CN116637120A - 一种包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种包载β‑烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒(NMN‑HAP)及其制备方法和应用。具体地，该纳米颗粒包含β‑烟酰胺单核苷酸和羟基磷灰石。所述NMN‑HAP的制备方法包含以下步骤：取羟基磷灰石与纯水混合分散，随后用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加β‑烟酰胺单核苷酸水溶液；混合物涡旋孵育后，去除上清液。本申请提供的NMN‑HAP具有提高NMN生物利用度和体内NAD+水平的抗衰老潜力，并同时维持骨骼健康，为实现双重健康益处提供潜在的可能性。

Description

一种包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒及其制备 方法和应用
技术领域
本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种包载β-烟酰胺单核苷酸(NMN)的羟基磷灰石(HAP)纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是一种广泛存在于细胞中的辅酶，在促进代谢途径中的氧化还原反应中起着关键作用，包括柠檬酸循环、糖酵解、脂肪酸和类固醇的生物合成等。此外，NAD+还作为多种消耗NAD+的酶的必需辅基，在诸多生物过程中发挥着重要作用。衰老与细胞内NAD+水平显著下降密切相关，且NAD+平衡紊乱与多种衰老相关的疾病如神经退行性疾病和糖尿病等息息相关。因此，维持NAD+水平已成为延长健康寿命的潜在治疗策略。
由于NAD+的固有不稳定和对大多数细胞的有限生物利用度，直接补充外源性NAD+并非恢复体内NAD+水平的最佳途径。相反，通过补充NAD+的生物合成前体，如烟酰胺单核苷酸(NMN)和烟酰胺核糖(NR)，可以促进细胞内NAD+的产生，被认为是一种更为有效的方法。此外，研究发现在肠道中存在转运蛋白Slc12a8，有助于特异性吸收NMN，使其相对于其他前体更有效地提高NAD+水平。
目前市场上口服NMN产品普遍存在的一个问题是其在胃肠道和肝脏中被迅速代谢和排泄。因此，亟需要开发一种创新的NMN制剂，以提高其生物利用度。
WO2020113811A1公开了一种含NMN的生物高分子纳米球、其药物制剂或功能食品及制备方法和应用。该生物高分子纳米球包括生物高分子载体和分散于所述生物高分子载体上的NMN，且生物高分子载体呈三维网状结构，平径粒径为200-1000nm，可用于制备防治亚健康、肿瘤的药物和功能食品。
CN109350611B公开了一种包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)的NMN纳米微球，其包括NMN纳米球，NMN纳米球外部包覆有KGM纳米球，所述NMN纳米球的粒径为500-1000nm，KGM纳米球的粒径为200-1000nm。在性质不稳定的NMN外部包覆KGM纳米颗粒，KGM纳米颗粒将NMN保护在内部，防止了NMN遇光或氧后不稳定、易分解。将NMN与KGM制备为包覆复合物后，所述NMN可在一定时间内缓释，避免了立刻被胃酸分解，该复合纳米微球可用于生产口服制剂、对抗癌症。还公开了包覆KGM的NMN纳米微球的制备工艺和应用，制备工艺步骤简单、条件温和，制得的纳米微球可广泛应用于抗癌药物、保健药物、宠物药物的生产中。
上述两项专利申请中所述的纳米球径粒均大于200nm。然而，研究表明，在10-100nm范围内的颗粒粒径被认为是最理想的，因为它们在体内可展现出延长的循环时间，能够有效躲避网状内皮系统的清除作用，并具备穿透狭窄毛细血管的能力。
CN112891241B涉及化妆品领域，具体涉及一种靶向线粒体皮肤抗衰纳米组合物，包括β-烟酰胺单核苷酸NMN、其他抗衰活性成分和纳米载药载体；所述NMN占所述纳米组合物总质量的0.1～10％；所述其他抗衰活性成分包括抗氧化剂、蛋白合成促进剂、抗光老化剂以及保湿剂中的至少一种；所述纳米载药载体的原料包括促细胞渗透剂、乳化剂、助乳化剂、液体脂质和水。该申请将不同机制抗衰活性成分合理搭配，协同增效；利用纳米载药载体包裹抗衰老活性成分，改善抗衰老成分的稳定性；活性成分高效进入皮肤深层组织以及抗衰靶细胞和线粒体，实现组织和细胞双重靶向，提高了生物利用度，增加了抗衰老效果，对皮肤温和无刺激，可在化妆品中广泛应用。
