CN116648463A

CN116648463A - Cd47-cd38双特异性抗体

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Publication number: CN116648463A
Application number: CN202180076954.9A
Authority: CN
Inventors: L·波切兹; B·普洛; M-A·杜西; E·德伊里; S·布莱因; C·斯图兹; C·埃斯托佩伊; J·罗友; T·蒙尼; C·格兰德塞尔蒙特; S·萨米切利
Original assignee: Ikonos Science
Current assignee: Ikonos Science
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-08-25
Also published as: EP4214231A1; AU2021344635A1; KR20230088370A; CA3192465A1; MX2023003192A; AR123548A1; US20220089767A1; CL2023000786A1; CO2023004698A2; JP2023542907A; WO2022058539A1; PE20231573A1; AU2021344635A9; TW202227497A; IL301330A

Abstract

本发明提供了靶向人CD47抗原和人CD38抗原的组分的新型双特异性异二聚体免疫球蛋白，特别是包含抗CD38重链可变区和轻链可变区以及抗CD47重链可变区和轻链可变区的那些。本发明还涉及这类新型双特异性异二聚体免疫球蛋白在治疗自身免疫性疾病和增殖性疾病，特别是癌症诸如血液恶性肿瘤和实体瘤中的用途。

Description

CD47-CD38双特异性抗体

技术领域

本发明涉及靶向人CD47抗原和人CD38抗原的组分的新型双特异性异二聚体免疫球蛋白。更具体地，本发明涉及抗CD38重链可变区和轻链可变区以及抗CD47重链可变区和轻链可变区。本发明还涉及这类新型双特异性异二聚体免疫球蛋白在治疗自身免疫性疾病和增殖性疾病，特别是癌症诸如血液恶性肿瘤和实体瘤中的用途。

背景技术

多发性骨髓瘤是一种肿瘤性浆细胞疾病，其特征是骨髓(BM)微环境中恶性浆细胞的克隆增殖、血液或尿液中的单克隆蛋白以及相关的器官功能障碍。多发性骨髓瘤占所有新癌症诊断的1％-2％和所有血液恶性肿瘤死亡的约20％。该疾病在男性和非裔美国人中更为常见。多发性骨髓瘤仍然是一种不可治愈的癌症，尽管最近对骨髓瘤发病机制的认识有所提高，导致开发了新的治疗方法并提高了生存率。

多发性骨髓瘤的诊断需要一个或多个骨髓瘤定义事件(MDE)的存在，以及在BM检查或活检证实的浆细胞瘤上10％或更多克隆浆细胞的证据。MDE包括所谓的CRAB(高钙血症、肾衰竭、贫血或溶骨性病变)特征以及以下三种特定生物标志物：克隆性BM浆细胞>60％，血清游离轻链(sFLC)比率>100(条件是受累的sFLC水平>100mg/L)，以及磁共振成像(MRI)上多于1个局灶性病变。肿瘤浆细胞中发生的几种遗传异常在骨髓瘤的发病机制中起主要作用并决定疾病预后。

骨髓瘤细胞的不受控制的生长会产生许多后果，包括骨骼破坏、BM衰竭、血浆体积和粘度增加、正常免疫球蛋白产生受到抑制和肾损害。

症状性(活动性)疾病应当立即治疗，而无症状(冒烟型)骨髓瘤仅需要临床观察，因为用常规化疗进行早期治疗尚未显示出明显的益处。研究性试验目前正在评估免疫调节药物延缓从无症状到有症状骨髓瘤进展的能力。对于活动性骨髓瘤，目前的数据支持启动诱导治疗方案，包括沙利度胺、来那度胺和/或硼替佐米，然后在主要疾病反应后对可以耐受自体造血干细胞移植(HSCT)调节方案的患者进行自体HSCT。对生理年龄(可能不同于实足年龄)和并存病症的存在的考虑决定治疗选择和药物剂量。例如，对于具有严重合并症(包括心肺或肝损伤)的患者来说，强度较低的方法是可取的，它可以限制治疗相关的死亡率并降低治疗中断的风险。

复发性/难治性多发性骨髓瘤的治疗提出了一个特殊的治疗挑战，因为疾病在复发时具有异质性，并且缺乏关于在疾病进展的不同时间点选择挽救疗法的基于生物学的明确建议。随着人们越来越认识到浆细胞的固有克隆异质性和基因组不稳定性会影响固有和获得性治疗耐药性，确定最佳治疗选择和治疗顺序变得至关重要。近年来，美国(US)食品和药物管理局(FDA)批准了用于复发性/难治性骨髓瘤的新药剂，从而增加了这些决定的复杂性，这些药剂包括蛋白酶体抑制剂(卡非佐米和伊沙佐米)、沙利度胺衍生物泊马度胺和组蛋白脱乙酰酶抑制剂帕比司他。目前正在开发针对特定细胞信号传导途径以及存活和增殖控制(包括PI3K/AKT/mTOR抑制剂、Hsp90抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂)的其他分子靶向疗法。尽管对多发性骨髓瘤的治疗取得了进展，但几乎所有患者都不可避免地会复发。骨髓瘤的复发通常随着每次复发而更具侵袭性，从而导致治疗难治性疾病的发展，这与较短的生存期相关。因此，需要额外的治疗选择。

靶向同一分子内的两种不同抗原的抗体为多种恶性肿瘤提供了免疫治疗策略。在临床前和临床研究中，已显示最大类别的免疫效应细胞重定向抗体介导T细胞重定向(MayC等人,(2012)Biochem Pharmacol,84(9):1105-12；Frankel SR&Baeuerle PA,(2013)CurrOpin Chem Biol,17(3):385-92；Nie等人,(2020)Antibody Therapeutics,3(1),17-62)。所有效应细胞重定向双特异性抗体或其片段被工程化以具有至少两个抗原结合位点，其中一个位点结合靶细胞上的表面抗原，而另一个位点结合效应细胞表面抗原。

然而，仍然需要改进基于效应细胞重定向抗体的疗法，特别是涉及治疗窗。治疗窗定义为发挥治疗功效而没有观察到毒性或观察到有限毒性的药物浓度范围。(《药物基因组学和分层医学手册》(Handbook of Pharmacogenomics and Stratified Medicine),2014)。任何疗法的目的都是达到在所有患者中都能看到功效而在任何患者中都没有副作用或具有可控制副作用的剂量(《临床药理学原理》(Principles of ClinicalPharmacology)(第三版)，2012)。为了拓宽双特异性抗体的治疗窗口，可以降低产生半数最大治疗反应(EC50)的药物浓度(提高疗效)，和/或可以增加产生毒性作用的浓度(提高在靶特异性)。

与用于过表达CD38的癌症(诸如多发性骨髓瘤)的其他批准的或候选药物相比，为了靶向更大的治疗窗，本发明人已经开始提供改进的基于效应细胞重定向抗体的治疗剂，其特异性地作用于肿瘤细胞。然而，尽管已显示结合CD38的单克隆抗体(诸如达雷妥尤单抗)可以与CD47-阻断性scFv联用，所述CD47-阻断性scFv与CD20-靶向scFv串联地遗传融合以通过阻断CD47/SIRPα信号来增强癌细胞的吞噬作用(van Bommel,P.E.等人(2017)，用双特异性抗体衍生物CD20选择性抑制CD47-SIRPα“不要吃我”信号传导增强了达雷妥尤单抗、阿仑单抗和奥比妥珠单抗)的抗癌活性(CD20-selective inhibition of CD47-SIRPα“don't eat me”signaling with abispecific antibody-derivative enhances theanticancer activity of daratumumab,alemtuzumab and obinutuzumab).ONCOIMMUNOLOGY，第7卷，第2期，1-8)，但在表达CD38的癌细胞中选择性地阻断CD47-SIRPα相互作用的可能性仍然是未满足的需求。

具体实施方式

本发明涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含至少两个结合部分，其中至少一个结合人CD38并且其中至少一个结合人CD47。

本发明还涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分。

本发明还涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分，其中至少两个CD38结合部分是单互补位的。

本发明还涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分，其中至少两个CD38结合部分是双互补位的。

本发明还涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含至少两个结合部分，其中至少一个结合人CD38并且其中至少一个结合人CD47，其中结合人CD47的结合部分中的至少一个也能够结合食蟹猴CD47。

本发明还涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含至少两个结合部分，其中至少一个结合人CD38并且其中至少一个结合人CD47，其中结合人CD38的结合部分中的至少一个也能够结合食蟹猴CD38。

本发明还涉及上述双特异性抗体作为药物的用途。

更具体地，用于治疗多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌诸如Her2+乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、高级别浆液性卵巢癌、腹膜癌。

根据本发明的一个方面，所公开的双特异性抗体包含结合人CD38的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：

SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241。

根据本发明的另一个方面，所公开的双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQID NO:195。

在某些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包含Fc区。具体地，所述Fc区是变体，其相对于亲本抗体的Fc区包含至少一个氨基酸修饰，而包含变体Fc区的抗体与亲本抗体相比表现出改变的效应子功能。

在某些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分，其对人CD47的亲和力低于结合人CD38的至少一个结合部分对人CD38的亲和力。

本发明还涉及一种被本文公开的双特异性抗体结合的人CD38胞外结构域上的表位。

本发明还涉及一种被本文公开的双特异性抗体结合的人CD47胞外结构域上的表位。

本发明还涉及一种编码本文公开的双特异性抗体的分离的核酸。

本发明还涉及一种包含编码本文公开的双特异性抗体的分离的核酸的载体。

本发明还涉及一种包含编码本文公开的双特异性抗体的分离的核酸的宿主细胞或一种包含编码本文公开的双特异性抗体的分离的核酸的载体。

本发明还涉及一种包含根据本发明的双特异性抗体和药学上可接受的载体的组合物，并且涉及还包含另一种药学活性剂的所述组合物。

本发明还涉及一种与治疗剂连接的包含根据本发明的双特异性抗体的免疫缀合物。

如根据本公开所使用的，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容清楚地另外指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个分子”任选地包括两个或多个这样的分子的组合，等等。

应当理解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“包含”、“由…组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。这种修饰包括碱基修饰诸如溴尿苷，核糖修饰诸如阿拉伯糖苷和2',3'-二脱氧核糖，乙基核苷酸间键修饰诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”具体包括单链和双链形式的DNA。

“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或它们的一些组合，其：(1)不与自然界中发现该分离的多核苷酸的全部或部分多核苷酸缔合，(2)与自然界中不与其连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为较大序列的一部分存在。

“分离的多肽”是这样的多肽：(1)不含通常发现的至少一些其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其在自然界中缔合的其他材料分离，(5)不与“分离的多肽”在自然界中缔合的多肽部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)可操作地与“分离的多肽”在自然界中不缔合的多肽缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然界中不存在。这种分离的多肽可以由合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何组合编码。优选地，分离的多肽基本上不含在其天然环境中发现的会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其他)的多肽或其他污染物。

本文所指的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。天然存在的抗体通常包含四聚体。每个这样的四聚体通常由两对相同的多肽链组成，每对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50kDa-70kDa的分子量)。如本文所用，术语“重链”和“轻链”是指具有足够的可变结构域序列以赋予对靶抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH3结构域位于羧基末端，全长轻链免疫球蛋白多肽包括可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)，其中VL结构域位于多肽的氨基末端，而CL结构域位于羧基末端。

人轻链通常被分类为κ和λ轻链，人重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地被细分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域通常通过约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，其中重链还包括约10个以上氨基酸的“d”区。参见例如FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul,W.编辑,Raven Press，第2版，1989)，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每对两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合特定表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域通常都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。Kabat(Kabat等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达(1987)和(1991)))描述的系统不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为KabatCDR。Chothia及其同事(Chothia和Lesk,1987,J.Mol Biol.196:901-17；Chothia等人,1989,Nature 342:877-83)发现Kabat CDR内的某些亚部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些亚部分被命名为LI、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可称为Chothia CDR，其边界与KabatCDR重叠。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界在通过以下文献进行了描述：Radian,1995,FASEB J.9:133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；以及Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77。还有其他CDR边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但仍将与Kabat CDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或延长。尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR，但本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任一个定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定预测的CDR是本领域熟知的，诸如在Martin,A.C.“抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein sequence and structure analysis of antibody variabledomains),”Antibody Engineering,第2卷,Kontermann R.,Diibel S.编辑,Springer-Verlag,Berlin,第33-51页(2010)中。也可以通过其他常规方法检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，例如，通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较以确定序列高变区。编号的序列可以通过肉眼比对，或者通过使用比对程序诸如CLUSTAL程序套件之一来比对，如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-80中所描述的。分子模型通常用于正确描绘框架和CDR区，并因此校正基于序列的分配。本发明涵盖所有这样的替代定义，并且本说明书中提供的序列并不旨在排除替代定义的CDR序列，所述替代定义的CDR序列可仅包含序列表中提供的CDR序列的一部分。

如本文所用，术语“Fc”是指包含非抗原结合片段的序列的分子，该非抗原结合片段由抗体的消化产生或通过其他方式产生，无论是单体形式还是多聚体形式，并且可以包含铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选是人类来源的并且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由单体多肽组成，这些单体多肽可以通过共价(即，二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键数量范围为1至4，这取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2和IgG4)。Fc的一个示例是

木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键合的二聚体。如本文所用，术语“天然Fc”是单体、二聚体和多聚体形式的总称。

F(ab)片段通常包括一条轻链和一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分不能与另一条重链多肽形成二硫键。如本文所用，F(ab)片段还可以包括含有由氨基酸接头隔开的两个可变结构域的一条轻链和含有由氨基酸接头和CH1结构域隔开的两个可变结构域的一条重链。

F(ab')片段通常包括一条轻链和含有更多恒定区(在CH1结构域与CH2结构域之间)的一条重链的一部分，使得可以在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。

如本文所用，术语“结合蛋白”是指非天然存在的或重组的或工程化的分子，诸如非天然存在的或重组的或工程化的抗体，其特异性结合至少一种靶抗原，例如本公开的CD38多肽或CD47多肽。

“重组”分子是已经通过重组方式制备、表达、产生或分离的分子。

本公开的一个实施方案提供了对一种至三种靶抗原具有生物学和免疫学特异性的结合蛋白。本公开的另一个实施方案提供了包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。本公开的另一个实施方案提供了包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本公开的又一个实施方案提供了表达此类结合蛋白(即，包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)的宿主细胞。

如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶”是指能够被结合蛋白结合并且另外能够在动物中用于产生能够结合该抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。靶抗原可具有一个或多个表位。对于由结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。抗原通过抗原结合位点被结合蛋白诸如抗体结合，抗原结合位点在本文中也称为“结合部分”或“结合结构域”。

“CD38”是分化38多肽的簇，一种在许多免疫细胞表面上发现的糖蛋白。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合一种或多种CD38多肽的胞外结构域。示例性CD38胞外结构域多肽序列包括但不限于人CD38的胞外结构域(例如，如SEQ ID NO:5所示)和食蟹猴CD38的胞外结构域(例如，如SEQ ID NO:6所示)。

“CD47”是分化47的簇，一种在人类中由CD47基因编码的跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，它与膜整联蛋白合作，并且还结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα)。CD47向免疫系统的巨噬细胞发出别吃我信号。人CD47由SEQ ID NO:7编码，而食蟹猴CD47由SEQ ID NO:8编码。

术语“单特异性结合蛋白”是指特异性结合一个抗原靶标的结合蛋白。

术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。

术语“双特异性结合蛋白”是指特异性结合两种不同抗原靶标的结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白结合两种不同的抗原。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白结合同一抗原上的两个不同表位。

术语“二价结合蛋白”是指具有两个抗原结合位点的结合蛋白。

术语“三特异性结合蛋白”是指特异性结合三种不同抗原靶标的结合蛋白。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合三种不同的抗原。在一些实施方案中，三特异性结合蛋白结合同一抗原上的一个、两个或三个不同表位。

术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。在具体的实施方案中，三价结合蛋白可以结合一种抗原靶标(即单特异性三价结合蛋白)。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合两种抗原靶标(即双特异性三价结合蛋白)。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合三种抗原靶标(即三特异性三价结合蛋白)。在一个更具体的实施方案中，结合两种抗原靶标的三价结合蛋白包含结合第一抗原靶标的一个结合部分和结合第二抗原靶标的相同表位的两个结合部分；这种结合蛋白称为“单互补位的”。在另一个更具体的实施方案中，结合两种抗原靶标的三价结合蛋白包含结合第一抗原靶标的一个结合部分和结合第二抗原靶标的两个不同表位的两个结合部分；这种结合蛋白称为“双互补位的”。“分离的”结合蛋白是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的结合蛋白。其天然环境的污染物组分是会干扰结合蛋白的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，结合蛋白将：(1)被纯化至大于95重量％的抗体，如通过Lowry方法确定的，并且最优选大于99重量％，(2)被纯化至足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染通过SDS-PAGE被纯化至均一。分离的结合蛋白包括重组细胞内的原位结合蛋白，因为结合蛋白的天然环境的至少一种组分将不存在。

如本文所用，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指作为存在的主要物质的化合物或物质(即，以摩尔计，它比组合物中的任何其他单独物质更丰富)。在一些实施方案中，基本上纯化的级分是这样的组合物，其中该物质包含至少约50％(以摩尔计)的存在的所有大分子物质。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将包含大于约80％、85％、90％、95％或99％的存在于组合物中的所有大摩尔物质。在其他实施方案中，物质被纯化至基本均一(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物质)，其中组合物基本上由单种大分子物质组成。

当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术，参见例如F.Ausubel等人编辑(1987)《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology),Greene Publishing and Wiley Interscience,纽约)从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体或结合蛋白结合的抗原的区域。在某些实施方案中，当结合蛋白优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，其被称为特异性结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数<10⁸M时，更优选当平衡解离常数<10⁹M时，最优选当解离常数<10¹⁰M时，结合蛋白被认为特异性结合抗原。

结合蛋白的解离常数(KD)可以例如通过表面等离子体共振来确定。通常，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(GE)通过表面等离子体共振(SPR)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析还可以通过固定分析物(生物传感器基质上的结合蛋白)并呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所用，术语“KD”是指特定结合蛋白与靶抗原之间相互作用的解离常数。

如本文所用，关于结合蛋白的术语“结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段以至少约1×10⁶M、1×10⁷M、1×10⁸M、1×10⁹M、1×10¹⁰M、1×10¹¹M、1×10¹²M或更高的Kd结合含有表位的抗原和/或以比其对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力结合表位的能力。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白结合两种或更多种抗原，例如人和食蟹猴CD38多肽。

在一些实施方案中，本公开的抗原结合结构域和/或结合蛋白与人和食蟹猴CD38多肽“交叉反应”，例如CD38胞外结构域，诸如SEQ ID NO:295(人CD38同种型28907-1)、SEQID NO:294(人CD38同种型28907-2)、SEQ ID NO:296(人CD38同种型28907-E)和SEQ ID NO:6(食蟹猴CD38)。在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段与人CD47(例如，SEQ IDNO:300(人CD47同种型OA3-323)、SEQ ID NO:301(人CD47同种型OA3-293)、SEQ ID NO:302(人CD47同种型OA3-305)和SEQ ID NO:303(人CD47同种型OA3-312))和食蟹猴CD47交叉反应。当两种抗原的EC50S处于相似范围时，结合抗原1的结合蛋白与抗原2“交叉反应”。

如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域之间的一个或多个氨基酸残基，以为轻链结构域和重链结构域提供足够的移动性以折叠成交叉双可变区免疫球蛋白。在序列水平上，分别在可变结构域之间或可变结构域与恒定结构域之间的过渡处插入接头。可以鉴定结构域之间的转变，因为免疫球蛋白结构域的大致大小是众所周知的。结构域转变的精确位置可以通过定位不形成二级结构元件诸如β-折叠或α-螺旋的肽段来确定，如实验数据所证明的或如可通过建模或二级结构预测的技术所假定的。

如本文所用，术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指其中可以插入另外的DNA片段的环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段插入病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开旨在包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们提供等同的功能。

如本文所用，短语“重组宿主细胞”(或“宿主细胞”)是指其中已引入重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，而且指这种细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但这样的细胞仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。多种宿主细胞表达系统可用于表达结合蛋白，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载体的一个示例是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用携带编码结合蛋白的多肽链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得多肽链在宿主细胞中表达，并且优选地分泌到培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可以回收结合蛋白。

如本文所用，术语“转化”是指细胞遗传特征的改变，并且当细胞被修饰以包含新的DNA时，它已被转化。例如，细胞在从其天然状态进行遗传修饰的位置被转化。转化后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件瞬时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当DNA随着细胞的分裂而复制时，细胞被认为已被稳定转化。如本文所用，术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已被引入细胞膜内部时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的。此类技术可用于将一种或多种外源DNA分子引入合适的宿主细胞中。

如本文所用并应用于对象的术语“天然存在的”是指该对象可在自然界中发现并且未被人为操纵的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多核苷酸或多肽是天然存在的，它可以从自然界中的来源分离处理并且未被人有意修饰。类似地，如本文所用，“非天然存在的”是指自然界中未发现的或已被人为结构修饰或合成的对象。

如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸和

类似物诸如α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是结合蛋白的多肽链的合适组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。

天然存在的残基可以根据常见的侧链特性分为几类：

(1)疏水性：Met、Ala、Vai、Leu、He、Phe、Trp、Tyr、Pro；

(2)极性亲水性：Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、His、Lys、Ser、Thr；

(3)脂肪族：Ala、Gly、He、Leu、Val、Pro；

(4)脂肪族疏水性：Ala、He、Leu、Vai、Pro；

(5)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(6)酸性：Asp、Glu；

(7)碱性：His、Lys、Arg；

(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(9)芳香族：His、Trp、Tyr、Phe；以及

(10)芳香族疏水性：Phe、Trp、Tyr。

保守氨基酸取代可能涉及这些类别之一的成员与同一类别的另一个成员的交换。非保守取代可能涉及这些类别之一的成员与另一个类别的成员的交换。

本领域技术人员将能够使用熟知的技术确定结合蛋白的多肽链的合适变体。例如，本领域技术人员可以鉴定多肽链的合适区域，通过靶向认为对活性不重要的区域可以在不破坏活性的情况下改变这些区域。或者，本领域技术人员可以鉴定相似多肽中保守的分子残基和部分。此外，即使对于生物活性或结构可能重要的区域也可以进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不不利地影响多肽结构。

如本文所用，术语“患者”包括人和动物受试者。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和防止性或预防性措施。需要治疗的人包括患有疾病的人以及易于患有疾病的人或需要预防疾病的人。在具体的实施方案中，结合蛋白可用于治疗患有癌症的人或易患癌症的人，或改善人类受试者的癌症。结合蛋白也可用于预防人类患者的癌症。在具体的实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌诸如Her2+乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、高级别浆液性卵巢癌、腹膜癌。

如本文所用，术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指当适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适合实现或增强结合蛋白递送的一种或多种制剂材料。

当用于指包含一种或多种结合蛋白的药物组合物时，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗结果的量或剂量。更具体地，治疗有效量是足以在一段时间内抑制与所治疗病症相关的一种或多种临床定义的病理过程的结合蛋白的量。有效量可以根据所使用的特异性结合蛋白而变化，并且还取决于与所治疗的患者相关的多种因素和状况以及病症的严重程度。例如，如果要在体内施用结合蛋白，则考虑的因素包括患者的年龄、体重和健康状况以及临床前动物研究中获得的剂量反应曲线和毒性数据。给定药物组合物的有效量或治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。

本公开的一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的结合蛋白。

抗CD38结合蛋白

本公开的某些方面涉及包含结合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的抗原结合位点的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白是单特异性的和/或单价的、双特异性的和/或二价的、三特异性的和/或三价的、或多特异性的和/或多价的。

本文描述了示例性单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白的多种特征。例如，在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段与人CD38(例如，SEQ ID NO:295(人CD38同种型28907-1)、SEQ ID NO:294(人CD38同种型28907-2)、SEQ ID NO:296(人CD38同种型28907-E))和食蟹猴CD38交叉反应。在一些实施方案中，结合蛋白诱导CD38+细胞的凋亡。

在一些实施方案中，结合蛋白是二价的和/或双特异性的。在一些实施方案中，结合蛋白是多价的，诸如三价的或四价的。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽的胞外结构域)。

在上述任何双特异性结合蛋白中，除CD38以外的靶抗原可以是以下示例性靶抗原中的任一种：A2AR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BIYS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CCR7、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD47、CD48、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD272、CD273(也称为PDL2)、CD274(也称为PDLI)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为上皮细胞钙粘蛋白)、几丁质酶、CLEC9、CLEC91、CRTH2、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷酸三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、Gi24、GITR、GITRL、GM-CSF、GPRC5D、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNa、IgE、IGF1R、IL2Rbeta、IL1、IL1RAP、ILILIA、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、RAP、IL9R、IL10、rlL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整联蛋白)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、KG2D、NTPDase-1、0X40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISPl1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM，以及XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)、XCL1和XCL2。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人类抗原靶标。

在上文所述的任何双特异性结合蛋白中，可以使用本文所述的任何接头或接头的组合。

在某些具体的实施方案中，本发明涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD38的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:200；SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:201；SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:202；SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:203；SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:204；SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:205；SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:206；SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:208；SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:209；SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:210；SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:211；SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:152、SEQ IDNO:212；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:213；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:214；SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:215；SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:216；SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:217；SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:218；SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:219；SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:220；SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:221；SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:222；SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ IDNO:223；SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:224；SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:225；SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:226；SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:227；SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:228；SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:229；SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:230；SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:231；SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:174、SEQ IDNO:234；SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:235；SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:236；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:238；SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:239；SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:240；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:242；SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:243；SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:244；SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:245；SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:246；SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:247；SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:248；SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:189、SEQ ID NO:249；SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:250。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包含结合人CD38的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:235；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQID NO:237；SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241。

抗CD47结合蛋白

本公开的某些方面涉及包含结合CD47多肽(例如，人和食蟹猴CD47多肽)的抗原结合位点的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白是单特异性的和/或单价的、双特异性的和/或二价的、三特异性的和/或三价的、或多特异性的和/或多价的。

本文描述了示例性单特异性、双特异性或三特异性结合蛋白的多种特征。例如，在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段与人CD47(例如，SEQ ID NQ:300(人CD47同种型OA3-323)、SEQ ID NQ:301(人CD47同种型OA3-293)、SEQ ID NQ:302(人CD47同种型OA3-305)和SEQ ID NQ:303(人CD47同种型OA3-312))和食蟹猴CD47交叉反应。

在一些实施方案中，结合蛋白是二价的和/或双特异性的。在一些实施方案中，结合蛋白是多价的，诸如三价的或四价的。在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点结合CD47多肽(例如，人和/或食蟹猴CD47多肽的胞外结构域)。

在上述任何双特异性结合蛋白中，除CD47以外的靶抗原可以是以下示例性靶抗原中的任一种：AZAR、APRIL、ATPDase、BAFF、BAFFR、BCMA、BIYS、BTK、BTLA、B7DC、B7H1、B7H4(也称为VTCN1)、B7H5、B7H6、B7H7、B7RP1、B7-4、C3、C5、CCL2(也称为MCP-1)、CCL3(也称为MIP-1a)、CCL4(也称为MIP-1b)、CCL5(也称为RANTES)、CCL7(也称为MCP-3)、CCL8(也称为mcp-2)、CCL11(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL15(也称为MIP-1d)、CCL17(也称为TARC)、CCL19(也称为MIP-3b)、CCL20(也称为MIP-3a)、CCL21(也称为MIP-2)、CCL24(也称为MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(也称为TECK)、CCL26(也称为嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCR3、CCR4、CD3、CCR7、CD19、CD20、CD23(也称为FCER2，IgE的受体)、CD24、CD27、CD28、CD38、CD39、CD40、CD47、CD48、CD70、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD122、CD137(也称为41BB)、CD137L、CD152(也称为CTLA4)、CD154(也称为CD40L)、CD160、CD27Z、CD273(也称为PDLZ)、CD274(也称为PDLI)、CD275(也称为B7H2)、CD276(也称为B7H3)、CD278(也称为ICOS)、CD279(也称为PD-1)、CDH1(也称为上皮细胞钙粘蛋白)、几丁质酶、CLEC9、CLEC91、CRTHZ、CSF-1(也称为M-CSF)、CSF-2(也称为GM-CSF)、CSF-3(也称为GCSF)、CX3CL1(也称为SCYD1)、CXCL12(也称为SDF1)、CXCL13、CXCR3、DNGR-1、外核苷酸三磷酸二磷酸水解酶1、EGFR、ENTPD1、FCER1A、FCER1、FLAP、FOLH1、GiZ4、GITR、GITRL、GM-CSF、GPRC5D、Her2、HHLA2、HMGB1、HVEM、ICOSLG、IDO、IFNa、IgE、IGF1R、IL2Rbeta、IL1、IL1RAP、ILILIA、IL1B、IL1F10、IL2、IL4、IL4Ra、IL5、IL5R、IL6、IL7、IL7Ra、IL8、IL9、RAP、IL9R、IL10、rlL10、IL12、IL13、IL13Ra1、IL13Ra2、IL15、IL17、IL17Rb(也称为IL25的受体)、IL18、IL22、IL23、IL25、IL27、IL33、IL35、ITGB4(也称为b4整联蛋白)、ITK、KIR、LAG3、LAMP1、瘦素、LPFS2、MHC II类、NCR3LG1、KGZD、NTPDase-1、OX40、OX40L、PD-1H、血小板受体、PROM1、S152、SISP1、SLC、SPG64、ST2(也称为IL33的受体)、STEAP2、Syk激酶、TACI、TDO、T14、TIGIT、TIM3、TLR、TLR2、TLR4、TLR5、TLR9、TMEF1、TNFa、TFRSF7、Tp55、TREM1、TSLP(也称为IL7Ra的共受体)、TSLPR、TWEAK、VEGF、VISTA、Vstm3、WUCAM，以及XCR1(也称为GPR5/CCXCR1)、XCL1和XCL2。在一些实施方案中，一种或多种上述抗原靶标是人类抗原靶标。

在某些具体的实施方案中，本发明涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的结合部分，该结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:71、SEQID NO:131、SEQ ID NO:191；SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:192；SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:194；SEQID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195；SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:196；SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:197；SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:138、SEQID NO:198；SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:199；SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:200；SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:201。在一个优选的实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包含结合人CD47的结合部分，该结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。

