CN116635073A

CN116635073A - 抗marco抗体和其用途

Info

Publication number: CN116635073A
Application number: CN202180088936.2A
Authority: CN
Inventors: N·扬钱; M·斯特雷利; 杨曦; L·梁; V·斯里拉姆; J·波拉克; V·尤里克; L·黑格布洛姆; K·莫吉卡; L·G·普雷斯塔; S·米特拉
Original assignee: Develop Immune Medical Co
Current assignee: Develop Immune Medical Co
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-08-22

Abstract

本文提供了抗MARCO抗体。还提供了产生和使用抗MARCO抗体的方法。

Description

抗MARCO抗体和其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年11月18日提交的美国申请第63/115,272号和2021年9月15日提交的美国申请第63/244,662号的优先权和权益，所述申请各自通过引用整体并入本文。

序列表

本申请含有已通过EFS网提交并且据此通过引用整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝创建于20XX年某月XX日，命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt并且大小为X,XXX,XXX字节。

背景技术

肿瘤微环境的髓系群体主要包括单核细胞和嗜中性粒细胞(有时宽松地分组为髓源性抑制细胞)、巨噬细胞和树突状细胞。尽管肿瘤内髓系群体作为整体长期被视为非刺激性或抑制性的，但最近人们认识到并非所有肿瘤浸润性髓系细胞都相同。

具有胶原结构的巨噬细胞受体(MARCO，也称为SCARA2；参见HGNC:6895和NCBI:NM_006770.3，如2020年5月8日经由NCBI网站可获得；出于所有目的通过引用并入本文)属于A类清除受体家族，并表达于腹膜巨噬细胞以及脾脏和淋巴结中的巨噬细胞亚群(参见Hirano S,PLoS ONE 2015:10(11):e0142062)。最近的研究已突出了MARCO为人类癌症中的特异性TAM标志物(Lavin等人,Cell；2017:169(4)750-765)。MARCO介导未经调理的粒子和微生物(例如细菌)的巨噬细胞内化(参见Jing J,J Immunol2013；190:(12)6360-6367)。最近，MARCO已显示参与树突状细胞中TLR诱导的基因表达应答，并且可在炎性免疫应答中发挥作用(Kissick HT,PLoS oNE 2014；9(8):2104148)。

对新颖癌症治疗方法的需求仍未满足，包括选择性去除、或者重新编程或激活对刺激免疫细胞应答无效的髓系细胞(例如，T细胞或NK细胞)，从而增强肿瘤微环境内的免疫应答。

发明内容

在一些方面，本文中提供了经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合至具有胶原结构的人类巨噬细胞受体(MARCO)(SEQ ID NO:384)。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至人类MARCO的清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)。

在一些方面，本文中提供了经分离的抗体或其抗原结合片段，其结合至具有胶原结构的人类巨噬细胞受体(MARCO)(SEQ ID NO:384)的清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)。

在一些实施方案中，所述抗体包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQID NO:3)，CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)或XASEGISNDLA(SEQ ID NO:383)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少一者：MARCO(SEQ ID NO:384)的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含嵌合、人类、人源化或大鼠抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASEGISNDLA(SEQ ID NO:27)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列LASEGISNDLA(SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:61中所示的VH序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:111中所示的VH序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含SEQ ID NO:66中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含SEQ ID NO:116中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:61中所示的VH序列；并且所述VL序列包含SEQ ID NO:66中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:111中所示的VH序列；并且所述VL序列包含SEQ ID NO:116中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含与选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:65中所示的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:115中所示的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示的序列的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:70中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:120中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:65中所示的重链序列；和如SEQID NO:70中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:115中所示的重链序列；和如SEQID NO:120中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示的序列的重链序列；以及选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的重链序列；和/或与选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的轻链序列。

在一些方面，本文中提供了结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GYTFTDYAVN(SEQ ID NO:232)，CDR-H2包含序列WINTQTGKPT(SEQ ID NO:233)，CDR-H3包含序列DSYYYSSSLDY(SEQ ID NO:234)，CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ ID NO:432)或XASAGISNDLA(SEQ ID NO:381)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:238)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPWT(SEQ ID NO:239)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ ID NO:432)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASAGISNDLA(SEQ ID NO:317)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列LASAGISNDLA(SEQ ID NO:237)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:454中所示的VH序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含如SEQ ID NO:459中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含选自SEQ ID NO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:454中所示的VH序列；并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:459中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQ ID NO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含与选自SEQ ID NO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:458中所示的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示的序列的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:463中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:458中所示的重链序列；和如SEQID NO:463中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示的序列的重链序列；以及选自SEQ ID NO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的重链序列；和/或与选自SEQ ID NO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的轻链序列。