CN115282117A公开了一种口腔粘膜给药的β-烟酰胺单核苷酸纳米混悬剂，其中所述β-烟酰胺单核苷酸纳米混悬剂呈水包油型纳米级液滴，所述β-烟酰胺单核苷酸纳米混悬剂包括水相成分和油相成分，其中所述油相成分包括甘油，所述水相成分包括纯水和β-烟酰胺单核苷酸。相应地，该申请还公开了β-烟酰胺单核苷酸纳米混悬剂的制造方法。该发明使得β-烟酰胺单核苷酸直接透过口腔黏膜吸收进入血液，增加了β-烟酰胺单核苷酸的吸收率，避免了胃肠道消化酶对β-烟酰胺单核苷酸的降解。
上述两项专利申请中描述的纳米组合物、纳米混悬剂的颗粒粒径分别为10-300nm、50-200nm，粒径大小是理想的。然而，这两项专利申请的制备步骤相对繁琐，涉及复杂的成分，包括乳化剂、助乳化剂和油相等。同时，这些成分的生物相容性可能并不理想。
CN113712987A涉及用于提高NAD+水平的组合物及其用途，具体地涉及包含烟酰胺单核苷酸、白藜芦醇和人参皂苷的组合物及其用途。该申请提供的组合物中的三种活性成分显示出良好的协同效果，可以显著提高脑、肝脏和肌肉组织中NAD+的水平。然而，由于该组合物不属于纳米药物传递系统，对于其在体内NMN生物利用度是否具有优势尚不清楚。
羟基磷灰石(HAP)是人体骨骼的主要无机成分，因而被广泛用作促进骨骼健康的膳食补充剂。近年来，由于HAP具有微孔纳米结构、非毒性以及优异的生物相容性和生物活性，使其成为理想的药物载体，可用于输送各种药物(从小分子到蛋白质和核酸等大分子)。然而，目前尚未发现使用HAP作为载体来包裹NMN的纳米制剂。
此外，研究表明HAP还可以增强巨噬细胞线粒体内NAD+的产生。因此，本申请旨在提供一种基于HAP的纳米药物传递系统，称为NMN-HAP，该系统将更有效地提高NMN生物利用度以及体内NAD+、NR水平，并同时维持骨骼健康，为实现双重健康益处提供潜在的可能性。
发明内容
本申请提供了一种包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒(NMN-HAP)，其包含β-烟酰胺单核苷酸和羟基磷灰石。
在本申请的一个实施方式中，所述β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的重量为2-5：1，优选为3：1。
在本申请的一个实施方式中，所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒为棒状结构，粒径为50-150nm，优选为100nm。
在本申请的一个实施方式中，所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒的包封率为45.15±1.57％。
在本申请的一个实施方式中，所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒的药物负载能力为42.42±0.71％。
本申请还提供了包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒的制备方法，其包含以下步骤：取羟基磷灰石与纯水混合分散，随后用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加β-烟酰胺单核苷酸水溶液；混合物涡旋孵育后，去除上清液。
进一步地，所述羟基磷灰石为棒状结构，粒径为50-150nm，优选为100nm。羟基磷灰石与纯水的重量比为1：5-10，优选1：7。所述混合分散的具体步骤为羟基磷灰石与纯水混合后，使用超声波进行悬浮液分散，优选使用960瓦的探头超声，优选5秒超声后休息3秒，优选持续1.5小时。所述β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的最终重量比为2-5：1，优选3：1。所述混合物涡旋孵育为在室温下孵育12小时。采用离心去除上清液，具体地为3000转/分钟离心5分钟。
在本申请的一个实施方式中，所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒的制备方法包含以下步骤：首先，将粒径约为100nm的棒状HAP与纯水按重量比为1：7混合，并使用960瓦的探头超声波，5秒超声后休息3秒，进行悬浮液分散，持续1.5小时。随后，用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加NMN水溶液。NMN与HAP的最终重量比为3：1，乙醇与纯水的最终体积比为7：3。混合物在室温下经过12小时涡旋孵育后，以3,000转/分钟的速度离心5分钟，去除上清液。
