CN116640835A - 一种核酸原位扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸原位扩增方法，包括如下步骤：将待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行杂交形成双链结构。抗体核酸为固定在固相载体上的核酸片段，延伸核酸指在溶液中游离的核酸片段；待扩增的抗体核酸以延伸核酸为模板，在DNA聚合酶作用下，延长合成新的序列片段；并通过核酸外切酶从5端开始，选择性的水解形成双链的延伸核酸，而不会水解游离的单链形式的延伸核酸。抗体核酸上的延长合成出的新的序列片段，变成了单链形式，重新杂交结合延伸核酸开始新的循环。本发明有效快速的使原始核酸片段在原位通过延伸核酸片段的辅助，进行自我序列的反复延长，最终形成一种串联结构，且对重复序列不做限制，实现了序列的多样性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域技术领域，尤其涉及一种核酸原位扩增方法。
背景技术
免疫荧光技术，是标记免疫组织化学技术中发展最早的一种，它是在免疫学，生物化学，显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光显微技术是通过使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光的显微技术。
虽然免疫组织化学技术历史悠久，应用广泛，但是受到技术的限制，能同时检测的抗原数量有限，常规的多重免疫组织化学技术也只能检测少数的抗原（比如2-3种）。这种限制主要体现在显色上，比如免疫荧光技术，采用荧光标记，不同荧光物质的发射波长谱和吸收波长谱，容易发生重叠，为了避免互相干扰，在光谱图上只能选择相距较远的荧光物质，通常为3-4个选择。
虽然成像质谱流式（Imaging Mass Cytometry，IMC）创新性的使用金属标签抗体（主要是镧系金属）标记单细胞悬液或者组织切片样本，以质谱作为检测手段，从根本上解决了传统荧光标记技术由于光谱叠加导致的串色问题，可以实现数十种抗体标记物检测，可以对样本的细胞亚群和功能进行全面和精细的分析。但成像质谱流式的设备昂贵，难以普及。
随着空间单细胞组学的兴起，多重免疫组织化学技术的重要性越来越突出，研究人员通过循环显色的方法，在免疫荧光技术受到技术限制的条件下，仍然能够完成超高重的标记。循环显色的特点是抗体（或显色剂）进行多轮的显色和洗脱反应，虽然每个轮次只能检测少量抗原，但多轮循环后，能在同一张样本上检测多个抗原。
目前有多种洗脱的技术路线，一种是抗原和抗体结合后，洗脱旧抗体，然后再结合新抗体。由于抗原抗体的结合比较稳定，同时样本要重复使用，洗脱的时候不宜采取极端的反应条件，所以技术上比较费时费力，还有比较广泛使用的酪酰胺信号放大技术（TyramideSignal Amplification, TSA），通过利用辣根过氧化物酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法，结合抗体反复洗脱，可以检测多个抗原。
另一种洗脱技术是在抗体上结合一段特异序列的核酸，每次显色的时候，荧光基团修饰在互补的核酸序列上，通过核酸互补配对的特性进行显色。相比抗体的洗脱，核酸互补链的结合再洗脱方便很多，所以在抗原上连接一段特异的核酸，再通过荧光标记的互补核酸显色的技术路线就显得更为简洁。但这同样存在缺点，即核酸上结合的荧光基团的信号强度有限，单个荧光分子的信噪比达不到荧光显微镜的阈值。比如Akoya Biosciences公司的显微镜检测技术只能检测到至少十几个抗原聚集形成簇的时候的信号，对于分布比较稀疏的抗原，就无法检测到了。
为了增强荧光信号，也有很多技术路线，比如采用桥式核酸序列，是相同核酸序列的串联形式，美国的生命科学公司Nanostring的CosMx平台采用了该方式，信号可以放大30倍左右。但这种技术增加了反应的复杂度，溶液中增加了很多中间的桥式核酸序列，也影响了效率。另一种方式是通过核酸的原位扩增，让抗体连接的核酸片段自我延伸，形成重复序列的串联长片段。美国的生命科学公司Ultivue就是采用了这个技术路线，信号可以放大30-50倍。但是Ultivue公司的扩增技术采用了茎环结构的引物，为了控制反应，重复序列中不能含有G碱基，限制了序列的多样性，也就限制了可以同时检测的抗原的数量。
发明内容
