体具有保护作用。自然通讯12, 6304(2021))。
讨论
nmAb是对抗传染病的强大武器。迄今为止，已经鉴定和表征了来自转基因小鼠、恢复期患者和噬菌体展示的一组针对SARS-CoV-2的中和抗体。在这些抗体中，其中一些已被批准用于治疗COVID-19。然而，这些mAb对两种最主要的VOCs delta 和omicron的保护作用要么丧失要么显着降低(Cao Y，et al.Omicron逃脱了大多数现有的SARS-CoV-2中和抗体。自然，(2021)；刘L，等。SARS-CoV-2的Omicron 变体表现出引人注目的抗体逃避。自然，(2021年)。在这些批准的mAb中，S309 (VIR-7831)(Tortorici MA,et al.Science 370,950-957(2020))在假病毒试验中保持其对 Delta和Omicron的中和活性(Cao Y等人。Omicron逃脱了大多数现有的SARS-CoV- 2中和抗体。Nature,(2021))目前，S309(sotrovimab)已根据紧急使用授权(EUA)获得批准，用于治疗轻度至中度COVID-19。然而，尚未在因COVID-19住院的患者中观察到sotrovimab治疗的益处。因此，仍然非常需要针对SARS-CoV-2产生更好临床结果的更广泛的nmAb。
*****************
本文引用的所有参考文献均以引用的方式并入，就好像每个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体地和单独地指示以引用的方式并入一样。申请人旨在通过引用的方式并入该声明与每个单独的出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或已识别的专利相关，即使此类引用并未紧邻通过引用并入。如果有的话，在说明书中包含专门的引用并入声明不会以任何方式削弱这个引用引用并入的一般声明。本文引用参考文献并不意味着承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
Claims (39)
1.一种分离的单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的SARS-CoV-2刺突蛋白，其中所述分离的抗体包含：
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，该轻链可变区(LVR)包含LCDR1：SEQ ID NO：10、LCDR2：SEQ ID NO：11和LCDR3:SEQ ID NO:12，以及包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:13、HCDR2:SEQ ID NO:14的重链可变区(HVR)内的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和HCDR3：SEQ IDNO：15；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，该轻链可变区(LVR)包含LCDR1：SEQ ID NO：20、LCDR2：SEQ ID NO：21和LCDR3:SEQ ID NO:22，和三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:23、HCDR2:SEQ ID NO:24的重链可变区(HVR)内和HCDR3：SEQ ID NO：25；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，包括LCDR1：SEQ ID NO：30、LCDR2：SEQ ID NO：31和LCDR3:SEQ IDNO:32，以及包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:33、HCDR2:SEQ ID NO:34的重链可变区(HVR)内的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和HCDR3：SEQ ID NO：35；
一个免疫球蛋白恒定区，三个轻链互补决定区(CDR)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)包含在一个轻链可变区(LVR)中，包括LCDR1:SEQ ID NO:40、LCDR2:SEQ ID NO:41和LCDR3:SEQ IDNO:42，和三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)包含在包含HCDR1:SEQ ID NO:43、HCDR2:SEQ ID NO:44的重链可变区(HVR)内和HCDR3：SEQ ID NO：45。
2.如权利要求1所述的分离的抗体，其中
轻链可变区(LVR)包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，重链可变区(HVR)包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；
轻链可变区(LVR)包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，重链可变区(HVR)包含SEQ IDNO：28所示的氨基酸序列；
轻链可变区(LVR)包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，重链可变区(HVR)包含SEQ IDNO:38所示的氨基酸序列；
轻链可变区(LVR)包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，重链可变区(HVR)包含SEQ IDNO:48所示的氨基酸序列；或者
轻链可变区(LVR)包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，重链可变区(HVR)包含SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列。
3.权利要求1的分离抗体，其中所述免疫球蛋白恒定区是IgG1恒定区。
4.如权利要求1所述的分离抗体，其为重组抗体。
5.根据权利要求1所述的分离抗体，其特征在于，所述分离抗体结合SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域，所述RBD结构域包含SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:111。
6.权利要求1的分离的抗体，其中所述分离的抗体具有至少一种本文所述的免疫球蛋白恒定区取代。
7.权利要求1的分离抗体，其中所述分离抗体在免疫球蛋白恒定区中具有LALA取代。
8.一种药物组合物，包含前述权利要求的分离的抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。