本申请制备所得的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒为棒状结构，粒径为50-150nm，优选为100nm；包封率为45.15±1.57％；药物负载能力为42.42±0.71％。
本申请还提供了所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒用于制备药物的用途，其用于预防或治疗肿瘤、衰老相关疾病，或促进骨骼健康；所述衰老相关疾病包括神经退行性疾病、糖尿病。
本申请还提供了所述包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒用于非疾病治疗目的的抗衰老、促进骨骼健康的用途；所述抗衰老包括皮肤抗衰老。
经过研究发现，本申请与现有技术相比，至少包括以下有益效果：
1、本申请提供的NMN-HAP纳米颗粒粒径约为100nm，在体内可展现出延长的循环时间、能够有效逃避网状内皮系统的清除作用，并具备穿透狭窄毛细血管的能力。实验结果证明其与游离型NMN相比，具有持续释放特性，从而延长了NMN的循环时间并提高了其生物利用度。
2、本申请提供的NMN-HAP纳米颗粒在提升血浆以及某些组织中NAD+水平方面具有持久且增强的疗效，且增强了提升NR水平的能力，并促使其作为NAD+的前体物质被组织吸收。这种效应是组织特异性的，NMN主要积累在肝脏中，且显著改善了对大脑的靶向效果，NMN-HAP在大脑中的靶向效率增加了10倍以上。
3、本申请提供的NMN-HAP纳米颗粒制备步骤更为简单，HAP具有优良的生物相容性，代谢后只释放出钙和磷离子，可供体内利用；且HAP同时具有维持骨骼健康的功效。
因此，本申请提供的NMN-HAP纳米颗粒有效地提高NMN生物利用度和体内NAD+水平，具有抗衰老潜力，并同时维持骨骼健康，为实现双重健康益处提供潜在的可能性。
附图说明
图1为NMN-HAP的电镜图(左侧显示的尺度为500nm，而右侧显示的尺度为100nm)。
图2为口服给予NMN-HAP和游离型NMN(相当于500mg/kg的NMN剂量)后大鼠的NMN平均血浆浓度-时间曲线图(n＝6；平均值±标准差)。
图3为口服给予NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP(相当于500mg/kg的NMN剂量)后大鼠中(A)NAD+和(B)NR的平均血浆浓度-时间曲线图(n＝6；平均值±标准差)。
图4为口服给予NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP(相当于500mg/kg的NMN剂量)后大鼠各组织中的NAD+水平(n＝6；平均值±标准差)。
图5为口服给予NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP(相当于500mg/kg的NMN剂量)后大鼠各组织中的NR水平(n＝6；平均值±标准差)。
具体实施方式
下面进一步结合实施例来阐述本发明；但这些实施例并不限制本发明的范围。除非另有声明，各实施例中所用的所有反应物均从商业途径获得；制备实验和产物分析检测中所用仪器设备等均为通常使用的常规仪器和设备。
实施例1：NMN-HAP的制备
首先，将粒径约为100nm的棒状HAP与纯水按重量比为1:7混合，并使用960瓦的探头超声波(5秒超声后休息3秒)进行悬浮液分散，持续1.5小时。随后，用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加NMN水溶液。NMN与HAP的最终重量比为3：1，乙醇与纯水的最终体积比为7：3。混合物在室温下经过12小时涡旋孵育后，以3,000转/分钟的速度离心5分钟，去除上清液。最后，通过加入纯水重新悬浮NMN-HAP样品(NMN含量约为65mg/mL)。
实施例2：NMN-HAP的表征
形态特征分析：采用透射电子显微镜(TEM)对NMN-HAP进行了粒径和形态分析。样品在纯水中悬浮后，沉积在碳涂覆的铜TEM网上，并利用FEI Tecnai Spirit 120kv透射电子显微镜进行观察。结果如图1所示，制备的NMN-HAP呈现出棒状结构，其粒径约为100nm。