在一些方面，本文中提供了结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列KFTFSNYGMN(SEQ ID NO:142)，CDR-H2包含序列LIYYNSNNKY(SEQ ID NO:143)，CDR-H3包含序列SLTGGSDYFDS(SEQ ID NO:144)，CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ ID NO:433)或XASKSIGTFLA(SEQ ID NO:382)，其中X为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，CDR-L2包含序列SGSTLQS(SEQ ID NO:148)，并且CDR-L3包含序列QQHDEYPFT(SEQ ID NO:149)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ ID NO:433)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列KASKSIGTFLA(SEQ ID NO:147)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASKSIGTFLA(SEQ ID NO:157)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含选自SEQ ID NO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含选自SEQ ID NO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQ ID NO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含与选自SEQ ID NO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示的序列的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示的序列的重链序列和选自SEQ ID NO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与选自SEQ IDNO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或轻链序列，所述轻链序列包含与选自SEQ IDNO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在另一方面，本文中提供了结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GYTFTDYYLH(SEQ ID NO:252)，CDR-H2包含序列YINPNNAYTS(SEQ ID NO:253)，CDR-H3包含序列DTTDYYNLHFAY(SEQ ID NO:254)，CDR-L1包含序列LTSEGISNDLA(SEQ IDNO:257)，CDR-L2包含序列DASRLED(SEQ ID NO:258)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQID NO:259)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:251或261中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含如SEQ ID NO:256或266中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:251或261中所示的序列，并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:256或266中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含与SEQ ID NO:251或261中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与SEQ ID NO:256或266中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:255或265中所示的重链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:260或270中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:255或265中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:260或270中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与如SEQ ID NO:255或265中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和轻链序列，所述轻链序列包含与如SEQ ID NO:260或270中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在另一方面，本文中提供了结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GFSLTSYTLS(SEQ ID NO:362)，CDR-H2包含序列AIWGGDNTD(SEQ ID NO:363)，CDR-H3包含序列ELGGSFDY(SEQ ID NO:364)，CDR-L1包含序列KTSQNINKKLD(SEQ ID NO:367)，CDR-L2包含序列YTNNLQT(SEQ ID NO:368)，并且CDR-L3包含序列YQYDSGFT(SEQ ID NO:369)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:361或371中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含如SEQ ID NO:366或376中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含如SEQ ID NO:361或371中所示的序列，并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:366或376中所示的序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含与SEQ ID NO:361或371中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与SEQ ID NO:366或376中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含如SEQ ID NO:365或375中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:370或380中所示的轻链序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与如SEQ ID NO:365或375中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和轻链序列，所述轻链序列包含与如SEQ ID NO:370或380中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体、中性抗体、拮抗性抗体、激动剂抗体、多克隆抗体、无岩藻糖基化抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和scFv。

在一些实施方案中，所述抗体为scFv。

在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。

在一些实施方案中，所述抗体为人类抗体。

在一些实施方案中，所述抗体包含Fc区。

在一些实施方案中，所述Fc区包含人类Fc区。

在一些实施方案中，所述抗体包含活性人类Fc区。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM类的重链人类恒定区。

在一些实施方案中，所述抗体包含IgG类和选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4子类的人类重链恒定区。

在一些实施方案中，所述人类Fc区包含野生型人类IgG1 Fc区。

在一些实施方案中，所述人类Fc区包含野生型人类IgG4 Fc区。

在一些实施方案中，所述Fc区包含一个或多个氨基酸取代，其中与不存在所述一个或多个取代的Fc区相比，所述一个或多个取代导致抗体半衰期增加、ADCC活性增加、ADCP活性增加、CDC活性增加、ADCC活性降低、ADCP活性降低或CDC活性降低。

在一些实施方案中，所述Fc区结合选自由以下组成的组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb。

在一些实施方案中，所述抗体以小于或等于约0.5、1、2、3、4、5、6或7×10^-9M的KD结合至人类MARCO，如通过表面等离子体共振(SPR)测定所测量。

在一些实施方案中，所述抗体与人类MARCO的结合是二价阳离子依赖性的。

在一些实施方案中，所述抗体与人类MARCO的结合是二价阳离子非依赖性的。

在一些实施方案中，所述二价阳离子包含Ca2+或Mg2+。

在一些实施方案中，所述抗体结合人类MARCO的细胞外结构域。

在一些实施方案中，所述抗体结合至可溶性MARCO。

在一些实施方案中，所述抗体结合人类MARCO、食蟹猴MARCO或人类和食蟹猴MARCO的SRCR结构域。

在一些实施方案中，所述抗体结合人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下中的至少一者：MARCO(SEQ ID NO:384)的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。

在一些实施方案中，所述抗体具有受体-配体阻断活性。

在一些实施方案中，在与细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导至少一种细胞因子或趋化因子的表达增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导增加的NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII高单核细胞或MHCII中单核细胞。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加脾脏中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

在一些实施方案中，在施用于受试者后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导抗肿瘤记忆应答增加。

在一些实施方案中，细胞为MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述细胞为人类MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

在一些实施方案中，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。

在一些实施方案中，所述抗体结合至MARCO+细胞的细胞表面上的MARCO。

在一些实施方案中，所述抗体：与人源化PI-HX-3011、PI-HX-3031、PI-HX-3043、PI-HX-3061、PI-HX-3092抗体竞争结合至人类MARCO；结合至人类MARCO；结合至食蟹猴MARCO；结合至人类和食蟹猴MARCO；结合至人类MARCO的SRCR结构域；结合至食蟹猴MARCO的SRCR结构域；结合至人类和食蟹猴MARCO的SRCR结构域；以二价阳离子依赖性方式结合至人类或食蟹猴MARCO；以二价阳离子非依赖性方式结合至人类或食蟹猴MARCO；在结合至MARCO+细胞后刺激MARCO信号传导；在结合至MARCO+细胞后诱导一个或多个免疫信号通路；在结合至MARCO+细胞后诱导细胞因子或趋化因子分泌，任选地其中所述细胞因子或趋化因子为IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子；在结合至MARCO+细胞后，诱导NK细胞活化、B细胞调控、T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化增加；诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答；减少细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路；诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定；诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞；在结合至MARCO+细胞后调节脾脏中的B细胞；增加脾脏和/或肿瘤中的CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII高单核细胞和/或MHCII中单核细胞；增加脾脏和/或肿瘤中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞；减少脾脏和/或肿瘤中的TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞；在结合至MARCO+细胞后诱导细胞粘附、细胞骨架、趋化性和细胞迁移变化；在结合至MARCO+细胞后诱导细胞信号通路，包括粘附、迁移、趋化细胞周期、T细胞受体、吞噬作用、自噬和wnt通路；使MARCO+髓系细胞失能；或能够进行以上任何组合。