双特异性抗CD47和抗CD38蛋白

具体地，结合人CD38的至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQID NO:80、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:200；SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:201；SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:202；SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:143、SEQID NO:203；SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:204；SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:205；SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:206；SEQ ID NO:87、SEQID NO:147、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:208；SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:209；SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:210；SEQID NO:91、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:211；SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:212；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:213；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:154、SEQID NO:214；SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:215；SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:216；SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:217；SEQ ID NO:98、SEQID NO:158、SEQ ID NO:218；SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:219；SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:220；SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:221；SEQID NO:102、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:222；SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223；SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:224；SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:165、SEQID NO:225；SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:226；SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:227；SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:228；SEQ ID NO:109、SEQID NO:169、SEQ ID NO:229；SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:230；SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:231；SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:232；SEQID NO:113、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:234；SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:235；SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:175、SEQID NO:236；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:238；SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:239；SEQ ID NO:120、SEQID NO:180、SEQ ID NO:240；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:242；SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:243；SEQID NO:124、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:244；SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:245；SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:246；SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:187、SEQID NO:247；SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:248；SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:249；SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:250；并且结合人CD47的至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:131、SEQID NO:191；SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:192；SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:193；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:194；SEQ ID NO:75、SEQID NO:135、SEQ ID NO:195；SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:196；SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:197；SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:198；SEQID NO:79、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:199；SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:200；SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:201。

更具体地，结合人CD38的至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:235；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；并且结合人CD47的至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。甚至更具体地，结合人CD38的至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；并且结合人CD47的至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。

在示例性实施方案中，本发明涉及双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分。结合人CD47的至少一个结合部分可以包含上文和段落“抗CD47结合蛋白”中描述的任何CDR组。结合人CD38的至少两个结合部分可以包含上文和段落“抗CD38结合蛋白”中描述的任何CDR组。

在某些实施方案中，至少两个CD38结合部分是单互补位的，即它们结合它们的抗原靶标的相同表位。在其他实施方案中，至少两个CD38结合部分是双互补位的，即它们结合它们的抗原靶标的不同表位。具体地，根据本发明的某些实施方案的抗体包含结合人CD38的至少两个结合部分：结合人CD38的第一表位的一个Fc近端结合部分和结合人CD38的第二表位的一个Fc远端结合部分。在具体的实施方案中，结合人CD38的至少两个结合部分中的至少一个包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:232；SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:235；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQID NO:237；SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241。在更具体的实施方案中，结合人CD38的至少两个结合部分中的至少一个包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；并且结合人CD38的至少两个结合部分中的至少一个包含CDR组SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237。在优选的实施方案中，结合人CD38的第一表位的Fc近端结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；并且结合人CD38的第二表位的Fc远端结合部分包含CDR组SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237。在更优选的实施方案中，结合人CD38的第一表位的Fc近端结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQ IDNO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；结合人CD38的第二表位的Fc远端结合部分包含CDR组SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；此外，上述双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。优选地，本发明的双特异性抗体包含结合人CD38的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:117、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:237；结合人CD38的至少一个第二结合部分，该至少一个第二结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223和SEQID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:241；以及结合人CD47的至少一个结合部分，该至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。

在本发明的某些实施方案中，双特异性抗体是全长抗体，其中结合人CD38的至少一个结合部分和/或结合人CD47的至少一个结合部分是Fab区。如本文所用，术语“Fab”或“Fab区”或“Fab结构域”包括包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的该区域，或者在全长抗体或抗体片段的情况下指该区域。本发明还提供了结合人CD38或人Cd47的抗体片段。抗体片段包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包括Fab'和Fab'-SH；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward ES等人,(1989)Nature,341:544-546)，其由单个可变结构域组成；(v)F(ab')2片段，一种包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，这允许两个结构域缔合形成抗原结合位点(Bird RE等人,(1988)Science 242:423-426；Huston JS等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii)“双抗体”或“三抗体”，通过遗传融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson I&Hollinger P(2000)Methods Enzymol.326:461-79；WO94/13804；Holliger P等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-48)；以及(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma MJ&Morrison SL(1997)Nature Biotechnology,15(2):159-163)。

在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分，并且它是包含选自包括SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、299的组的氨基酸序列的Fab；在具体的实施方案中，结合人CD47的Fab包含具有G65S突变(Kabat编号)的VH链，在更具体的实施方案中，结合人CD47的Fab包含SEQ ID NO:15或299的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含结合具有SEQ ID NO:15并且包含具有G65S突变(Kabat编号)的VH链的人CD47的至少一种Fab，具体地，本发明的双特异性抗体包含结合包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列的人CD47的至少一种Fab。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体包含结合人CD38的至少一个结合部分，并且是包含选自包括SEQ ID NO:22、23、24、25、26、U、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70的组的氨基酸序列的Fab。优选地，结合人CD38的Fab的氨基酸序列选自包括SEQ ID NO:43、52、55、57和61的组。

在本发明的具体实施方案中，双特异性抗体是使用先前描述的重链(Hc)异二聚化技术构建的(Skegro等人,(2017)J Biol Chem 292(23):9745-9759和Stutz等人,(2020)J Biol Chem 295(28):9392-9408,WO2012131555)，其中BEAT(A)链在本文中也称为BEAT(A)，并且BEAT(B)链在本文中也称为BEAT(B)。更具体地，BEAT(A)Hc包含具有突变G65S(Kabat编号)的VH结构域、CH1γ1区、γ1铰链区、γ1CH2区和与共同轻链(cLc)组装的基于γ3的BEAT(A)CH3结构域。BEAT(B)Hc包含VH结构域、CH1γ1区、γ1铰链区、γ1CH2区和与cLc组装的基于γ1的BEAT(B)CH3结构域。根据本发明，BEAT(A)重链(Hc)包含选自包括SEQ ID NO:259、274、276、280、281、283、285和278的组的氨基酸序列；BEAT(B)Hc包含选自包括SEQ ID NO:260、261、262、275、277、279、282、284、286、287、288、289、290、291、292和293的组的氨基酸序列。cLc包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在优选的实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包含：包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；包含SEQ ID NO:274的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ IDNO:277的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ IDNO:278的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:282的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQID NO:291的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQID NO:280的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc；或包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的BEAT(A)链、包含SEQ ID NO:293的氨基酸序列的BEAT(B)链和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc。在优选的实施方案中，本文公开的双特异性抗体包含结合CD47并包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的BAET(A)链；结合CD38并包含SEQ ID NO:292或293的氨基酸序列、更优选SEQ IDNO:293的氨基酸序列的BEAT(B)链；以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的cLc。

在某些方面，本发明公开了一种包含至少两个结合部分的双特异性抗体，该至少两个结合部分中的至少一个结合人CD38并且该至少两个结合部分中的至少一个结合人CD47，其中结合人CD47的至少一个结合部分对人CD47的亲和力低于结合人CD38的至少一个结合部分对人CD38的亲和力。具体地，结合人CD47的至少一个结合部分对人CD47的亲和力为约1000nM或更小、或约900nM或更小、或约800nM或更小、或约850nM或更小、或约700nM或更小、或约600nM或更小、或约500nM或更小、或约400nM或更小、或约300nM或更小、或约200nM或更小、或约150nM或更小、或约140nM或更小、或约130nM或更小、或约120nM或更小，优选约110nM或更小，更优选105nM或更小，例如约104nM；或优选介于约700nM和约1000nM之间，更优选介于约798nM和约958nM之间，更优选约878.3nM。具体地，结合人CD38的至少一个结合部分对人CD38的亲和力为约100nM或更小、或约50nM或更小、或约30nM或更小、或约20nM或更小、或约10nM或更小，优选约10nM或更小、约9nM或更小、约8nM或更小、约7nM或更小、约6nM或更小、约5nM或更小、约4nM或更小、约3nM或更小、约2nM或更小，优选约1nM或更小，例如约16.22nM、约17.6nM、约6.13nM、约2.3nM、约3.5nM、约0.55nM、约0.9nM。

本发明还公开了双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分，特别是双互补位双特异性抗体，其中Fc近端结合部分对人CD38的第一表位的亲和力与Fc远端结合部分对人CD38的第二表位的亲和力大致相同、或相同或不同。

核酸

标准重组DNA方法用于构建编码形成结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸掺入到重组表达载体中，并将此类载体引入宿主细胞中。参见例如Sambrook等人,2001,《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)(冷泉港实验室出版社，第3版)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。除非提供了具体定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关的命名法以及实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。类似地，常规技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者治疗。

本公开的其他方面涉及分离的核酸分子，其包含编码本文所述的任何结合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。

本公开的某些方面涉及多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸是载体(例如，表达载体)。该试剂盒尤其可用于产生本文所述的一种或多种结合蛋白，例如本公开的双特异性或三特异性结合蛋白。在一些实施方案中，试剂盒包含一种、两种、三种或四种多核苷酸。

在一些实施方案中，分离的核酸可操作地连接至异源启动子以指导结合蛋白编码核酸序列的转录。启动子可以指指导核酸转录的核酸控制序列。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与结合蛋白的编码序列可操作地连接。启动子的示例可以包括但不限于从病毒(诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子、异源真核启动子(诸如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等)、CAG启动子(Niwa等人,Gene 108(2):193-9,1991)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、四环素诱导型启动子(Masui等人.Nucleic Acids Res.33:e43,2005)、lac系统、tip系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子和酵母菌α-交配因子的启动子。编码本公开的结合蛋白的多核苷酸可以在组成型启动子、诱导型启动子或本文所述的任何其他合适的启动子或本领域技术人员容易识别的其他合适的启动子的控制下。

在一些实施方案中，将分离的核酸掺入载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体可以包含与待表达的多核苷酸可操作地连接的一个或多个调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。合适的增强子的示例可以包括但不限于来自哺乳动物基因的增强子序列(诸如珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、胰岛素等)和来自真核细胞病毒的增强子序列(诸如复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始点晚期侧的多瘤病毒增强子、腺病毒增强子等)。合适载体的示例可以包括例如质粒、粘粒、附加体、转座子和病毒载体(例如，腺病毒、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒载体等)。表达载体可用于转染宿主细胞，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

能够在宿主中表达和复制的生物学功能性病毒和质粒DNA载体是本领域已知的并且可用于转染任何感兴趣的细胞。

本公开的其他方面涉及一种载体系统，其包含编码本文所述的任何结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的一种或多种载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链的第一载体、编码结合蛋白的第二多肽链的第二载体、编码结合蛋白的第三多肽链的第三载体和编码结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链和第二多肽链的第一载体和编码结合蛋白的第三多肽链和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链和第三多肽链的第一载体和编码结合蛋白的第二多肽链和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链和第四多肽链的第一载体和编码结合蛋白的第二多肽链和第三多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体系统包含编码结合蛋白的第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链的第一载体。载体系统的一种或多种载体可以是本文所述的任何载体。在一些实施方案中，一种或多种载体是表达载体。

分离的宿主细胞

本公开的其他方面涉及分离的宿主细胞，其包含本文所述的一种或多种分离的多核苷酸、多核苷酸试剂盒、载体和/或载体系统。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫宿主细胞的示例可以包括例如果蝇细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾细胞(例如，High Five^TM细胞)和草地贪夜蛾细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的示例可以包括例如人胚肾细胞(例如，亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞)、Expi293TI\/l细胞、CHO细胞、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK、ATCC CCL 10)、小鼠塞尔托利细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76、ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA、ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK、ATCC CCL 34)、水牛

大鼠肝细胞(例如，BRL 3A、ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138、ATCC CCL75)、人肝细胞(例如，Hep G2、HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，MMT 060562、ATCCCCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝癌细胞系(例如，Hep G2)和骨髓瘤细胞(例如，NS0和Sp2/0细胞)。

本公开的其他方面涉及一种产生本文所述的任何结合蛋白的方法。在一些实施方案中，该方法包括a)在使得宿主细胞表达结合蛋白的条件下培养包含分离的核酸、载体和/或载体系统(例如，本文所述的任何分离的核酸、载体和/或载体系统)的宿主细胞(例如，本文所述的任何宿主细胞)；以及b)从宿主细胞分离结合蛋白。在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的。从培养的宿主细胞分离蛋白质的方法是本领域普通技术人员熟知的，包括例如通过亲和层析(例如，两步亲和层析，包括蛋白A亲和层析，然后是尺寸排阻层析)。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白通过蛋白A亲和层析纯化。

接头

在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4的范围为无氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸长，或少于100、50、40、30、20或15个氨基酸或更少。接头也可以是10、9、8、1、6、5、4、3、2或1个氨基酸长。一个结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以全部具有相同的氨基酸序列，或者可以全部具有不同的氨基酸序列。

合适的接头的示例包括单个甘氨酸(Gly)残基；双甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽；具有五个甘氨酸残基的肽；具有六个甘氨酸残基的肽；具有七个甘氨酸残基的肽；以及具有八个甘氨酸残基的肽。可以使用氨基酸残基的其他组合，诸如肽GGGT(SEQ IS NO:297)或GGGGS，或所述肽的重复，诸如肽GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO:298)。在优选的实施方案中，接头具有SEQ ID NO:298的氨基酸序列。

上文列出的示例不旨在以任何方式限制本公开的范围，并且包含选自由缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸组成的组的随机选择的氨基酸的接头已显示适用于结合蛋白。关于接头序列的其他描述，参见例如WO2012135345和国际申请号PCT/US2017/027488。

接头中氨基酸残基的同一性和序列可以根据接头中实现所必需的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头是最好的。如果需要更刚性和延伸的接头，甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的一些组合是有用的。任何氨基酸残基都可以被认为是与其他氨基酸残基组合的接头，以根据需要根据期望的性质构建更大的肽接头。

Fc区和恒定结构域

本发明还涉及一种包含Fc区的双特异性抗体。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含抗体片段，包括但不限于抗体F(ab)、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含含有Fc区的抗体片段，包括但不限于抗体F(ab)、F(ab')2、Fab'-SH、Fv或scFv片段。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含全长抗体重链或包含Fc区的多肽链。在一些实施方案中，Fc区是人Fc区，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区包括抗体铰链、CH1、CH2、CH3和任选的CH4结构域。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区包括本文所述的一种或多种突变。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包括一种或两种Fc变体。如本文所用，术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含补救受体FcRn(新生Fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性Fc变体以及它们与补救受体的相互作用是本领域已知的。因此，术语“Fc变体”可以包括从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的区域，因为它们提供了本发明的抗体样结合蛋白不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包括缺少一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基已被修饰的分子或序列，其影响或涉及：(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达时的N端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)结合补救受体以外的Fc受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

如本文所用，术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括随后被修饰以产生变体的未修饰的抗体。所述亲本抗体可以是天然存在的抗体、非天然存在的抗体或天然存在的抗体的变体或工程化形式。亲本抗体可以指抗体本身、包含亲本抗体的组合物或编码它的氨基酸序列。在本发明的优选实施方案中，亲本抗体包含Fc区。更具体地，根据本发明的亲本抗体的Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区；在一些实施方案中，根据本发明的亲本抗体的Fc区是修饰的或未修饰的IgG1 Fc区。

在某些方面，本发明的双特异性抗体包含变体Fc区，其相对于亲本抗体的Fc区包含至少一个氨基酸修饰，而包含变体Fc区的抗体与亲本抗体相比表现出改变的效应子功能。更具体地，Fc区的CH2结构域包含至少一个氨基酸修饰。

在本发明的具体实施方案中，双特异性抗体是使用先前描述的重链(Hc)异二聚化技术构建的(Skegro等人,(2017)J Biol Chem 292(23):9745-9759和Stutz等人,(2020)J Biol Chem 295(28):9392-9408,WO2012131555)，其中BEAT(A)链在本文中也称为BEAT(A)，并且BEAT(B)链在本文中也称为BEAT(B)，已被工程化以增加Fc效应子功能。更具体地，Fc区的CH2结构域已被工程化以包含至少一个氨基酸修饰。更具体地，BEAT(A)在选自包括以下项的组的位置处包含一个或多个取代：324、334、269、298、239、332和333；并且BEAT(B)在选自包括以下项的组的位置处包含一个或多个取代：324、334、269、298、239、332和333；优选包括324、334、269、289、298、333。甚至更具体地，BEAT(A)包含选自包括以下项的组的一个或多个取代：S324N、K334E、K334A、E269D、S298A、S239D、I332E和E333A；并且BEAT(B)在选自包括以下项的组的位置处包含一个或多个取代：S324N、K334E、K334A、E269D、S289A、K334A、E333A。在某些具体的实施方案中，BEAT(A)包含选自包括以下项的组的一组突变：S324N；或S324N和K334E；或E269D、S298A、S324N和K334A；或S239D、I332E和S324N；或E269D、S298A、S324N和E334A；或S298A、S324N和E333A；或S298A、S324N和K334A；或S324N、S298A、E269D和E333A；或S324N、S298A、E269D和K334A。在其他具体的实施方案中，BEAT(B)包含选自包括以下项的组的一组突变：S324N；或S324N和K334E；或E269D、S298A、S324N和K334A；或S239D、I332E和S324N；或E269D；或E269D、S298A、S324N和E334A；或S298A、S324N和E333A；或S298A、S324N和K334A；或S324N、S298A、E269D和E333A；或S324N、S298A、E269D和K334A。在某些优选的实施方案中，BEAT(A)和BEAT(B)包含突变S324N；或突变S324N和K334E；或突变E269D、S298A、S324N和K334A；或突变E269D、S298A、S324N和E334A；或突变S298A、S324N和E333A；或突变S298A、S324N和K334A；或突变S324N和K334E。在特别优选的实施方案中，BEAT(A)包含突变S239D、I332E和S324N，并且BEAT(B)包含突变S324N。

在一些实施方案中，Fc区包含减少或消除Fc区的Fc受体结合和/或效应子功能(例如，Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的一个或多个突变。

在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG1的位置234、235和/或329的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG1的位置298、299和/或300的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。

在一些实施方案中，Fc区是包含减少或消除Fcyl和/或Fcyll结合的一个或多个突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是包含减少或消除Fcyl和/或Fcyll结合但不影响FcRn结合的一个或多个突变的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG4的位置228和/或409的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG4的位置234和/或235的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是F234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG4的位置228、234、235和/或409的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228P、F234A、L235A和/或R409K。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG4的位置233-236的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236处的缺失。在一些实施方案中，Fc区是人IgG4 Fc区，其在对应于根据EU索引的人IgG4的位置228、233、236和/或409的取代处包含氨基酸突变。在一些实施方案中，氨基酸突变是S228P；E233P、F234V、L235A和在236处的缺失；和/或R409K。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以改进纯化，例如，通过调节对纯化试剂的亲和力。例如，已知如果异二聚体形式的两个Fc区中的一个含有减少或消除与蛋白A结合的突变，则异二聚体结合蛋白可以选择性地从它们的同二聚体形式中纯化出来，因为异二聚体形式对于基于蛋白A的纯化将具有比任一同二聚体形式中等的亲和力，并且可以例如通过使用不同的pH从蛋白A中选择性地洗脱(参见例如Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，突变在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处包含取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，该第二多肽链还包含与CH1连接的第一Fc区，该第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，该第三多肽链还包含与CH1连接的第二Fc区，该第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中第一Fc区和第二Fc区中的仅一个在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含结和孔突变以及一个或多个突变以改进纯化。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。

为了提高一些结合蛋白(例如，双特异性或三特异性结合蛋白)的产率，可以通过BEAT技术改变CH结构域，该BEAT技术在国际公开号WO2012131555中通过几个示例进行了详细描述。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以改进血清半衰期(参见例如Hinton,P R.等人(2006)J.Immunol.176(l):346-56)。在一些实施方案中，突变在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处包含取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，该第二多肽链还包含与CH1连接的第一Fc区，该第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，该第三多肽链还包含与CH1连接的第二Fc区，该第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，其中第一Fc区和/或第二Fc区在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置428和434的位置处包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是1714281和N434S。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含结和孔突变以及一个或多个突变以改进血清半衰期。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个突变以降低效应子功能，例如Fc受体介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，第二多肽链还包含与CH1连接的第一Fc区，该第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区；其中第三多肽链还包含与CH1连接的第二Fc区，该第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区；其中第一Fc区和第二Fc区是人IgG1 Fc区；并且其中第一Fc区和第二Fc区在对应于根据EU索引的人IgG1的位置234和235的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二多肽链和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，并且其中这些Fc区在对应于根据EU索引的人IgG1的位置234和235的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A和L235A。在一些实施方案中，第二多肽链还包含与CH1连接的第一Fc区，该第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区；其中第三多肽链还包含与CH1连接的第二Fc区，该第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定区；其中第一Fc区和第二Fc区是人IgG1 Fc区；并且其中第一Fc区和第二Fc区在对应于根据EU索引的人IgG1的位置234、235、和329的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二多肽链和第三多肽链的Fc区是人IgG1 Fc区，并且其中这些Fc区在对应于根据EU索引的人IgG1的位置234、235和329的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些实施方案中，第二多肽链和第三多肽链的Fc区是人IgG4 Fc区，并且这些Fc区在对应于根据EU索引的人IgG4的位置234和235的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A和L235A。在一些实施方案中，结合蛋白包含第二多肽链和第三多肽链，该第二多肽链还包含与CH1连接的第一Fc区，该第一Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，该第三多肽链还包含与CH1连接的第二Fc区，该第二Fc区包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且其中第一Fc区和第二Fc区在对应于根据EU索引的人IgG4的位置234和235的位置处各自包含氨基酸取代，其中氨基酸取代是F234A和L235A。

在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含结和孔突变以及一个或多个突变以降低效应子功能。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区是人IgG4 Fc区。对于位置329处的Fc突变的进一步描述，参见例如Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604和WO 1999051642。

结合蛋白的应用

结合蛋白可用于任何已知的测定方法，诸如竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法以及用于检测和定量一种或多种靶抗原的免疫沉淀测定法。结合蛋白将以适于所采用的测定方法的亲和力结合一种或多种靶抗原。

对于诊断应用，在某些实施方案中，结合蛋白可以用可检测部分标记。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S、1251、99Tc、U1In或67Ga；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

结合蛋白也可用于体内成像。可以将用可检测部分标记的结合蛋白施用于动物，优选施用到血流中，并测定标记抗体在宿主中的存在和位置。结合蛋白可以用在动物中可检测的任何部分标记，无论是通过核磁共振、放射学还是本领域已知的其他检测手段。

对于临床或研究应用，在某些实施方案中，结合蛋白可以与细胞毒性剂缀合。多种与细胞毒性剂偶联的抗体(即抗体-药物偶联物)已被用于将细胞毒性有效负载靶向特定肿瘤细胞。细胞毒性剂和将试剂与抗体缀合的接头是本领域已知的；例如参见parslow,A.C.等人(2016)Biomedicines 4:14和Kalim,M.等人(2017)Drug Des.Devel.Ther.11:2265-2276。

本公开还涉及包含结合蛋白和用于检测生物样品中靶抗原水平的其他试剂的试剂盒。这样的试剂可以包括可检测的标记物、封闭血清、阳性和阴性对照样品以及检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，该组合物包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体系统和/或宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。该容器装有组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合可有效治疗、预防和/或诊断病症，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，标签或包装说明书指示该组合物用于预防、诊断和/或治疗所选病症。或者或另外，制品或试剂盒还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户的角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

在一些实施方案中，将本公开的结合蛋白施用于需要其的患者以治疗或预防癌症。在一些实施方案中，本公开涉及预防和/或治疗增殖性疾病或病症(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的异二聚体抗体或与其相关的药物组合物。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的异二聚体抗体或与其相关的药物组合物用于预防和/或治疗有需要的患者的增殖性疾病或病症(例如，癌症)的用途。在一些实施方案中，本公开涉及本文所述的异二聚体抗体或与其相关的药物组合物，其用于制备用于预防和/或治疗有需要的患者的增殖性疾病或病症(例如，癌症)的药物。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，结合蛋白包含结合T细胞表面蛋白的抗原结合位点和结合人CD38多肽的胞外结构域的另一个抗原结合位点。在一些实施方案中，结合蛋白包含结合人CD38多肽的胞外结构域的抗原结合位点和结合人CD47多肽的抗原结合位点。

在一些实施方案中，癌症细胞在其细胞表面表达人CD38 1多肽(例如，包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列)。在一些实施方案中，癌症细胞表达人CD38同种型SEQ ID NO:295(人CD38同种型28907-1)、SEQ ID NO:294(人CD38同种型38907-2)、SEQ ID NO:296(人CD38同种型28907-E)。在一些实施方案中，基于癌症细胞表达人CD38同种型SEQ ID NO:295(人CD38同种型28907-1)、SEQ ID NO:294(人CD38同种型28907-2)、SEQ ID NO:296(人CD38同种型28907-E)来选择患者进行治疗。

在某些实施方案中，癌症选自包括以下项的组：用于治疗多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌诸如Her2+乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、高级别浆液性卵巢癌、腹膜癌。在具体的实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。已经测试了抗CD38抗体用于治疗多发性骨髓瘤，诸如达雷妥尤单抗，在本文中也称为和伊莎妥昔单抗。然而，虽然多发性骨髓瘤被认为是可治疗的，但几乎所有患者都不可避免地会复发，从而导致发展为治疗难治性疾病。在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，患者已经用先前的多发性骨髓瘤治疗进行了治疗。在一些实施方案中，将本公开的结合蛋白作为用于多发性骨髓瘤的第1线、第2线或第3线治疗施用于患者。

在某些实施方案中，具有结合CD47的至少一个结合部分的根据本发明的双特异性抗体允许阻断CD47与SIRPα之间的相互作用，避免由于CD47-SIRPα相互作用而传递“别吃我”信号，这抑制巨噬细胞吞噬作用。结合CD47的示例性临床基准单克隆抗体是莫洛利单抗，在本文中也称为5F9。在本发明中，术语“莫洛利单抗”和“5F9”可互换使用。在某些实施方案中，测试的分子是“59F样”(在本文中也称为“莫洛利单抗样”)抗体，其与临床莫洛利单抗分子相同，但它是内部生产的。在本发明中，术语“莫洛利单抗”、“5F9”、“59F样”和“莫洛利单抗样”是可互换的。更具体地，包含至少两个结合部分的双特异性抗体阻断CD47-SIRPα相互作用，并因此在表达CD38的细胞中选择性地阻断“别吃我”信号，该至少两个结合部分中的至少一个结合人CD38并且至少一个结合人CD47。

在某些实施方案中，与基准Darzalex和5F9相比，根据本发明的双特异性抗体在体外显示出与CD38高肿瘤细胞系(诸如Daudi、Raji、KMS-12-PE)的更高结合。在其他实施方案中，与Darzalex相比，根据本发明的双特异性抗体显示出与CD38低肿瘤细胞系(NCI-H929和KMS-12-BM)的更高结合。在某些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体在体外诱导表达CD38^高或CD38^低的肿瘤细胞的吞噬作用方面显示出与5F9相当的效率。在某些实施方案中，与Darzalex相比，根据本发明的双特异性抗体在体外显示出更高的CDC杀伤肿瘤细胞。在某些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体显示出通过ADCC对表达CD38^高或CD38^低的肿瘤细胞与通过Darzalex诱导的相当的杀伤，并且在体外对表达CD38^低的肿瘤细胞显示出更高的效力。在某些实施方案中，与Darzalex和5F9的组合相比，根据本发明的双特异性抗体在体外显示出更高的效力。

结合蛋白治疗组合物及其施用

包含结合蛋白的治疗或药物组合物在本公开的范围内。此类治疗或药物组合物可以包含治疗有效量的结合蛋白或结合蛋白-药物缀合物，其与根据施用模式而选择的药学上或生理学上可接受的制剂混合。可接受的制剂材料优选在使用的剂量和浓度下对接受者无毒。

药物组合物可以包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(诸如钠)、防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(诸如普郎尼克；PEG；山梨醇酯；聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨基丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙酸)、稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)、张力增强剂(诸如碱金属卤化物—优选氯化钠或氯化钾—或甘露糖醇山梨糖醇)、递送媒介物、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见例如《雷明顿药学》(REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES)(第18版，A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company 1990)及其后续版本，出于任何目的以引用方式并入本文)。

最佳药物组合物将由技术人员根据例如预期的给药途径、递送形式和期望的剂量来确定。此类组合物可影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性的或非水性的。例如，用于注射的合适媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。

其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可包含山梨糖醇或合适的替代物。在本公开的一个实施方案中，可以通过将具有所需纯度的所选组合物与冻干块或水溶液形式的任选制剂混合来制备用于储存的结合蛋白组合物。此外，可以使用合适的赋形剂诸如蔗糖将结合蛋白配制为冻干物。

本公开的药物组合物可以选择用于肠胃外递送或皮下递送。或者，可以选择用于吸入或通过消化道递送(诸如口服)的组合物。这种药学上可接受的组合物的制备在本领域技术范围内。

制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。例如，使用缓冲剂将组合物保持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

当考虑肠胃外施用时，所使用的治疗组合物可以是无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的期望的结合蛋白。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中将结合蛋白配制为无菌、等渗溶液，适当保存。

另一种制剂可涉及所需分子与试剂的制剂，该试剂诸如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体，该制剂提供产品的控制或持续释放，该产品然后可通过贮存注射递送。也可以使用透明质酸，这可以起到促进循环持续时间的作用。用于引入所需分子的其他合适的手段包括可植入药物递送装置。

在一个实施方案中，药物组合物可以配制用于吸入。例如，结合蛋白可以配制为用于吸入的干粉。结合蛋白吸入溶液也可以与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。在另一个实施方案中，溶液可以被雾化。

还考虑了某些制剂可以口服施用。在本公开的一个实施方案中，以这种方式施用的结合蛋白可以与或不与通常用于配制固体剂型诸如片剂和胶囊的那些载体一起配制。例如，胶囊可以设计成在生物利用度最大化和系统前降解最小化时在胃肠道中释放制剂的活性部分。可以包括另外的试剂以促进结合蛋白的吸收。也可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

另一种药物组合物可以包括有效量的结合蛋白与适于制备片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解在无菌水或另一种合适的载体中，可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

本公开的另外的药物组合物对于本领域技术人员而言将是显而易见的，包括涉及持续或控制递送制剂中的结合蛋白的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送方式的技术，诸如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和贮库注射剂，也是本领域技术人员已知的。缓释制剂的其他示例包括成型制品形式的半透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物还可以包括脂质体，其可以通过本领域已知的几种方法中的任一种来制备。

用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过经无菌过滤膜过滤来完成。当组合物被冻干时，使用该方法的灭菌可以在冻干和重构之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，肠胃外组合物通常被置于具有无菌入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。

一旦药物组合物已被配制，它可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式或以需要在施用前重构的形式(例如，冻干的)储存。