为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种核酸原位扩增方法，可以有效快速的使得原始核酸片段在原位，通过延伸核酸片段的辅助，进行自我序列的反复延长，最终形成一种串联结构。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种核酸原位扩增方法，包括如下步骤：
S1、核酸杂交结合：将待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行杂交结合形成双链结构；所述抗体核酸为准备进行延长的核酸片段，所述延伸核酸指提供模版，辅助延伸反应的核酸片段；
S2、等温扩增：待扩增的抗体核酸以延伸核酸为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增；
S3、水解杂交核酸链：选用满足需求的核酸外切酶，在满足核酸外切酶的反应环境下，通过核酸外切酶对S2中作为模版链的延伸核酸进行水解；进一步的，是通过核酸外切酶从5端开始，选择性的水解形成双链的延伸核酸。
S4 、循环重复：经水解后剩下的抗体核酸的一端合成新的序列后以单链形式再次杂交新的游离的延伸核酸，循环重复S1-S3获得所需的延长扩增的核酸片段。
优选地，所述S1中所述延伸核酸为具有重复序列的串联形式的片段，所述重复序列与待扩增的抗体核酸片段的序列互补配对。
优选地，所述S1中待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行3端或5端的杂交结合形成双链结构。
优选地，所述S2中待扩增的抗体核酸以延伸核酸的5端序列为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增。
优选地，所述S3中的核酸外切酶为仅能水解双链形式的核酸，不能水解单链形式的核酸，且只能从核酸的5端开始水解的核酸外切酶。
优选地，所述S3中对获得的新的双链结构中延伸核酸片段的5端进行水解。
优选地，所述S4中待扩增的抗体核酸通过暴露的3端序列与新的游离的延伸核酸进行结合完成一次延长。
优选地，所述核酸外切酶包括T7核酸外切酶。
本发明的有益效果体现在：本发明实现了有效快速的使原始核酸片段在原位通过延伸核酸片段的辅助，进行自我序列的反复延长，最终形成一种串联结构，且对重复序列不做限制，实现了序列的多样性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：本发明的核酸原位扩增原理流程示意图。
图2：本发明的核酸原位扩增中产生的无效结合的结构示意图。
图3：本发明的核酸原位扩增中产生的另一种无效结合的结构示意图。
图4：本发明延伸核酸的种类结构示意图。
图5：本发明实施例一中没有扩增的荧光图片。
图6：本发明实施例一中有扩增的荧光图片。
图7：本发明实施例一中的荧光强度分布图。
图8：本发明实施例二的原理示意图。
图9：本发明实施例二中每个孔的荧光强度的分布曲线图。
图10：本发明实施例三中每种磁珠的荧光强度的分布曲线图。
图11：本发明实施例三中扩增前的磁珠的荧光图片。
图12：本发明实施例三中扩增后的磁珠的荧光图片。
图13：本发明实施例四中每种磁珠的荧光强度的分布曲线图。
图14：本发明实施例四中扩增后的磁珠在Cy3荧光通道下的图片。
图15：本发明实施例四中扩增后的磁珠在FAM荧光通道下的图片。
实施方式
本发明提出了一种核酸原位扩增方法，本发明的原理如图1所示，具体包括如下步骤：
S1、核酸杂交结合：将待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行3端或5端的杂交结合形成双链结构。本实施例中，所述抗体核酸为固定在固相载体上的核酸片段，所述延伸核酸指在溶液中游离的核酸片段；所述延伸核酸为具有重复序列的串联形式的片段，所述重复序列与待扩增的抗体核酸片段的序列互补配对。
S2、等温扩增：在满足等温扩增的反应环境下，例如，选择扩增所需的DNA聚合酶、dNTP，以及合适的离子浓度等。待扩增的抗体核酸以延伸核酸为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增；所述S2中将待扩增的抗体核酸以延伸核酸的5端与抗体核酸互补的序列为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增形成新的序列。
S3、水解杂交核酸链：选用满足需求的核酸外切酶（比如T7核酸外切酶），所述核酸外切酶的特性在于：只能水解双链形式的核酸，不能水解单链形式的核酸，并且只能从核酸的5端开始水解。