包封率(EE％)的检测：采用高速离心法对NMN-HAP的包封率进行检测。首先，取50μL的NMN-HAP样品进行离心，转速为14,000转/分钟，时间为5分钟。随后，利用后文描述的超高效液相色谱(UHPLC)条件测定上清液中NMN的浓度。上清液中的NMN浓度被定义为游离态NMN的浓度(C1)。然后，将沉淀物溶解于50μL的0.1N盐酸中，并经过10分钟超声处理以测量其中被包封的NMN的浓度(C2)。包封率的计算公式为：EE％＝C2/(C1+C2)×100％。实验结果显示，NMN-HAP的包封率为45.15±1.57％。
药物负载能力(DL％)的检测：药物负载能力(DL％)表示NMN-HAP中单位重量HAP所负载的NMN的数量。首先，取50μL的NMN-HAP样品进行离心，转速为14,000转/分钟，时间为5分钟。随后，去除上清液，并对沉淀物进行速度真空干燥。收集干燥后的粉末并称重(W1)。然后，测量粉末中存在的NMN量(W2)。DL％的计算公式为：DL％＝W2/W1×100％。实验结果显示，NMN-HAP的药物负载能力为42.42±0.71％。
UHPLC条件：采用Agilent 1290Infinity UHPLC系统进行分析，使用WatersAcquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)。流动相由溶剂A(含0.1％甲酸的纯水)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)组成。采用梯度洗脱程序，流速为0.35mL/min，具体设置如下：0～3分钟，2～10％B；3～5分钟，10～100％B；5～6分钟，100～100％B；6～6.1分钟，100～2％B；6.1～8分钟，2～2％B。柱温设为40℃，进样体积为1μL。紫外检测波长设置为266nm。NMN储备溶液以5mg/mL的浓度在纯水中制备。通过2倍稀释法制备了一系列标准品，浓度范围在0.0625-2mg/mL之间。通过绘制峰面积(y)与相应浓度(x)的关系曲线，构建了标准曲线。
实施例3：比较NMN-HAP和游离型NMN的药代动力学
实验动物：选择健康的C57/BL6小鼠，雄性，年龄为12-14周(体重23-28克)。
分组及给药：将共计99只小鼠随机分为四组：对照组(n＝9)和三个实验组(NMN-HAP组、游离型NMN组和游离型HAP组，每组n＝30)。在NMN-HAP组中，小鼠口服NMN-HAP悬浮液(含67.94mg/mL的NMN和40.38mg/mL的HAP)，剂量相当于500mg/kg的NMN。游离型NMN组口服NMN溶液(以浓度为50mg/mL的NMN在纯水中溶解制备)的剂量为500mg/kg。游离型HAP组口服与NMN-HAP组中HAP剂量相同的HAP悬浮液。在给药后特定的时间间隔(1、4、8、12和24小时)，从每组中随机选取6只小鼠通过眼内眶采集血液后进行颈椎脱位处死。对照组的所有小鼠在时间点0进行了采血和后续处死。
血浆样品处理：使用肝素化管采集血液样品，并立即以3,000转/分钟的速度离心10分钟以分离血浆。为了提取分析物(NMN、NAD+和NR)并沉淀蛋白质，将50μL血浆样品加入200μL的预冷混合溶剂(ACN和MeOH的体积比为50:50)。混合物充分振荡，然后在冰上孵育20分钟。随后，样品以14,000转/分钟的速度在4℃下离心10分钟。得到的上清液转移到新的管中，并使用速度真空干燥。得到的残渣用50μL纯水重新溶解，随后利用UHPLC-MRM-MS进行分析。
UHPLC-MRM-MS条件：采用基于超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-QQQ-MS)分析技术对样品中NMN、NAD+和NR的含量进行检测。选用Zorbax Eclipse AAA色谱柱(4.6×150mm，3.5μm)，流动相系统由含有5mM甲酸铵和0.05％甲酸的水(pH 3.0)作为水相，甲醇作为有机相。流速为0.3mL/min。采用以下梯度洗脱程序：0～8分钟，2～5％B；8～15分钟，5～15％B；15～18分钟，15～80％B；18～18.1分，80～100％B。在正离子模式下使用电喷雾离子源(ESI)，并选择多反应监测模式(MRM)进行扫描检测。
结果：利用所获得的数据构建了NMN-HAP组和游离型NMN组的NMN血浆浓度-时间曲线，如图2所示。此外，我们计算并在表1中列出了药代动力学参数。分析结果显示，NMN-HAP与游离型NMN之间存在显著差异。相较于游离型NMN，NMN-HAP表现出更长的达到最大血浆浓度时间(Tmax)，更高的最大血浆浓度(Cmax)，更长的半衰期(t1/2)以及更低的清除率(CL)。特别值得注意的是，与游离型NMN相比，NMN-HAP的曲线下面积(AUC0-t)显著增加。这些发现表明，NMN-HAP可能具有持续释放特性，从而延长了NMN的循环时间并提高了其生物利用度。