本公开还包括用于生产单剂量施用单位的试剂盒。试剂盒可各自包含具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。包含单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒也包括在本公开的范围内。

治疗上要使用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员应当理解，治疗的合适剂量水平将因此部分地根据递送的分子、使用结合蛋白的适应症、施用途径以及患者的体型(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)而变化。因此，临床医生可以滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。

施用频率将取决于所用制剂中结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医生将施用组合物直至达到实现期望效果的剂量。因此，组合物可以随着时间的推移以单次剂量、两次或更多次剂量(其可以含有或可以不含有相同量的期望分子)或通过植入装置或导管连续输注来施用。合适剂量的进一步细化由本领域普通技术人员常规地进行，并且在他们常规执行的任务范围内。可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定适当的剂量。

药物组合物的施用途径与已知方法一致，例如，

口服；通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过缓释系统；或通过植入装置。在需要时，组合物可以通过推注或通过输注连续施用，或通过植入装置施用。

组合物还可以通过植入膜、海绵或其他合适的材料来局部施用，在这些材料上已经吸收或包封了所需分子。在使用植入装置的情况下，该装置可以植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以通过扩散、定时释放推注或连续施用。

本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的多发性骨髓瘤的方法。该方法采用以这样的方式与CD47和CD38共接合的异二聚体，以便将恶性细胞与T细胞瞬时连接，从而诱导T细胞介导的对结合恶性细胞的杀伤。本文所述的方法利用以这样的方式结合CD47和CD38的异二聚体抗体，以便最大限度地破坏靶细胞，同时减少不想要的副作用(例如，不受控制的细胞因子释放)。

治疗方案

将异二聚体抗体施用于有需要的受试者，例如患有多发性骨髓瘤诸如复发性/难治性多发性骨髓瘤的人类受试者。复发性骨髓瘤的特征是在先反应后疾病的复发。指示该疾病的实验室和放射学标准的示例包括但不限于血清或尿液单克隆蛋白(M-蛋白)增加>25％，或涉及和不涉及的血清游离轻链分别从最低点或新的浆细胞瘤或高钙血症的发展之间差异>25％。Sonneveld等人,Haematologica.2016年4月；101(4):396-406。

在非分泌性疾病患者中，复发的特征在于骨髓浆细胞的增加。复发性疾病的信号的特征还在于一种或多种CRAB标准的出现或再次出现或快速且一致的生化复发。难治性骨髓瘤是对治疗没有反应的骨髓瘤。复发性/难治性多发性骨髓瘤是指在先前对先前疗法至少获得最小反应的患者中，在疗法后或在上一次治疗的60天内变得无反应或进展的疾病。Sonneveld，同上；Anderson等人，Leukemia.2008；22(2):231-239。

本公开的方法包括向受试者施用约0.05mg至约200mg的剂量的异二聚体抗体。在各种实施方案中，该剂量为约0.5mg至约200mg、约0.5mg至约150mg、约1mg至约150mg、约10mg至约100mg、约10mg至约200mg、约4mg至约200mg、约12mg至约200mg、约12mg至约100mg、约36mg至约200mg、约36mg至约100mg或约100mg至约200mg。在该方法的各个方面，向受试者施用的剂量为约0.05mg、约0.15mg、约0.45mg、约1.35mg、约4mg、约12mg、约36mg、约100mg或约200mg。

在另选的方面，异二聚体抗体的单次剂量为至少约0.05mg、至少约0.15mg、至少约0.45mg、至少约1.35mg、至少约4mg、至少约12mg、至少约36mg或至少约100mg。在各个方面，异二聚体抗体的单次剂量不超过约200mg(例如，不超过约100mg或不超过约36mg)。应当理解，单次剂量可以通过多次施用(即，分次剂量)施用，使得多次施用组合为本文所述的剂量。例如，多次施用(例如，两次或更多次注射)组合为至少约0.05mg、至少约0.15mg、至少约0.45mg、至少约1.35mg、至少约4mg、至少约12mg、至少约36mg或至少约100mg。在各个方面，单次剂量的异二聚体抗体的多次施用组合为不超过约200mg(例如，不超过约100mg或不超过约36mg)。

在该方法的各个方面，在治疗过程中调整剂量。例如，在一次或多次施用中向受试者施用初始剂量，并且在一次或多次后续施用中使用更高的剂量。换句话说，本公开考虑在治疗过程中增加异二聚体抗体的剂量至少一次。或者，可以在治疗过程中减少剂量，使得异二聚体抗体的量随着治疗的进行而减少。

本公开考虑了一种方法，其中在治疗期间施用多个(即，两个或更多个)剂量的异二聚体抗体。单个剂量可以以任何间隔施用，诸如每周一次、每周两次、每周三次、每周四次或每周五次。单个剂量可以每两周、每三周或每四周施用一次。换句话说，在一些方面，在向受试者施用异二聚体抗体之间经历了至少两周的等待期。剂量施用之间的等待时间在整个治疗期过程中无需保持一致。换句话说，可以在治疗过程中调整剂量之间的间隔。在一些方面，该方法包括在治疗的第一周和第二周每周向受试者施用两个剂量的异二聚体抗体(即，对于第1周和第2周每周两次)，在治疗的第三周和第四周每周向受试者施用一个剂量的异二聚体抗体(即，对于第3周和第4周每周一次)，以及从第5周开始至治疗结束每两周施用一个剂量的异二聚体抗体(即，在从第5周开始至治疗结束的剂量之间有两周的等待期)。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但第一次施用的剂量之间的较短间隔(例如，每周两次剂量)促进了快速的靶细胞清除。如本文所述增加剂量之间的间隔维持细胞清除，同时最小化与免疫疗法相关的不需要的副作用。

或者，在各个方面，该方法包括在治疗的第1-4周每周施用一个剂量的异二聚体抗体，并且任选地从第5周开始至治疗结束每两周施用一个剂量的异二聚体抗体。

在例如三个月至约18个月、或约三个月至约12个月、或约三个月至约九个月、或约三个月至约六个月、或约三个月至约八个月、或约六个月至约18个月、或约六个月至约12个月、或约八个月至约12个月、或约六个月至约八个月、或约八个月至约12个月(例如，约八个月)的治疗期间内施用多个剂量的异二聚体抗体。任选地，在约12周至约52周或约12周至约36周或约24周至约32周的治疗期内施用多个(即，两个或更多个)剂量的异二聚体抗体，其中剂量施用为每周两次、每周一次、每两周一次或每四周一次。

“治疗”多发性骨髓瘤是指实现对该疾病的任何积极治疗反应。例如，积极的治疗反应包括疾病的以下一项或多项改善：(1)肿瘤细胞数量减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(4)减少肿瘤细胞产生的副蛋白；(5)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)肿瘤生长；(6)提高患者存活率；以及(7)与疾病或病症相关的一种或多种症状的一些缓解。可以使用筛选技术诸如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线照相成像、计算机断层摄影(CT)扫描、骨骼扫描成像、内窥镜检查和包括骨髓穿刺(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数的肿瘤活检采样来评估肿瘤反应的肿瘤形态(即，总肿瘤负荷、肿瘤大小等)的变化。不需要完全的治疗反应(即，没有临床上可检测的疾病，任何先前异常的放射照相研究、骨髓和脑脊液(CSF)或异常的单克隆蛋白正常化)；考虑了任何程度的改善。实施例中列出了与疾病治疗和改善相关的各种附加参数。

可以通过任何合适的方式将异二聚体抗体施用于受试者，例如，通过静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内、脑内、腹膜内、脑脊髓内、皮内、皮下、关节内、滑膜内、口服、局部或吸入途径。例如，异二聚体抗体可以作为大丸剂通过静脉施用或通过在一段时间内连续输注施用。在多个方面，该方法包括在约30分钟至约四小时的时间内通过静脉内输注施用异二聚体抗体。任选地，在随后的施用中减少输注时间。例如，在一个实施方案中，在约四小时的时间内施用第一剂量的异二聚体抗体，并且在两小时或更短的时间内施用随后的剂量。在这方面，任选地在约四小时内施用第一剂量的异二聚体抗体，任选地在约两小时内施用第二剂量的异二聚体抗体，并且任选地在约30分钟内施用随后的剂量。

在一些情况下，受试者先前已接受过多发性骨髓瘤治疗。例如，受试者可能先前已施用免疫调节药物(沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)、蛋白酶体抑制剂(诸如泊马度胺、硼替佐米或卡非佐米)、地塞米松、多柔比星或它们的组合。

任选地，受试者先前用抗CD38单特异性抗体如达雷妥尤单抗治疗。在各种实施方案中，受试者是复发的或用先前的抗CD38单特异性抗体治疗难治的。当患者已用抗CD38单特异性抗体治疗时，优选在足以将抗CD38单特异性抗体的全身浓度降低至0.2pg/ml或更低的清除期后施用初始剂量的异二聚体抗体。换句话说，该方法包括在先前施用抗CD38单特异性抗体和施用异二聚体抗体之间的等待期。在各种实施方案中，该方法包括在施用初始剂量的异二聚体抗体之前停止用抗CD38单特异性抗体治疗至少12周(例如，约13至约15周)。

组合疗法

任选地，异二聚体抗体是治疗方案的一部分，该治疗方案包括施用一种或多种其他治疗剂、放射疗法、干细胞移植等。

本公开的方法任选地还包括向受试者施用地塞米松。地塞米松可以通过任何途径施用，诸如本文所述的途径。优选地，地塞米松静脉内或口服施用。当静脉内施用地塞米松时，任选地在施用异二聚体抗体前一小时内将其施用于受试者。地塞米松任选地以约8mg或约4mg的量施用。

在各种实施方案中，本公开的方法还包括施用化疗剂。DNA损伤化疗剂的非限制性示例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康、拓扑替康、喜树碱及其类似物或代谢物，以及多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；烷化剂(例如，美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲菌素、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基生成剂，诸如博来霉素；以及核苷模拟物(例如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、

巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和羟基脲)。

破坏细胞复制的化疗剂包括：紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春新碱、长春花碱和相关类似物；沙利度胺、来那度胺和相关类似物(例如，CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、CEP-18770、MGIBZ、肽乙烯基砜、肽环氧酮(诸如环氧霉素和卡非佐米)、β-内酯抑制剂(诸如乳胞素、MLN 519、NPI-0052、Salinosporamide A)、产生与金属的二硫代氨基甲酸酯络合物的化合物(诸如双硫仑)和某些抗氧化剂(诸如表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、儿茶素-3-没食子酸酯和Salinosporamide A)；NF-kB抑制剂，包括IKB激酶的抑制剂；与在癌症中过表达的蛋白质结合从而下调细胞复制的抗体(例如，曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗和贝伐单抗)；以及已知在癌症中上调、过表达或激活的蛋白质或酶的其他抑制剂，其抑制下调细胞复制。

治疗方案可包括施用其他抗体治疗剂，诸如埃罗妥珠单抗(针对SLAMF7的人源化单克隆抗体；Tai等人,Blood,2008；112:1329-37)；

靶向CD38的达雷妥尤单抗、MOR202和伊莎妥昔单抗；靶向CD138的nBT062-SMCC-DMI、nBT062-SPDB-DM4和nBT062-SPP-DMI；靶向CD40的卢卡木单抗(也称为HCD122)和达西组单抗(也称为SGN-40)；靶向CD56的洛沃妥珠单抗。关于用于治疗多发性骨髓瘤的抗体疗法的综述，参见例如Tandon等人,Oncology&Hematology Review,2015；11(2):115-21和Sondergeld等人,Clinical Advances in Hematology&Oncology,2015；13(9),599，两者均以引用方式并入。

在一些实施方案中，在用(硼替佐米)、Thalomid^TM(沙利度胺)、Aredia^TM(帕米膦酸盐)或Zometa^TM(唑来膦酸)治疗之前、同时或之后施用异二聚体抗体。

所有引用的参考文献均以引用方式以其整体明确地并入本文。尽管上文出于说明的目的描述了本发明的具体实施方案，但本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以对细节进行多种变化。

附图说明

图1.通过Octet Bio-Layer干涉测量法评估抗CD47-H2 Fab与人CD47结合后对人CD47/人SIRPα相互作用的阻断。将生物素化人CD47-avi-his蛋白加载到链霉亲和素SA生物传感器上。将抗CD47-H2 Fab以1μM注射到固定化人CD47的动力学缓冲液中以达到表面的饱和。然后，将1μM抗CD47 Fab和2μM最终浓度的人SIRPα的预混合溶液注射到饱和表面上。图中示出了作为波长偏移(以nm计；Y轴)与时间(X轴)的关系的与传感器尖端的结合。用Fab克隆名称标记曲线。

图2.使用Octet Bio-Layer干涉测量法的抗CD38-E2和抗CD38-B6克隆与人CD38的表位分箱，将生物素化人CD38-avi-his蛋白加载到链霉亲和素SA生物传感器上。将抗CD38-E2 Fab以200nM注射到固定化人CD38的动力学缓冲液中以达到表面的饱和。然后，将200nM最终浓度的抗CD38-E2Fab和抗CD38-B6 Fab的预混合溶液分别注射到饱和表面上。使用抗CD38-H5 Fab代替抗CD38-B6 Fab进行相同的实验程序，作为竞争性对照。图中示出了作为波长偏移(以nm计；Y轴)与时间(X轴)的关系的与传感器尖端的结合。用竞争Fab克隆名称标记曲线。

图3.BEAT CD38/CD47双特异性抗体的示意图。A(-)表示没有PA结合位点，而A(+)表示存在PA结合位点。

图4.对Daudi细胞的CDC测定将Fc工程化变体与非增强对照进行比较。

图5.对Raji细胞的ADCP测定将Fc工程化变体与非增强对照进行比较。通过非增强型BEAT CD38/CD47-19吞噬作用的平均倍数变化绘制一条水平线，以可视化Fc工程化对ADCP效力的影响。

图6.“2+1”BEAT CD38/CD47双特异性抗体的示意图。“2+1”BEAT双特异性抗体类似于“1+1”形式的那些进行工程化。“Fc远端”抗CD38 Fab结构域与“Fc近端”抗CD38 Fab的VH结构域的N端融合。

图7.对Daudi细胞的CDC测定比较了“2+1”和“1+1”形式的CD38/CD47 BEAT抗体。图8.对Raji细胞的ADCP测定比较了“2+1”和“1+1”形式的CD38/CD47 BEAT抗体。

通过非增强型“1+1”BEAT CD38/CD47-19吞噬作用的平均倍数变化绘制一条水平线，以可视化“2+1”形式和Fc工程化对ADCP效力的影响。

图9.CDC、ADCC和ADCP测定比较了BEAT CD38/CD47-42、-48和-60。

图10.通过DSC的CD38/CD47双特异性抗体的热稳定性分析。A，BEAT CD38/CD47-42。B，BEAT CD38/CD47-48。C，BEAT CD38/CD47-60。

图11.通过流式细胞术对一组淋巴瘤Daudi(A)和Raji(B)以及多发性骨髓瘤细胞KMS-12-PE(C)、NCI-H929(D)和KMS-12-BM(E)评估BEAT CD38/47-48和60的结合。与基准相比，BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60显示出对具有不同CD38和CD47表达水平的肿瘤细胞系的优异的剂量依赖性结合。

图12.(A)BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60阻断CD47/SIRPα相互作用，与高亲和力抗CD47抗体基准相比，同种型对照背景显示为虚线；(B)最大CD47/SIRPα抑制和EC50的累积分析。

图13.用CD38^高(Daudi)或CD38^低(KMS12-BM)肿瘤细胞进行ADCP测定。(A-C)Daudi(A)或KMS12-BM(C)肿瘤细胞吞噬作用的两条代表性曲线。重复的平均值+/-标准偏差(SD)。(B-D)多个实验Daudi(B)或KMS12-BM(D)肿瘤细胞中最大吞噬作用和EC50的累积分析。表示n＝9次实验的平均值+/-SD。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

图14.用CD38^低(KMS12-BM)肿瘤细胞进行ADCP测定。(A)分子结构和Fab臂亲和力的示意图。(B-C)KMS12-BM肿瘤细胞的多个实验中最大吞噬作用(B)和EC50(C)的累积分析。表示n＝7次实验的平均值+/-SD。

图15.用CD38高表达肿瘤细胞(Daudi)进行CDC测定。(A)特异性杀伤的代表性曲线。重复的平均值在本文中表示为+/-标准偏差(SD)。(B)多个实验中最大杀伤和EC50的累积分析。表示n＝5次实验的平均值+/-SD。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

图16.用CD38^高(Raji)或CD38^低-int(NCl-H929)肿瘤细胞进行ADCC测定。(A-C)Raji(A)或NCI-H929(C)肿瘤细胞特异性杀伤的两条代表性曲线。重复的平均值+/-标准偏差(SD)。(B-D)多个实验Raji(B)或NCI-H929(D)肿瘤细胞中ADCC最大杀伤和EC50的累积分析。(Daudi)。表示n＝3次实验的平均值+/-SD。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

图17.用CD38^低-int(NCl-H929)肿瘤细胞进行MMoAK测定。(A)测定的示意图，(B)通过MMoAK杀伤肿瘤细胞的代表性曲线。重复的平均值+/-标准偏差(SD)。(C-D)在使用CD38^低-int(NCl-H929)作为靶细胞的多个实验中的最大杀伤(C)和EC50(D)的累积分析。表示n＝9次实验的平均值+/-SD。ADCC＝抗体依赖性细胞毒性；ADCP＝抗体依赖性细胞吞噬作用；CDC＝补体依赖性细胞毒性；ADCP＝抗体依赖性细胞吞噬作用；CDC＝补体依赖性细胞毒性。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

图18.在抗原库存在的情况下，用CD38^低-int(NCI-H929)肿瘤细胞进行MMoAK测定。(A-D)在存在5百万个/ml RBC(A-C)或2.8ng/ml sCD38(B-D)作为抗原库的情况下，使用CD38^低-int(NCI-H929)在多个实验中对最大杀伤(A-B)和EC50(C-D)进行累积分析。表示n＝3-5次实验的平均值+/-SD。统计：配对T检验。NS＝不显著，RBC＝红细胞；sCD38＝可溶性CD38。

图19.(A-B)用CD38^低-int(NCI-H929)肿瘤细胞进行MMoAK测定。(A)肿瘤细胞吞噬作用的代表性曲线和(B)多个实验中最大吞噬作用和EC50的累积分析。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

图20.(A-C)代表性实验示出了Raji-CD47KO细胞中(A)Darzalex(AF647缀合)、(B)BEAT 38/47-60(AF488缀合)或(C)缀合Darzalex和BEAT 38/47-60的混合物的结合。(D)在Raji-CD47KO细胞中与由对照抗体(Cntrl IgG1)、Darzalex或BEAT 38/47-60纯化的抗体介导的BEAT 38/47-60(AF488缀合)的竞争百分比。

图21.(A-B)用CD38^高(Daudi)或CD38^低(KMS12-BM)肿瘤细胞进行ADCP测定。Daudi(A)或KMS12-BM(B)肿瘤细胞吞噬作用的两条代表性曲线以及多个实验Daudi(A)或KMS12-BM(B)肿瘤细胞中最大吞噬作用和EC50的累积分析。(C-D)用CD38^高(Raji)或CD38^低-int(NCI-H929)肿瘤细胞进行ADCC测定。Raji(C)或NCI-H929(D)肿瘤细胞特异性杀伤的两条代表性曲线。图中示出了多个实验中ADCC最大杀伤和EC50的累积分析。(E-F)用CD38^高表达肿瘤细胞(Daudi)进行CDC测定。(E)特异性杀伤的代表性曲线和(F)多个实验中最大杀伤和EC50的累积分析。重复的平均值在所有代表性曲线图中表示+/-标准偏差。

图22.(A)通过流式细胞术分析的人类健康供体RBC中的代表性非线性S形回归结合曲线(相对几何平均荧光强度)(n＝6)。(B)通过库姆斯测定法测量的血细胞凝集(n＝6)。在离心后凝集程度评分为0(无凝集)至4(完全凝集)。(C)使用血液分析仪(Sigma 5H)在内部评估的RBC耗竭的诱导。(D)通过使用光谱法测量血浆中血红蛋白在414nm处的吸光度来定量溶血。结果在GraphPad Prism软件中对无抗体处理条件(阴性对照)和triton X-100(阳性对照)进行归一化。(E)通过流式细胞术分析的相对于LeoA1阳性对照的血小板聚集。

图23.在门控细胞类型后通过流式细胞术分析的人类健康供体中的代表性非线性S形回归结合曲线(相对几何平均荧光强度)，如每张图所示：(A)CD8+T细胞，(B)CD4+T细胞，(C)B细胞，(D)粒细胞和(E)髓样细胞。对六个不同供体评估了结合。

图24.BEAT CD38/47-48在10mg/kg的治疗性治疗中控制了Raji肿瘤生长。A.皮下异种移植Raji肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-48(深灰色)、1mg/kg的BEATCD38/47-48(灰色)、0,1mg/kg的BEAT CD38/47-48(浅灰色)处理的小鼠(n＝5只小鼠/组)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.第27天的肿瘤体积(+/-SEM)。Raj_9研究。

图25.BEAT CD38/47-60在10mg/kg的治疗性治疗中控制了Raji肿瘤生长。A.皮下异种移植Raji肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-60(深灰色)、1mg/kg的BEATCD38/47-60(灰色)、0,1mg/kg的BEAT CD38/47-60(浅灰色)处理的小鼠(n＝5只小鼠/组)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.在第Tl天的肿瘤体积(+/-SEM)。Raj_9研究。

图26.BEAT CD38/47-48在治疗性治疗中控制了Raji肿瘤生长。A.皮下异种移植Raji肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-48(深灰色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-59(灰色)和Darzalex(正方形-虚线)处理的小鼠(n＝10只小鼠/组；5只小鼠在第15天后用于离体研究)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.第36天的肿瘤体积(+/-SEM)，进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett事后多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。Raj_10研究。

图27.BEAT CD38/47-60在治疗性治疗中控制了Raji肿瘤生长。A.皮下异种移植Raji肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-60(深灰色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-79(灰色)和Darzalex(正方形-虚线)处理的小鼠(n＝10只小鼠/组；5只小鼠在第15天后用于离体研究)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.第36天的肿瘤体积(+/-SEM)，进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett事后多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。Raj_10研究。

图28.BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60在治疗性治疗中控制了Raji肿瘤生长。A.皮下异种移植Raji肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-48(深灰色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-60(灰色)和Darzalex(正方形-虚线)处理的小鼠(n＝10只小鼠/组；5只小鼠在第15天后用于离体研究)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.第36天的肿瘤体积(+/-SEM)，进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett事后多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。Raj_10研究。

图29.肿瘤中的IL-1b水平和MHCII+巨噬细胞。异种移植16天后，每组处死5只动物。收集小鼠血清和肿瘤并通过Luminex(A)和FACS(B)进行离体分析。BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60显示了肿瘤中IL-1b水平降低的趋势(A)。BEAT CD38/CD47-60显示了肿瘤中MHCII+巨噬细胞的显著减少(B)。进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett事后多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。Raj_10研究。

图30.BEAT CD38/47-48在10mg/kg的治疗性治疗中控制了KMS-IZ-BM肿瘤生长。A.皮下异种移植KMS-IZ-BM肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-48(深灰色)、1mg/kg的BEAT CD38/47-48(灰色)、0,1mg/kg的BEAT CD38/47-48(浅灰色)和Darzalex(正方形-虚线)处理的小鼠(n＝5只小鼠/组)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.在第37天随机分配后的肿瘤生长(ΔT)(+/-SEM)。进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett多重比较检验用于多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。KMS_7研究。

图31.BEAT CD38/47-60在10mg/kg的治疗性治疗中控制了KMS-IZ-BM肿瘤生长。A.皮下异种移植KMS-12-BM肿瘤并用PBS(黑色)、10mg/kg的BEAT CD38/47-60(深灰色)、1mg/kg的BEAT CD38/47-60(灰色)、0,1mg/kg的BEAT CD38/47-60(浅灰色)和Darzalex(正方形-虚线)处理的小鼠(n＝5只小鼠/组)中随时间的肿瘤生长(+/-SEM)。当肿瘤达到约100mm3时施用治疗。B.在第37天随机分配后的肿瘤生长(ΔT)(+/-SEM)。进行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett多重比较检验用于多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。显著性水平用星号表示。KMS_7研究。

实施例1：抗CD47抗体的产生

材料和方法

重组抗原

由Twist Biosciences(San Francisco,USA)合成编码全长人CD47(UniProt登录号：Q08722；SEQ ID NO:7)和全长食蟹猴CD47(登录号：A0A2K5X4I2，SEQ ID NO:8)的人密码子优化序列。将人CD47(残基19至141；SEQ ID NO:3)和食蟹猴CD47(残基19至141；SEQ IDNO:4)的可溶性胞外区克隆到经修饰的pcDNA^TM3.1质粒(ThermoFisher Scientific，目录号：V79020)中，以产生这样的蛋白质，其具有C-末端Avitag^TM(Avidity LLC)，随后是10-His标签，在两个标签之间具有Gly₃接头序列(缩写为人CD47-ECD-Avi-His和食蟹猴CD47-ECD-Avi-His)。对于人和食蟹猴蛋白，将位于位置33处的半胱氨酸突变为丝氨酸以防止多聚化。表达载体携带驱动产物分泌的鼠VJ2C前导肽以及OriP序列。对于蛋白质表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将编码人CD47-ECD-Avi-His和食蟹猴CD47-ECD-Avi-His(残基19至141；分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)的质粒和非编码质粒共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL standards；目录号：CRL-10852)中。简言之，在补充有0.1％Pluronic F-68(Gibco)的RPMI 1640(Biowest)中以8百万个细胞/ml制备细胞。然后在37℃处用DNA-PEI混合物转染细胞。转染后四小时，将细胞培养物在补充有酚红和4mM L-谷氨酰胺的293(Sigma Aldrich)中以1:1稀释，并在37℃、5％ CO2和80％湿度处在轨道振荡下温育5天。表达后，通过离心和过滤制备澄清的上清液，使用1M氢氧化钠将pH调节至7.4(4℃)。将Ni-Sepharose Excell珠(GE Healthcare)添加到澄清的上清液中，并在温和搅拌下在4℃处温育过夜。接着，将混合物装载到Econo柱(Bio-Rad Laboratories)上用于重力流动纯化。首先在pH 7.4的1X PBS(10CV)中洗涤珠，然后在补充有20mM咪唑的1XPBS(10CV)中洗涤珠，用500mM咪唑(9×1CV)的单个洗脱步骤洗脱蛋白质，或者按照分步洗脱方案依次使用补充有40mM(9×1CV)、80mM(11×1CV)、250mM(5×1CV)和500mM(3×1CV)咪唑的pH 7.4的1X PBS洗脱蛋白质。合并级分，并用1X PBS，pH 7.4在4℃处透析两次。通过SDS-PAGE、SE-HPLC、内毒素测量和SPR评估蛋白质质量，如上所述。如本文所述的人和食蟹猴CD47-ECD-Avi-His标记的融合蛋白分别具有SEQ ID NO:3和4。

由Twist Bioscience合成编码全长人SIRPα(UniProt登录号：P78324-2)的人密码子优化序列。将人SIRPα(残基31至352；SEQ ID NO:9)的可溶性胞外区克隆到经修饰的pcDNA^TM3.1质粒(ThermoFisher Scientific，目录号：V79020)中，以产生这样的蛋白质，其具有C-末端Avitag^TM(Avidity LLC)，随后是10-His标签，在两个标签之间具有Gly₃接头序列(缩写为人SIRPα-ECD-Avi-His)。表达载体携带驱动产物分泌的鼠VJ2C前导肽以及OriP序列。对于蛋白质表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将编码人SIRPα-ECD-Avi-His(残基31至352；SEQ ID NO:9)的质粒和非编码质粒共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL standards；目录号：CRL-10852)中，如上所述。表达后，将Ni-Sepharose Excell珠(GE Healthcare)添加到澄清的上清液中，并在温和搅拌下在4℃处温育过夜。接着，将混合物装载到Econo柱(Bio-Rad Laboratories)上用于重力流动纯化。首先在1X PBS、pH 7.4(10CV)中洗涤珠，然后在补充有20mM咪唑(10CV)的1X PBS中洗涤，并在500mM咪唑(6×2CV)下用单个洗脱步骤洗脱蛋白质。在PD-10柱(GE)上将缓冲液更换为1X PBS、pH 7.4。通过SDS-PAGE、SE-HPLC、内毒素测量和SPR评估蛋白质质量，如上所述。如本文所述的人SIRPα-ECD-Avi-His标记的融合蛋白具有SEQ ID NO:9。

重组细胞系

将全长人CD47(UniProt序列ID Q08722；残基1-323；SEQ ID NO:7)和全长食蟹猴CD47(登录号A0A2K5X4I2；残基1-323；SEQ ID NO:8)的人密码子优化序列克隆到经修饰的pcDNA^TM3.1质粒(ThermoFisher Scientific，目录号：V79020)中。该载体还含有增强的绿色荧光蛋白(eGFP)和嘌呤霉素抗性基因(具有插入的核糖体内进入位点(IRES)元件)。对于蛋白质表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将上述质粒转染到悬浮适应的CHO-S细胞(cGMP banked,Invitrogen，目录号：A1136401)中。简言之，在CD CHO(Gibco)中以2百万个细胞/ml制备细胞。然后在37℃处用DNA-PEI混合物转染细胞。转染后四小时，将细胞培养物在补充有4mM L-谷氨酰胺的PowerCHO 2(Lonza)中以1:1稀释，并在37℃、5％ CO2和80％湿度处在轨道振荡下温育。通过用荧光显微镜监测eGFP报告蛋白的表达来评估靶抗原的表达。如本文所述的人和食蟹猴CD47蛋白分别具有SEQ ID NO:7和8。

文库生成

本文所用的文库来自合成来源，其多样性限于重链(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和固定的VK3-15/JK1轻链(SEQ ID NO:10)。该文库含有基于VH1-69、VH3-23、VH3-15和VH3-53抗体种系的4个不同的子文库。已经使用三聚体寡核苷酸将CDR随机化。为每个子文库设计用于使CDR-H1和CDR-H2多样化的引物，并分别编码Kabat残基27-35和50-58处的种系特异性天然存在的多样性。使用编码15个CDR-H3长度(6-20)和Kabat残基95-102处的长度特异性天然存在的多样性的寡核苷酸库将CDR-H3随机化。将多样化的scFv片段合并以模拟天然CDR-H3长度分布并克隆到pNGLEN(内部修饰的pUC119噬菌粒载体)中，并将所得连接反应物电穿孔到大肠杆菌TG1细胞中。每个子文库具有介于1.2×10¹⁰和1.7×10¹⁰之间的多样性，四个子文库达到5.6×10¹⁰的总多样性。