在满足核酸外切酶的反应环境下，通过核酸外切酶对S2中作为模版链的延伸核酸进行水解，而抗体核酸的3端上新合成的序列，则不会水解，而是作为单链形式，进入下一个循环。
S4 、循环重复：抗体核酸的3端上新合成的序列，再次杂交新的游离的延伸核酸，循环重复S1-S3获得所需的延长扩增。
需要说明的是，本发明中抗体核酸和延伸核酸在发生杂交时，不仅仅会产生图1的形式，还可能产生图2和图3的形式，即会产生“无效结合”。在这些情况下，抗体核酸没有得到延长扩增，但是同样会经过水解的步骤，“无效结合”的部分被水解，将重新进入新的杂交的过程。
本发明中延伸核酸的设计有多种选择，结合图4所示，其中抗体核酸，核酸序列为A，反向互补序列为a。图4中第一种为延伸核酸为a的两次串联序列示意，第二种为延伸核酸为a的三次串联序列示意。第三种为延伸核酸的5端a已经被互补链配对，只有3端的a为单链的序列示意。第四中为延伸核酸的3端被封闭，不能进行延伸。防止延伸核酸在溶液中发生非特异性延伸的序列示意。第五种为延伸核酸的3端被封闭，并且对aa串联结构中间的碱基进行硫甙修饰，阻止核酸外切酶的连续水解的序列示意。第六种为延伸核酸的3端被封闭，并且对aa串联结构中间的碱基进行硫甙修饰，同时用dUTP替代3端的a序列上的dTTP，方便后续使用USER (Uracil-Specific Excision Reagent)酶系统进行清除的序列示意。
为更好的理解本发明，以下进行具体实施例的阐述。
实施例一
基于链霉亲和素和生物素能特异性的结合，形成稳定的结构，所以采用链霉亲和素包被的酶标板（类似样本上的抗原），和亲和素修饰的核酸片段（类似抗体上的核酸片段）来作为测试平台。
本实施例用来快速有效的对核酸进行原位扩增，并且进行定性检测。
链霉亲和素包被的酶标板购买自苏州海狸生物医学工程有限公司，产品货号22351。所有的核酸序列都订购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
模拟结合在抗体上的核酸称之“抗体核酸”，其序列为：5’-CGATGGCTCAGGTA-3’，5端修饰Biotin，简写为“Biotin_seq_1”。
在扩增反应中，和抗体核酸序列互补并且呈串联结构的核酸，称之“延伸核酸”，其序列为：5-’ TACCTGAGCCATCGTACCTGAGCCATCG-3’，3端修饰C3-Space，用来阻断反应，简写为“YS_seq_1”。
显色的探针和抗体核酸序列互补，称之为“探针核酸’，其序列为：5-’TACCTGAGCCATCG-3’，3端修饰荧光染料FAM，简写为 “ Probe_seq_1-FAM”。
实验所需的酶，购自New England Biolabs中国公司，Bst 2.0 DNA Polymerase货号0537S，T7 Exonuclease货号M0263s。
荧光显微镜型号为宁波舜宇仪器有限公司的CX40正置荧光显微镜，拍摄系统是福州鑫图光电有限公司的彩色数码相机MIchrome 5 Pro。
实验步骤为：
S1、通过链霉亲和素和生物素的结合，核酸序列连接到固相表面
首先稀释生物素标记的核酸Biotin_seq_1至浓度为20nM，然后取50μL稀释液到链霉亲和素包被的酶标板的反应孔中，室温孵育2小时，然后用水洗涤3次后，移弃溶液。
S2、核酸序列在固相表面进行复制
在结合了生物素核酸的孔1中添加50μL的反应溶液，反应体系如表1所示。在孔2中添加的反应液不含Bst酶，在孔3中添加的反应液不含T7酶，在孔4中添加的反应液不含酶，各自室温反应2小时。然后用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。
S3、彻底清除双链核酸上的互补序列，形成单链结构
在每孔中添加45μL的水，5μL的T7核酸外切酶的反应缓冲液（10x），和1μL的T7核酸外切酶，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。
S4、带荧光标记的核酸探针结合到固相表面的核酸上进行显色
在每孔中添加50μL的浓度为1μm的Probe_seq_1-FAM，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜20x，曝光1秒钟，增益值设为100。
结果如图5-图7所示，图5是没有扩增的荧光图片（孔4），图6是有扩增的荧光图片（孔1）。酶标板的底部表面有移液枪的枪头的划痕，划痕处包被的链霉亲和素被刮擦丢失，所以没有荧光信号，其他的地方显示出荧光。图7为图片的荧光强度分布图。用软件提取彩色图片的每个色素点的数值，然后排序显示（0为全黑，255为最亮，中间的数值代表不同的灰度）。其中，虚线代表没有扩增的荧光强度分布，实线代表有扩增的荧光强度分布。