表1.雄性C57/BL6小鼠口服NMN-HAP和游离型NMN(相当于500mg/kg剂量的NMN)后的血浆药代动力学参数；表示为平均值±标准偏差(n＝6)
Cmax：最大血浆浓度；Tmax：达到最大血浆浓度的时间；t1/2：半衰期；AUC0-t：时间0到最后一个时间点的曲线下面积；CL：清除率。
*P值＜0.05，表示两组之间存在显着差异
实施例4：比较NMN-HAP和游离型NMN的体内组织分布
组织取样及处理：在小鼠被处死后，立即收集其大脑、心脏、肝脏、肾脏、肺、骨骼肌、脾脏和胸腺等各组织，经PBS洗涤后进行称重。然后，将组织用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以5倍于组织重量的体积均质化。取100μL组织样品用于分析物的提取，另取50μL组织样品用于蛋白质的提取。所有操作均迅速进行，并将所有样品储存在-80℃直至进一步处理。对于分析物的提取，将100μL组织样品加入400μL预冷的ACN/MeOH混合溶剂(体积比为50/50)。混合物充分振荡后，在冰上孵育20分钟。随后，在4℃下以14,000rpm的速度离心10分钟，将上清液转移到新的管中，并使用速度真空干燥。残渣用50μL纯水重新溶解，并进行UHPLC-MRM-MS分析。对于蛋白质的提取，将50μL组织样品与50μL 2倍浓度的RIPA缓冲液混合。混合物充分振荡，在冰上孵育30分钟。随后，在4℃下以14,000rpm的速度离心10分钟，收集上清液，并使用Bradford法测定每个样品的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品。
结果：口服NMN-HAP或游离型NMN后，对NMN在各种组织中的分布进行了研究，确定了Tmax和AUC0-t。基于这些参数，使用以下方程计算了峰浓度比(Ce)、相对摄取速率(Re)和靶向效率(Te)：Ce＝NMN-HAP的Cmax/游离型NMN的Cmax，Re＝NMN-HAP的AUC/游离型NMN的AUC，Te＝单个组织的AUC/所有组织的AUC总和。结果见表2。研究结果显示，肝脏中的Te值超过90％，表明NMN主要积累在肝脏中。此外，大脑、肺、骨骼肌、脾脏和胸腺的Ce和Re值均超过1，表明NMN-HAP在这些组织中的分布增强。值得特别注意的是，与游离型NMN相比，NMN-HAP在大脑中的Te值增加了10倍以上，其Ce和Re值分别为5.29和13.72。这些发现表明，纳米颗粒NMN-HAP显著改善了对大脑的靶向效果。相反，NMN-HAP在心脏中的Te值比游离型NMN低2倍，其Ce和Re值分别为0.67和0.54，表明心脏中的靶向效果降低。因此，NMN-HAP对NMN的分布影响似乎具有组织特异性。
表2.NMN-HAP和游离型NMN在小鼠组织中的靶向参数(n＝6)。立即收集其、心脏、肝脏、肾脏、肺、骨骼肌、脾脏和胸腺
Ce：峰浓度比，Ce＝NMN-HAP的Cmax/游离型NMN的Cmax。
Re：相对摄取速率，Re＝NMN-HAP的AUC/游离型NMN的AUC。
Te：靶向效率，Te＝单个组织的AUC/所有组织的AUC总和。
实施例5：NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP口服后，血浆和组织中NAD+丰度的比较
NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP口服后，NAD+的血浆浓度-时间曲线如图3A所示，显示出不同的NAD+水平变化模式。NMN-HAP给药后，NAD+水平在最初的4小时内迅速上升，然后逐渐下降，直至24小时。相比之下，游离型NMN给药导致NAD+浓度在第一小时内迅速升高，然后在接下来的8小时内增长速度减慢，随后在接下来的4小时内急剧下降。这些发现表明，与游离型NMN相比，NMN-HAP给药后血浆中累积的NAD+含量更高。另一方面，游离型HAP给药导致血浆中NAD+水平在4小时内略微增加，8小时后恢复到基线水平。这些结果表明，基于HAP的NMN纳米药物输送系统在提升血浆NAD+水平方面具有更强的疗效，并表现出较低的降解速率，从而与游离型NMN相比，在体内恢复NAD+水平方面具有更卓越的能力。