在一些实施方案中，所述抗体被用作药物。

在一些实施方案中，所述抗体被用于治疗癌症或感染。

在一些实施方案中，所述抗体被用于治疗癌症，其中所述癌症选自实体瘤和液体瘤。

在另一方面，本文中提供了编码本文中所描述的抗体、其VH、其VL、其轻链、其重链或其抗原结合部分的经分离的多核苷酸或多核苷酸集；任选地，所述经分离的多核苷酸或多核苷酸集为cDNA。

在另一方面，本文中提供了包含所述多核苷酸或多核苷酸集的载体或载体集。

在另一方面，本文中提供了包含所述多核苷酸或多核苷酸集或者所述载体或载体集的宿主细胞。

在另一方面，本文中提供了产生抗体的方法，所述方法包括用宿主细胞表达所述抗体或其抗原结合片段并分离所表达的抗体。

在另一方面，本文中提供了药物组合物，所述药物组合物包含经分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，本文中提供了药盒，所述药盒包含经分离的抗体或其抗原结合片段或药物组合物和使用说明书。

在另一方面，本文中提供了在受试者中增加免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含结合至人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)的抗体。

在一些实施方案中，所述组合物包含所述经分离的抗体或所述药物组合物。

在一些实施方案中，所述抗体具有受体-配体阻断活性。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答是适应性免疫应答。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答是先天性免疫应答。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答包括细胞的至少一种细胞因子或趋化因子的表达与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答包括NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

在一些实施方案中，在细胞接触后，所述抗体诱导在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

在一些实施方案中，所述抗体诱导增加的记忆免疫应答。

在一些实施方案中，所述细胞为MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述细胞为人类MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述受试者是人类。

在一些实施方案中，所述受试者患有癌症。

在一些实施方案中，所述癌症是实体癌。

在一些实施方案中，所述癌症是液体癌。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌(gastric cancer)、胃部癌症(stomach cancer)、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。

在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌、乳腺癌、基底样乳腺癌、卵巢癌或胃癌。

在一些实施方案中，与非肿瘤免疫细胞相比，MARCO以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

在一些实施方案中，与非肿瘤免疫细胞相比，IL-10以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

在另一方面，本文中提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含本文中所公开的抗体或其药物组合物。

在另一方面，本文中提供了治疗受试者癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的组合物。

在一些实施方案中，所述受试者先前已接受、同时正接受或随后将接受免疫疗法。

在一些实施方案中，所述免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞检查点抑制剂；和抗PD1抗体。

在一些实施方案中，所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

在另一方面，本文中提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物和免疫疗法。

在一些实施方案中，所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

在一些实施方案中，所述受试者是人类。

在一些实施方案中，所述癌症是实体癌。

在一些实施方案中，所述癌症是液体癌。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌、胃部癌症、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导抗肿瘤记忆应答增加。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述施用增加了所述受试者的免疫应答。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答包括与同种型对照抗体相比的细胞的至少一种细胞因子或趋化因子的表达，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

在一些实施方案中，所述细胞为MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述细胞为人类MARCO+细胞。

在另一方面，本文中提供了使在细胞表面上表达MARCO的髓系细胞失能的方法，所述方法包括使所述髓系细胞与抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段接触。

在另一方面，本文中提供了使在细胞表面上表达MARCO的髓系细胞失能的方法，所述方法包括使所述髓系细胞与本文中所描述的抗体或其药物组合物接触。

在一些实施方案中，所述抗体通过ADCC活性、CDC活性或ADCP活性中的至少一者使所述髓系细胞失能，任选地其中所述抗体通过ADCC活性使所述髓系细胞失能，任选地其中所述抗体通过CDC活性使所述髓系细胞失能，并且任选地其中所述抗体通过ADCP活性使所述髓系细胞失能。

在一些实施方案中，所述髓系细胞是MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述髓系细胞是人类MARCO+细胞。

在一些实施方案中，所述髓系细胞是单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

在一些实施方案中，所述髓系细胞是肿瘤内或脾脏髓系细胞。

在一些实施方案中，所述接触是在体外或体内。

在一些实施方案中，所述接触在受试者体内发生，任选地其中所述受试者患有癌症。

在一些实施方案中，所述受试者是人类。

在一些实施方案中，所述癌症是实体癌。

在一些实施方案中，所述癌症是液体癌。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述接触增加了所述受试者的免疫应答。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧通路、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

在一些实施方案中，在细胞接触后，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

在一些实施方案中，在细胞接触后，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

在一些实施方案中，所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

在一些实施方案中，测定来自受试者的样品中MARCO蛋白的表达水平包括使所述样品与抗MARCO抗体接触并进行免疫组织化学测定或可溶性MARCO测定。

在一些实施方案中，所述测定是免疫组织化学测定，并且所述抗体包括RDM5、RDM9、PI-3010.15、PI-3010.25或PI-3030.41。

附图说明

利用以下描述和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优势，在所述附图中：

图1显示肿瘤(左侧条形)相对于正常(右侧条形)组织中经排序的MARCO mRNA表达。

图2显示人类单核细胞源性巨噬细胞(MDM)中IL-10诱导MARCO RNA表达。

图3A显示不同肿瘤类型中MARCO和IL-10表达的相关性。图3B显示TREM2表达、CD45表达、IL-10表达和MARCO表达之间的相关性的热图。

图4A显示CRC中MARCO表达与患者存活概率呈负相关。图4B显示RCC中MARCO表达与患者存活概率呈负相关。图4C显示神经母细胞瘤中MARCO表达与患者存活概率呈负相关。图4D显示根据INSS阶段，MARCO表达随神经母细胞瘤疾病严重程度而增加。