文库选择

每个子文库单独选择或作为库选择。第一种淘选策略包括使用重组人CD47蛋白进行两轮选择，然后使用表达CD47的食蟹猴CHO细胞进行2轮选择。第二种淘选策略包括使用重组人CD47蛋白进行一轮选择，然后使用表达CD47的人CHO细胞进行3轮选择。第三种淘选策略包括使用表达人CD47的CHO细胞进行一轮选择，然后使用重组人CD47蛋白进行3轮选择。

对于使用重组蛋白的淘选策略，将纯化的噬菌体颗粒(10¹²个噬菌体形成单位)和磁性Dynabeads^TMMyOne^TM链霉亲和素C1珠(Invitrogen，目录号：65002)用含有3％(w/v)脱脂乳(3％ MPBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)在室温(RT)处封闭1小时。将噬菌体在室温处针对预先封闭的珠取消选择1小时。将取消选择的噬菌体与内部产生的100nM生物素化重组人CD47-avi-his蛋白(SEQ ID NO:3)在室温处温育2小时。将抗原结合噬菌体在室温处捕获在链霉亲和素珠上30分钟，并用含有0.1％(v/v)Tween的PBS(PBS-Tween 0.1％)洗涤珠五次，并用PBS洗涤两次。将噬菌体在室温处用100mM三乙胺洗脱10分钟，并使用Tris-HCl 1M pH8中和。使用洗脱的噬菌体来感染10ml指数生长的大肠杆菌TG1细胞。使感染的细胞在2YT培养基中在37℃和100转/分钟(RPM)下生长1小时，然后铺展在2YTAG(补充有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2TY培养基)琼脂板上并在30℃处温育过夜(ON)。将菌落从板上刮下到10ml 2YT中并添加15％甘油(v/v)，在-80℃处储存。使来自甘油储备液的TG1细胞在2YTAG培养基中在37℃和240RPM下生长直至600nm处的OD达到0.5。然后在37℃和100RPM下使用10的感染复数(MOI)用M13K07辅助噬菌体超感染细胞1小时。然后将培养基更换为2YTAK(补充有100μg/ml氨苄青霉素和50μg ml卡那霉素的2YT培养基)，并将细胞在30℃和280RPM下进一步培养过夜。第二天，将10μl含有噬菌体的无细胞上清液用于随后一轮的选择。

对于使用CHO细胞的淘选策略，用含有3％(w/v)牛血清白蛋白(PBS/BSA 3％)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)在室温处将纯化的噬菌体颗粒封闭1小时。用补充有0.1％叠氮化物的PBS/BSA 3％封闭2×10⁷个未转染的CHO细胞和瞬时表达人CD47蛋白(SEQ ID NO:7)或食蟹猴CD47蛋白(SEQ ID NO:8)的2×10⁷CHO细胞以避免受体在室温处内化1小时。将噬菌体在室温处针对未转染的细胞取消选择1小时。然后将取消选择的噬菌体与转染的细胞在室温处温育2小时。为了除去非特异性噬菌体，将细胞用PBS-Tween 0.1％洗涤四次，并用PBS洗涤两次。将噬菌体在室温处用柠檬酸76mM、pH 2.0洗脱10分钟，并使用Tris-HCl 1M pH 8中和。使用洗脱的噬菌体来感染10ml指数生长的大肠杆菌TG1细胞。如上所述进行噬菌体扩增。

通过SPR的scFv筛选

使用表面等离子体共振(SPR)分析来确认scFv克隆的特异性结合活性。在室温处使用Biacore 2000控制软件v3.2在Biacore 2000仪器(Biacore,GE Healthcare)上进行测量，并用来自相同制造商的Biacore T200评估软件(v3.1)进行分析。将内部产生的重组人CD47-avi-his蛋白(SEQ ID NO:3)和内部产生的重组食蟹猴CD47-avi-his蛋白(SEQ IDNO:4)在pH 4.5的乙酸盐缓冲液(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100350)中分别稀释至200nM的最终浓度，随后分别固定在流动路径2和3上，使用胺偶联试剂盒(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100050)在CMS传感器芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100012)上达到约1500个共振单位(缩写为RU)的水平。类似地，用不相关的蛋白固定流动路径4。使用HBS-EP(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100188)作为运行缓冲液。将过滤的周质提取物直接注射到共价偶联的人CD47和食蟹猴CD47CMS传感器芯片上。将样品以30μl/min的流速注射到流动路径1、2、3和4上(流动路径1用作参照)3min，随后在运行缓冲液中解离3min。在每次结合事件后，用10mM甘氨酸pH 1.5溶液(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100354)以30pl/min注射1min使表面再生。每次测量包括零浓度样品以及无关的scFv周质提取物，分别用于参考和特异性。

通过流式细胞术的scFv筛选

通过流式细胞术评估scFv克隆与瞬时表达人CD47蛋白(SEQ ID NO:7)的CHO细胞的结合。挑取来自第三轮或第四轮筛选的各个大肠杆菌菌落，并在96孔深孔板中在补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2TY培养基中生长。通过添加0.02mM的IPTG并在30℃和250RPM下温育过夜来诱导scFv表达。将细胞离心并通过将细菌沉淀重悬浮于TES缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8；1mM EDTApH 8；20％蔗糖)中，然后在冰上温育30分钟获得周质提取物。通过离心除去细胞碎片，并将含有scFv的上清液用于流式细胞术实验。将表达CD47和未转染的CHO细胞以10⁵个细胞/孔的密度接种在微量滴定板中。接下来，将板离心以除去细胞上清液，并将预先在含有3％(w/v)牛血清白蛋白(PBS-BSA 3％)的PBS中以1:1稀释的100μl周质提取物添加到每个孔中，并将板在4℃处进一步温育30分钟。然后将细胞用PBS-BSA3％洗涤，并与在PBS-BSA 3％中以1:200稀释的生物素-鸡抗c-Myc抗体(GallusImmunotech目录号：ACMYC-B)在4℃处温育30分钟。接下来，将细胞用PBS-BSA 3％洗涤，并与在PBS-BSA 3％中以1:100稀释的链霉亲和素APC(eBioscience，目录号：17-4317)在4℃处温育30分钟。最后，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD biosciences)测量细胞荧光。

Fab表达

编码不同抗体恒定区的cDNA由GENEART AG(Regensburg,Germany)进行基因合成，并使用标准分子生物学技术进行修饰。将PCR产物用合适的DNA限制酶消化，纯化并连接在携带CMV启动子和牛激素多腺苷酰化(多(A))的经修饰的pcDNA3.1质粒(Invitrogen)中。表达载体还携带oriP和鼠VJ2C前导肽，oriP是Epstein-Barr病毒的质粒复制的起点，而鼠VJ2C前导肽用于分泌编码的多肽链。为了将scFv文库克隆重新格式化为人IgG1 Fab片段，将其噬菌体文库载体中的每个scFv克隆用于通过PCR扩增其单独的VH cDNA，接下来将VHPCR产物克隆到上述经修饰的pcDNA 3.1载体中编码人IgG1重链CH1结构域的cDNA的上游，而将固定的VK3-15/JK1轻链(SEQ ID NO:10)克隆到上述经修饰的pcDNA 3.1载体中编码人κ恒定轻链结构域的cDNA的上游。

对于Fab表达，使用PEI将等量的重链和轻链载体共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞(ATCC，目录号CRL-10852)中。通常，在补充有0.1％ Pluronic F-68的RPMI中以8百万个细胞/ml制备细胞。然后用DNA-PEI混合物转染细胞。转染后四小时，将细胞培养物在补充有酚红和4mM L-谷氨酰胺的293中以1:1稀释，并在37℃、5％ CO2和80％湿度处在轨道振荡下温育5天。通过离心然后过滤制备含有重组蛋白的无细胞培养物上清液，并用于进一步纯化。使用CaptureSelect^TMIgG-CH1亲和基质(ThermoScientific，目录号：194320050)纯化Fab蛋白。将亲和树脂添加到过滤的培养物上清液中并在温和混合下在4℃处温育过夜。第二天，将树脂珠收集到Poly-Prep柱(Bio-Rad Laboratories)中，用PBS洗涤，并用酸性缓冲液(通常为甘氨酸0.1M pH 3)洗脱重组蛋白。在用1/10体积的Tris-HClpH 8中和后，将制剂缓冲液交换到PBS中。

Fab对CD47的结合亲和力

使用表面等离子体共振(SPR)来测量Fab片段对人和食蟹猴CD47的结合亲和力。在25℃处在Biacore T200仪器(Biacore,GE Healthcare)上测量亲和力并用Biacore T200评估软件(v3.1)分析。使用内部产生的重组人CD47-avi-his和重组食蟹猴CD47-avi-his蛋白(分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)在Series S CMS传感器芯片(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100530)上进行测量。使用市售的胺偶联试剂盒(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100050)将重组人CD47蛋白和重组食蟹猴CD47蛋白分别共价固定在传感器芯片表面的流动路径2和流动路径4上的约50个RU。将Fab片段以15.6nM至2000nM的不同浓度在HBS-EP+缓冲液(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100669)中以单循环动力学以30μl/min的流速注射在流动路径1、2、3和4(流动路径1和3用作参照)上持续3分钟。监测解离5分钟。在每个循环后，用30pl 10mM甘氨酸pH 1.5(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100354)再生涂有重组CD47蛋白的Series S CMS传感器芯片表面。使用1:1朗缪尔动力学拟合模型处理实验数据。测量包括用于参考的零浓度样品。Chi^值、U值和残值用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

CD47/SIRPα阻断测定

Fab片段阻断人CD47与人SIRPα之间相互作用的能力通过生物层干涉测量法(BLI)进行评估。在OctetRED96e仪器(ForteBio)上进行测量，并使用Data Analyis HT 11.1版软件(Octet,ForteBio)进行分析。将内部产生的生物素化重组人CD47-avi-his蛋白(SEQ IDNO:3)以1μg/ml加载到链霉亲和素SA生物传感器(ForteBio，目录号：15-5019)上的动力学缓冲液(ForteBio，目录号：18-1105)中100秒。将涂有生物素化人CD47抗原的链霉亲和素生物传感器浸入1μM Fab的溶液中10分钟以实现CD47涂覆表面的饱和，随后连续浸入内部产生的1μM Fab 1和2pM重组人SIRPα蛋白(SEQ ID NO:9)的混合溶液中5分钟。所有步骤均在25℃和1000RPM振荡下进行。在每个循环前用生物素化人CD47蛋白涂覆新鲜的链霉亲和素生物传感器。

结果和结论

对通过SPR显示出与重组人CD47蛋白和重组食蟹猴CD47蛋白特异性结合以及对于所测试的那些显示出与表达CD47的CHO细胞特异性结合的ScFv克隆进行测序，并将独特的序列重新格式化为Fab片段用于进一步表征。生化表征包括结合亲和力的评估和使用人CD47/SIRPα阻断测定法进行的功能评估。

Fab对CD47的结合亲和力

二十一个Fab克隆显示出对人和食蟹猴CD47的结合亲和力，如通过SPR确定的平衡解离常数(KD)低于2μM。克隆抗CD47-UCP01-H2(下文也称为抗CD47-H2)显示出对人CD47的亲和力为104nM，对食蟹猴CD47的亲和力为142nM。所提及的克隆的重链序列识别编号和结合亲和力报告于表1中。

表1.开发的Fab克隆及其对人和食蟹猴CD47的相对亲和力的概述。

CD47/SIRPα阻断测定

使用生物层干涉测量法测试Fab片段阻断人CD47与人SIRPα之间的相互作用。测试了所有开发的Fab片段阻断人CD47与人SIRPα之间的相互作用。用克隆抗CD47-H2阻断重组人CD47蛋白与重组人SIRPα蛋白之间的相互作用示于图1中。

实施例2：抗CD38抗体的产生

材料和方法

重组靶抗原

人和食蟹猴CD38的cDNA获自Source Biosciences(Erwin-Negelein-Haus,Germany，目录号：IRAU37D11,4309086))，它们的胞外区(尤其是UniProt登录号：P28907，残基43-300和Uniprot登录号：Q5VAN0，残基43-301(残基44缺失))被PCR扩增并克隆到来源于pcDNA3.1(Invitrogen AG)的内部表达载体中。该表达载体包含Kozak序列和起始密码子，随后是位于其多克隆位点5'端的鼠IgGx轻链前导肽和位于3'端的6-His-tag。人CD38(残基43至300，SEQ ID NO:1)和食蟹猴CD38(残基43-301，SEQ ID NO:2)与6-His-tag融合的可溶性胞外区表达如下。简言之，将含有HEK细胞、0.1％普朗尼克酸(Invitrogen AG)、表达载体和聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection,Illkirch,France)的一体积RPMI1640培养基(PAA Laboratories)在摇瓶中在37℃、5％ CO2和80％湿度处温育。

4小时后，将补充有6mM谷氨酰胺的一体积Ex-Cell 293培养基添加到混合物中，并继续进一步温育共5天。产生后，通过离心获得澄清的上清液，并使用0.2μm过滤器过滤，使用Tris 1M pH 8.7将pH值调节至7.4(4℃)。将Ni-Sepharose Excell珠(GE Healthcare)添加到澄清的上清液中，并在搅拌下在4℃处温育过夜。将溶液装载到Econo柱(Bio-RadLaboratories)上进行重力流动纯化。随后用1X PBS、pH 7.4(1或2X 10CV)和补充有20mM咪唑(10CV)的1X PBS、pH 7.4洗涤珠。根据批次，用补充有500mM咪唑的1X PBS、pH 7.4洗脱蛋白质，或通过逐步增加咪唑的浓度(40mM、80mM和250mM咪唑)洗脱蛋白质。合并感兴趣的级分，并用1X PBS，pH 7.4在4℃处透析两次。将蛋白质浓缩并使用0.22μm过滤器无菌过滤。通过SDS-PAGE、SE-HPLC和内毒素测量和ELISA评估蛋白质质量。简言之，在室温处使用TosohBioscience TSKgel G3000SWxl柱(目录号：08541，Tosoh Bioscience)进行SE-HPLC，使用0.1M磷酸钠缓冲液、0.15M氯化钠(pH 6.8)作为洗脱剂，流速为1ml/min，在具有Waters2998PDA检测器(Waters)的Waters Alliance 2695HPLC系统上，在214nm和280nm处监测。利用基于鲎变形细胞溶解物(LAL)的测定法，使用来自Charles River的Multi-CartridgeSystem Endosafe-MCS来确认细菌内毒素水平低于0.5EU/mg。这些蛋白质在本文中称为人CD38-C-His和食蟹猴CD38-C-His，并且分别描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

重组细胞系

将全长人CD38(UniProt序列ID P28907；残基1-300；SEQ ID NO:5)或全长食蟹猴CD38(登录号Q5VAN0；残基1-301；SEQ ID NO:6)的人密码子优化序列克隆到经修饰的pcDNA^TM3.1质粒(ThermoFisher Scientific，目录号：V79020)中。在悬浮适应的CHO-S细胞(cGMP banked,Invitrogen，目录号：A1136401)中进行转染和蛋白质表达，如实施例1所述。如本文所述的人和食蟹猴CD38蛋白分别具有SEQ ID NO:5和6。

文库选择

已如实施例1所述进行选择，并进行以下修饰。第一个淘选策略包括使用生物素化重组人CD38蛋白(Acrobiosystems，目录号：CD8-H82E7)的三轮选择。第二轮淘选策略包括使用生物素化重组人CD38蛋白进行两轮选择，然后使用瞬时表达人CD38蛋白(SEQ ID NO:5)或食蟹猴CD38蛋白(SEQ ID NO:6)的CHO细胞进行两轮选择。

通过SPR的scFv筛选

使用表面等离子体共振(SPR)分析来确认scFv克隆的特异性结合活性。在室温处使用Biacore 2000控制软件v3.2在Biacore 2000仪器(Biacore,GE Healthcare)上进行测量，并用来自相同制造商的Biacore T200评估软件(v3.1)进行分析。将内部产生的市售重组人CD38蛋白(Acrobiosystems，目录号：CD8-H224)和重组食蟹猴CD38蛋白(R&D Systems，目录号：9834-AC-050)，或重组人CD38胞外结构域(ECD)-C-his(SEQ ID NQ:1)和重组食蟹猴CD38-ECD-C-his(SEQ ID NQ:2)蛋白在pH 4.5的乙酸盐缓冲液(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100350)中分别稀释至200nM的最终浓度，随后分别固定在流动路径2和3上，使用胺偶联试剂盒(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100050)在CM5传感器芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100012)上达到约1500个共振单位(缩写为RU)的水平。类似地，用市售重组小鼠CD38蛋白(Creative Biomart，目录号：CD38-3112M)或无关抗原固定流动路径4。使用HBS-EP(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100188)作为运行缓冲液。将过滤的周质提取物直接注射到共价偶联的人CD38-his和食蟹猴CD38-his CMS传感器芯片上。将样品以30μl/min的流速注射到流动路径1、2、3和4上(流动路径1用作参照)3min，随后在运行缓冲液中解离5min。在每次结合事件后，用10mM甘氨酸pH 1.5溶液(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100354)以30μl/min注射1min使表面再生。每次测量包括零浓度样品以及无关的scFv周质提取物，分别用于参考和特异性。

通过流式细胞术的scFv筛选

通过流式细胞术评估scFv克隆与瞬时表达人CD38蛋白(SEQ ID NO:5)的CHO细胞的结合，如实施例1所述。

Fab对CD38的结合亲和力

如实施例1所述表达和纯化人IgG1 Fab片段。使用表面等离子体共振(SPR)来测量Fab片段对人和食蟹猴CD38的结合亲和力。在25℃处在Biacore T200仪器(Biacore,GEHealthcare)上测量亲和力并用Biacore T200评估软件(v3.1)分析。使用市售重组生物素化人CD38 Avitag^TM、His Tag(Acrobiosystems，目录号：CD8-H82E7)在Series S传感器芯片SA(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100531)或Series S BiotinCAPture芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：28920234)上进行对人CD38的测量。使用内部产生的重组食蟹猴CD38-ECD-C-his蛋白(SEQ ID NO:2)在预先固定有抗组氨酸抗体(Biacore,GEHealthcare，目录号：28995056)的Series S CM5传感器芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100530)上进行对食蟹猴CD38的测量。

通过固定CD38并使用Fab片段作为分析物来评估对人和食蟹猴CD38的亲和力。将生物素化重组人CD38蛋白固定到Series S传感器芯片SA的流动路径2上的约160个RU或Series S BiotinCAPture芯片的流动路径2上的约100个RU，并将重组食蟹猴CD38-his蛋白固定到预先涂有抗组氨酸抗体的Series S CMS传感器芯片的流动路径2上的约50-100个RU。将Fab片段以7.8nM至2000nM的不同浓度在HBS-EP+缓冲液(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100669)中以单循环动力学以30μl/min的流速注射在流动路径1和2(流动路径1用作参照)上持续3分钟。监测解离5分钟。在每个循环后，用60μl 10mM甘氨酸pH 1.5(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100354)再生涂有生物素化重组人CD38蛋白表面的Series S传感器芯片SA，同时分别使用BiotinCAPture试剂盒(Biacore,GE Healthcare，目录号：28920234)和His Capture试剂盒(Biacore,GE Healthcare，目录号：28995056)提供的再生溶液再生涂有抗组氨酸抗体表面的Series SBiotinCAPture芯片和Series S CMS传感器芯片。使用1:1朗缪尔动力学拟合模型处理实验数据。测量包括用于参考的零浓度样品。Chi²值、U值和残值用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

表位分箱

使用生物层干涉测量法(BLI)评估Fab片段对人CD38的表位分箱。在OctetRED96e仪器(ForteBio)上进行测量，并使用Data Analyis HT 11.1版软件(Octet,ForteBio)进行分析。将生物素化人CD38-avi-his蛋白(Acrobiosystems，目录号：CD8-H82E7)以1μg/ml加载到链霉亲和素SA生物传感器(ForteBio，目录号15-5019)上的动力学缓冲液(ForteBio，目录号：18-1105)中5分钟。将涂有生物素化人CD38抗原的链霉亲和素生物感应器浸入200nM Fab 1(饱和Fab)的溶液中10分钟，随后连续浸入200nM Fab 1和200nM Fab 2(竞争Fab)的混合溶液中5分钟。所有步骤均在25℃和1000RPM振荡下进行。在每个循环前用生物素化人CD38涂覆新鲜的链霉亲和素生物传感器。

结果和结论

对通过SPR显示出与重组人CD38和重组食蟹猴CD38蛋白特异性结合以及与人CD38CHO细胞特异性结合的ScFv克隆进行测序，并将在SPR上显示出最佳结合概况的独特序列重新格式化为Fab片段以用于结合亲和力测量。

Fab对CD38的结合亲和力

三十五个Fab克隆显示出对重组人和食蟹猴CD38蛋白的结合亲和力，如通过SPR确定的平衡解离常数(KD)低于10μl。克隆抗CD38-UCP01-E2，下文也称为抗CD38-E2(重链SEQID NO:28)，显示出对人CD38和食蟹猴CD38的亲和力分别为110nM和89nM。克隆抗CD38-UCP03-B6，下文也称为抗CD38-B6(重链SEQ ID NO:43)，显示出对人CD38和食蟹猴CD38的亲和力分别为225nM和829nM。所提及的克隆的重链序列识别编号和结合亲和力报告于表2中。

表2.开发的Fab克隆及其对人和食蟹猴CD38的相对亲和力的概述。NB＝没有可检测的结合；NT＝未检查。

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表位分箱

为了评估抗CD38克隆在CD38上的竞争，使用Octet Bio-Layer干涉测量法使用抗CD38 Fab片段和重组人CD38蛋白进行表位分箱测定。图2示出了抗CD38-E2和抗CD38-B6克隆不相互竞争，因此不识别CD38上的重叠表位。

实施例3：抗CD38-E2和抗CD38-B6的优化

材料和方法

重组靶抗原

重组人CD38-ECD-C-his蛋白(SEQ ID NO.1)(下文也称为重组人CD38蛋白)和重组食蟹猴CD38-ECD-C-his蛋白(SEQ ID NO.2)(下文也称为重组食蟹猴CD38蛋白)如实施例2所述在内部产生。

文库生成和选择

通过在CDR的重链中引入多样性，产生了抗CD38-E2(SEQ ID NO:28)和抗CD38-B6(SEQ ID NO:43)克隆的五个亲和力成熟文库。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别使用Kabat残基27-35、50-58、95-101减去2处的简并NNK密码子寡核苷酸(其中N是四种脱氧核糖核苷酸中的任一种，K是G或T)随机化。使用含有5个连续简并密码子的重叠寡核苷酸库产生每个文库。CDR-H1和CDR-H2也分别使用位置Kabat 27-35和50-58处的三聚体寡核苷酸多样化。将所得的五个文库PCR产物克隆到pNGLEN(内部修饰的pUC119噬菌粒载体)中，并将所得的连接反应物电穿孔到大肠杆菌TG1细胞中。将转化的细胞铺展在2YTAG板上，并在30℃处温育过夜。将菌落从板上刮下到10ml 2YT培养基中并添加15％甘油(最终浓度)，在-80℃处储存。通过用三分之v/v的20％ PEG-6000、2.5M NaCl的两个沉淀步骤产生和纯化噬菌体，并将其重悬浮于PBS中。

如实施例1所述使用重组蛋白进行噬菌体展示选择，并进行以下修饰。将取消选择的噬菌体与50nM、5nM和0.5nM生物素化重组人CD38蛋白(Acrobiosystems，目录号：CD8-H82E7)分别温育第1轮、第2轮和第3轮。温育1小时后，在第2轮和第3轮期间，在室温处添加内部产生的1μM重组人CD38蛋白(非生物素化的，SEQ ID NO:1)3小时。

通过SPR的亲和力筛选

SPR分析用于确认新scFv克隆的特异性结合活性，并根据它们的结合特性对阳性克隆进行分级。如实施例2所述进行测量，并进行以下修饰。在25℃处在Biacore T200仪器(Biacore,GE Healthcare)上进行测量并用Biacore T200评估软件(v3.1)分析。将市售重组人CD38蛋白(Acrobiosystems，目录号：CD8-H224)在pH 4.5的乙酸盐缓冲液(Biacore,GEHealthcare，目录号：BR100350)中稀释至200nM的最终浓度，随后固定在流动路径2上，使用胺偶联试剂盒(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100050)在Series S CM5传感器芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100530)上达到约1300RU的水平。将过滤的周质提取物直接注射到流动路径1和2上的共价偶联的人CD38 CMS传感器芯片上(流动路径1用作参考)。监测HBS-EP+缓冲液中的解离10分钟。如实施例1所述将显示最佳结合特性的scFv克隆重新格式化为Fab片段。

Fab对CD3的结合亲和力

使用Fab作为分析物在Series S BiotinCAPture芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：28920234)上使用如实施例2所述的市售重组生物素化人CD38 Avitag^TM、His Tag(Acrobiosystems，目录号：CD8-H82E7)进行Fab对人CD38的亲和力，其中Fab注射浓度为1.95nM至500n5。使用Fab作为分析物在预先固定有抗组氨酸抗体(Biacore,GEHealthcare，目录号：28995056)的Series S CMS传感器芯片(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100530)上使用如实施例2中所述的内部产生的重组食蟹猴CD38-ECD-C-his蛋白(SEQ ID NO:2)进行对食蟹猴CD38的测量，其中Fab注射浓度为1.48nM至120nM。

使用Fab作为配体，在Biacore T200仪器(Biacore,GE Healthcare)上在25℃处测量Fab对人和食蟹猴CD38的亲和力，并用Biacore T200评估软件(v3.1)分析。使用商业试剂盒(人Fab捕获试剂盒，Biacore,GE Healthcare，目录号：28958325)在与抗人Fab抗体偶联的Series S CM5传感器芯片(Biacore T200，Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100530)上进行测量。用内部产生的重组人CD38蛋白或重组食蟹猴CD38蛋白(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)进行SPR测量。通过固定Fab片段并使用人或食蟹猴CD38蛋白作为分析物来评估对人和食蟹猴CD38的亲和力。在与抗人Fab抗体偶联的Series S CM5传感器芯片的流动路径2上捕获约50-200个RU的Fab。将人或食蟹猴CD38以0.2nM至100nM的不同浓度在HBS-EP+缓冲液(Biacore,GE Healthcare，目录号：BR100669)中以多循环动力学以30μl/min的流速注射在流动路径1和2(流动路径1用作参照)上持续5分钟。监测解离10分钟。在每个循环后，用60μl提供有人Fab捕获试剂盒(Biacore,GE Healthcare，目录号：28958325)的再生溶液使表面再生。使用1:1朗缪尔动力学拟合模型处理实验数据。测量包括用于参考的零浓度样品。Chi²值、U值和残值用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

结果和结论

抗CD38-E2克隆(重链SEQ ID NQ:28)和抗CD38-B6克隆(重链SEQ ID NQ:43)的亲和力成熟涉及五个单独文库中CDR-H1(Kabat位置27-35)、CDR-H2(Kabat位置50-58)和CDR-H3(Kabat位置95-101减去2)的多样化。分离如通过SPR测量的具有比它们各自的亲本克隆(抗CD38-E2或抗CD38-B6)更慢解离速率的ScFv克隆。将ScFv克隆重新格式化并表达为Fab片段并通过SPR测量对人和食蟹猴CD38的亲和力。根据该评估，将源自CDR-H1和CDR-H2文库的选择的突变组合用于进一步的解离速率改善；称为Fab克隆抗CD38-E2-RecA(SEQ ID NO:57)的一个克隆对人和食蟹猴CD38具有最高的亲和力，使用Fab作为配体测量的KD分别为0.9nM和3.7nM。使用Fabs作为分析物测量，克隆抗CD38-E2-UCP02-F3(SEQ ID NO:52)(下文也称为抗CD38-E2-F3)和抗CD38-E2-UCP02-F8(SEQ ID NO:55)(下文也称为抗CD38-E2-F8)显示对人CD38的亲和力分别为3.5nM和17.6nM，对食蟹猴CD38的亲和力分别为2.4nM和24.5nM。称为Fab克隆抗CD38-B6-D9(SEQ ID NO:61)的一个克隆显示出抗CD38-B6的亲和力成熟对人和食蟹猴CD38的亲和力的最高增加，其中使用Fab作为配体测量的KD值分别为2.3nM和5.2nM并且使用Fab作为分析物测量的KD值分别为0.55和3.3nM。所提及的克隆对人和食蟹猴CD38的重链序列识别编号和结合亲和力报告于表3中。

表3.用Fab作为分析物和用Fab作为配体测量的开发的Fab克隆及其对人和食蟹猴 CD38的相对亲和力的概述NB＝没有可检测的结合；NT＝未检查。

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实施例4：工程化CD38/CD47双特异性抗体

材料和方法

用于瞬时哺乳动物细胞表达的表达载体的构建

部分或全部编码不同多肽链的cDNA首先由Twist Biosciences(San Francisco,USA)进行基因合成并使用标准分子生物学技术进行修饰。使用标准分子生物学技术将PCR产物插入携带CMV启动子和牛激素多腺苷酰化信号(poly(A))的经修饰的pcDNA3.1质粒(Invitrogen AG,Zug,Switzerland)中。将所有多肽链独立地克隆到表达载体中，其中分泌由鼠IgGx轻链前导肽驱动。

抗体在HEK-293-EBNA细胞中的表达

除非另有说明，否则BEAT双特异性抗体和对照抗体表达如下。对于瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将等量的每种工程化链载体共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL standards,Teddington,UK；目录号：CRL-10852)中。通常，在补充有0.1％ Pluronic F-68(Gibco)的RPMI1640(Biowest)中以8百万个细胞/ml制备细胞。然后在37℃处用DNA-PEI混合物转染细胞。转染后4小时，将细胞培养物在补充有酚红或BalanCDHEK293(Irvine Scientific)和4mM L-谷氨酰胺的293中以1:1稀释，并在37℃、5％ CO2和80％湿度处在轨道振荡下温育5天。通过离心然后过滤制备含有重组蛋白的无细胞培养物上清液，并用于进一步纯化。