此外，还检测了NMN-HAP、游离型NMN或游离型HAP口服后不同时间间隔内组织中的NAD+水平，如图4所示。在大脑、肝脏、肾脏和肺部，NMN-HAP给药后的NAD+水平最初低于游离型NMN的水平。然而，在8小时后，NMN-HAP给药后的NAD+水平显著高于游离型NMN。此外，在骨骼肌和胸腺中，NMN-HAP给药后的NAD+水平最初低于游离型NMN的水平，但在24小时时逆转趋势。相反，在心脏和脾脏中，NMN-HAP给药后的NAD+水平始终低于游离型NMN给药后的水平。有趣的是，HAP的给药似乎提高了组织中的NAD+水平，特别是在大脑、心脏、肾脏和骨骼肌中。这些结果与血浆结果一致，表明基于HAP的NMN纳米药物输送系统在提升血浆NAD+水平方面具有持久且增强的疗效。然而，需要注意的是，这种效应是组织特异性的。此外，HAP的给药效果可能也有助于提高NMN-HAP给药后观察到的更高组织NAD+水平。
实施例6：NMN-HAP、游离型NMN和游离型HAP口服后，血浆和组织中NR丰度的比较
NMN可以通过细胞外核苷酸酶的作用在血液中转化为NR，随后被组织进一步吸收并作为NAD+的前体物质。因此，口服NMN-HAP、游离型NMN或游离型HAP后，我们评估了血浆和组织中NR的水平。图3B显示了血浆中NR的浓度-时间曲线。观察到NMN-HAP和游离型NMN的给药均显著增加了血浆中的NR水平。然而，两种给药方式之间存在差异。NMN-HAP给药后，NR水平在12小时内增加，然后下降，而游离型NMN给药后，NR水平在8小时内达到峰值，然后下降。此外，与游离型NMN相比，NMN-HAP给药导致了更高的血浆NR积累。这些发现表明，基于HAP的NMN纳米药物输送系统增强了提升血浆NR水平的能力，并促使其作为NAD+的前体物质被组织吸收。另一方面，游离型HAP的给药似乎对血浆中的NR水平没有影响。
图5展示了口服NMN-HAP、游离型NMN或游离型HAP后不同时间间隔内组织中的NR水平。在大脑和肝脏中，NMN-HAP给药后最初的NR水平低于游离型NMN的水平。然而，在8小时后，NMN-HAP给药后的NR水平显著高于游离型NMN。类似地，在肾脏和骨骼肌中，NMN-HAP给药后最初的NR水平低于游离型NMN，但在24小时时逆转趋势。相反，在心脏中，NR水平始终低于游离型NMN给药后的水平。此外，给予HAP似乎能够提高组织中NR的水平，特别是在心脏、肾脏和骨骼肌中。这些NR水平在组织中的变化趋势与NAD+水平的观察结果一致。这些发现进一步强调了NMN转化为NR以及NR作为NAD+前体物质的进一步利用对于维持体内NAD+水平的重要性。
可见，本申请实施例证明了所提供的NMN-HAP纳米颗粒粒径约为100nm，具有持续释放的特性，从而延长了NMN的循环时间并提高了其生物利用度。与游离型NMN相比，NMN-HAP在大脑、肺、骨骼肌、脾脏和胸腺等组织中的分布增加，在大脑中的靶向效率增加了10倍以上。NMN-HAP显著提高了血浆以及某些组织(主要是大脑和肝脏)中NAD+和NR(NAD+的前体)水平。因此所述NMN-HAP具有提高NMN生物利用度和体内NAD+水平的抗衰老潜力，并且可以同时发挥维持骨骼健康的作用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (32)

1.一种包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，其包含β-烟酰胺单核苷酸和羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的重量为2-5：1。
3.根据权利要求2所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，所述β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的重量为3：1。
4.根据权利要求1-3任一所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，所述纳米颗粒为棒状结构，粒径为50-150nm。
5.根据权利要求4所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为100nm。
6.根据权利要求5所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，所述纳米颗粒的包封率为45.15±1.57％。
7.根据权利要求5-6任一所述的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒，所述纳米颗粒的药物负载能力为42.42±0.71％。