图5显示相对于其他乳腺癌亚型，MARCO在基底样乳腺癌中上调。

图6A显示33种抗人类MARCO抗体与GFP-239T对照细胞(左侧条形)、表达人类MARCO的细胞(中间条形)或表达小鼠MARCO的细胞(右侧条形)的结合。图6B显示与对照细胞(GFP对照)相比，一种MARCO抗体PI-M014结合至表达huMARCO、muMARCO和CynoMARCO的细胞的流式细胞术直方图。图6C显示PI-M014和同种型对照抗体结合至表达huMARCO的细胞的滴定。图6D显示PI-M014结合至人类单核细胞源性巨噬细胞的流式细胞术直方图。

图7显示结合竞争测定的汇总，并且PI-M015和PI-M017彼此竞争结合至MARCO抗原，指示其结合至相同的MARCO表位。

图8A显示MARCO表达于人类MDM中。图8B显示MARCO表达于来自原发性人类肿瘤样品(胃癌和卵巢癌)的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中。

图9显示RDM-9514也以剂量依赖性方式阻断LDL结合至MARCO。

图10A显示RDM-9514结合至从CT26肿瘤和Py8119肿瘤分离的MHCII^高TAM和MHCII^低TAM上的表面表达的MARCO。图10B显示MARCO表达于CT26同基因型肿瘤模型中的TAM和单核细胞上。

图11A显示抗小鼠MARCO抗体PI-HX-3017(左侧条形，更名为PI-3009)、PI-HX-3016(中左侧条形，更名为PI-3008)、PI-HX-3021(中右侧条形，更名为PI-3007)和PI-HX-3012(右侧条形)各自与小鼠BMDM结合。图11B显示相同抗体也与从CT26同基因型肿瘤模型(n＝2)中的肿瘤分离的TAM(右侧条形)和单核细胞(左侧条形)上的MARCO结合。

图12显示用同种型抗体、仅PD-1抗体或PI-3008加PD-1抗体、PI-3007加PD-1抗体、PI-3009加PD-1抗体和PI-3007加PD-1抗体处理的小鼠组的肿瘤体积。

图13A显示用同种型对照抗体处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13B显示用抗PD-1抗体处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13C显示用PI-3008和抗PD-1抗体处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13D显示用PI-3009和抗PD-1抗体处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13E显示用同种型对照抗体处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13F显示用岩藻糖基化PI-3008处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13G显示用无岩藻糖基化PI-3008处理的个别小鼠的肿瘤体积。图13H显示用所指示抗体处理的小鼠的肿瘤体积。图13I显示用所指示抗体处理的小鼠的肿瘤体积。图13J显示与wt Fc PI-3008和PD-1抗体相比，用同种型对照抗体(wt Fc)处理的小鼠的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。图13K显示与死亡Fc PI-3021和PD-1抗体相比，用同种型对照抗体(效应子死亡Fc)处理的小鼠的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)。

图14显示先前已用抗MARCO和抗PD-1抗体处理的小鼠中再植入的CT26肿瘤细胞和EMT6细胞的肿瘤体积。

图15A显示PD研究的时间线。图15B显示用同种型抗体或PI-3008处理的小鼠中的CT26肿瘤体积。图15C显示第一和第二剂量之后小鼠中PI-3008抗体的定量。

图16A显示用PI-3008处理的CT26小鼠的TME内的促炎性分子表达。图16B显示用PI-3008体外或体内处理之后BMDM和CT26肿瘤中上调的基因的比较。

图17A显示PI-HX-3061VH与人类VH框架序列和三个基于PI-HX-3061的人源化VH序列的序列比较。图17B显示PI-HX-3061VL与人类VL框架序列和一个基于PI-HX-3061的人源化VL序列的序列比较。

图18显示PI-HX-3031VL与人类VL框架序列和6个基于PI-HX-3031的人源化VL序列的序列比较。

图19显示在竞争测定中与抗MARCO抗体和AF488荧光细菌一起温育的细胞的几何平均荧光强度(gMFI)。细胞与抗MARCO抗体一起预温育以剂量依赖性方式减少细菌结合和荧光信号。

图20A显示嵌合抗体与过度表达MARCO的293T细胞结合但不与PBL(外周血白细胞)中存在的免疫细胞结合。嗜酸性粒细胞结合在所有测试抗体(包括hIgG1同种型对照)中都是非特异性的。PI-3010示于左侧，PI-3030示于左侧中间，PI-3031示于右侧中间，并且同种型对照hIgG1示于右侧。图20B显示来自子宫内膜癌(原发性人类肿瘤)的TAM和单核细胞上的PI-HX-3031结合。抗体结合为右侧峰，同种型对照结合为左侧峰。

图21显示人类和小鼠MARCO中野生型SRCR结构域的序列比较以及在所指示的鼠类和人类重组变异蛋白质中进行的突变。

图22显示人类和小鼠MARCO中野生型SRCR结构域的氨基酸残基以及在所指示的重组变异蛋白质中进行的突变。

图23显示所指示抗体与重组人类SRCR MARCO hVar3蛋白的结合。

图24显示鼠类SRCR(左，Q452)和人类SRCR(右，D452)中的重叠SRCR表位残基(圈出)。

图25A显示PI-3025的PK标准校准曲线。图25B显示PI-3048的PK标准校准曲线。

图26A显示配体结合PK测定中PI-3025和PI-3048的浓度-时间概况。图26B显示总PK测定中PI-3025和PI-3048的浓度-时间概况。

图27提供来自用抗MARCO抗体处理之后的两个不同供体的hMDM中的细胞因子和其他相关基因表达(MIP-1α、IL-27、LIF、IL-1β、IL-2、IL-4、IP-10、IL-6、IL-10、CD40、IL-12p70、G-CSF、IFNγ、GM-CSF、TNFα、MIP-1β、MCP-1、MIG、gro-α、IL-1α、IL-15、MCP-3、M-CSF和VEGF-A)。