通过差异蛋白A亲和层析纯化BEAT CD38/CD47双特异性抗体

来自HEK293-EBNA的上清液任选地在纯化前用0.1体积(V)的1M、pH 6.0磷酸钠调节或不经调节直接使用。将KanCapA树脂(KANEKA,Belgium)添加到经调节的上清液中。将混合物在4℃处搅拌温育过夜。温育后，将结合的蛋白用10个柱体积(CV)的PBS pH 7.4洗涤，然后用2个CV的170mM、pH 5.0的乙酸钠洗涤，然后在多个步骤中用50mM、pH4.3、4.1和/或pH3.9的乙酸钠洗脱并用0.1V的1M、pH 8.0Tris-HCl中和。将洗脱级分透析至PBS，pH 7.4，无菌过滤并通过SE-HPLC(TSKgel G3000SWXL，5μm，7.8mm×30cm L，5μm颗粒和孔(目录号08541，TOSOH BIOSCIENCE)在室温下用0.1M磷酸缓冲液、0.15M氯化钠(pH6.8)作为洗脱剂以1ml/min流速在具有柱加热器和UV/Vis检测器(来自Waters的2487或2489)或PDA检测器(来自Waters的2996或2998)的HPLC Alliance 2695(Waters)或Acquity Arc HPLC(Waters)上进行分析，以及通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4％-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG,Basel,Switzerland)进行分析。利用基于鲎变形细胞溶解物(LAL)的测定法，使用来自Charles River的Multi-Cartridge System Endosafe-MCS来确认细菌内毒素水平低于5EU/mg。通常，对于纯化的抗体，聚集形式的含量低于5％并且通过SE-HPLC的单分散性高于95％。如下所述，通过与质谱联用的反相高效液相色谱法(RP-HPLC-MS)进一步分析样品的异二聚化水平。

通过RP-HPLC-MS测定异二聚化水平

用PNGase F将样品去糖基化过夜。RP-HPLC-MS在Vanquish色谱系统(ThermoFisher Scientific)上进行，该Vanquish色谱系统与扩展质量范围混合电喷雾-四极杆_Orbitrap质谱仪(QExactive Plus BioPharma,ThermoFisher Scientific)联用。将纯化的蛋白质注射到聚苯基反相柱(Bio BioResolve RP mAb 2.1×150mm2.7μm柱，Waters UK)上。柱温设定为70℃。流动相由0.08％甲酸和0.02％三氟乙酸水溶液(溶剂A)和0.08％甲酸和0.02％三氟乙酸乙腈溶液(溶剂B)组成。以0.4ml/min的流速在5％溶剂B中加载蛋白质。用30％至38％线性梯度的溶剂B进行洗脱。以正离子模式运行质谱仪，扫描m/z 1500-5000范围，在m/z 200处分辨率为17500。将源内碰撞能量设定为60eV以避免TFA加合物。使用BioPharma Finder软件(ThermoFisher Scientific)处理获得的数据。使用滑动窗口进行峰检测，并使用/>算法进行解卷积。通过将测量的质量与针对不同的预期物质计算的那些进行比较来进行鉴定。通过对检测到的蛋白质种类的提取离子色谱图面积进行积分来评估纯度。

结果和结论

使用先前描述的重链(Hc)异二聚化技术构建结合CD38和CD47的双特异性抗原结合分子(Skegro等人,(2017)J Biol Chem 292(23):9745-9759和Stutz等人,(2020)J Biol Chem 295(28):9392-9408)；这种双特异性抗原结合分子在本文中称为BEATCD38/CD47。BEAT CD38/CD47分子的抗CD38部分可用于靶向表达CD38的肿瘤细胞，并且双特异性分子的抗CD47部分可用于阻断通过免疫细胞上CD47与SIRPα(信号调节蛋白α)的相互作用驱动的CD47介导的吞噬作用抑制信号(主要是巨噬细胞，Willingham等人,(2012)ProcNatl Acad Sci USA 109(17):6662-6667)。SIRPα与其配体CD47(一种广泛表达的跨膜蛋白)的相互作用通过启动最终抑制吞噬作用的信号级联而传递“别吃我”信号。这种抑制信号的存在允许癌细胞部分逃脱巨噬细胞介导的免疫系统控制机制。CD47在大多数细胞类型上表达，因此为了避免与不表达CD38的表达CD47的细胞结合，对CD47的弱亲和力被认为是合适的，即，使抗CD38结构域驱动与靶细胞的结合，这随后允许通过亲和力结合相同细胞上的近端CD47受体。重要的是，CD47在表达CD38的红细胞(RBC)和血小板上表达。对双特异性抗体的在靶特异性至关重要的是通过桥接CD47和CD38来控制RBC以及血小板的交联，这将由具有两个高亲和力结合臂的双特异性抗体构建体诱导。我们设想了CD47结合臂的低亲和力，以最小化与不表达CD38的表达CD47的细胞的结合，并避免血细胞凝集和血小板聚集，但是有效地阻断CD47-SIRPα相互作用。因此，对CD47的阻断与对CD38的高特异性的组合将允许对表达CD38的癌细胞特异性地使CD47介导的吞噬作用抑制失效。因此，靶细胞将易受抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的影响。进一步的效应机制，即抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，将有助于作用机制。

使用标准方法构建包含抗CD38特异性结合结构域和抗CD47特异性结合结构域的双特异性抗体，其中抗CD38抗原结合结构域和抗CD47抗原结合结构域各自包含与共同轻链(cLc)配对的不同、独特的Hc可变区(VH)(图3)。cLc避免了在双特异性抗体中掺入两个不同的VH结构域以及两个不同的同源轻链时通常观察到的任何可能的轻链错配。双特异性抗体含有异二聚体BEAT Fc区(SEQ ID NO:257和258)，并且Hc被工程化而具有对蛋白A(PA)的不同亲合力，从而允许如先前报道的那样分离同二聚体和异二聚体种类(Skegro等人,(2017)同上和Ollier等人,(2019)MAbs 11(8):1464-1478)。更具体地，异二聚体免疫球蛋白的抗CD47臂由BEAT(A)Hc组成，其包含具有突变G65S(Kabat编号)的选自表1的VH(抗CD47-H2)、CH1γ1区、γ1铰链区、γ1CH2区和与cLc(SEQ ID NO:10)组装的基于γ3的BEAT(A)CH3结构域。该Hc包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与PA结合。然而，由于本文使用的Hc具有源自VH3亚类的其VH结构域，因此VH结构域被突变以包括G65S取代，从而去除Hc内的任何附加的PA结合位点(Ollier等人,(2019)，同上)。重要的是，设计并测试了本文未显示的许多附加的构建体，以及具有不同亲和力的替代性抗CD47 VH结构域，之后认为抗CD47-H2是最合适的。异二聚体免疫球蛋白的抗CD38臂由BEAT(B)Hc组成，其包含选自表3的VH结构域(抗CD38-E2-F3、抗CD38-E2-F8或抗CD38-E2-RecA)的、CH1γ1区、γ1铰链区、γ1CH2区和与cLc组装的基于γ1的BEAT(B)CH3结构域。由BEAT(A)和BEAT(B)Hc以及cLc的组装产生的双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38/CD47-X，其中X是由一组特定的可变结构域组成的构建体编号(表4)。双特异性抗体在HEK中瞬时表达并通过差异PA层析纯化。对于所有抗体，通过SE-HPLC观察到>95％的单分散性和如通过RP-HPLC-MS确定的<1％同二聚体污染物。内毒素水平低于5EU/mg。下面进一步测试了BEAT CD38/CD47双特异性抗体的生物学活性。

表4.BEAT CD38/CD47双特异性抗体构建体及其相关SEQ ID NO的列表。

构建体	BEAT(A)Hc	BEAT(B)Hc	cLc
				BEAT CD38/CD47-3	SEQ ID NO:259	SEQ ID NO:260	SEQ ID NO:10
BEAT CD38/CD47-6	SEQ ID NO:259	SEQ ID NO:261	SEQ ID NO:10
				BEAT CD38/CD47-19	SEQ ID NO:259	SEQ ID NO:262	SEQ ID NO:10

实施例5：具有增强效应子功能的工程化抗体

材料和方法

克隆、表达和纯化

如上所述在HEK293-EBNA细胞中产生双特异性抗体。BEAT CD38/CD47-60以及-42和-48用于图9及之后描述的测定在CHO-S细胞中表达。使用聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)将工程化链载体和编码Epstein-Barr病毒(EBV)核抗原-1(EBNA-1)的载体共转染到CHO-S细胞(cGMP banked,Invitrogen，目录号A1136401)中。通常，在CD-CHO培养基(Gibco)中以8百万个细胞/ml制备细胞。然后在37℃处用DNA-PEI混合物转染细胞。转染后四小时，将细胞培养物在补充有4mM L-谷氨酰胺的PowerCHO^TM2(Lonza)中以1:1稀释，并在32℃、5％ CO2和80％湿度处在轨道振荡下温育14天。通过离心然后过滤制备含有重组蛋白的澄清细胞培养物上清液。如上所述，通过差异PA色谱法从上清液中纯化BEAT CD38/CD47双特异性抗体。

曲妥珠单抗对照IgG1抗体(SEQ ID NO:263和264)如上所述在HEK293-EBNA或CHO-S中表达并如下纯化：通过离心然后过滤制备含有重组蛋白的澄清细胞培养物上清液。上清液不经处理直接使用。将CaptivA树脂(Repligen,Waltham,USA)添加到上清液中，并在恒定搅拌下在4℃处温育过夜。温育后，用10个柱体积(CV)的PBS pH 7.4洗涤结合蛋白，然后再用10个CV的PBS pH 7.4洗涤。然后在4个CV的100mM、pH 3.0甘氨酸的多个步骤中洗脱蛋白质，并用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0中和。

对于同种型对照抗体(ABC IgG1，SEQ ID NO:265和266)的表达，在Opti-MEM培养基(ThermoFisher)中使用线性聚乙烯亚胺(PEI)将等量的每种工程化链载体和编码增强绿色荧光蛋白(eGFP)、嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)和新霉素抗性基因的载体共转染到CHO-S细胞(cGMP banked,Invitrogen，目录号A1136401)中。转染后四小时，将细胞培养物在含有4mM L-谷氨酰胺的PowerCHO2 CD培养基(Lonza)中以1:1稀释。第二天，将细胞稀释至2x10e6个细胞/ml，并使用有限稀释(从1:10至1:50)在96孔板(100μl/孔)中在补充有嘌呤霉素(5μg/ml)和遗传霉素(200μg/ml)的具有4mM L-谷氨酰胺的PowerCHO2培养基中进行亚克隆。一周后通过添加100μl含有4mM L-谷氨酰胺和嘌呤霉素的PowerCHO2培养基来更新选择压力。转染后14天并基于通过流式细胞术判断的eGFP信号的强度进行稳定克隆的选择。扩增了具有最强eGFP表达的克隆。将表达ABC IgG1抗体的稳定CHO细胞系在补充有4mML-谷氨酰胺、5μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml遗传霉素的PowerCHO2培养基中在TubeSpin生物反应器(TPP)中传代培养，在37℃、5％ CO2和80％湿度处以200RPM进行轨道振荡。与上述曲妥珠单抗对照IgG1抗体的纯化类似地进行纯化。

5F9 IgG4铰链稳定的抗体(下文称为5F9-G4(SEQ ID NO:267和268))，如上所述在HEK293-EBNA中表达并如下纯化：通过离心然后过滤制备含有重组蛋白的澄清细胞培养物上清液。将KANEKA KanCapA^TM树脂(Kaneka)添加到上清液中，并在恒定搅拌下在4℃处温育过夜。温育后，用1X PBS，pH 7.4(1×10CV)洗涤结合的蛋白，并使用分步洗脱方案依次用50mM乙酸钠pH 4.3、pH 4.1、pH 3.9和甘氨酸0.1M pH 3.5洗脱。

如上所述，通过SDS-PAGE、SE-HPLC和任选的RP-HPLC-MS分析所有纯化的样品。

重组人新生儿Fc受体(FcRn)胞外结构域Avitag^TM-聚组氨酸标记的融合蛋白

如上所述克隆人FcRn(Uniprot登录号：P55899；残基24-297；SEQ ID NO:269)和全长β2-微球蛋白(82171；Uniprot登录号：P61769，残基1-119；SEQ ID NO:270)的可溶性胞外区。在没有任何标签的情况下克隆B2M，并克隆FcRn以生成具有C端Avitag^TM(Avidity LLC)然后是10-His标签的蛋白质，两个标签之间具有gly₃接头序列(缩写为人SIRPα-ECD-Avi-His)。编码人FcRn的表达载体携带驱动产物分泌的鼠VJ2C前导肽以及OriP序列。编码人B2M的表达载体携带B2M天然前导肽。对于人FcRn/B2M复合物的表达，将编码人FcRn-ECD-Avi-His和B2M的质粒共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞中，如上所述。表达后，将Ni-Sepharose Excell珠(GE Healthcare)添加到澄清的上清液中，并在温和搅拌下在4℃处温育过夜。接着，将混合物装载到Econo柱(Bio-Rad Laboratories)上用于重力流动纯化。首先在1X PBS，20mM咪唑，pH 7.4(10CV)中洗涤珠，然后在补充有40mM咪唑、pH 7.4(10CV)的1X PBS中洗涤，并使用补充有250mM咪唑的1X PBS(1×1CV和5×2CV)洗脱蛋白质。在PD-10柱(GE)上进行缓冲液更换为20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 6.0。通过SDS-PAGE、SE-HPLC、内毒素测量评估蛋白质质量，如上所述。如本文所述的人FcRn-ECD-Avi-His标记的融合蛋白具有SEQ ID NQ:269。

重组人Fcγ受体(FcγR)胞外结构域聚组氨酸标记的融合蛋白

如上所述克隆FcγR2a(UniProt登录号：P12318残基34-208)、FcγR2b(UniProt登录号：P31994残基46-217)和FcγR3a(Uniprot登录号：P08637，残基17-193)的胞外区。该表达载体包含Kozak序列和起始密码子，随后是位于其多克隆位点5'端的鼠IgGx轻链前导肽和位于3'端的6或10-His-tag。如上所述表达与6或10-His-tag融合的人FcγR2a、FcγR2b和FcγR3a的可溶性胞外区。在表达和收获后，除了FcγR3a-ECD-His外，在添加树脂之前，用20mM咪唑补充澄清的上清液并将pH调节至7.4。将上清液与树脂温育过夜。第二天，通过重力流动收集流通液，并用2×10CV的1X PBS、20mM、pH 7.4咪唑(FcγR2a-ECD-His和FcγR2b-ECD-His)或10CV的1X PBS、pH 7.4洗涤树脂，随后用10CV的1X PBS、20mM、pH 7.4咪唑(对于FcγR3a-ECD-His)进行第二洗涤步骤。用5×1 CV和2×2 CV的1X PBS、500mM、pH 7.4咪唑(FcγR2a-ECD-His和FcγR2b-ECD-His)或8×1CV的1X PBS、250mM、pH 7.4咪唑(FcγR3a-ECD-His)洗脱蛋白质。然后用1X PBS、pH 7.4透析纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE、SE-HPLC、内毒素测量评估蛋白质质量，如上所述。如本文所述的人FcγR2a、FcγR2b和FcγR3a His标记的融合蛋白分别具有SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272和SEQ ID NO:273。

通过SPR测量FcγRla亲和力

SPR分析用于使用单循环动力学测量不同双特异性抗体的结合动力学的缔合和解离速率常数。抗体的结合动力学在BIAcore 8K+仪器(BIAcore-GE Healthcare EuropeGmbH,Glattbrugg,Switzerland)上在25℃处测量并用Biacore Insight Evaluation软件(2.0.15.12933版，BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH)分析。

使用市售Biotin CAPture试剂盒(Cytiva Life Sciences，原GE HealthcareEurope GmbH，目录号：28920234)在与Avi-Tagged FcγRla(Acrobiosystems，目录号：FCA-H82E8)偶联的Series S CAP传感器芯片(Cytiva Life Sciences，原GE HealthcareEurope GmbH，目录号：28920234)上进行测量至50-150RU的最终水平。将不同稀释度的双特异性抗体候选物和曲妥珠单抗对照IgG1(0nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM)以30μl/min注射到传感器芯片上2分钟。解离十分钟后，以10μl/min注入CAP再生液2分钟，进行再生，接着进行两分钟的稳定期。数据(传感图：fc2-fc1)用1:1Langmuir模型拟合，而不用使用全局拟合的传质。解离时间为至少600秒。一式两份地进行测量，并包括用于参考的零浓度样品。Chi2值和残值均用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

通过SPR测量FcγRlla、llb和Illa亲和力

SPR分析用于测量与不同双特异性抗体结合的稳态亲和力。抗体的稳态亲和力在BIAcore 8K+仪器(BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,Switzerland)上在25℃处测量并用Biacore Insight Evaluation软件(2.0.15.12933版，BIAcore-GEHealthcare Europe GmbH)分析。

在Series S蛋白G传感器芯片(Cytiva Life Sciences，原GE Healthcare EuropeGmbH，目录号：29179315)上进行测量。捕获双特异性候选分子和曲妥珠单抗对照IgG1以给出约80-100RU的最终Rmax。

将不同稀释度的Fc受体Ila、llb和Illa(0nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1250nM、2500nM、5000nM)以30μl/min的流速注射到传感器芯片上2分钟。解离2分钟后，注射下一浓度的分析物。在浓度系列结束时使芯片再生，以30μl/min的流速注入10mM甘氨酸pH1.5持续1min，随后是2min稳定期。数据(传感图：fc2-fc1)使用全局拟合用稳态亲和模型拟合。解离时间为至少120秒。一式两份地进行测量，并包括用于参考的零浓度样品。Chi2值和残值均用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

通过SPR测量FcRn亲和力

使用市售Biotin CAPture试剂盒(Cytiva Life Sciences，原GE HealthcareEurope GmbH，目录号：28920234)在与Avi-Tagged FcRn(Acrobiosystems，目录号：FCM-H82W2)偶联的Series S CAP传感器芯片(Cytiva Life Sciences，原GE HealthcareEurope GmbH，目录号：28920234)上进行测量至50-150RU的最终水平。将不同稀释度的双特异性抗体候选物曲妥珠单抗对照IgG1(4nM、12nM、37nM、111nM、333nM、1000nM)以10μl/min的流速注射到芯片上2分钟。解离2分钟后，注射HBS-EP+pH 8.5使芯片再生，随后是2分钟的稳定期。数据(传感图：fc2-fc1)使用全局拟合用稳态亲和模型拟合。一式两份地进行测量，并包括用于参考的零浓度样品。Chi2值和残值均用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

或者(对于BEAT CD38/CD47-60)，使用市售Human Fab Capture试剂盒(CytivaLife Sciences,formerly,GE Healthcare Europe GmbH，目录号：28958325)在与识别人Fab轻链的κ和λ亚型的单克隆抗体的混合物偶联的CM5传感器芯片(Cytiva LifeSciences,formerly GE Healthcare Europe GmbH，目录号：29104988)上进行测量。偶联抗体候选分子和曲妥珠单抗对照IgG1以给出约20RU的最终RU。将不同稀释度的FcRn(0nM、7.2nM、15.6nM、31.3nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM)以30μl/min的流速注射到芯片上3分钟。解离10分钟后，通过以30μl/min的流速注射10mM甘氨酸pH 2.0 2分钟使芯片再生，随后是1分钟的稳定期。数据(传感图：fc2-fc1)使用全局拟合用稳态亲和模型拟合。解离时间为至少600秒。一式两份地进行测量，并包括用于参考的零浓度样品。Chi2值和残值均用于评估实验数据与个体结合模型之间拟合的质量。

细胞培养

在RPMI1640中培养Raji(DSMZ，ACC-319)和Daudi(DSMZ，ACC-78)。细胞培养基补充有10％热灭活的胎牛血清(BioWest，目录号S1816)、L-谷氨酰胺(Biowest，目录号X0550)、1mM丙酮酸钠(Dutscher，目录号L064213)、1％非必需氨基酸(Gibco，目录号11140-035)和1％青霉素-链霉素溶液(Dutscher，目录号L0022)。对于Raji和NCI-H929，培养基还补充有1％ HEPES(Dutscher，目录号L0180-100)，对于NCI-H929，培养基还补充有0.05mM 2-巯基乙醇(Gibco，目录号31350-010)。

补体依赖性细胞毒性(CDC)测定

用5μM钙黄绿素AM(ThermoFisher，目录号C1430)标记肿瘤细胞，并在人血清(Sigma Aldrich，H4522)存在下，用增加浓度的测试抗体在超低附着96孔板(Corning，目录号3474)中铺板4小时30分钟。本文和下面所有其他测定中使用的Darzalex是商业上获得的(cone perf 100mg/5ml，Janssen)。使用Triton X-100作为最大肿瘤细胞杀伤的阳性对照。测定完成后，将细胞以350g离心5分钟，并将细胞上清液转移至底部透明的96孔板中。通过使用Synergy酶标仪定量上清液中释放的钙黄绿素来测量肿瘤细胞杀伤。根据公式[(在测试条件下的释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]计算特异性杀伤百分比。

巨噬细胞分化

通过Ficoll梯度从新鲜的血沉棕黄层中分离PBMC。随后使用EasySep CD14+单核细胞分离试剂盒(Stemcell，目录号19359)从PBMC中分离人单核细胞。通过在含有50ng/mLM-CSF(Peprotech，目录号300-25)的完全培养基中培养7天，使分离的单核细胞分化成巨噬细胞。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定

图5和图8所示的ADCP测定如下进行：使用Detachin(AMSBio，目录号T00-100)收集分化的巨噬细胞。将5×10⁴个巨噬细胞铺板在96孔平底板中，并在37℃处温育2小时以使巨噬细胞重新附着。随后将根据制造商的说明用phRodo(Sartorius，目录号4649)标记的1×10⁵个Raji细胞添加到具有80nM测试抗体的板中(效应物:靶标比率1:2)。将板转移到IncuCyte细胞分析系统(Sartorius)中，置于37℃细胞培养箱内5小时。每孔使用10倍物镜每30分钟拍摄两张图像，红色通道采集时间设定为800ms。使用IncuCyte软件分析板。吞噬作用定量为在5小时内针对phRodo信号测量的曲线下面积。

通过自动高通量定量显微镜评估吞噬作用

图9中所示的ADCP测定如下进行：将用1μg/mL pHrodo Red SE(Thermofisher，P36600)标记的1.5×10⁴个肿瘤细胞与用2.5μM细胞痕量紫(Thermofisher，C34557)染色的3×10³个单核细胞来源的巨噬细胞(效应物:靶标比率＝5:1)一起铺板于384孔透明底板(Corning，目录号3770)中。随后将增加浓度的测试抗体添加到孔中，并在37℃处温育2小时30分钟。然后使用CelllnsightCX5高含量筛选平台(Thermofisher)评估吞噬作用，并使用HCS Studio细胞分析软件分析。使用基于图像的分析将吞噬作用定量为100个细胞痕量紫阳性巨噬细胞的pHrodo-bright肿瘤细胞的平均数量。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定

通过Ficoll梯度从新鲜的血沉棕黄层中分离PBMC。随后使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-092-657)纯化NK细胞。然后将纯化的NK细胞与100U/mL重组人IL-2(Novartis，目录号L03AC01)在37℃处温育过夜。

在实验当天，将5×10⁴个IL-2刺激的NK细胞与用5μM钙黄绿素AM(ThermoFisher，目录号C1430)染色的1×10⁴个肿瘤细胞(效应物:靶标比率＝5:1)一起接种在超低附着96孔板(Corning，目录号3474)中。随后将增加浓度的测试抗体添加到孔中，并在37℃处温育4小时30分钟。测定完成后，将细胞以350g离心5分钟，并重悬于含有Sytox死细胞染色剂(Thermofisher，目录号S11348)的FACS缓冲液中。使用Cytoflex流式细胞仪(BeckmanCoulter)获得样品，并使用Flowjo(Tree Star)分析。存活的肿瘤细胞被鉴定为钙黄绿素AM阳性和Sytox死细胞染色阴性。使用公式：100-[(测试条件下的计数)/(无抗体条件下的计数)]对杀伤进行定量。

差示扫描量热法(DSC)

使用量热测量来比较抗体的热稳定性。在VP-DSC差示扫描量热计或MicroCalPEAQ-DSC差示扫描量热计(Malvern Instruments,UK)上进行量热测量。细胞体积为0.128ml，加热速率为1℃/min，过压保持在64p.s.i。所有蛋白质片段在PBS(pH 7.4)中以1-2mg/ml的浓度使用。每种蛋白质的摩尔热容量通过与含有相同缓冲液(其中蛋白质已被省略)的重复样品进行比较来评估。使用标准程序分析部分摩尔热容量和熔化曲线。在使用制造商提供的软件中的非双态模型进一步分析之前，对热分析图进行基线校正和浓度归一化。

强制降解

将抗体在PBS中稀释至0.5mg/mL，无菌过滤并在40℃处温育3至14天，然后储存在-80℃直至分析。温育后，如上所述通过SDS-P

PAGE和SE-HPLC分析样品。

结果和结论

如上所述，效应子功能对于BEAT CD38/CD47双特异性抗体的作用模式至关重要。先前已报道在Fc部分中引入的突变会增加抗体的效应子功能(例如Shields等人,(2001)JBiol Chem 276(9):6591-6604、Lazar等人,(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103(11):4005-4010)。因此，BEAT CD38/CD47双特异性抗体的Fc区被进一步工程化以增强多种作用模式，如下所述。

具有增强的补体介导的效应子功能和增强的抗体依赖性细胞吞噬作用的抗体变体

BEAT Fc的许多变体旨在增强CDC以及ADCP。靶标结合抗体的Fc部分与C1q(C1补体的第一子组分)的相互作用激活补体途径并最终诱导CDC。先前已经报道了IgG1抗体CH2结构域的C1q结合区中的氨基酸取代的几种组合增强CDC(WO2011104604)。相反，ADCP依赖于抗体Fc与效应细胞上的Fcγ受体(FcγR)的相互作用。这些在巨噬细胞上表达，并且特别是FcγRlla与ADCP有关，其中FcγRla和FeyIIla提供了较低但仍然显著和互补的贡献(Richards等人,(2008)Mol Cancer Ther 7(8):2517-2527)。先前已报道了引入到IgG抗体的CH2结构域中的过多突变以不同程度增加对FcγR的亲和力并调节FcγR介导的效应子功能(Shields等人,(2001)同上、Lazar等人,(2006)同上)。

在本文中，我们旨在将氨基酸取代的组合引入到异二聚体BEAT Fc的CH2结构域中，目的是增强由BEAT CD38/CD47双特异性抗体介导的CDC和ADCP，与巨噬细胞协作，实现CD47-SIRPα阻断。

我们之前报道了取代S324N以及S324N与E269D和S298A的组合，以大大增加IgG1抗体对靶细胞的补体诱导的裂解。值得注意的是，还报道了取代S298A增加了对FeγRIIla的亲和力并因此可考虑用于CDC以及ADCP增强(Shields等人,(2001)同上)。当在CD47靶向抗体中工程化ADCP增强时，要牢记的一个重要考虑因素是血小板细胞的表面上存在CD47以及FcγRlla。值得关注的是，对FcγRlla具有显著增加的亲和力的CD38/CD47双特异性抗体可以通过Fc结合血小板细胞，并且通过同时与CD47相互作用可以潜在地诱导血小板的交联和聚集，这会影响在靶特异性。为此，我们的工程化努力集中于增加FcγRllla结合亲和力，同时限制对FcγRlla的亲和力的增加。总之，目的是探索与CDC增强突变协作的对不同FcγR的亲和力的各种水平的增加，目的是找到杀伤效力与在靶特异性之间的最佳平衡。因此，将CDC增强突变S324N、E269D和S298A以及FcγR亲和力调节突变S298A、K334E、K334A、S239D和I332E的各种组合引入BEAT CD38/CD47-19中，产生构建体-21、-22、-24和-42(表5)。取代通常对称地引入到两条重链中。然而，突变S239D和I332E仅不对称地引入到BEAT(A)Hc中，因为其对称工程化消除了BEAT双特异性抗体的表达。

表5.具有增强Fc突变的效应子功能的CD38/CD47 BEAT双特异性抗体构建体及其相关SEQ ID NO的列表

双特异性抗体的产生和表征如上所述。通过SE-HPLC观察到>95％的单分散性和如通过RP-HPLC-MS确定的<1％同二聚体污染物。内毒素水平低于5EU/mg。它们介导CDC的能力在对Daudi细胞的基于细胞的测定中进行了评估。所有进一步工程化的变体都显示出优于非增强型BEAT CD38/CD47-19的CDC活性，证实突变在异二聚体BEAT Fc的背景下是功能性的，如同它们在野生型IgG1的背景下一样(图4)。单独的S324N(BEAT CD38/CD47-22)介导了CDC的大部分增加。在较低抗体浓度下，BEAT CD38/CD47-21中的附加突变K334E和BEATCD38/CD47-24中的E269D+S298A+K334A相对于单独的S324N介导最小的附加增加。S239D+I332E与单独的S324N(BEAT CD38/CD47-42)相比在CDC中没有介导任何附加的增加。

接下来，在对Raji细胞的基于细胞的测定中评估了BEAT CD38/CD47双特异性抗体介导ADCP的能力。评估了表4和表5中那些的其他构建体，其中进一步探索了FcγR亲和力调节(表6)。在构建体BEAT CD38/CD47-25和-26中评估了取代E269D从BEAT CD38/CD47-23和-24的去除，假设尽管E269D对于CDC是有益的，但是它可能潜在地干扰与FCyR的相互作用，如先前对于突变E269A所观察到的那样(Shields等人,(2000)同上)。构建体的产生和表征如上所述。通过SE-HPLC观察到>95％的单分散性和如通过RP-HPLC-MS确定的<1％同二聚体污染物。内毒素水平低于5EU/mg。

表6.具有增强Fc突变的效应子功能的其他CD38/CD47 BEAT双特异性抗体构建体及其相关SEQ ID NO的列表

所有共有相同抗CD47 VH的非增强抗体BEAT CD38/CD47-3、-6和-19显示出相似水平的ADCP，而不管抗CD38亲和力如何，其对于构建体-6最低而对于构建体-19最高(图5)。突变K334E显著增强了BEAT CD38/CD47-21的ADCP。与BEAT CD38/CD47-23和-24相比，去除取代E269D适度地改善了BEAT CD38/CD47-25和26中的ADCP。引入BEAT CD38/CD47-42中的突变S239D+I332E介导了ADCP效力超过任何其他构建体的最大增加。FcγR对有利构建体的亲和力通过SPR测量并与曲妥珠单抗对照IgG1的亲和力进行比较(表7)。最强的FcγR亲和力与ADCP效力的最大增加相关。