综上得出，在正常反应条件下，固相表面的核酸进行了自身序列的重复延伸，反应所需的DNA聚合酶和核酸外切酶必不可少。
表1-1：反应体系
| 反应成分 | 反应体积（共50µL） |
| 10X 等温扩增反应缓冲液 | 5 µL |
| 10 mMdNTPs | 7 µL |
| 100 mM MgSO4 | 6 µL |
| Bst 2.0 (8,000 U/mL) | 4µL |
| T7 核酸外切酶 | 4µL |
| H2O | 23 µL |
| YS_seq_1(50uM) | 1 µL |
表1-2：观察结果
| 反应条件 | 观察结果 | |
| 孔1 | 正常反应体系 | 荧光强度肉眼可见 |
| 孔2 | 无DNA聚合酶（Bst） | 几乎没有荧光 |
| 孔3 | 无核酸外切酶 | 几乎没有荧光 |
| 孔4 | 无DNA聚合酶和核酸外切酶 | 几乎没有荧光 |
实施例二
本实施例用来快速有效的对核酸进行原位扩增，并且进行定量检测。
为了提高实验效率，直接对延伸核酸的3端进行荧光标记，一方面可以封闭3段，另外一方面可以作为显色的探针核酸，直接结合到目标核酸上。这样扩增反应结束，就可以直接观察结果了。
同时在延伸核酸的中间部位添加多个硫甙修饰，以阻断T7核酸外切酶的连续反应，保留延伸核酸的3端部分，留在抗体核酸上，起到封闭抗体核酸的作用，避免无效反应。如图8所示。
本实施例的抗体核酸序列为：5’TCTCCCATTAGTCGG，5端修饰Biotin，简写为“Biotin_seq_2”。本实施例的延伸核酸序列为：5’-CCGACTAATGGGA*G*A*CCGACTAATGGGAGA-3’，3端修饰荧光基团FAM，简写为“YS_seq_2”，*表示硫甙修饰。
具体包括如下步骤：
首先，绘制荧光强度和核酸浓度的关系曲线
S1、首先梯度稀释生物素标记的核酸Biotin_seq_2，如表2-1所示，然后取50μL稀释液到链霉亲和素包被的酶标板的反应孔中，室温孵育2小时，然后用水洗涤3次后，移弃溶液。
S2、在每孔中添加50μL的浓度为1uM的YS_seq_2，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜20x，曝光2秒钟，增益值设为100。
然后，进行扩增反应。
S3、取50μL的Biotin_seq_2稀释液（12nM）到链霉亲和素包被的酶标板的反应孔中，室温孵育2小时，然后用水洗涤3次后，移弃溶液。
S4、在上述结合了生物素核酸的孔中添加50μL的反应溶液（三次重复），反应体系如表2-1所示。室温反应2小时。然后用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜20x，曝光2秒钟，增益值设为100。
结果如图9及表2-2所示。表2-2实验数据中显示的荧光强度为，每种Biotin_seq_2浓度对应的荧光分布曲线进行取值，然后从低到高排序，在序列的2/3处的荧光数值。
图9中，标记为Dilution的曲线，是在无扩增的条件下，对梯度稀释的不同浓度的Biotin_seq_2的荧光强度，绘制的标准曲线，其中标记为noise的曲线为设想的背景荧光噪音的曲线；标记为Amplification的点为扩增后测得的新的荧光强度。
由上可以得出，在上述反应条件下，固相表面的核酸进行了自身序列的重复延伸，延伸次数大约为50次左右。
表2-1：反应体系
| 反应成分 | 反应体积（共50μL） |
| 10X等温扩增反应缓冲液 | 5 µL |
| 10 mMdNTPs | 7 µL |
| 100 mM MgSO4 | 6 µL |
| Bst 2.0 (8,000 U/mL) | 4µL |
| T7核酸外切酶 | 4µL |
| H2O | 23 µL |
| YS_seq_2(50uM) | 1 µL |
表2-2：实验数据
| Biotin_seq_2的结合浓度 | 反应条件 | 荧光强度 | |
| 孔 1 | 333nM | 无扩增 | 61 |
| 孔 2 | 111nM | 无扩增 | 58 |
| 孔 3 | 37nM | 无扩增 | 56 |
| 孔 4 | 12nM | 无扩增 | 54 |
| 孔 5 | 4nM | 无扩增 | 50 |
| 孔 6 | 1.3 nM | 无扩增 | 52 |
| 孔 7 | 0.4 nM | 无扩增 | 51 |
| 孔 8 | 0.13nM | 无扩增 | 47 |