图28提供用PI-3010.15、PI-3010.25、PI-3030.41或hIgG1对照处理之后所指示基因的qPCR mRNA表达数据。

图29显示人类和小鼠MARCO mAb驱动类似的通路调控。

图30显示hDTC中通过抗MARCO抗体增加的顶部免疫活化基因和通路包括IL-2-STAT5信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、炎症应答、IFNγ应答和IFNα应答。

图31显示PI-3010.15在人类抑制性巨噬细胞(M2c)中诱导促炎性特征。

图32提供由PI-3010.15和PI-3030.41诱导的所指示细胞因子表达变化倍数的比较。

图33A显示PI-3008在来自C57BL/6小鼠的非极化巨噬细胞中诱导炎性体产生统计学上显著的IL-1β分泌。图33B显示PI-3008在来自C57BL/6小鼠的IL-10极化巨噬细胞中诱导炎性体产生统计学上显著的IL-1β分泌。图33C显示PI-3008在来自Balb/c小鼠的非极化巨噬细胞中诱导炎性体产生统计学上显著的IL-1β分泌。图33D显示PI-3008在来自Balb/c小鼠的IL-10极化巨噬细胞中诱导炎性体产生统计学上显著的IL-1β分泌。

图34A显示PI-3025(IgG1形式)和PI-3048(IgG4形式)在与0.1μg/ml LPS+ATP和1μg/ml LSP+ATP一起温育后在IL-10极化巨噬细胞中诱导统计学上显著的IL-1β分泌。图34B显示PI-3048在用1μg/ml LPS+ATP处理后诱导IL-1β分泌。PI-3025的条形示于每个组中左起第二个，PI-3048的条形示于每个组中的右侧。

图35显示与未处理条件相比，当用LPS和ATP处理时PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41诱导IL-1β产生。

图36显示PI-3008作为单一剂在EMT6模型中显示抗肿瘤活性。同种型对照抗体处理的小鼠中的肿瘤体积示于右图中，PI-3008抗体处理的小鼠中的肿瘤体积示于左图中。PI-3008处理的小鼠分组为应答者和无应答者。

图37显示PI-3008作为单一剂在E0771模型中显示抗肿瘤活性。同种型对照抗体处理的小鼠中的肿瘤体积示于右上和右下图中，PD-1抗体处理的小鼠中的肿瘤体积示于左上图中，并且PI-3008抗体处理的小鼠中的肿瘤体积示于左下图中。

图38A显示，与同种型对照相比，给与PI-3008的小鼠显示肿瘤体积存在统计学上显著的减少(p＝0.0037)。图38B显示同种型抗体和PI-3008的肿瘤生长抑制(TGI)百分比。图38C显示PI-3008和效应子死亡PI-3021二者在E0771模型中都具有抗肿瘤活性。

图39A提供E0771 PD/PK/功效研究时间线的示意图。图39B显示研究过程中经同种型对照处理的小鼠和经PI-3008处理的小鼠中的肿瘤体积。图39C提供同种型对照小鼠中的个别肿瘤体积。图39D提供PI-3008小鼠中的个别肿瘤体积。图39E提供第28天的最终肿瘤体积。图39F提供PI-3008的血清水平。

图40A提供利用PD-1抗体的单一和组合实验中的PI-3008血清浓度。图40B提供组合实验中的PD-1抗体血清浓度。

图41A提供施用同种型对照或PI-3008后用DAB染色的CD8 T细胞和NCR1(NK细胞)的IHC图像。图41B提供通过流式细胞术对炎性单核细胞浸润(CD8+T细胞、NCR1+NK细胞)的定量。图41C提供通过流式细胞术对MHCII^高Ly6C+单核细胞、DC浸润和NK1.1 NK细胞的定量。图41D提供在所指示的区域对CD206+细胞、MARCO+细胞、NCR1+细胞和CD8a+细胞的定量。

图42A提供E0771模型肿瘤上清液中由PI-3008诱导的所指示促炎性细胞因子和趋化因子的表达水平。图42B提供第2剂量后第1天在肿瘤上清液中观测到的与T细胞活化和NK细胞活化相关的所指示细胞因子的表达水平。

图43提供受体占用测定的结果。

图44A提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图44B提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图44C提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图44D提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。在每个图中，同种型样品示于配对的左侧，PI-3008样品示于配对的右侧。

图45提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏和血清中所指示免疫球蛋白类型的定量。

图46提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后在第二剂量后和研究结束时对脾脏中MARCO阳性细胞的定量。

图47A提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图47B提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图47C提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。图47D提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中所指示细胞类型的定量。

图48A提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中每个组织隔室的阳性细胞百分比的定量。图48B提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中每个组织隔室的阳性细胞百分比的定量。图48C提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中每个组织隔室的阳性细胞百分比的定量。图48D提供用同种型对照抗体或PI-3008处理后对脾脏中每个组织隔室的阳性细胞百分比的定量。在每个图中，同种型样品示于配对的左侧，PI-3008样品示于配对的右侧。

图49显示与同种型对照处理的肿瘤相比，PI-3008诱导CD8+T细胞和细胞毒性标志物颗粒酶B的增加，如通过IHC所测量的。

图50显示脾脏中边缘区巨噬细胞上MARCO水平的变化，当用非PI-3008竞争性抗小鼠MARCO IHC相容性抗体染色时，边缘区中有明显空隙。

图51A在上图显示使用高pH(ER2)表位修复条件时用2.5μg/mL RDM5染色的结直肠肿瘤组织(左)和肺肿瘤组织(右)的代表性图像。下图提供使用高pH(ER2)表位修复条件时用2.5μg/ml RDM5染色的来自肺、脾脏和肝脏的正常组织核心的代表性图像。深灰色表示表达MARCO的髓系细胞的阳性染色。图51B显示用RDM5抗体进行IHC染色后所指示癌症类型中阳性MARCO癌症病例的百分比。图51C显示用RDM5抗体进行IHC染色后所指示癌症类型中的IHC评分。