表7.通过SPR测量的FcγR亲和力的调节。

对于T细胞重定向双特异性抗体，Bluemel等人,(2010)Cancer ImmunolImmunother 59(8):1197-1209表明效力可受靶向表位影响，并因此受细胞表面上产生的几何排列影响。因此，我们假设Fc在靶接合后的几何定位将决定C1q结合的效率，进而决定补体激活的程度。此外，我们假定类似地，在BEAT CD38/CD47双特异性抗体与免疫细胞上的FcγR之间产生的几何形状和距离将影响效应子功能的效力。为此，我们研究了CD38中的各种结合表位以及“2+1”抗体形式。“2+1”BEAT双特异性抗体具有通过柔性接头(通常为甘氨酸-丝氨酸序列)与第一Fab结构域融合的附加Fab结构域(图6)。位于抗体Fc与第二Fab结构域之间的Fab结构域被称为“Fc近端”结合单元，而与“Fc近端”Fab的VH的N端融合的Fab结构域被称为“Fc远端”结合单元。与图3中描述的传统BEAT抗体形式(现在称为“1+1”形式)类似，通过使用cLc避免了“2+1”结构中的轻链错配，这基本上允许向BEAT抗体添加无限数目的不同结合结构域。因此，cLc允许工程化具有两个抗CD38结合单元的BEAT CD38/CD47双特异性抗体，除了结合CD47的VH结构域之外，所述两个抗CD38结合单元还具有结合CD38中两个不同表位的不同VH序列。这样的构建体在本文中称为“2+1”双互补位BEAT双特异性抗体。与“1+1”形式的抗体或“2+1”形式的抗体(单互补位且具有两个相同的抗CD38结合单位)相比，双互补位BEAT CD38/CD47双特异性抗体可诱导靶细胞上不同几何结构的结合，并且这又可调节效应子功能。

将“2+1”BEAT双特异性抗体类似于“1+1”形式的那些进行工程化，其中抗CD47BEAT(A)臂如上所述设计。异二聚体免疫球蛋白的抗CD38臂由BEAT(B)Hc组成，其包含选自表3的第一VH结构域(抗CD38-E2-RecA或抗CD38-B6)、CH1 y1区、甘氨酸-丝氨酸接头(GGGGSGGGGSGGGS)、选自表3的第二VH结构域(抗CD38-E2-RecA)、第二CH1γ1区、γ1铰链区、γ1CH2区和与cLc组装的基于γ1的BEAT(B)CH3结构域。由BEAT(A)和BEAT(B)Hc以及cLc的组装产生的“2+1”BEAT双特异性抗体列于表8中。重要的是，双互补位“2+1”BEAT双特异性抗体由VH结构域组成，这些VH结构域靶向CD38中的非重叠表位并且可以同时结合(图2)(BEATCD38/CD47-38、-39、-40和-48)。相反，单互补位“2+1”BEAT双特异性抗体包含相同VH结构域的两个拷贝(BEAT CD38/CD47-32和-34)。如上所述表达和纯化“2+1”BEAT双特异性抗体。对于所有抗体，通过SE-HPLC观察到>95％的单分散性和如通过RP-HPLC-MS确定的<1％同二聚体污染物。内毒素水平低于5EU/mg。然后进一步测试了BEAT CD38/CD47双特异性抗体的生物学活性。

表8.具有和不具有增强Fc突变的效应子功能的CD38/CD47“2+1”BEAT双特异性抗体构建体及其相关SEQ ID NO的列表

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“2+1”BEAT双特异性抗体与“1+1”形式的那些相比介导CDC的能力在对Daudi细胞的基于细胞的测定中进行了评估。从“1+1”形式变为“2+1”形式，在没有针对效应子功能进一步工程化的Fc的情况下，没有提高CDC效力(BEAT CD38/CD47-19对-38)(图7)。然而，在增强的BEAT Fc的情况下，“2+1”结构导致在比“1+1”形式的等效抗体更低的抗体浓度下CDC活性的增加(BEAT CD38/CD47-40和-48对-24和-42)。接着，比较“2+1”BEAT双特异性抗体在对Raji细胞的基于细胞的测定中诱导ADCP的能力(图8)。单互补位的“2+1”BEAT双特异性抗体表现出比其“1+1”对应物(BEAT CD38/CD47-32和-34对-23和-24)更高的ADCP效力，然而吞噬作用的水平不能匹配最有利的“1+1”构建体BEAT CD38/CD47-42的水平。有趣的是，即使具有非增强的Fc(BEAT CD38/CD47-38)，双互补位“2+1”BEAT双特异性抗体也显示出ADCP效力的显著增加，达到最增强的“1+1”构建体BEAT CD38/CD47-42的水平，证实了结合在细胞表面上的抗体的几何形状影响效应子功能并且双互补位接合正面影响ADCP效力的假设。在双互补位“2+1”BEAT双互补位抗体的情况下，FcγR亲和力的轻度增加没有进一步提高ADCP活性(BEAT CD38/CD47-39和-40)。具有突变S239D+I332E(其介导FcγR结合的最强增加)的双互补位构建体在进行上述测定时仍不可用，但稍后在随后的测定中显示具有超过等效“1+1”构建体的进一步增强的ADCP活性(BEAT CD38/CD47-48对-42)(图9)。有利构建体的FcγR亲和力通过SPR测量并与曲妥珠单抗对照IgG1的FcγR亲和力进行比较(表9)。

表9.

表9.通过SPR测量的“2+1”构建体的FcγR亲和力的调节。

总之，突变S324N有利地影响了CDC效力，并且双互补位“2+1”形式进一步增强了CDC效力(图4和图7)。在BEAT(B)重链中不对称引入的S239D+I332E导致ADCP活性的最强增加，其被双互补位“2+1”结构进一步增强。

用低亲和力的“Fc远端”抗CD38结合剂(抗CD38-B6，SPR KD＝225nM)工程化包含所有上述内容的构建体BEAT CD38/CD47-48。所述结合剂的亲和力成熟(表3)允许具有高亲和力“Fc近端”(抗CD38-E2-RecA)和“Fc远端”(抗CD38-B6-D9)抗CD38结合结构域(BEAT CD38/CD47-60)(表10)的附加双互补位“2+1”BEAT双特异性抗体的工程化。BEAT CD38/CD47-60以及-42和48在CHO中瞬时表达，如上所述纯化和表征。通过SE-HPLC观察到>95％的单分散性和如通过RP-HPLC-MS确定的<1％同二聚体污染物。内毒素水平低于5EU/mg。

表10.构建体BEAT CD38/CD47-60的SEQ ID NO

接下来，与有利的候选物-42和-48相比，在基于细胞的测定中评估了构建体BEATCD38/CD47-60诱导CDC、ADCP以及ADCC的能力。值得注意的是，在“Fc远端”位置具有高亲和力抗CD38结合结构域的BEAT CD38/CD47-60比在“Fc远端”位置具有低亲和力抗CD38结合结构域的BEAT CD38/CD47-48诱导显著更有效的CDC(图9)。所有构建体的ADCC相似，并且Daudi细胞的ADCP显示出BEAT CD38/CD47-60超过-48的最小增加。

BEAT CD38/CD47双特异性抗体的生物物理学表征

通过DSC进一步表征BEAT CD38/CD47双特异性抗体，以研究Fc中效应子功能工程化对热稳定性的影响(表11)。候选物BEAT CD38/CD47-42、-48和-60的相应热分析图示于图10中。与未增强的BEAT Fc相比，具有效应子功能增强突变的所有BEAT Fc都具有降低的热稳定性。突变S239D+I332E对热稳定性具有最强的影响，其次是K334E。突变的其他组合也降低了热稳定性，但程度较低。

表11.通过DSC观察到的BEAT CD38/CD47双特异性抗体的热转变(Tm)的总结。

考虑到增强型BEAT Fc的降低的热稳定性，我们进一步评估了在40℃的2周强制降解研究中的不同变体的稳定性。通过SE-HPLC测定的单分散性百分比在2周后对于原始BEATFc以及所有测试的增强型BEAT Fc变体没有改变，而曲妥珠单抗对照IgG1的单分散性百分比严重降低(表12)。

表12.对CD38/CD47 BEAT双特异性抗体进行的力降解研究的结果。

接下来，我们评估了增强型BEAT Fc的工程化是否影响人类新生儿Fc受体(FcRn)的结合。FcRn在CH2与CH3结构域之间的界面处结合，并因此Fc中的变化可以潜在地调节结合亲和力，这又可以影响血清半衰期(Martin等人,(2001)Mol Cell 7(4):867-877)。通过SPR测定增强型BEAT Fc变体对FcRn的亲和力(表13)。FcRn的结合不受BEAT Fc的进一步工程化的负面影响，并且KD在曲妥珠单抗对照IgG1所测量的范围内。

表13.BEAT CD38/CD47与FcRn结合的SPR测量。

实施例6：BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60候选物的体外生物学表征

实施例6.1：多发性骨髓瘤和淋巴瘤细胞系的BEAT CD38/47-48和60结合活性的体外表征

材料和方法

将每孔十万个细胞铺板在U底96孔板(TPP)中并以350g离心5分钟。通过轻弹板丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于100μl剂量-反应的初级纯化抗体中。将细胞在4℃(黑暗)处温育30分钟。两次洗涤步骤(350g，5分钟)后，将细胞用在FACS缓冲液中以1/200稀释的单克隆小鼠抗人IgG-Fc PE在4℃处染色30分钟。在最后洗涤步骤后，将细胞悬浮于含有Sytox(1/2000)或Dapi(1/50000)的FACS缓冲液中。

然后用Cytoflex(Beckman Coulter)进行流式细胞术分析。

使用FlowJo软件(BD)分析数据：提取每个样品的活单细胞的PE荧光强度几何平均值(geoMFI)。由于抗体可以表现出与细胞的一些非特异性结合，因此使用同种型对照抗体(ABC-IgG1)的geoMFI进行了归一化。将来自对照染色的geoMFI值减去每个分子的geoMFI值以产生相对荧光强度(RFI)。使用RFI计算所有的KD值。对于一些曲线，由于观察到钩状效应，排除最高浓度处的geoMFI值。

对于KD计算，在Prism软件(GraphPad)中对RFI值应用非线性单位点结合(双曲线)回归。

结果和结论

通过对表达不同水平的CD38和CD47的一组多发性骨髓瘤(KMS-12-PE、KMS-12-BM、NCI-H929)和淋巴瘤(Raji，Daudi)细胞系的流式细胞术评估BEAT CD38/47-48和-60的结合(图11)。该评估的合理性是评估BEAT 38/47-48和-60的Kd以及理解它们与肿瘤细胞系的结合，与抗CD38(DArzalex)或抗CD47(5F9-样，莫洛利单抗)单克隆抗体的结合相比。

与基准Darzalex和5F9相比，BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60显示出与CD38高肿瘤细胞系(Daudi、Raji、KMS-12-PE)更高的结合。此外，与Darzalex相比，BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60显示出与CD38低肿瘤细胞系(NCI-H929和KMS-12-BM)更高的结合。患者的多发性骨髓瘤细胞表现出原发性或获得性肿瘤逃逸机制的几个特征，包括CD47“别吃我”信号的上调和细胞表面CD38的下调(例如在接受Darzalex作为标准护理的患者中)。与标准护理Darzalex相比，BEAT 38/47被设计成克服这两种肿瘤逃逸机制并提高表达CD38的肿瘤细胞的靶向性。本发明的细胞结合数据表明，与现有基准相比，CD38和CD47的共靶向可以允许更好的治疗窗口，特别是在CD38低MM肿瘤细胞中。

实施例6.2：BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60抑制CD47-SIRPα相互作用

材料和方法

将用8uM Hoescht(Thermofisher，目录号33342)标记的10×10³个Daudi细胞以20μL铺板于384孔透明底板(Corning，目录号3770)中，并与20μL浓度递增(0.00015nM至640nM)的测试抗体在4℃处共温育30分钟。平行地，在测定缓冲液(PBS+2.5％ FBS+0.1％NaN₃)中制备由300ng/mL SIRPα-mIgG1 Fc融合蛋白(Accrobiosystem，目录号SIA-H52A8)和2.5ug/mL Alexa Fluor 647缀合的抗小鼠IgG Fc检测剂(Jackson Immunoresearch，目录号115-605-205)组成的抗体混合物(检测混合物)，并在室温处避光温育30分钟。将检测混合物(20uL)添加到细胞中并在室温处温育3小时。使用Celllnsight CX5高含量筛选平台(Thermo Fisher Scientific)，通过基于图像的分析来定量重组SIRPα-Fc与肿瘤细胞的结合。抑制显示为检测混合物荧光信号的抑制百分比。

结果和结论

遍在免疫检查点CD47在与巨噬细胞表达的其同源受体SIRPα结合后作为抑制吞噬作用的“别吃我”信号起作用。肿瘤细胞增强了这种机制并过表达CD47作为免疫逃逸机制以避免吞噬作用。BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60被设计成在靶标共接合后选择性地阻断CD38表达细胞上的CD47-SIRPα，并增强抗体依赖性细胞吞噬作用。因此，我们使用体外模型和基于图像的分析评估了BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60抑制CD38阳性肿瘤细胞上CD47/SIRPα相互作用的功效(图12)。

尽管对CD47的亲和力较低，但BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60显示出对Daudi细胞上CD47/SIRPα相互作用的有效抑制。这与高亲和力抗CD47 5F9抗体抑制CD47/SIRPα相互作用的能力相当。总之，数据表明，即使在存在低亲和力CD47结合剂的情况下，组合高亲和力抗CD38结合剂也可以抑制CD47/SIRPα相互作用。

实施例6.3.与临床基准Darzalex相比，BEAT38/47-48和-60显示出通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)对表达CD38^低的肿瘤细胞的优异杀伤作用

材料和方法

将用1μg/mL pH-Rodo Red SE标记的1.5×10⁴个肿瘤细胞与用2.5μM细胞痕量紫染色的3×10³个单核细胞来源的巨噬细胞(效应物:靶标比率＝5:1)一起铺板于384孔透明底板中。在一些实验中，向每个孔中添加2.8ng/ml sCD38或500M/ml红细胞以评估CD38和CD47抗原库的影响。随后将增加浓度的测试抗体添加到孔中，并在37℃、5％ CO2处温育2小时30分钟。然后使用CelllnsightCX5高含量筛选平台评估吞噬作用，并使用HCS Studio细胞分析软件分析。使用基于图像的分析将吞噬作用定量为100个细胞痕量紫阳性巨噬细胞的pHrodo-bright肿瘤细胞的平均数量。

结果和结论

肿瘤细胞已进化出逃逸免疫系统识别的机制，包括劫持CD47-SIRPα轴。事实上，CD47在MM患者中过表达，据报道几乎100％的CD38阳性骨髓瘤细胞以高水平表达CD47。在血液恶性肿瘤和实体瘤中，CD47表达与疾病进展和对治疗的低反应相关。

CD47/SIRPα中和分子在体外和体内均显示出针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。在体外，CD47/SIRPα阻断抗体已被描述为恢复肿瘤细胞吞噬作用并增强由肿瘤靶向抗体诸如利妥昔单抗或曲妥珠单抗引发的抗体依赖性细胞吞噬作用。已经在临床前和临床环境中开发了几种抗CD47靶向方法；更突出的是抗CD47抗体Hu5F9-G4，一种具有两个高亲和力抗CD47 Fab臂的单克隆抗体，其在IgG4形式(在本文中称为5F9)中具有低/缺失的Fc功能。由于其低功能性IgG4 Fc部分，5F9主要在组合中起作用，如在临床试验中作为组合伙伴与利妥昔单抗在非霍奇金淋巴瘤的治疗中协同作用所报道的。与5F9不同，BEAT CD38/47-48和-60通过选择性阻断表达CD38的肿瘤细胞上的CD47-SIRPα相互作用，同时通过其Fc增强的效应子功能(包括增强的ADCP)激活吞噬作用，来增强作为独立分子的ADCP。此外，BEAT CD38/47-48和-60与MM标准护理Darzalex不同，因为预计其通过靶向CD38肿瘤细胞和伴随的CD47/SIRPα相互作用来增强针对MM细胞的ADCP活性。使用SIRPα-Fc融合蛋白的竞争性结合测定中评估体外BEAT 38/47顶部候选物抑制CD47/SIRPα相互作用的能力。BEAT 38/47-48和-60在体外有效抑制肿瘤细胞上的CD47/SIRPα相互作用，达到与5F9介导相当的程度(实施例6.2)。

与临床基准5F9和Darzalex相比，我们评估了BEAT 38/47-48和-60ADCP对肿瘤细胞的效力。BEAT 38/47-48和-60均显示出与Darzalex介导的表达CD38^高的肿瘤细胞的吞噬作用诱导相当的最大水平。对于表达CD38^高的肿瘤细胞，Darzalex显示出比BEAT 38/47-48和-60略高的尽管统计学显著的效力，通过其较低的EC50值测量。相反，在表达CD38^低的肿瘤细胞上，BEAT 38/47-48和-60均诱导了统计学上显著更高的肿瘤细胞吞噬作用，其水平是Darzalex诱导的量的两倍，如通过它们的最大吞噬指数所测量的(图13和表14)。尽管仅用一个低亲和力的Fab臂阻断CD47/SIRPα相互作用，但在诱导表达CD38^高或CD38^低的肿瘤细胞的吞噬作用方面，BEAT 38/47-48和-60均显示出与5F9相当的效率。后一点具有高度相关性，因为它表明当通过同时具有两个抗CD38高亲和力Fab臂靶向肿瘤细胞时，降低抗CD47亲和力不影响BEAT CD38/47形式中的肿瘤细胞吞噬作用。当比较我们的内部临床候选物BEAT38/47-48和-60时，我们发现它们的效力没有差异，如通过在表达CD38^高或CD38^低的肿瘤细胞中的最大杀伤或EC50所测量的(图13)。

这些数据表明，BEAT CD38/47设计允许与5F9相当的肿瘤细胞吞噬作用，尽管显著降低了对CD47的亲和力，从而潜在地提高CD47的靶向性。事实上，由于其普遍存在的表达，靶向CD47可能具有挑战性；RBC和血小板属于更好表征的细胞类型，因为它们的清除依赖于CD47表达。因此，设计抗CD47疗法的关键方面是减轻作为主要抗原库的RBC(或血小板)的交联。事实上，由于其与RBC的在靶结合，5F9在所治疗的27％-41％的NHL患者中引起剂量依赖性贫血。此外，BEAT CD38/47形式显示出诱导针对表达CD38^低的肿瘤细胞的较高效力，如通过标准护理Darzalex诱导的。总之，我们的数据表明，与MM标准护理相比，BEAT 38/47-48和-60在低CD38抗原可利用性的情况下具有改善的效力，同时对RBC上的靶向性更有利，如5F9所报道的。

表14.使用Tuckey多重比较检验在CD38^高(Daudi)或CD38^低(KMS12-BM)肿瘤细胞中计算的统计值NS＝不显著。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

实施例6.4：与单臂抗CD47相比，BEAT38/47-48和-60显示出表达CD38^低的肿瘤细胞的优异杀伤作用

材料和方法

如实施例6.3的“材料和方法”段落中所述进行实验。

结果和结论

为了评估与单靶向抗CD38或抗CD47相比，共靶向CD38和CD47是否改善BEAT 38/47的功能，我们分析了BEAT 38/47-48和-60相对于它们的CD38或CD47单臂诱导肿瘤细胞的ADCP的能力(图14A)。BEAT 38/47-48和-60均显示出表达CD38^低的肿瘤细胞的增强的ADCP，如分别与单臂CD38-59和-79相比测量它们更高的最大吞噬作用。此外，尽管单臂CD47-54与BEAT 38/47-48和-60(在7个实验中的3个中)相比达到了相似或更高的肿瘤细胞吞噬作用的诱导，但是其诱导吞噬作用的效力低于BEAT 38/47-48和-60两者，如通过更高的EC50所测量的(图14B和表15)。

总之，BEAT 38/47-48和-60显示出比它们的相关抗CD38和抗CD47单臂更高的效力，这表明BEAT形式幸运地在患者中诱导了比通过靶向单一CD38或CD47诱导的更好的效力。

表15.使用Tuckey多重比较检验在CD38^低(KMS12-BM)肿瘤细胞中计算的统计值

条件	最大吞噬作用	EC50
			BEAT 38/47-48对单臂CD47-54	>0.05	>0.05
BEAT 38/47-60对单臂CD47-54	>0.05	>0.05
			BEAT 38/47-48对单臂CD38-59	>0.05	>0.05
BEAT 38/47-60对单臂CD38-79	>0.05	>0.05

实施例6.5：与临床基准相比，BEAT38/47-48和-60显示出通过补体依赖性细胞毒性(CDC)对肿瘤细胞的优异杀伤

材料和方法

用5μM钙黄绿素AM标记肿瘤细胞，并在37℃、5％ CO2处，并在人血清存在下，用浓度渐增的测试抗体在96孔板中铺板4小时30分钟。在一些实验中，向每个孔中添加2.8ng/mlsCD38或500M/ml红细胞以评估CD38和CD47抗原库的影响。

使用Triton X-100作为最大肿瘤细胞杀伤的阳性对照。测定完成后，将细胞以350g离心5分钟以沉淀细胞。然后将100μL上清液小心地转移到黑色平底96孔板中，不转移任何细胞。使用以下参数用Synergy酶标仪读取由钙黄绿素释放诱导的荧光：

○激发波长：485nm

○发射波长：515nm

根据下式计算特异性杀伤：

％特异性杀伤＝[(在测试条件下的释放-自发释放)/(最大释放TritonX100-自发释放)]。

结果和结论

靶标结合抗体的Fc部分与C1q(C1补体系统的第一子组分)的相互作用激活补体途径并最终诱导CDC。这是大多数经过临床验证的抗体杀伤肿瘤细胞的作用机制(MOA)之一，包括MM标准护理Darzalex。肿瘤细胞进化并经历几种免疫逃逸机制，包括逃逸药物治疗(获得性逃逸机制)。与MM相关，对CDC杀伤的逃逸是对Darzalex抗性的最佳建立机制之一，其最终影响疾病的复发。对CDC的获得性逃逸机制是多因素的并且仍然需要被充分了解。然而，有几个因素会影响它，包括每个肿瘤细胞的抗原密度(CD38下调)以及补体调节蛋白(包括CD46、CD55和CD59)的过表达。由于这些原因，BEAT 38/47-48和-60被设计成具有它们的Fc部分的专用工程化以增强Fc效应子功能，包括CDC(如WO2011104604所报道的)。此外，如本专利中先前报道的，与1+1结构相比，BEAT 38/47-48和-60在它们的2+1结构中已经增强了CDC，这最可能是由于增强了细胞表面中的CD38簇集以实现最佳CDC杀伤(参见实施例5和图7)。

与临床基准相比，我们评估了BEAT 38/47-48和-60对肿瘤细胞诱导CDC的效力。与Darzalex相比，BEAT 38/47-48和-60都显示出统计学上显著更高的CDC杀伤肿瘤细胞。如所预期的，5F9-样不诱导任何可检测的CDC杀伤，与它的低/缺失IgG4 Fc效应子形式一致。当比较我们的内部临床候选物BEAT 38/47-48和-60时，我们发现BEAT 38/47-60在效力方面显示出统计学上显著的差异，如通过较低的CDC EC50所测量的。在两个BEAT CD38/47之间没有发现最大杀伤的差异(图15和表16)。

这些数据表明，与在Darzalex中使用野生型(WT)IgG-1类相比，用专门的CDC增强突变调节Fc效应子功能提高了效力。在CDC可能受损的情况下，这种针对Darzalex的改善的效力幸运地有利于增强BEAT 38/47患者的活性。

表16.使用Tuckey多重比较检验(用于最大杀伤)和T检验(用于EC50)在CD38^高 (Daudi)肿瘤细胞中计算的统计值NS＝不显著。

条件	最大杀伤	EC50
			BEAT 38/47-48对Darzalex	>0.0005	NS
BEAT 38/47-60对Darzalex	>0.0005	NS
			BEAT 38/47-60对BEAT 38/47-48	NS	>0.005

实施例6.6：与临床基准相比，BEAT38/47-48和-60显示出通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)对表达CD38^低的肿瘤细胞的优异杀伤作用

材料和方法

肿瘤细胞首先用1μM eFluor670标记，然后用浓度递增的浓度的BEAT 38/47或对照抗体铺板在96孔板中。然后添加纯化的NK细胞以使最终效应子:靶标(E:T)比例为5:1。将板在37℃、5％ CO₂处温育。温育4小时30分钟后，将板离心。然后将细胞重悬于含有Sytox(1/2000)或Dapi(1/50000)的100μl FACS缓冲液中。

然后用Cytoflex(Beckman Coulter)进行流式细胞术分析。存活的肿瘤细胞被鉴定为eFluor670阳性和Sytox死细胞染色阴性。

然后报道活肿瘤细胞的绝对数目，并用下式计算杀伤％和特异性ADCC％：

％特异性杀伤＝(1-(靶抗体计数/样品的孔/靶抗体计数的平均值/仅靶标的孔))*100

％特异性ADCC＝样品的特异性杀伤％-没有抗体的特异性杀伤％

结果和结论

靶结合抗体Fcγ-受体III(CD16)的Fc部分的相互作用激活NK细胞并诱导有效的脱颗粒，从而导致肿瘤细胞的ADCC。与CDC一起，ADCC是杀死肿瘤细胞的Fc感受态抗体的最佳表征的MOA之一，并且被认为是由Darzalex诱导的杀死MM细胞的更突出的机制之一。

与临床基准(图16和表17)相比，我们评估了BEAT 38/47-48和-60ADCC对肿瘤细胞的效力。BEAT 38/47-48和-60均显示出与Darzalex诱导的相当的对表达CD38^高的肿瘤细胞的杀伤。相反，在表达CD38^低的肿瘤细胞上，尽管达到了与Darzalex相似的最大肿瘤细胞杀伤水平，但BEAT 38/47-48和-60都显示出更显著的效力，如通过统计学上显著降低的杀伤EC50所测量的。与CDC已经显示的类似，5F9-样不诱导任何可检测的ADCC杀伤，与它的低/缺失IgG4 Fc效应子形式一致。这些数据表明，通过在BEAT CD38/47-48和-60中具有两个双互补位CD38 Fab臂，可以在细胞表面上缺乏CD38水平时改善ADCC的效力。当比较我们的内部临床候选物BEAT 38/47-48和-60时，我们发现它们的效力没有差异，如通过在表达CD38^高或CD38^低的肿瘤细胞中的最大杀伤或EC50所测量的。

在表达CD38^低的肿瘤细胞上的针对Darzalex的改善的ADCC效力幸运地有利于在由于Darzalex治疗引起的抗原下调而显示出低表达CD38的患者中以及在由于获得性免疫逃逸机制而具有低CD38的MM克隆上的增强的活性。

表17.在CD38^高(Raji)或CD38^低 ^- ^int(NCI-H929)肿瘤细胞中使用Tuckey多重比较检验计算的统计值NS＝不显著。

实施例6.7：通过多重杀伤作用模式(MMoAK)测定测量BEAT CD38/47-48和BEAT CD38/47-60诱导NCI-H929MM肿瘤细胞的杀伤

材料和方法

从获自La Chaux-de-Fonds输血中心的血沉棕黄层收获来自健康志愿者的外周血单核细胞(PMBC)。对于血液过滤处理，将血沉棕黄层在50ml PBS中稀释(1/2稀释)，然后转移到预先装有Ficoll的3个SepMate管中。按照制造商的说明进行分离(在制动下以1200g离心10分钟)。将单核层转移至50ml falcon管中，将PBMC在PBS中洗涤3次(300g，10分钟)，计数并在-80℃处冷冻。测定前一天，将自体PBMC解冻并在37℃处在完全培养基中温育过夜。从冷冻的PBMC中纯化人单核细胞，并通过将它们在含有50ng/mL M-CSF的完全培养基中培养7天而分化成巨噬细胞。

MMoAK测定

在实验当天，在超低附着96孔板中，在50％人血清存在下，将1x105PBMC+5000个自体单核细胞衍生的巨噬细胞与用5μM eFluor 670标记的肿瘤细胞一起铺板。在一些实验中(图18)，向每个孔中添加2.8ng/ml sCD38或500M/ml红细胞以评估CD38和CD47抗原库的影响。然后将增加浓度的测试抗体和对照抗体添加到孔中，并在37℃、5％ CO2处进一步温育48小时。测定完成后，将细胞以350g离心10分钟，并重悬于含有Sytox(1/2000)或Dapi(1/50000)的100μl FACS缓冲液中。使用Cytoflex流式细胞仪获得样品，并使用Flowjo软件(tree star)分析。

存活的肿瘤细胞被鉴定为eFluor-670阳性和Sytox死细胞染色阴性。然后报道活肿瘤细胞的绝对数目，并用下式计算杀伤％和特异性杀伤％：

-使用以下公式定量BEAT 38/47的杀伤能力：

-％特异性杀伤＝(1-(靶抗体计数/样品的孔/靶抗体计数的平均值/仅靶标的孔))*100

结果和结论

生理学上，抗体依赖性效应子功能不是作为单独的实体出现，而是同时出现。为了准确比较BEAT 38/47-48和-60与基准的效力，在体外建立了优化的多重杀伤测定模式(图17A)。它由在人血清和自体单核细胞来源的巨噬细胞存在下用100U/ml IL-2刺激的人PBMC与肿瘤细胞的共培养组成。通过这种方法，在测试抗体的存在下，肿瘤细胞通过多种机制被杀死，诸如通过IL-2激活的NK细胞的ADCC、通过T细胞的重定向裂解(RDL)、通过补体的CDC和ADCP(通过吞噬细胞的存在介导)。重要的是，在MMoAK测定中，人血清还充当人免疫球蛋白(Ig)的来源，这是在存在生理水平的Ig的情况下评估抗体依赖性效应子功能效力的关键要素。因此，可以定量BEAT 38/47-48和-60杀伤效力，并通过该测定与基准精确比较。