| 孔 9 | 0 nM | 无扩增 | 52 |
| 孔 10 | 12nM | 扩增 | 70 |
| 孔 11 | 12nM | 扩增 | 69 |
| 孔 12 | 12nM | 扩增 | 76 |
实施例三
本实施例用来快速有效的对核酸进行原位扩增，并且进行定量检测。核酸通过生物素，结合在链霉亲和素包被的磁珠上。
链霉亲和素包被的磁珠，直径为300nM，购买自苏州海狸生物医学工程有限公司。
本实施例的抗体核酸序列为：5’TCTCCCATTAGTCGG，5端修饰Biotin，简写为“Biotin_seq_2”。本实施例的延伸核酸序列为：5’-CCGACTAATGGGA*G*A*CCGACTAATGGGAGA-3’，3端修饰荧光基团FAM，简写为“YS_seq_2”，*表示硫甙修饰。
具体包括如下步骤：
首先，绘制荧光强度和核酸浓度的关系曲线
S1、首先梯度稀释生物素标记的核酸Biotin_seq_2，然后取50μL稀释液到链霉亲和素包被的磁珠溶液中，室温孵育2小时，然后用水洗涤3次后，移弃溶液。
S2、用50μL的浓度为1uM的YS_seq_2重悬磁珠，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。
然后，进行扩增反应。
S3、在上述结合了生物素核酸（浓度稀释分别4nM和1.3nM）的磁珠中，添加50μL的反应溶液（反应体系同表2-1）。室温反应2小时。然后用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。最后，置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。
结果如图10-图12所示。其中，图10中标记为Dilution的曲线，是在无扩增的条件下，对梯度稀释的不同浓度的Biotin_seq_2的荧光强度，绘制的标准曲线。图11是扩增前的磁珠的荧光图片，图12是扩增后的磁珠的荧光图片。
其中，图10标记为Amplification的星号的点，是4nM浓度的Biotin_seq_2，扩增后，测得的新的荧光强度。荧光强度明显增加，扩增反应的效率大约为50倍左右。标记为Amplification的三角形的点，是1.3nM浓度的Biotin_seq_2，扩增后测得的新的荧光强度。荧光强度明显增加，扩增反应的效率大约为50倍左右。
实施例四
本实施例采用了两种序列的延伸核酸，用来检测是否有非特异性延伸的反应，并且检测洗脱反应。
本实施例的抗体核酸序列为：5’-TGGATGTGTTACGAT-3’，5端修饰Biotin，简写为“Biotin_seq_3”。本实施例的延伸核酸序列为：5’-CCGACTAATGGGA*G*A*CCGACTAATGGGAGA-3’，3端修饰荧光基团FAM，简写为“YS_seq_2”，*表示硫甙修饰。另一条延伸核酸序列为：5’-ATCGTAACACATCC*A*T*ATCGUAACACAUCCA-3’，3端修饰荧光基团Cy3，简写为“YS_seq_3”，*表示硫甙修饰，U代表用尿嘧啶替代胸腺嘧啶。
实验所需的酶，购自New England Biolabs中国公司，USER (Uracil-SpecificExcision Reagent)酶，货号M5505s。
实验步骤为：
首先，绘制荧光强度和核酸浓度的关系曲线
S1、首先梯度稀释生物素标记的核酸Biotin_seq_3，然后取50μL稀释液到链霉亲和素包被的磁珠溶液中，室温孵育2小时，然后用水洗涤3次后，移弃溶液。
S21、用50μL的YS_seq_2和YS_seq_3混合溶液（浓度为1uM）重悬磁珠，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。
然后，进行扩增反应。
S3、在上述结合了生物素核酸（浓度稀释分别4nM和1.3nM）的磁珠中，添加50μL的反应溶液（反应体系见表4-1）。室温反应2小时。然后用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。分别用FAM和Cy3染料对应荧光通道观察，
最后，进行洗脱和再次染色。
S4、用USER酶溶液（反应条件同产品说明书）重悬扩增反应后的磁珠，室温反应15分钟，然后用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。
S5、用50μL的YS_seq_2和YS_seq_3混合溶液（浓度为1μM）重悬上述磁珠，室温反应0.5小时后，用TE溶液洗涤2次后，移弃溶液。置于荧光显微镜下观察拍照，显微镜的目镜10x，物镜40x，曝光2秒钟，增益值设为100。