图52显示一些抗MARCO抗体与MARCO结合是钙依赖性的。

图53显示所指示的MARCO抗体与表达人类和食蟹猴MARCO的细胞系结合。

图54显示与经由瞬时转染产生的参考抗体相比，通过稳定转染方法产生的抗体与表达MARCO的细胞结合。

图55A显示RG-3000A的sMARCO校准曲线。图55B显示正常和癌症血清样品中的sMARCO水平。

图56显示MARCO抗体、PD-1抗体、组合或同种型抗体处理后B细胞缺陷小鼠中的肿瘤体积。

图57显示在4小时或24小时时由PI-3010.15或同种型抗体与所指示的激动剂组合诱导的NF-kB报告基因活性。

图58显示PI-3008处理在早期时间点在E0771模型中的肿瘤中诱导所指示的细胞因子和趋化因子。

图59显示PI-3008处理在早期时间点在E0771模型中的脾脏中诱导所指示的细胞因子和趋化因子。

图60提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第2天和第5天对所指示的肿瘤髓系细胞类型的定量。

图61提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第2天和第5天对所指示的肿瘤髓系细胞类型的定量。

图62提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第2天和第5天对所指示的肿瘤髓系细胞类型的定量。

图63提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第2天和第5天对所指示的肿瘤淋巴样细胞类型的定量。

图64提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的脾脏淋巴样细胞类型的定量。

图65提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的脾脏淋巴样或髓系细胞类型的定量。

图66提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的脾脏髓系细胞类型的定量。

图67提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的脾脏髓系细胞类型的定量。

图68提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的脾脏髓系细胞类型的定量。

图69提供施用同种型对照抗体或PI-3008后第5天对所指示的血液中细胞类型的定量。

图70显示在脾脏和肿瘤中表达MARCO的细胞中实现治疗性MARCO抗体的受体占用。

图71显示PI-3010.15诱导所指示的促炎性细胞因子的表达。

具体实施方式

定义

除非另外说明，否则权利要求和说明书中所使用的术语如下所示进行定义。

术语“改善”是指在治疗疾病状态，例如癌症疾病状态方面的任何治疗有益的结果，包括预防、减轻其严重程度或进展、缓解或治愈。

术语“原位”是指在与活生物体分开生长，例如，在组织培养物中生长的活细胞中发生的过程。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文中所使用的术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列有规定百分比的核苷酸或氨基酸残基相同，如使用以下所描述的序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可利用的其他算法)之一或通过目视检查所测量。取决于应用，“同一性”百分比可存在于所比较的序列区域上，例如功能结构域上，或替代地存在于待比较的两个序列的全长上。

就序列比较而言，通常一个序列充当与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法、通过这些算法(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)的计算机化实施或通过目视检查(通常参见Ausubel等人,下文)来进行。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

术语“足量”意指足以产生所需效果的量，例如足以调节细胞中蛋白质聚集的量。

术语“治疗有效量”是对改善疾病症状有效的量。治疗有效量可为“预防有效量”，因为预防可视为治疗。

本申请中所使用的缩写包括以下：。

必须注意，除非上下文另外明确指出，否则如说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”和“所述”包括复数个所指物。

抗体

结构

本申请提供了抗体和包含结合MARCO蛋白的抗体的组合物。此类抗体包括增加、增强或诱导免疫应答或者使髓系细胞杀灭、失能或耗竭的抗体。

术语“抗体”在本文中以其最广泛意义使用并且包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包含一个或多个特异性结合至抗原或表位的抗原结合结构域。抗体特定地包括完整抗体(例如完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。

公认免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五类主要抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干者可进一步分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA1和IgA₂。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链构成，每一对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)，例如，一对轻链和重链的同源二聚体。每条链的N末端结构域定义约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N末端至C末端分别包含VH、CH1、CH2和CH3结构域。轻链从N末端至C末端包含VL和CL结构域。IgG1重链包含介于CH1与CH2结构域之间的铰链。在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含与治疗性多肽连接的来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，在本文中所提供的抗体中发现的免疫球蛋白结构域来自或衍生自基于免疫球蛋白的构建体，例如双功能抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文中所描述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体(例如骆驼抗体)的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文中所提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体(例如牛抗体、人类抗体、骆驼抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体)的至少一个免疫球蛋白结构域。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含重链。在一个实施方案中，所述重链为IgA。在一个实施方案中，所述重链为IgD。在一个实施方案中，所述重链为IgE。在一个实施方案中，所述重链为IgG。在一个实施方案中，所述重链为IgM。在一个实施方案中，所述重链为IgG1。在一个实施方案中，所述重链为IgG2。在一个实施方案中，所述重链为IgG3。在一个实施方案中，所述重链为IgG4。在一个实施方案中，所述重链为IgA1。在一个实施方案中，所述重链为IgA2。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列方面高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的每个区域。通常，原生四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在本文中在提及形成抗原结合区的可变区部分时可互换使用。Kabat等人,U.S.Dept.of Healthand Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等人,J Mol Biol 196:901-917(1987)已描述这个特定区域，其中当彼此比较时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义提及抗体或其变体的CDR旨在落在如本文中所定义和使用的术语的范围内。涵盖特定CDR的确切残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。在提供抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可用常规方式确定构成特定CDR的残基。

CDR的氨基酸序列边界可由本领域技术人员使用多种已知编号方案中的任一种来确定，包括Kabat等人,同上(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)中所描述的那些编号方案；所述文献各自通过引用整体并入。

表A提供如通过Kabat和Chothia方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案提供残基编号。