8.一种包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒的制备方法，其包含以下步骤：取羟基磷灰石与纯水混合分散，随后用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加β-烟酰胺单核苷酸水溶液；所得混合物涡旋孵育后，去除上清液。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒的制备方法，其中所述β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的最终重量比为2-5：1。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒的制备方法，其中所述β-烟酰胺单核苷酸与羟基磷灰石的最终重量比为3：1。
11.根据权利要求8-10任一所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石为棒状结构，粒径为50-150nm。
12.根据权利要求11所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石的粒径为100nm。
13.根据权利要求8-10、12任一所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石与纯水的重量比为1：5-10。
14.根据权利要求13所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石与纯水的重量比为1:7。
15.根据权利要求11所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石与纯水的重量比为1：5-10。
16.根据权利要求15所述的纳米颗粒的制备方法，所述羟基磷灰石与纯水的重量比为1:7。
17.根据权利要求8-10、12任一所述的纳米颗粒的制备方法，所述混合分散的具体步骤为羟基磷灰石与纯水混合后，使用超声波进行悬浮液分散。
18.根据权利要求17所述的纳米颗粒的制备方法，优选使用960瓦的探头超声，5秒超声后休息3秒，持续1.5小时。
19.根据权利要求11所述的纳米颗粒的制备方法，所述混合分散的具体步骤为羟基磷灰石与纯水混合后，使用超声波进行悬浮液分散。
20.根据权利要求19所述的纳米颗粒的制备方法，优选使用960瓦的探头超声，5秒超声后休息3秒，持续1.5小时。
21.根据权利要求8-10、12任一所述的纳米颗粒的制备方法，所述混合物涡旋孵育为在室温下孵育12小时。
22.根据权利要求11所述的纳米颗粒的制备方法，所述混合物涡旋孵育为在室温下孵育12小时。
23.根据权利要求8-10、12任一所述的纳米颗粒的制备方法，采用离心去除上清液。
24.根据权利要求23所述的纳米颗粒的制备方法，具体地为3000转/分钟离心5分钟。
25.根据权利要求11所述的纳米颗粒的制备方法，采用离心去除上清液。
26.根据权利要求25所述的纳米颗粒的制备方法，具体地为3000转/分钟离心5分钟。
27.根据权利要求8所述的纳米颗粒的制备方法，其包含以下步骤：首先，将粒径为100nm的棒状HAP与纯水按重量比为1：7混合，并使用960瓦的探头超声波，5秒超声后休息3秒，进行悬浮液分散，持续1.5小时；随后，用乙醇替换悬浮液中的纯水，并添加NMN水溶液，NMN与HAP的最终重量比为3：1，乙醇与纯水的最终体积比为7：3；混合物在室温下经过12小时涡旋孵育后，以3,000转/分钟的速度离心5分钟，去除上清液。
28.根据权利要求27所述的纳米颗粒的制备方法，所得纳米颗粒的包封率为45.15±1.57％；药物负载能力为42.42±0.71％。
29.权利要求1-7任一所述的、或权利要求8-28任一所述制备方法制得的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤、衰老相关疾病，或促进骨骼健康。
30.根据权利要求29所述的用途，所述衰老相关疾病为神经退行性疾病、糖尿病。
31.权利要求1-7任一所述的、或权利要求8-28任一所述制备方法制得的包载β-烟酰胺单核苷酸的羟基磷灰石纳米颗粒用于非疾病治疗目的的抗衰老、促进骨骼健康的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，所述抗衰老为皮肤抗衰老。
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