结果如图13-图15所示。其中，图13中，标记为Dilution的曲线，是在无扩增的条件下，对梯度稀释的不同浓度的Biotin_seq_3的荧光强度，绘制的标准曲线。图14是扩增后的磁珠在Cy3荧光通道下的图片（清晰明亮）。图15是扩增后的磁珠在FAM荧光通道下的图片（只有背景荧光强度）。图13中标记为Amplification的星号的点，是4nM浓度的Biotin_seq_3，扩增后，测得的新的荧光强度。荧光强度明显增加，扩增反应的效率大约为50倍左右。标记为Amplification的三角形的点，是1.3nM浓度的Biotin_seq_3，扩增后测得的新的荧光强度。荧光强度明显增加，扩增反应的效率大约为50倍左右。
扩增反应后的磁珠，经过步骤四洗脱后，荧光显微镜下无法观察到荧光图案，在经过步骤五显色后，荧光图像恢复，强度不变。
由上可知，在正常反应条件下，固相表面的核酸进行了自身序列的重复延伸，其反应受到延伸核酸的指引，具有序列特异性。高浓度的其他序列的延伸核酸也不能有效的产生非特异性的延伸。固相表面的核酸延伸后和荧光标记的延伸引物结合，这种结合是可以被洗脱后再结合，反复循环的。
表4-1：反应体系
| 反应成分 | 反应体积（共50μL） |
| 10X 等温扩增反应缓冲液 | 5 µL |
| 10 mMdNTPs | 7 µL |
| 100 mM MgSO4 | 6 µL |
| Bst 2.0 (8,000 U/mL) | 4µL |
| T7核酸外切酶 | 4µL |
| H2O | 22 µL |
| YS_seq_2(50uM) | 1 µL |
| YS_seq_3(50uM) | 1 µL |
同时，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种核酸原位扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、核酸杂交结合：将待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行杂交结合形成双链结构；所述抗体核酸为准备进行延长的核酸片段，所述延伸核酸指提供模版，辅助延伸反应的核酸片段；
S2、等温扩增：待扩增的抗体核酸以延伸核酸为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增；
S3、水解杂交核酸链：选用满足需求的核酸外切酶，在满足核酸外切酶的反应环境下，通过核酸外切酶对S2中作为模版链的延伸核酸进行水解；
S4 、循环重复：经水解后剩下的抗体核酸的一端合成新的序列后以单链形式再次杂交新的游离的延伸核酸，循环重复S1-S3获得所需的延长扩增的核酸片段。
2.如权利要求1所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：所述S1中所述延伸核酸为具有重复序列的串联形式的片段，所述重复序列与待扩增的抗体核酸片段的序列互补配对。
3.如权利要求2所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：所述S1中待扩增的抗体核酸和延伸核酸进行3端或5端的杂交结合形成双链结构。
4.如权利要求3所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：所述S2中待扩增的抗体核酸以延伸核酸的5端序列为模板，在DNA聚合酶作用下结合延伸扩增。
5.如权利要求1所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：所述S3中的核酸外切酶为仅能水解双链形式的核酸，不能水解单链形式的核酸，且只能从核酸的5端开始水解的核酸外切酶。
6.如权利要求5所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：所述S3中对获得的新的双链结构中延伸核酸片段的5端进行水解。
7.如权利要求6所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：所述S4中待扩增的抗体核酸通过暴露的3端序列与新的游离的延伸核酸进行结合完成一次延长。
8.如权利要求1所述的一种核酸原位扩增方法，其特征在于：所述核酸外切酶包括T7核酸外切酶。
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