9.一种与冠状病毒刺突蛋白(CoV-S)特异性结合的分离重组抗体，其中分离抗体具有以下一种或多种特征：
(a)与CoV-S结合，EC50小于约10-9米；
(b)与未进行所述给药的可比较的冠状病毒感染动物相比，在向所述感染冠状病毒的动物给药后，证明感染冠状病毒的动物的存活率增加；和/或
(c)包含三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，该重链可变区(HVR)包含与表1的HVR具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及包含在轻链可变区(LVR)内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其包含与表1的LVR具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
10.权利要求9的分离的抗体，其中所述分离的抗体具有至少一种本文所述的免疫球蛋白恒定区取代。
11.一种分离的重组抗体，可特异性结合冠状病毒刺突蛋白(RBD-CoV-S)上的RBD结构域，其中该抗体具有以下一项或多项特征：
(a)与RBD-CoV-S结合，EC50小于约10-9米；
(b)与未进行所述给药的可比较的冠状病毒感染动物相比，在向所述感染冠状病毒的动物给药后，证明感染冠状病毒的动物的存活率增加；和/或
(c)包含三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，该重链可变区(HVR)包含与表1的HVR具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及包含在轻链可变区(LVR)内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其包含与表1的LVR具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的分离抗体，其中所述分离抗体具有至少一种本文所述的免疫球蛋白恒定区取代。
13.如权利要求9或11所述的抗体，包括：
(a)表1的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或
(b)表1的抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
14.如权利要求9-12中任一项所述的抗体，其包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含表1的单一抗体的HVR和LVR。
15.一种抗原结合蛋白，其与权利要求9-14中任一项所述的抗体竞争结合CoV-S。
16.一种抗原结合蛋白，与权利要求9-14中任一项所述的抗体结合至与CoV-S相同的表位或与CoV-S上的重叠表位结合。
17.如权利要求9-14中任一项所述的抗体，其包含一种或多种以下特性：
(a)抑制冠状病毒的生长；
(b)与冠状病毒表面结合；
(c)在体外限制冠状病毒感染细胞的传播；和
(d)保护经工程改造以表达人类ACE2或TMPRSS2蛋白的小鼠免于因冠状病毒感染而死亡和/或体重减轻。
18.根据权利要求9-16中任一项所述的抗体，其中，所述CoV-S为SARS-CoV-2-S。
19.一种复合物，其包含与CoV-S多肽结合的权利要求9-16中任一项的抗体。
20.权利要求19的复合物，其中所述CoV-S是SARS-CoV-2-S。
21.一种制备权利要求1-18中任一项的抗体的方法，包括：
(a)将编码所述抗体的一种或多种多核苷酸引入宿主细胞；
(b)在有利于一种或多种多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞；和
(c)任选地，从宿主细胞和/或宿主细胞在其中生长的培养基中分离抗体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
23.一种抗体，它是权利要求21或22的方法的产物。
24.一种多肽，包括：
(a)表1中列出的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者
(b)表1中列出的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
25.根据权利要求24所述的多肽，其中所述分离的抗体具有至少一种本文所述的免疫球蛋白恒定区取代。
26.编码权利要求24或25的多肽的多核苷酸。
27.一种包含权利要求26的多核苷酸的载体。
28.一种宿主细胞，其包含权利要求1-18中任一项所述的抗体，或权利要求24-27中任一项所述的多肽或多核苷酸或载体。
29.一种组合物或试剂盒，其包含权利要求1-18中任一项所述的抗体以及另外的治疗剂。
30.一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体以及任选的另外的治疗剂。
31.一种容器或注射装置，其包含权利要求1-18、29和30中任一项所述的抗体或组合物。
32.一种抑制SARS-CoV-2变体复制的方法，包括将SARS-CoV-2变体与权利要求1-18中任一项所述的抗体接触，其中，所述SARS-CoV-2变体为伽玛(P.1)、Delta(B.1.617.2)或Omicron(B.1.1.529)。
33.一种在有需要的受试者中治疗SARS-CoV-2变体感染的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-18中任一项所述的抗体，其中所述SARS-CoV-2变体2是Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)或Omicron(B.1.1.529)。
34.权利要求33的方法，其中所述治疗有效量在约0.002mg/kg和100mg/kg之间。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗体经皮下、静脉内或肌内施用。
36.一种在有需要的受试者中预防SARS-CoV-2变体感染的方法，包括向所述受试者施用预防有效量的权利要求1-18中任一项的抗体，其中所述SARS-CoV-2变体2是Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)或Omicron(B.1.1.529)。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗原结合蛋白经皮下、静脉内或肌内施用。
38.一种将权利要求1-18中任一项的抗体施用到受试者体内的方法，包括将所述抗体注射到受试者体内。
39.根据权利要求38所述的方法，其中将所述抗体皮下、静脉内或肌内注射到所述受试者的身体中。
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