在这种条件下，5F9未能诱导可检测水平的肿瘤细胞杀伤，最可能是由于具有最小效应子功能的IgG4 Fc，从而超过了Fc受体与血清中存在的Ig。形成鲜明对比的是，BEAT38/47-48和-60表现出显著的肿瘤细胞杀伤，其是Darzalex诱导的两倍(图17B)。当比较我们的内部临床候选物时，在两个BEAT CD38/47之间没有发现最大杀伤的差异，然而，BEAT38/47-60在效力方面显示出统计学上显著的差异，如通过在MMoAK中较低的EC50所测量的(图17C和D)。

CD38可以在血清中释放，并且循环可溶性CD38(sCD38)的分数随着MM中的疾病阶段而增加，从而潜在地充当CD38的库，并且因此限制CD38靶向疗法的功效。与此同时，基于RBC上的高水平CD47表达，大量循环RBC可以是BEAT 38/47-48和-60的第二主要抗原库。因此，在MMoAK中评估了sCD38和高浓度RBC的影响以测试抗原库是否影响体外BEAT 38/47-48和-60效力。存在或不存在2.8ng/ml(在患者骨髓中检测到的浓度)的sCD38不影响BEAT 38/47-48和-60通过MMoAK杀伤肿瘤细胞，如通过最大杀伤或EC50无差异所测量的(图18和表18)。同样，这种杀伤模式不受高浓度RBC(5亿个/ml)的影响(图18)。

总之，通过使用旨在概括体内Fc感受态抗体MOA的复杂性的测定，我们发现BEAT38/47-48和-60与MM标准护理Darzalex相比在效力方面显示出重要的差异。此外，该测定说明了Fc功能的正确活性有多重要，因为在血清存在下，5F9吞噬表达CD38^低的肿瘤细胞的能力被完全消除。重要的是，CD38或CD47抗原库不影响体外BEAT 38/47-48和-60效力。这些发现及其翻译相关性强烈支持BEAT 38/47-48和-60将在MM患者中具有显著的活性，其幸运地优于标准护理Darzalex的活性。基于所有测试的参数，两种BEAT在体外效力方面没有显示出主要的差异。然而，与BEAT 38/47-48相比，BEAT 38/47-60在CDC和MMoAK中显示出增强的效力，因此它优先于BEAT 38/47-48作为我们的临床候选物。

表18.在CD38低-int(NCI-H929)肿瘤细胞中使用单向方差多重比较检验计算统计值。NS＝不显著。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

条件	最大杀伤	EC50
			BEAT 38/47-48对Darzalex	>0.01	NS
BEAT 38/47-60对Darzalex	>0.05	NS
			BEAT 38/47-48对5F9	>0.0001	NA
BEAT 38/47-60对5F9	>0.0001	NA
			Darzalex对5F9	NS	NA
BEAT 38/47-60对BEAT 38/47-48	NS	>0.05

实施例6.8：与基准Darzalex和5F9的组合相比，BEAT38/47-60在体外显示出更高的效力

材料和方法

如实施例6.7中所述进行MMoAK。对于组合条件(Darzalex+5F9)，以剂量依赖性方式如BEAT 38/47-60测试Darzalex，同时以饱和浓度(160nM)使用5F9。

结果和结论

Darzalex是MM治疗中的标准护理，莫洛利单抗已经成功地与肿瘤靶向抗体(即利妥昔单抗)组合使用(MARK P.CHAO等人.Anti-CD47Antibody Synergizes with Rituximabto Promote Phagocytosis and Eradicate Non-Hodgkin Lymphoma.2010年9月3日.Cell142,699-713)，以增强肿瘤细胞的吞噬作用。因此，要解决的关键问题是理解与Darzalex和CD47阻断剂的潜在组合相比，BEAT 38/47概念是否显示出更好的抗肿瘤细胞功效。事实上，这种组合已经出现在急性淋巴细胞白血病中，其中发现其与单一疗法CD38相比显示出改善的功效(FOTINI VOGIATZI等人.Co-Targeting of CD38 and CD47 in T Cell AcuteLymphoblastic Leukemi 614.Acute lymphoblastic leukemia:therapy,excludingtransplantation.2020年11月5日.Blood(2020)136(增刊1):39)。因此，我们在MMoAK测定中评估了BEAT 38/47-60针对Darzalex与莫洛利单抗样(5F9)组合的效力，以便概括所有效应子功能以及Fc受体与循环Ig的竞争。为了进行严格的比较，将饱和剂量的莫洛利单抗样与不同浓度的Darzalex(如BEAT 38/47-60)组合使用。在这些设置中，与Darzalex与5F9的组合诱导的相比，BEAT 38/47-60显示出统计上显著更高的肿瘤细胞杀伤(图19和表19)。

这些数据表明，尽管在单个Fab臂中对CD47具有较低亲和力，但通过使用高亲和力抗CD38 Fab臂通过亲和力依赖性交联在使用BEAT形式的靶界面的效应子处阻断CD47，与高亲和力抗CD38和抗CD47单克隆抗体的组合相比，诱导较高的肿瘤细胞效力。

表19.在CD38高(Raji)或CD38低-int(NCI-H929)肿瘤细胞中使用Tuckey多重比较检验计算的统计值当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

条件	最大吞噬作用	EC50
			BEAT 38/47-60对(Darzalex+5F9)	<0.01	NA

实施例6.9：BEAT38/47-60不与Darzalex竞争结合细胞上的CD38，并且其效力不受伴随的Darzalex体外治疗的影响

材料和方法

将Raji-CD47KO细胞与饱和浓度的Darzalex-AF647、BEAT 38/47-AF488或Darzalex-AF647+BEAT 38/47-AF488的混合物一起温育(图20A-C)。洗涤步骤后，用Cytoflex细胞仪分析荧光。图20A-C示出了代表性的流式细胞仪点图。

关于图20D，在添加饱和浓度的BEAT 38/47-AF488之前，将Raji-CD47KO细胞与饱和浓度的IgG1对照、Darzalex或BEAT 38/47纯化的抗体在4℃处预温育30分钟。洗涤步骤后，用Cytoflex细胞仪分析荧光，然后计算与BEAT 38/47-AF488竞争的百分比。重复的平均值在本文中表示为+/-标准偏差(SD)。

如实施例6.7中所述进行MMoAK。用递增剂量的BEAT 38/47和图中X轴所示浓度的Darzalex进行BEAT38/47+Darzalex组合。

结果和结论

Darzalex是用于治疗多发性骨髓瘤的标准护理，并且预计BEAT 38/47-60将用于Darzalex治疗后复发的难治性MM患者。因此，我们评估了在Darzalex存在的情况下BEAT38/47-60是否受到细胞结合的影响以及Darzalex是否影响BEAT 38/47-60在体外对肿瘤细胞的效力。为了准确解决对CD38的竞争，我们使用CD47-KO Raji肿瘤细胞来避免CD47与BEAT 38/47-60的结合。通过同时用BEAT 38/47-60和Darzalex在4℃处温育CD47-KO Raji细胞，我们发现Darzalex不影响BEAT 38/47-60与CD47-KO Raji细胞的结合(图20A-C)。此外，我们发现当Darzalex在BEAT 38/47-60染色之前与CD47-KO Raji肿瘤细胞一起温育时，仅BEAT 38/47-60结合仅受到低(20％)抑制(图20D)。为了解决由Darzalex介导的对细胞结合的低竞争是否影响BEAT 38/47-60体外效力，我们测试了在Darzalex存在的情况下BEAT38/47-60的ADCP、ADCC和CDC活性。总之，我们发现通过在体外与Darzalex组合治疗对BEAT38/47-60的任何效应子功能都没有影响(图21和表20)。

总之，这些数据表明，即使在存在结合Darzalex的情况下，BEAT 38/47-60也能保持其功效。

表20.在指定的肿瘤细胞系中使用Tuckey多重比较检验计算的统计值。NS＝不显著。当杀伤曲线没有达到相当的最大水平时，比较EC50不适用(NA)。

实施例7：BEAT CD38/47-60在靶概况的离体评估

CD47遍在表达并在几种血液癌症中上调。为了测试BEAT CD38/47-60对非肿瘤细胞的在靶特异性，我们评估了它们在已知表达高水平CD47的RBC和血小板中的结合。

为了评估BEAT CD38/47-60，使用不同批次的分子作为临床开发批次。尽管与之前实施例中使用的BEAT CD38/47-60相比显示出改善的纯度，但BEAT CD38/47-60早期和晚期开发批次均显示出针对肿瘤细胞系相当的功能性和效力。

实施例7.1：与体外5F9相比，BEAT38/47-60在RBC和血小板中显示出较低的靶向/ 脱靶肿瘤活性

材料和方法

BEAT 38/47和5F9与人RBC的结合(图22A)

BEAT 38/47或5F9人红细胞结合的代表性示例。图22A中的图示出了给定供体的非线性S形回归结合曲线(相对几何平均荧光强度)的叠加。对六种不同的人红细胞供体进行了结合评估。如实施例6.1中所述进行细胞染色。

使用间接库姆斯测定法评估BEAT 38/47诱导红细胞凝集的能力(图22B)

0.8％血液溶液的制备

从Bern输血中心获得在EDTA K3管上收集的来自健康志愿者的新鲜外周血。将2ml新鲜血液添加到50ml Falcon管中的48ml无菌PBS中。将管以3500G离心10分钟。用25ml移液管轻轻除去上清液。通过将100μl浓缩的红细胞添加到新的干净试管中的10ml ID-稀释剂2中来制备0.8％红细胞悬浮液。

间接库姆斯检验

然后制备在无菌PBS中3倍浓缩的测试和对照抗体。然后将来自0.8％血液溶液的50ul血液和25ul每种抗体稀释液添加到ID卡库姆斯抗IgG的每个柱中。

将卡在37℃处温育15分钟，然后在ID离心机中离心。ID卡的每个微管都在凝胶基质中含有抗人球蛋白抗IgG(兔)。凝胶柱用作过滤器，其在卡的离心过程中当凝集的红细胞通过凝胶柱时捕获它们。凝胶柱基于尺寸将凝集的红细胞与非凝集的红细胞分离。任何凝集的红细胞在凝胶柱的顶部或沿着凝胶柱被捕获，而非凝集的红细胞下降到微管的底部，形成沉淀。凝集程度评分为0(无凝集)至4(完全凝集)。

红细胞消耗测定(图22C)

使用血液分析仪(用人血的Sigma 5H)在内部评估BEAT 38/47诱导红细胞损失的能力(图22C)。从Bern输血中心获得在EDTA K3管上收集的来自健康人类志愿者的新鲜外周血。

在温和搅拌(100rpm)下，将测试抗体和对照抗体在13倍浓缩的500ul完全外周血中在37℃处温育1小时30分钟。温育后，使用Sigma 5H血液分析仪(SwissAvans)进行血细胞计数。然后报告新鲜血液中的红细胞浓度并在GraphPad Prism软件中分析。

RBC的溶血(图22D)

从Bern输血中心获得在EDTA K3管上收集的来自健康志愿者的新鲜外周血。通过在37℃处将测试抗体和对照抗体在新鲜外周血中温育3小时30分钟并在414nm处分析血浆中的血红蛋白吸光度来体外测试BEAT 38/47-诱导的溶血(图22D)。使用Triton X-100作为溶血的阳性对照。将样品离心并将血浆转移到透明底96孔板中。通过测量血浆在414nm处的吸光度来定量溶血。结果在GraphPad Prism软件中对无抗体处理条件(阴性对照)和tritonX-100(阳性对照)进行归一化。

血小板聚集(图22E)

血液收集和制备

在书面知情同意后，使用19号针和60ml注射器，通过小心的静脉穿刺从最近拒绝摄入非甾体抗炎药或已知影响血小板功能的其他药物的六名健康志愿者获得血液。将血液(总体积50ml)分配到10ml带刻度的塑料管中，每个带刻度的塑料管含有3.13％(w/v)柠檬酸三钠二水合物(1份柠檬酸盐对9份血液)，并小心地倒置3次以与抗凝剂混合。小心混合后，使血液在工作台上静置10分钟，然后以180×g离心10分钟以制备富含血小板的血浆(PRP)。使用塑料移液管小心地吸取PRP，合并到无菌塑料30ml通用容器中。将一些残余血液进一步离心(3,000×g，10分钟)以获得贫血小板贫乏的血浆(PPP)，其是在聚集仪AggRAM上设定100％光透射聚集测量(LTA)所需要的。

LTA程序

根据制造商的说明书使用AggRAM聚集仪。在实验开始前将仪器预热至37℃。对于每个单独的样品(聚集曲线)，使用250μL自体PPP样品设定100％光透射率。此后，将215μL的PRP添加到装有搅拌棒的比色皿中，并将25μL的测试化合物或LeoA1添加到样品中，然后将其在不搅拌的情况下置于AggRAM的加热孔中2分钟。1分钟后，在搅拌下将比色皿移至AggRAM的光学孔中，在添加10μL胶原、ADP或PBS之前，设定光透射以再记录一分钟以建立0％透射基线。再记录6分钟的聚集反应。直接从聚集仪打印显示光透射变化的聚集迹线和每次运行的报告。将所有个体志愿者的原始数据的硬拷贝存储在Platelet Services内的指定安全位置中，并且可以根据请求提供。数值输出(AUC和％Max)直接取自机器，并以列表形式呈现在Platelet Services报告中，并使用GraphPad Prism软件显示。

结果和结论

CD38和CD47尽管在多发性骨髓瘤细胞中上调，但可以在其他组织和细胞区室(包括RBC、血小板和几种白细胞)中以低水平表达。具体地，人RBC由于其CD47的高基础表达而特别倾向于被基于抗CD47的疗法靶向。事实上，在I期临床试验中约60％的患者中的短暂性贫血是莫洛利单抗的主要副作用(SIKIC,B.I.等人.First-in-Human,First-in-ClassPhase I Trial of the Anti-CD47 Antibody Hu5F9-G4 in Patients With AdvancedCancers.J Clin Oncol 37,946-953,2019)。基于此，BEAT 38/47-60被设计成具有低亲和力抗CD47 Fab臂，以减轻由抗CD47单一疗法(如高亲和力抗CD47莫洛利单抗)诱导的靶向RBC的风险。因此，与莫洛利单抗样单克隆抗体相比，我们在体外解决了BEAT 38/47-60的几个靶向/脱靶肿瘤参数。我们分析了与RBC和全血细胞亚群的结合、血细胞凝集的诱导、RBC耗竭和溶血以及血小板聚集(图22)。

与莫洛利单抗(5F9)相比，BEAT 38/47-60在全血液中与增加浓度的抗体一起温育显示出显著更低的与RBC的结合(图22A)，表明对RBC的更有利的靶向。与莫洛利单抗相比，这与它对CD47的较低亲合力一致。为了评估较低结合的RBC是否导致对RBC的较低靶效应，我们评估了

BEAT 38/47-60的血细胞凝集、溶血和RBC耗竭潜力。为了在体外对RBC凝集进行稳健且可重复的测量，我们建立了库姆斯测定法，一种在结合于RBC上的抗体交联时间接诱导凝集的方法。使用该方法。莫洛利单抗在体外诱导RBC的显著血细胞凝集，而BEAT 38/47-60与其相比诱导较低的库姆斯评分(图22B)。此外，使用血液分析仪对RBC进行计数，我们发现全血与BEAT 38/47-60的温育不会诱导全血中可检测到的RBC消耗(图22C)。相反，莫洛利单抗样抗体诱导全血中RBC的剂量依赖性消耗(图22C)。BEAT 38/47-60和莫洛利单抗样抗体均未在体外诱导可检测的RBC裂解(图22D)。接下来，评估了BEAT 38/47-60对体外血小板聚集的影响。使用Leao-1(一种公认的诱导血小板聚集的抗体)(JUDITH L.SCOTT等人.Characterization of a novel membrane glycoprotein involved in plateletactivation.J Biol Chem.1989年8月15日；264(23):13475-82)作为阳性对照。因此，它诱导了高水平的血小板聚集(图22E)。相反，BEAT 38/47-60或莫洛利单抗样抗体未能诱导血小板聚集(图22E)。

总之，这些数据表明，与抗CD47莫洛利单抗样抗体相比，BEAT 38/47-60在RBC上具有更有利的靶向概况。

表21：在指定的库姆斯评分条件下使用Tuckey多重比较检验计算的统计值

	条件	EC50
			库姆斯评分	BEAT 38/47-60对5F9	<0.0001

实施例7.2：与体外5F9相比，BEAT38/47-60在RBC和血小板中显示出较低的靶向/ 脱靶肿瘤活性

材料和方法

对六种不同的人红细胞供体进行了结合评估。如图11中所述进行细胞染色。

结果和结论

接下来，我们分析了全血中BEAT 38/47-60的结合水平，因为CD47和CD38可以在多个白细胞亚群上表达。BEAT 38/47-60和莫洛利单抗样抗体与免疫细胞的结合在对来自健康供体的全血进行染色后通过流式细胞术进行比较。相对于5F9，BEAT 38/47-60显示出与CD4和CD8 T细胞亚群、B细胞和NK细胞结合较低的趋势。与粒细胞的结合是唯一例外，其中BEAT 38/47-60在最高测试浓度处显示出更高结合的趋势(图23)。

总之，这些数据表明，与抗CD47莫洛利单抗样抗体相比，BEAT 38/47-60没有显示出主要的倾向，如通过其在全血上的靶向概况所测量的。

实施例8：BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60体内模型的功效

实施例8.1：BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在体内表达高水平CD38的 Raji肿瘤小鼠模型中的功效

材料和方法

动物饲养

在来自JANVIER LABS的雌性6-7周龄免疫活性SCID小鼠中进行体内实验。将所有小鼠维持在标准环境条件下的啮齿动物笼中(20±1℃室温，50±10％相对湿度，12小时光暗循环)。小鼠接受照射的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。研究是与Transcure公司(法国)合作进行的。

Raji肿瘤小鼠模型CD38高表达

进行了两个实验，分别命名为Raj_9和Raj_10研究。

Raj_9研究。Raji肿瘤中BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60的剂量递增。仅在第0天用Raji肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组5只小鼠；8组；共40只小鼠)。异种移植12天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBS1X；BEAT CD38/CD47-48分子剂量为10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg，BEAT CD38/CD47-60分子剂量为10、1mg/kg和0.1mg/kg，每周一次，持续3周。没有对这些动物进行离体分析。该实验仅进行一次。

Raj_10研究。BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在Raji肿瘤中的功效研究。仅在第0天用Raji肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组10只小鼠；8组；共80只小鼠)。异种移植12天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBS1X；BEAT CD38/CD47-48分子；BEAT CD38/CD47-60分子；BEAT CD38/CD47-59分子；BEAT CD38/CD47-79分子每周一次，持续3周。以16mg/kg每周两次静脉内注射Darzalex，持续3周。在第16天对每组5只动物进行离体分析。收集小鼠血清和肿瘤用于离体分析。对小鼠血清和肿瘤上清液样品进行Luminex分析。对小鼠肿瘤进行FACS分析。该实验仅进行一次。

使用1-Δt/Δc方法(测试肿瘤大小的变化除以对照肿瘤大小的变化)计算肿瘤生长抑制并以百分比表示。使用每组的平均值进行该计算：

TGI＝(1-(处理V_当前-处理V_开始)/(对照V_当前-对照V_开始))100，作为％

肿瘤消退被定义为达到负Δt。

用于流式细胞术的小鼠样品制备

对于肿瘤样品，收集肿瘤并用GentleMACS解离。将细胞悬浮液过滤并离心。然后对细胞进行计数并染色用于免疫细胞分析。用完整抗体组染色并在FACS缓冲液中制备相关对照。在Northern光仪器(CYTEK)上分析样品。使用FlowJo vl10.7.1和GraphPad Prism 8分析数据。

用于Luminex测定的小鼠样品制备

根据制造商的说明书通过多重Luminex定量评价血清样品和肿瘤上清液样品。将珠、体内样品和/或上清液以及由试剂盒提供的稀释标准品添加到板中，温育过夜。将检测抗体添加到板中并在室温处温育30分钟。洗涤板，并添加链霉亲和素-PE并在室温处温育30分钟。洗涤板，添加读数缓冲液并在室温处温育，然后用Luminex 200仪器读数。使用ProcartaPlex 1.0分析软件分析Luminex数据。将细胞因子浓度归一化为定量的上限(ULOQ)和下限(LLOQ)。将低于LLOQ的所有数据设定为标准曲线的最低点并认为是不可分析的(对于GraphPad Prism分析，不允许为零)。使用Excel和GraphPad Prism 8分析数据。

统计分析

使用GraphPad Prism 9软件分析数据。所进行的统计学分析：单向方差分析(ANOVA)，并且如果显著，则进行用PBS对照的Dunnett和Tukey多重比较，认为P<0.05是统计学显著的。显著性水平用星号表示。(***表示<0.0001；***表示0.0001；**表示0.001，并且*表示0.05)。

结果和结论

BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在Raji肿瘤细胞系衍生的异种移植物(CDX)模型中的体内剂量反应实验中进行了评估，该肿瘤细胞系表达高水平的CD38并且已经报道对Darzalex有反应(YU等人,Novel anti-CD38 humanized mAb SG003 possessedenhanced cytotoxicity in lymphoma than Daratumumab via antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity.BMC Biotechnology(2019)19:28)。仅在第0天用Raji肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组5只小鼠；8组；共40只小鼠)。异种移植12天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBS、10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的BEAT CD38/CD47-48分子以及10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的BEAT CD38/CD47-60分子，每周一次，持续3周。登记时的肿瘤体积在40-270mm³之间变化。在第12天没有可测量的肿瘤的3只小鼠被排除在进一步评估之外。

在治疗开始后15天(异种移植后27天)，对照肿瘤达到1000mm3的伦理终点并且停止研究。在所有3个剂量下评估了两种分子的肿瘤生长抑制。用BEAT CD38/CD47-48处理的3/5小鼠和用BEAT CD38/CD47-60处理的4/5小鼠在处理期间观察到肿瘤消退。肿瘤生长显示在图24和图25中。基于消退数，确定10mg/kg为有效剂量。由于肿瘤体积的高度可变性，并且没有进行事后检验，因此对D27的单向方差分析方法并不显著。

在Raji肿瘤模型中的另一个体内实验中测试了在10mg/kg处的BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60的功效。在第0天用Raji肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组10只小鼠；8组；共80只小鼠)。异种移植12天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBSIX；BEAT CD38/CD47-48分子；BEAT CD38/CD47-60分子；BEAT CD38/CD47-59分子(针对BEAT CD38/CD47-48的单臂CD38对照)和BEAT CD38/CD47-79分子(针对BEAT CD38/CD47-60的单臂CD38对照)，每周一次，共3周。所有BEAT分子均以10mg/kg注射。以16mg/kg每周两次静脉内注射Darzalex，持续3周。在第16天对每组5只动物进行离体分析。收集小鼠血清和肿瘤用于离体分析。对小鼠血清和肿瘤上清液样品进行Luminex分析。对小鼠肿瘤进行FACS分析。

异种移植后36天，对照小鼠的肿瘤超过1000mm³并终止研究。计算了肿瘤生长抑制(TGI)，所有BEAT和Darzalex均显示出47％至110％(消退)的显著TGI(表22)。BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60均显示出对肿瘤减少的显著功效(图26、图27和图28以及表22)。

表22.图26、图27和图28在第36天的统计学分析(单向方差分析(ANOVA)，随后进行 Dunnett多重比较)显示了TGI(肿瘤生长抑制)。

BEAT CD38/CD47-48在5/5小鼠中实现了消退；BEAT CD38/CD47-60在3/5小鼠中实现了消退，而Darzalex显示没有消退，并且如表23所示，Tukey事后检验显示BEAT CD38/CD47-48与CD38/CD47-60之间没有差异。在第36天，在该实验设计中，BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60显示出比Darzalex更好的功效(分别为P＝0.0003和P＝0.0076)(表23)。

表23.图26、图27和图28在第36天的统计学分析(单向方差分析(ANOVA)，随后进行 Tukey多重比较)

异种移植15天后(第一次治疗后3天)，每组处死5只动物。收集小鼠血清和肿瘤并通过Luminex和FACS进行离体分析。BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60显示了肿瘤中IL-1b水平降低的趋势(图29A)。BEAT CD38/CD47-60显示了肿瘤中MHCII+巨噬细胞的显著减少(图29B和表24)。

表24.图29B的统计分析(单向方差分析(ANOVA)，随后进行Dunnett多重比较)

总之，10mg/kg的BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在Raji异种移植小鼠模型中显示出显著的肿瘤减少功效。BEAT CD38/CD47-60显示与ADCP一致的相应巨噬细胞激活。

实施例8.2：BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在体内表达低水平CD38的KIVIS-12-BM肿瘤小鼠模型中的功效

材料和方法

动物饲养

KMS-12-BM肿瘤小鼠模型Darzalex抗性

进行一次实验并将其命名为KMS_7研究。

KMS_7研究。KMS-12-BM肿瘤中BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60的剂量递增。仅在第0天用KMS-12-BM肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组5只小鼠；9组；共45只小鼠)。异种移植15天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBS1X；BEATCD38/CD47-48分子剂量为10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg，BEAT CD38/CD47-60分子剂量为10、1mg/kg和0.1mg/kg，每周一次，持续3周。以16mg/kg每周两次静脉内注射Darzalex，持续3周。没有对这些动物进行离体分析。该实验仅进行一次。

TGI＝(1-(处理V_当前-处理V_开始)/(对照V_当前-对照V_开始))×100，作为％

肿瘤消退被定义为达到负Δt(肿瘤在研究结束时比开始时小)。

统计分析

使用GraphPad Prism 9软件分析数据。所进行的统计学分析：对肿瘤生长的单向方差分析(ANOVA)，并且如果显著，则进行用PBS对照的Dunnett和Tukey多重比较，认为P<0.05是统计学显著的。显著性水平用星号表示。(****表示<0.0001；***表示0.0001；**表示0.001，并且*表示0.05)。

结果和结论

在表达低水平CD38的KMS-12-BM肿瘤模型中的一个体内实验中测试了BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60。在第0天用KMS-12-BM肿瘤细胞对SCID小鼠进行皮下异种移植(每组5只小鼠；9组；共45只小鼠)。异种移植15天后，基于肿瘤体积将小鼠随机分配，并静脉内注射PBS、10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的BEAT CD38/CD47-48分子以及10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的BEAT CD38/CD47-60分子，每周一次，持续3周。以16mg/kg每周两次静脉内注射Darzalex，持续3周。

监测肿瘤生长，并在第37天计划的3周治疗结束时评估肿瘤生长抑制(图30和图31)。对照肿瘤平均生长300mm³，并且肿瘤生长抑制范围从Darzalex的-37％(进展比对照快，尽管这并不显著)到10mg/kg的BEAT CD38/CD47-48的86％肿瘤生长抑制(表25)。在最高剂量(10mg/kg)下，BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60在统计学上都优于PBS和Darzalex处理(表25和表26)。在第37天，BEAT CD38/CD47-48与BEAT CD38/CD47-60之间没有统计学差异(表25和表26)。

表25.图30和图31在第37天的统计分析。

在第55天，在该实验设计中，BEAT CD38/CD47-48显示出比Darzalex更好的功效(P＝0.0478)(表26)。

表26.图30和图31在第55天的统计分析。

/>

总之，与PBS对照相比，10mg/kg的BEAT CD38/CD47-48和BEAT CD38/CD47-60分别显示出86％和74％的功效和肿瘤生长抑制。

序列表

<110> 伊克诺斯科学公司

<120> CD47-CD38双特异性抗体

<130> ISB1442-01-PC00

<160> 303

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 1 - 人CD38-ECD-C-His

<400> 1

Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg

1 5 10 15

Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His

20 25 30

Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys

35 40 45

Gly Ala Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr

50 55 60

Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile

65 70 75 80

Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val

85 90 95

Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala

100 105 110

Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr

115 120 125

Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser

130 135 140

Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp

145 150 155 160

Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys

165 170 175

Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys

180 185 190

Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser

195 200 205

Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile

210 215 220

Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp

225 230 235 240

Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser

245 250 255

Glu Ile His His His His His His

260

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 2 - 食蟹猴CD38-ECD-C-His

<400> 2

Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg

1 5 10 15

Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His

20 25 30

Pro Glu Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys

35 40 45

Gly Ala Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr

50 55 60

Gln Pro Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr

65 70 75 80

Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val

85 90 95

Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala

100 105 110

Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr

115 120 125

Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser

130 135 140

Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys

165 170 175

Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys

180 185 190

Val Gln Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser

195 200 205

Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile

210 215 220

Ser Lys Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp

225 230 235 240

Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser

245 250 255

Gly Ile His His His His His His

260

<210> 3

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 3 - 人CD47(C33S)-ECD-Avi-His

<400> 3

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Ser Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Gly Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

130 135 140

Gly Gly Gly His His His His His His His His His His

145 150 155

<210> 4

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 4 - 食蟹猴CD47(C33S)-ECD-Avi-His

<400> 4

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Ser Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Pro Ala Asn Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Gly Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

130 135 140

Gly Gly Gly His His His His His His His His His His

145 150 155

<210> 5

<211> 299

<212> PRT

<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 5 - 全长人CD38

<400> 5

Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val Leu

20 25 30

Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln Gln

35 40 45

Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu Ala

50 55 60

Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val Asp

65 70 75 80

Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys His

85 90 95

Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu Gly

100 105 110

Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile Lys

115 120 125

Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr Leu

130 135 140

Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly

145 150 155 160

Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg

165 170 175

Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val Ser

180 185 190

Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu Asn

195 200 205

Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val

210 215 220

Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp

225 230 235 240

Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro

245 250 255

Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe

260 265 270

Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys

275 280 285

Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

290 295

<210> 6

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 6 - 全长食蟹猴CD38

<400> 6

Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu Ser Arg Arg Ala Gln Val Cys Leu Gly Val Cys Leu Leu Val Leu

20 25 30

Leu Ile Leu Val Val Val Val Ala Val Val Leu Pro Arg Trp Arg Gln

35 40 45

Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu

50 55 60

Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu Met Arg His Val

65 70 75 80

Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys

85 90 95

Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Val Lys Leu

100 105 110

Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu Trp Ser Arg Ile

115 120 125

Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr

130 135 140

Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys

145 150 155 160

Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp

165 170 175

Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val

180 185 190

Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val His Val Met Leu

195 200 205

Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser

210 215 220

Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Glu Ala

225 230 235 240

Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp

245 250 255

Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Arg

260 265 270

Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val

275 280 285

Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile

290 295 300

<210> 7

<211> 305

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 7 - 全长人CD47

<400> 7

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val

115 120 125

Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile

130 135 140

Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala

145 150 155 160

Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala

165 170 175

Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu

180 185 190

Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr

195 200 205

Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu

210 215 220

Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu

225 230 235 240

Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly

245 250 255

Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys

260 265 270

Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val

275 280 285

Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp

290 295 300

Glu

305

<210> 8

<211> 305

<212> PRT

<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 8 - 全长食蟹猴CD47

<400> 8

Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn

1 5 10 15

Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr

35 40 45

Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Ala Pro Ala Asn Phe Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys

100 105 110

Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val

115 120 125

Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile

130 135 140

Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala

145 150 155 160

Leu Leu Val Ala Gly Leu Met Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala

165 170 175

Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu

180 185 190

Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr

195 200 205

Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu

210 215 220

Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu

225 230 235 240

Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly

245 250 255

Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys

260 265 270

Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val

275 280 285

Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp

290 295 300

Glu

305

<210> 9

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 9 - 人SIRPa-v1-ECD(E31-H352)

<400> 9

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His

<210> 10

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 10 - Vk3-15/Jk1轻链

<400> 10

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 11 - 抗CD47-UCP01-A1 FAB重链

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Phe Phe Arg Leu Tyr

20 25 30

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Thr Asp Gly Phe Val Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Pro Tyr Gly Glu Tyr Tyr Val Val Gly

100 105 110

Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

130 135 140

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

165 170 175

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

195 200 205

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215 220

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230

<210> 12

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 12 - 抗CD47-UCP01-G1 FAB重链

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Val Glu Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Arg Asp Ser Arg Gly Lys Tyr Gly Ala Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys

225

<210> 13

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<220>

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<400> 25

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<400> 27

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 86 - 抗CD38-UCP01-H1 CDRH1

<400> 86

Gly Asp Phe Phe Ser Gly Tyr Ala Ile Asn

1 5 10

<210> 87

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 87 - 抗CD38-UCP01-C2 CDRH1

<400> 87

Gly Gly Tyr Leu Gly Ile Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 88

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 88 - 抗CD38-UCP01-E2 CDRH1

<400> 88

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

<210> 89

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 89 - 抗CD38-UCP02-A7 CDRH1

<400> 89

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Asp Met Ser

1 5 10

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 90 - 抗CD38-UCP02-B1 CDRH1

<400> 90

Gly Gly Gln Phe Ser Phe Tyr Ala Ile Asn

1 5 10

<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 91 - 抗CD38-UCP02-B7 CDRH1

<400> 91

Gly Phe Ser Phe Asn Glu Ala Trp Met Thr

1 5 10

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 92 - 抗CD38-UCP02-C3 CDRH1

<400> 92

Gly Asp Tyr Phe Asn Asn Tyr Ala Ile Asn

1 5 10

<210> 93

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 93 - 抗CD38-UCP02-D1 CDRH1

<400> 93

Gly Gly Asp Phe Asp Gln Tyr Tyr Ile Ser

1 5 10

<210> 94

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 94 - 抗CD38-UCP02-D5 CDRH1

<400> 94

Gly Gly Ile Phe Ser Val His Ala Ile His

1 5 10

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 95 - 抗CD38-UCP02-E5 CDRH1

<400> 95

Gly Gly Gly Phe Arg His Tyr Phe Ile Ser

1 5 10

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 96 - 抗CD38-UCP02-F2 CDRH1

<400> 96

Gly Asp Val Phe Ser Leu Leu Ala Ile Gly

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 97 - 抗CD38-UCP02-F5 CDRH1

<400> 97

Gly Gly Val Phe Ser Tyr Tyr Thr Ile Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 98 - 抗CD38-UCP02-F6 CDRH1

<400> 98

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Asp Met Ser

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 99 - 抗CD38-UCP02-H1 CDRH1

<400> 99

Gly Asp Lys Phe Asn Thr Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 100

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 100 - 抗CD38-UCP03-B3 CDRH1

<400> 100

Gly Gly Asp Phe Thr Leu Tyr Ser Ile Ser

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 101 - 抗CD38-UCP03-C3 CDRH1

<400> 101

Gly Gly Lys Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 102

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 102 - 抗CD38-UCP03-H5 CDRH1

<400> 102

Gly Gly Leu Phe Ser Phe Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 103

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 103 - 抗CD38-UCP03-B6 CDRH1

<400> 103

Gly Gly His Ile Ser Asn Ser Ala Ile Asn

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 104 - 抗CD38-UCP03-E3 CDRH1

<400> 104

Gly Gly Ser Phe Ser Ile Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 105 - 抗CD38-UCP03-A6 CDRH1

<400> 105

Gly Gly Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 106 - 抗CD38-UCP03-B1 CDRH1

<400> 106

Gly Gly Gly Phe Ser Lys Tyr Phe Ile Thr

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 107 - 抗CD38-UCP03-C2 CDRH1

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Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 108 - 抗CD38-UCP03-H2 CDRH1

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Gly Gly Glu Phe Ser Ile Tyr Val Ile Ser

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 109 - 抗CD38-UCP03-H3 CDRH1

<400> 109

Gly Gly Val Phe Ser Gln Phe Pro Ile Ser

1 5 10

<210> 110

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 110 - 抗CD38-E2-UCP01-A10 CDRH1

<400> 110

Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 111 - 抗CD38-E2-UCP02-E7 CDRH1

<400> 111

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 112 - 抗CD38-E2-UCP02-F3 CDRH1

<400> 112

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 113 - 抗CD38-E2-UCP02-D6 CDRH1

<400> 113

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 114 - 抗CD38-E2-UCP02-G8 CDRH1

<400> 114

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

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<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 115 - 抗CD38-E2-UCP02-F8 CDRH1

<400> 115

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 116 - 抗CD38-E2-UCP02-A5 CDRH1

<400> 116

Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

<210> 117

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 117 - 抗CD38-E2-RecA CDRH1

<400> 117

Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 118

Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 119 - 抗CD38-E2-RecC CDRH1

<400> 119

Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 120 - 抗CD38-E2-RecD CDRH1

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Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 121 - 抗CD38-B6-MP01-D9 CDRH1

<400> 121

Gly Gly Phe Phe Ser His Tyr Ile Ile Asn

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 122 - 抗CD38-B6-MP01-B4 CDRH1

<400> 122

Gly Tyr Glu Phe Asn Thr Tyr Ile Ile Asn

1 5 10

<210> 123

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 123 - 抗CD38-B6-MP02-C1 CDRH1

<400> 123

Gly Gly His Gln Leu Gly Lys Ile Ile Asn

1 5 10

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 124 - 抗CD38-B6-MP02-B10 CDRH1

<400> 124

Gly Gly His Asn Leu Gly Lys Ile Ile Asn

1 5 10

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 125 - 抗CD38-B6-MP01-H3a CDRH1

<400> 125

Gly Gly Pro Phe Asn Ala Asn Ile Val Asn

1 5 10

<210> 126

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 126 - 抗CD38-B6-MP01-H3b CDRH1

<400> 126

Gly Gly Pro Phe Gln Ser Asn Ile Val Asn

1 5 10

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 127 - 抗CD38-B6-MP01-A4 CDRH1

<400> 127

Gly Gly Pro Phe Ser Asp Tyr Val Ile Asn

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 128 - 抗CD38-B6-MP01-C2 CDRH1

<400> 128

Gly Gly Ala Phe Ser Asp Tyr Val Ile Ser

1 5 10

<210> 129

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 129 - 抗CD38-B6-MP02-C2 CDRH1

<400> 129

Gly Gly His Gly Gln Gln Arg Ile Ile Asn

1 5 10

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 130 - 抗CD38-B6-MP02-G11 CDRH1

<400> 130

Gly Gly His Thr Leu Pro Pro Ile Ile Asn

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 131 - 抗CD47-UCP01-A1 CDRH2

<400> 131

Gly Ile Ile Pro Thr Asp Gly Phe Val Gly

1 5 10

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 132 - 抗CD47-UCP01-G1 CDRH2

<400> 132

Val Ile Ser Val Glu Gly Gly Leu Thr Val

1 5 10

<210> 133

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 133 - 抗CD47-UCP01-A2 CDRH2

<400> 133

Ile Ile Ser Pro Asn Gly His Val Thr Ala

1 5 10

<210> 134

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 134 - 抗CD47-UCP01-G2 CDRH2

<400> 134

Val Ile Tyr Lys Tyr Gly Lys Thr Ser

1 5

<210> 135

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 135 - 抗CD47-UCP01-H2 CDRH2

<400> 135

Val Ile Tyr Gln Ser Gly Val Thr Arg

1 5

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 136 - 抗CD47-UCP01-A3 CDRH2

<400> 136

Val Ile Tyr Lys Tyr Gly Phe Thr Glu

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 137 - 抗CD47-UCP01-B3 CDRH2

<400> 137

Val Ile Tyr Lys Lys Gly Phe Thr Asn

1 5

<210> 138

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 138 - 抗CD47-UCP02-C1 CDRH2

<400> 138

Arg Ile Thr Ala Val Arg Gly Val Pro Thr

1 5 10

<210> 139

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 139 - 抗CD47-UCP02-H3 CDRH2

<400> 139

Gly Ile Ile Pro Thr Asp Gly Phe Val Gly

1 5 10

<210> 140

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 140 - 抗CD47-UCP02-B3 CDRH2

<400> 140

Gly Ile Ser Pro Ile Asp Gly Tyr Ala Ala

1 5 10

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 141 - 抗CD47-UCP02-C2 CDRH2

<400> 141

Leu Ile Asn Lys Asn Gly Gln Thr Gly

1 5

<210> 142

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 142 - 抗CD38-UCP01-B1 CDRH2

<400> 142

Arg Ile Ile Pro Thr Leu Gly Asp Ser Gln

1 5 10

<210> 143

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 143 - 抗CD38-UCP01-D1 CDRH2

<400> 143

Gly Ile Ile Pro Val Asn Gly Leu Ala Asp

1 5 10

<210> 144

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 144 - 抗CD38-UCP01-F1 CDRH2

<400> 144

Ser Ile Ile Pro Leu Leu Gly Asp Pro Glu

1 5 10

<210> 145

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 145 - 抗CD38-UCP01-G1 CDRH2

<400> 145

Gly Val Ile Pro Lys Ile Gly Tyr Thr Ser

1 5 10

<210> 146

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 146 - 抗CD38-UCP01-H1 CDRH2

<400> 146

Arg Ile Ile Pro Leu Leu Gly Asp Thr Tyr

1 5 10

<210> 147

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 147 - 抗CD38-UCP01-C2 CDRH2

<400> 147

Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Glu Ala Asp

1 5 10

<210> 148

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 148 - 抗CD38-UCP01-E2 CDRH2

<400> 148

Arg Ile Ile Pro Val Phe Gly Ser Ala His

1 5 10

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 149 - 抗CD38-UCP02-A7 CDRH2

<400> 149

Thr Ile Thr Leu His Gly Gly Asp Thr Tyr

1 5 10

<210> 150

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 150 - 抗CD38-UCP02-B1 CDRH2

<400> 150

Glu Ile Ile Pro Asp Tyr Gly Val Thr His

1 5 10

<210> 151

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 151 - 抗CD38-UCP02-B7 CDRH2

<400> 151

Arg Ile Lys Ser Tyr Ser Asp Gly Gly Tyr Thr Gly

1 5 10

<210> 152

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 152 - 抗CD38-UCP02-C3 CDRH2

<400> 152

Arg Ile Ile Pro Phe Leu Asp Asp Ala Asn

1 5 10

<210> 153

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 153 - 抗CD38-UCP02-D1 CDRH2

<400> 153

Arg Ile Ile Pro Thr Leu Gly Asp Ser Gln

1 5 10

<210> 154

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 154 - 抗CD38-UCP02-D5 CDRH2

<400> 154

Glu Ile Ile Pro Val Ile Gly Glu Ala Asp

1 5 10

<210> 155

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 155 - 抗CD38-UCP02-E5 CDRH2

<400> 155

Gly Ile Ile Pro Ala Ala Ala Thr Pro Tyr

1 5 10

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 156 - 抗CD38-UCP02-F2 CDRH2

<400> 156

Arg Ile Ile Pro Ser Leu Asp Ala Thr His

1 5 10

<210> 157

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 157 - 抗CD38-UCP02-F5 CDRH2

<400> 157

Arg Ile Ile Pro Ser Leu Gly Ala Thr His

1 5 10

<210> 158

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 158 - 抗CD38-UCP02-F6 CDRH2

<400> 158

Ala Val Ser Leu Tyr Gly Asp Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 159

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 159 - 抗CD38-UCP02-H1 CDRH2

<400> 159

Gly Ile Thr Pro Arg Tyr Asp Tyr Ala His

1 5 10

<210> 160

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 160 - 抗CD38-UCP03-B3 CDRH2

<400> 160

Arg Ile Ile Pro Thr Gly Ala Asn Ala Asn

1 5 10

<210> 161

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 161 - 抗CD38-UCP03-C3 CDRH2

<400> 161

Arg Ile Ile Pro Gln Ile Gly Asp Ala Ala

1 5 10

<210> 162

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 162 - 抗CD38-UCP03-H5 CDRH2

<400> 162

Gly Ile Ile Pro Phe Phe Gly Glu Pro Gln

1 5 10

<210> 163

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 163 - 抗CD38-UCP03-B6 CDRH2

<400> 163

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 164

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 164 - 抗CD38-UCP03-E3 CDRH2

<400> 164

Gly Ile Ile Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asp

1 5 10

<210> 165

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 165 - 抗CD38-UCP03-A6 CDRH2

<400> 165

Gly Ile Ile Pro Leu Leu Gly Glu Pro Val

1 5 10

<210> 166

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 166 - 抗CD38-UCP03-B1 CDRH2

<400> 166

Gly Val Ile Pro Lys Ile Gly Tyr Thr Ser

1 5 10

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 167 - 抗CD38-UCP03-C2 CDRH2

<400> 167

Gly Ile Ile Pro Ala Phe Gly Asp Ala Gly

1 5 10

<210> 168

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 168 - 抗CD38-UCP03-H2 CDRH2

<400> 168

Arg Val Ile Pro Ser Thr Gly Asp Thr Asn

1 5 10

<210> 169

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 169 - 抗CD38-UCP03-H3 CDRH2

<400> 169

Gly Ile Ile Ala Gly Tyr Gly Ala Thr Glu

1 5 10

<210> 170

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 170 - 抗CD38-E2-UCP01-A10 CDRH2

<400> 170

Arg Ile Ile Pro Val Phe Gly Ser Ala His

1 5 10

<210> 171

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 171 - 抗CD38-E2-UCP02-E7 CDRH2

<400> 171

Arg Ile Ile Pro Ala Leu Ala Ala Thr His

1 5 10

<210> 172

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 172 - 抗CD38-E2-UCP02-F3 CDRH2

<400> 172

Arg Ile Ile Pro Val Leu Asp Ala Ala His

1 5 10

<210> 173

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 173 - 抗CD38-E2-UCP02-D6 CDRH2

<400> 173

Arg Ile Ile Pro Arg Leu Asp Ala Glu His

1 5 10

<210> 174

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 174 - 抗CD38-E2-UCP02-G8 CDRH2

<400> 174

Arg Ile Ile Pro Ala Leu Gly Gly Val His

1 5 10

<210> 175

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 175 - 抗CD38-E2-UCP02-A5 CDRH2

<400> 175

Arg Ile Ile Pro Asp Leu Gly Ala Ala His

1 5 10

<210> 176

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 176 - 抗CD38-E2-UCP02-F8 CDRH2

<400> 176

Arg Ile Ile Pro Ser Leu Asp Ala Gly His

1 5 10

<210> 177

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 177 - 抗CD38-E2-RecA CDRH2

<400> 177

Arg Ile Ile Pro Arg Leu Asp Ala Glu His

1 5 10

<210> 178

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 178 - 抗CD38-E2-RecB CDRH2

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Arg Ile Ile Pro Ala Leu Ala Ala Thr His

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 179 - 抗CD38-E2-RecC CDRH2

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Arg Ile Ile Pro Val Leu Asp Ala Ala His

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 180 - 抗CD38-E2-RecD CDRH2

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Arg Ile Ile Pro Ala Leu Gly Gly Val His

1 5 10

<210> 181

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 181 - 抗CD38-B6-MP01-D9 CDRH2

<400> 181

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 182 - 抗CD38-B6-MP01-B4 CDRH2

<400> 182

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 183

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 183 - 抗CD38-B6-MP02-C1 CDRH2

<400> 183

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 184

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 184 - 抗CD38-B6-MP02-B10 CDRH2

<400> 184

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 185

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 185 - 抗CD38-B6-MP01-H3a CDRH2

<400> 185

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 186

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 186 - 抗CD38-B6-MP01-H3b CDRH2

<400> 186

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 187 - 抗CD38-B6-MP01-A4 CDRH2

<400> 187

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 188

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 188 - 抗CD38-B6-MP01-C2 CDRH2

<400> 188

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 189 - 抗CD38-B6-MP02-C2 CDRH2

<400> 189

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 190

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 190 - 抗CD38-B6-MP02-G11 CDRH2

<400> 190

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 191

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 191 - 抗CD47-UCP01-A1 CDRH3

<400> 191

Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Pro Tyr Gly Glu Tyr Tyr Val Val Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Phe Ala Tyr

20

<210> 192

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 192 - 抗CD47-UCP01-G1 CDRH3

<400> 192

Ala Arg Gly Ser Arg Asp Ser Arg Gly Lys Tyr Gly Ala Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 193

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 193 - 抗CD47-UCP01-A2 CDRH3

<400> 193

Ala Arg Asp Gly Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Val Ala Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 194

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 194 - 抗CD47-UCP01-G2 CDRH3

<400> 194

Ala Arg Gly Leu Thr Val Ser Pro Tyr Trp Gly Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 195

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 195 - 抗CD47-UCP01-H2 CDRH3

<400> 195

Ala Arg Gly Arg Tyr Gly Val Ala Gly Gly Pro Gly Tyr Ala Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 196

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 196 - 抗CD47-UCP01-A3 CDRH3

<400> 196

Ala Arg Gly Ser Ser Ile Ala Ala Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Gly Trp Met Asp Val

20

<210> 197

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 197 - 抗CD47-UCP01-B3 CDRH3

<400> 197

Ala Arg Gly Leu Ser Val Asp Lys Tyr Asp Gly Gly Pro Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 198

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 198 - 抗CD47-UCP02-C1 CDRH3

<400> 198

Ala Arg Ala Ser Tyr Gly Gly Pro Arg Tyr Tyr Trp Asp Gly Leu Asp

1 5 10 15

Ile

<210> 199

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 199 - 抗CD47-UCP02-H3 CDRH3

<400> 199

Ala Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Pro Tyr Gly Glu Tyr Tyr Val Val Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Phe Ala Tyr

20

<210> 200

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 200 - 抗CD47-UCP02-B3 CDRH3

<400> 200

Ala Arg Ser Arg Arg Pro Tyr Ser Ala Ser Ala Ser Tyr Pro Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 201

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 201 - 抗CD47-UCP02-C2 CDRH3

<400> 201

Ala Arg Ser Tyr Ala Arg Ser Ser Tyr Gln Glu Asp Tyr

1 5 10

<210> 202

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 202 - 抗CD38-UCP01-B1 CDRH3

<400> 202

Ala Arg Ala Val Ile Val Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Val Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 203

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 203 - 抗CD38-UCP01-D1 CDRH3

<400> 203

Ala Arg Thr Ile Gly Arg Tyr Ile Ile Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 204

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 204 - 抗CD38-UCP01-F1 CDRH3

<400> 204

Ala Arg Tyr Pro Tyr Pro Tyr Gly Ser Lys Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 205

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 205 - 抗CD38-UCP01-G1 CDRH3

<400> 205

Ala Arg Gly Ser Asp Asp Tyr Ala Ser Tyr Ser Pro Leu Asp Ser

1 5 10 15

<210> 206

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 206 - 抗CD38-UCP01-H1 CDRH3

<400> 206

Ala Arg Ser Ala Ala Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 207

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 207 - 抗CD38-UCP01-C2 CDRH3

<400> 207

Ala Arg Gly Gly Val Trp Trp Asp Tyr

1 5

<210> 208

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 208 - 抗CD38-UCP01-E2 CDRH3

<400> 208

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 209

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 209 - 抗CD38-UCP02-A7 CDRH3

<400> 209

Ala Arg Asp Pro Ser Tyr Ile Tyr Ser Thr Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 210

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 210 - 抗CD38-UCP02-B1 CDRH3

<400> 210

Ala Arg Trp Ser Tyr Thr Tyr Gly Ile Arg Tyr Tyr Tyr Lys Leu Phe

1 5 10 15

Asp Pro

<210> 211

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 211 - 抗CD38-UCP02-B7 CDRH3

<400> 211

Ala Arg Ser Pro Gly Ile Pro Tyr His Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 212

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 212 - 抗CD38-UCP02-C3 CDRH3

<400> 212

Ala Arg Ala Thr Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 213

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 213 - 抗CD38-UCP02-D1 CDRH3

<400> 213

Ala Arg Ala Val Ile Val Ser Pro Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Val Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 214

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 214 - 抗CD38-UCP02-D5 CDRH3

<400> 214

Ala Arg Glu Gln Tyr Tyr Tyr Ala Leu Gly Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 215

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 215 - 抗CD38-UCP02-E5 CDRH3

<400> 215

Ala Arg Gly Tyr Trp His Trp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 216

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 216 - 抗CD38-UCP02-F2 CDRH3

<400> 216

Ala Arg Gly Arg Asp Val Leu Arg Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 217

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 217 - 抗CD38-UCP02-F5 CDRH3

<400> 217

Ala Arg Ser Asp Ser Phe Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Met Asp Leu

1 5 10

<210> 218

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 218 - 抗CD38-UCP02-F6 CDRH3

<400> 218

Ala Arg Glu Pro Val Ser Tyr Asp Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 219

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 219 - 抗CD38-UCP02-H1 CDRH3

<400> 219

Ala Arg Ser Trp Gly Phe Arg Ala Gly Tyr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 220

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 220 - 抗CD38-UCP03-B3 CDRH3

<400> 220

Ala Arg Ser Trp Pro Ser Leu Gly Ser Gly Trp Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 221

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 221 - 抗CD38-UCP03-C3 CDRH3

<400> 221

Ala Arg Ala Ser Phe Leu Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 222

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 222 - 抗CD38-UCP03-H5 CDRH3

<400> 222

Ala Arg Gly Ser Tyr Arg Phe Asp Val

1 5

<210> 223

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 223 - 抗CD38-UCP03-B6 CDRH3

<400> 223

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 224

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 224 - 抗CD38-UCP03-E3 CDRH3

<400> 224

Ala Arg Gly Pro Tyr Asp Ser Tyr Gly Glu Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 225

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 225 - 抗CD38-UCP03-A6 CDRH3

<400> 225

Ala Arg Gly His Arg Val Tyr Ser Ser Ser Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 226

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 226 - 抗CD38-UCP03-B1 CDRH3

<400> 226

Ala Arg Gly Ser Asp Asp Tyr Ala Ser Tyr Ser Pro Leu Asp Ser

1 5 10 15

<210> 227

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 227 - 抗CD38-UCP03-C2 CDRH3

<400> 227

Ala Arg Gly Arg Val Leu Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 228

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 228 - 抗CD38-UCP03-H2 CDRH3

<400> 228

Ala Arg Gly Lys Ala Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Ala Ile

1 5 10

<210> 229

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 229 - 抗CD38-UCP03-H3 CDRH3

<400> 229

Ala Arg Val Tyr Gly Gly Ile Asp

1 5

<210> 230

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 230 - 抗CD38-E2-UCP01-A10 CDRH3

<400> 230

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 231

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 231 - 抗CD38-E2-UCP02-E7 CDRH3

<400> 231

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 232

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 232 - 抗CD38-E2-UCP02-F3 CDRH3

<400> 232

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 233

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 233 - 抗CD38-E2-UCP02-D6 CDRH3

<400> 233

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 234

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 234 - 抗CD38-E2-UCP02-G8 CDRH3

<400> 234

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 235

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 235 - 抗CD38-E2-UCP02-F8 CDRH3

<400> 235

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 236

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 236 - 抗CD38-E2-UCP02-A5 CDRH3

<400> 236

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 237

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 237 - 抗CD38-E2-RecA CDRH3

<400> 237

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 238

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 238 - 抗CD38-E2-RecB CDRH3

<400> 238

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 239

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 239 - 抗CD38-E2-RecC CDRH3

<400> 239

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 240

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 240 - 抗CD38-E2-RecD CDRH3

<400> 240

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 241

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 241 - 抗CD38-B6-MP01-D9 CDRH3

<400> 241

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 242

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 242 - 抗CD38-B6-MP01-B4 CDRH3

<400> 242

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 243

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 243 - 抗CD38-B6-MP02-C1 CDRH3

<400> 243

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 244

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 244 - 抗CD38-B6-MP02-B10 CDRH3

<400> 244

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 245

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 245 - 抗CD38-B6-MP01-H3a CDRH3

<400> 245

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 246

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 246 - 抗CD38-B6-MP01-H3b CDRH3

<400> 246

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 247

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 247 - 抗CD38-B6-MP01-A4 CDRH3

<400> 247

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 248

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 248 - 抗CD38-B6-MP01-C2 CDRH3

<400> 248

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 249

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 249 - 抗CD38-B6-MP02-C2 CDRH3

<400> 249

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 250

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 250 - 抗CD38-B6-MP02-G11 CDRH3

<400> 250

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 251

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 251 - 抗CD38-E2衍生物CDRH1共有序列

<400> 251

Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr Ala Ile Gln

1 5 10

<210> 252

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 252 - 抗CD38-E2衍生物CDRH2共有序列

<220>

<221> VARIANT

<222> 5,7,8,9

<223> 其中位置5处的X可以是V、A、S、D、R；其中位置7处的X可以是A、G、D；其中位置2处的X可以是G或L；其中位置8处的X可以是A、G；其中位置9处的X可以是V、A、G、T、E。

<400> 252

Arg Ile Ile Pro Xaa Phe Xaa Xaa Xaa His

1 5 10

<210> 253

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 253 - 抗CD38-E2衍生物CDRH3共有序列

<400> 253

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 254

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 254 - 抗CD38-B6衍生物CDRH1共有序列

<220>

<221> VARIANT

<222> 8,9,10

<223> 其中位置2处的X可以是G、Y；其中位置3处的X可以是F、A、P、H、E；其中位置4处的X可以是F、G、T、Q、N；其中位置5处的X可以是L、S、Q、N；其中位置6处的X可以是A、G、T、S、P、H、Q、D；其中位置7处的X可以是Y、P、N、K、R。其中位置8处的X可以是I、V；其中位置9处的X可以是I、V；其中位置10处的X可以是S、N。

<400> 254

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 255 - 抗CD38-B6衍生物CDRH2共有序列

<400> 255

Arg Val Ile Pro Val Ile Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

<210> 256

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 256 - 抗CD38-B6衍生物CDRH3共有序列

<400> 256

Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Ser Phe Tyr Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 257

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 257 - BEAT (A) Fc

<400> 257

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys

130 135 140

Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 258

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 258 - BEAT (B) Fc

<400> 258

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val

115 120 125

Ala Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Thr

130 135 140

Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp Pro Pro

165 170 175

Leu Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 259

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 259 - BEAT CD38/CD47-3, -6, -19, -38 BEAT (A) Hc

<400> 259

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Gln Ser Gly Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Tyr Gly Val Ala Gly Gly Pro Gly Tyr Ala Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Ala Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Lys Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu

405 410 415

Asn Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly

450

<210> 260

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 260 - BEAT CD38/CD47-3 BEAT (B) Hc

<400> 260

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Val Leu Asp Ala Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Glu Val Ala Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Thr Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp

385 390 395 400

Pro Pro Leu Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu

405 410 415

Arg Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly

450

<210> 261

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 261 â BEAT CD38/CD47-6 BEAT (B) Hc

<400> 261

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ser Leu Asp Ala Gly His Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Tyr Leu Tyr Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Ile

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Glu Val Ala Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Thr Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp

385 390 395 400

Pro Pro Leu Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu

405 410 415

Arg Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly

450

<210> 262

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 262 - BEAT CD38/CD47-19 BEAT (B) Hc

<400> 262

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Leu Pro Asp Ala Thr Tyr

20 25 30

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Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr

130 135 140

Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys

145 150 155 160

Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp

165 170 175

Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val

180 185 190

Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu

195 200 205

Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser

210 215 220

Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala

225 230 235 240

Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp

245 250 255

Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln

260 265 270

Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val

275 280 285

Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile

290 295 300

<210> 297

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 297- 4G T接头

<400> 297

Gly Gly Gly Thr

1

<210> 298

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> >SEQ ID NO: 298- 4GS接头

<400> 298

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 299

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有G65S突变的FAB抗CD47-H2

<400> 299

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Gln Ser Gly Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Tyr Gly Val Ala Gly Gly Pro Gly Tyr Ala Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys

225

<210> 300

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人CD47同种型OA3-323

<400> 300

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met

305 310 315 320

Asn Asp Glu

<210> 301

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人CD47同种型OA3-293

<400> 301

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val

290

<210> 302

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人CD47同种型OA3-305

<400> 302

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn

290 295 300

Asn

305

<210> 303

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人CD47同种型OA3-312

<400> 303

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn

305 310

Claims

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含至少两个结合部分，其中至少一个结合人CD38并且其中至少一个结合人CD47。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含结合人CD47的至少一个结合部分和结合人CD38的至少两个结合部分。

3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述至少两个CD38结合部分是单互补位的。

4.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述至少两个CD38结合部分是双互补位的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性抗体，其中结合人CD47的所述结合部分中的至少一个也能够结合食蟹猴CD47。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗体，其中结合人CD38的所述结合部分中的至少一个也能够结合食蟹猴CD38。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体用作药物。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，所述双特异性抗体用于治疗多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、乳腺癌诸如Her2+乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、生发中心B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、高级别浆液性卵巢癌、腹膜癌。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合人CD38的至少一个结合部分包含选自包括以下项的组的CDR组：SEQID NO:103、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:223；SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:237；SEQ ID NO:121；SEQ ID NO:181、SEQID NO:241。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合人CD47的至少一个结合部分包含包括以下项的CDR组：SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:195。

11.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含Fc区。

12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述Fc区是变体，其相对于亲本抗体的Fc区包含至少一个氨基酸修饰，而包含所述变体Fc区的所述抗体与所述亲本抗体相比表现出改变的效应子功能。

13.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中所述结合人CD47的至少一个结合部分对人CD47的亲和力低于所述结合人CD38的至少一个结合部分对人CD38的亲和力。

14.一种人CD38胞外结构域上的表位，所述表位被根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体结合。

15.一种人CD47胞外结构域上的表位，所述表位被根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体结合。

16.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体。

17.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求16所述的分离的核酸。