例如，可使用抗体编号软件(例如Abnum，可得自bioinf.org.uk/abs/abnum/并且描述于Abhinandan和Martin,Immunology,2008,45:3832-3839，通过引用整体并入)指定CDR。

表A.根据Kabat和Chothia编号方案的CDR中的残基。

CDR	Kabat	Chothia
			L1	L24-L34	L24-L34
L2	L50-L56	L50-L56
			L3	L89-L97	L89-L97
H1(Kabat编号)	H31-H35B	H26-H32或H34*
			H1(Chothia编号)	H31-H35	H26-H32
H2	H50-H65	H52-H56
			H3	H95-H102	H95-H102

*当使用Kabat编号规约进行编号时，CDR-H1的C末端根据CDR的长度而在H32与H34之间变化。

当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人,同上中所报道)。除非另外陈述，否则使用EU编号方案提及本文中所描述的抗体重链恒定区中的残基。

如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个特定此种实施方案中，Fab轻链的C末端连接至单链Fab分子中Fab重链的N末端。如本文中更详细描述，scFv具有通过多肽链从其C末端连接至重链可变结构域(VH)的N末端的轻链可变结构域(VL)。替代地，scFv包含多肽链，其中VH的C末端通过多肽链连接至VL的N末端。

“Fab片段”(也称为抗原结合片段)含有轻链恒定结构域(CL)和第一重链恒定结构域(CH1)以及分别处于轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定环(CDR，也称为高变区)。Fab'片段与Fab片段的差异在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了数个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

“F(ab')₂”片段含有在铰链区附近通过二硫键连接的两个Fab'片段。F(ab')₂片段可例如通过重组方法或通过对完整抗体进行胃蛋白酶消化来产生。F(ab')片段可例如通过用β-巯基乙醇处理进行解离。

“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接二聚体。

“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽进一步包含位于VH与VL结构域之间的多肽接头，由此使得scFv能够形成所要结构以供抗原结合。关于scFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185、美国专利第5,571,894号和美国专利第5,587,458号中。

“scFv-Fc”片段包含附接至Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可附接至scFv的C末端。Fc结构域可在V_H或V_L之后，取决于scFv中可变结构域的方向(即，V_H-V_L或V_L-V_H)。可使用本领域中已知或本文中所描述的任何适合的Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包含IgG4Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包含IgG1 Fc结构域。

术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指其中抗体的一个可变结构域特异性结合至抗原而另一可变结构域不存在的分子。单结构域抗体和其片段描述于Arabi Ghahroudi等人,FEBS Letters,1998,414:521-526和Muyldermans等人,Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中，所述文献各自通过引用整体并入。单结构域抗体也称为sdAb或纳米抗体。Sdab相当稳定并且易于表达为与抗体Fc链的融合伴侣(Harmsen MM,De Haard HJ(2007).“Properties,production,and applications of camelid single-domain antibodyfragments”.Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换用于指具有与天然存在的抗体结构基本上类似的结构并且具有包含Fc区的重链的抗体。例如，当用于指IgG分子时，“全长抗体”是包含两条重链和两条轻链的抗体。

术语“表位”意指特异性结合至抗体的抗原部分。表位通常由表面可及的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于与前者的结合在变性溶剂的存在下可能丧失，而后者则不然。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基。抗体结合的表位可使用用于表位测定，例如测试与具有不同点突变的MARCO变体或与嵌合MARCO变体的抗体结合的已知技术来测定。在一些实施方案中，所述MARCO表位处于SRCR结构域中。在一些实施方案中，所述MARCO表位处于胶原样结构域中。在一些实施方案中，所述抗MARCO抗体或其抗原结合片段结合SRCR结构域。在一些实施方案中，所述抗MARCO抗体或其抗原结合片段结合胶原样结构域。

“多特异性抗体”是包含共同特异性结合两个或更多个不同表位的两个或更多个不同抗原结合结构域的抗体。两个或更多个不同表位可为相同抗原(例如，由细胞表达的单一MARCO分子)或不同抗原(例如，由相同细胞表达的不同MARCO分子，或MARCO分子和非MARCO分子)上的表位。在一些方面，多特异性抗体结合两个不同的表位(即，“双特异性抗体”)。在一些方面，多特异性抗体结合三个不同的表位(即，“三特异性抗体”)。

“单特异性抗体”是包含一个或多个特异性结合至单一表位的结合位点的抗体。单特异性抗体的实例是天然存在的IgG分子，其尽管为二价(即，具有两个抗原结合结构域)，但可识别两个抗原结合结构域中的每一个上的相同表位。结合特异性可以任何适合的化合价存在。

术语“单克隆抗体”是指来自基本上均质的抗体群体的抗体。基本上均质的抗体群体包括基本上类似并且结合相同表位的抗体，但在产生单克隆抗体期间通常可能出现的变体除外。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体选择单一抗体的方法来获得。例如，所述选择方法可为从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆的库中选择独特克隆。可进一步改变所选抗体，例如，以提高对靶标的亲和力(“亲和力成熟”)，使抗体人源化，提高其在细胞培养物中的产量，和/或降低其在受试者中的免疫原性。

“效应子功能”是指那些由抗体Fc区介导的生物活性，所述活性可能因抗体同种型而异。抗体效应子功能的实例包括活化补体依赖性细胞毒性(CDC)的C1q结合、活化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc受体结合和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、受体配体阻断、激动或拮抗。活性Fc区是能够执行基于Fc的效应子功能如ADCC、CDC和/或ADCP的区域。

抗MARCO抗体可包括本文中所描述的那些抗体，例如表中所示的克隆。在一些实施方案中，所述抗体包含替代支架。在一些实施方案中，所述抗体由替代支架组成。在一些实施方案中，所述抗体基本上由替代支架组成。在一些实施方案中，所述抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，所述抗体基本上由抗体片段组成。“MARCO抗体”、“抗MARCO抗体”或“MARCO特异性抗体”是如本文中所提供的特异性结合至抗原MARCO的抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合MARCO的细胞外结构域。在某些实施方案中，本文中所提供的MARCO抗体结合至在来自不同物种的MARCO蛋白之间或之中保守的MARCO表位。

术语“嵌合抗体”或“嵌合体抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种的抗体。

“人源化”形式的非人类抗体是含有来源于非人类抗体的极小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是来自一个或多个CDR的残基被来自非人类抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基代替的人类抗体(受体抗体)。供体抗体可为任何适合的非人类抗体，例如具有所要特异性、亲和力或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人类灵长类动物抗体。与非人类物种抗体相比，人源化抗体在其施用于人类受试者时不太可能诱导免疫应答，和/或诱导不太严重的免疫应答。在一些情况下，受体抗体的所选框架区残基被来自供体抗体的相应框架区残基代替。人源化抗体还可包含受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。可进行此类修饰以进一步精化抗体功能。如何制造人源化抗体的实例可见于美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号，所述美国专利各自通过引用整体并入。关于进一步详情，参见Jones等人,Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人,Nature,1988,332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，所述文献各自通过引用整体并入。

在一些实施方案中，所述抗体包括大鼠MARCO抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括嵌合MARCO抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括人源化MARCO抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括人类MARCO抗体。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:141中所示的大鼠VH序列相比，所述人源化MARCO抗体VH序列包含16G、19R、23A、37V、42G、48V、49S、82Q、88A、93V、114T、115L、S16G、K19R、V23A、I37V、K42G、I48V、A49S、E82Q、S88A、M93V、V114T或M115L中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VH序列包含根据EU索引编号的G16、R19、A23、V37、G42、V48、S49、Q82、A88、V93、T114、L115中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VH序列包含根据EU索引编号的I38、I48、A49、S54、Q54、A54、G56、S56、Q56、A56、S57、Q57或A57中的至少一者。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:146中所示的大鼠VL序列相比，所述人源化MARCO抗体VL序列包含2I、10S、13S、16V、18D、19R、21T、23T、25R、38Q、41G、43A、44P、50D、51A、53S、55E、58V、76S、77S、79Q、85T、99Q、V2I、Y10S、A13S、P16V、E18D、S19R、S21T、S23T、K25R、E38Q、E41G、T43A、N44P、S50D、G51A、T53S、Q55E、T58V、R76S、N77S、E79Q、V85T和S99Q中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VL序列包含根据EU索引编号的I2、S10、S13、V16、D18、R19、T21、T23、R25、Q38、G41、A43、P44、D50、A51、S53、E55、V58、S76、S77、Q79、T85或Q99中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VL序列包含根据EU索引编号的V2、R24、K24、Q38、E38、A43、T43、N44或P44中的至少一者。

在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:231中所示的大鼠VH序列相比，所述人源化MARCO抗体VH序列包含2V、9A、11V、16A、20V、38R、43Q、46E、62Q、63K、65Q、66G、68V、69T、70M、71T、72R、73D、76T、78A、79Y、80M、81E、82L、83S、84S、86R、87S、92V、94Y、96A、114T、115L、I2V、P9A、L11V、E16A、I20V、K38R、N43Q、K46E、D62Q、D63K、K65Q、Q66G、F68V、V69T、F70M、S71T、L72R、E73D、A76T、S78A、F79Y、L80M、Q81E、I82L、N83S、N84S、N86R、I87S、T92V、F94Y、T96A、V114T、M115L中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VH序列包含根据EU索引编号的V2、A9、V11、A16、V20、R38、Q43、E46、Q62、K63、Q65、G66G、V68、T69、M70、T71、R72、D73、T76、A78、Y79、M80、E81、L82、S83、S84、R86、S87、V92、Y94、A96、T114、L115中的至少一者。

在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:236中所示的大鼠VL序列相比，所述人源化MARCO抗体VL序列包含9S、15V、17D、18R、20T、22T、24R、40P、43A、45K、70D、72T、73T、76S、77L、82F、84T、86Y、100Q、106I、A9S、L15V、E17D、T18R、S20T、E22T、L24R、S40P、S43A、Q45K、R70D、S72T、K73T、D76S、M77L、E82F、D84T、F86Y、G100Q、L106I中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VL序列包含根据EU索引编号的S9、V15、D17、R18、T20、T22、R24、P40、A43、K45、D70、T72、T73、S76、L77、F82、T84、Y86、Q100或I106中的至少一者。

在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:1中所示的大鼠VH序列相比，所述人源化MARCO抗体VH序列包含1E、5Q、13K、16E、48I、61P、62S、67V、68T、76N、79S、82L、83S、85V、86T、87A、88A、92V、116T、117L、Q1E、K5Q、Q13K、Q16E、M48I、S61P、L62S、L67V、S68T、S76N、F79S、M82L、N83S、L85V、Q86T、T87A、E88A、T92V、V116T或M117L中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VH序列包含根据EU索引编号的E1、Q5、K13、E16、I48、P61、S62、V67、T68、N76、S79、L82、S83、V85、T86、A87、A88、V92、T116或L117中的至少一者。

在一些实施方案中，与如SEQ ID NO:6中所示的大鼠VL序列相比，所述人源化MARCO抗体VL序列包含9S、13A、15V、17D、18R、20T、22T、24R、40P、43A、45K、56S、70D、71F、72T、74T、77S、78L、92F、94T、96Y、100Q、9S、T13A、L15V、E17D、T18R、S20T、E22T、L24R、S40P、S43A、Q45K、D56S、R70D、Y71F、S72T、K74T、G77S、M78L、E92F、D94T、F96Y或S100Q中的至少一者。在一些实施方案中，所述人源化MARCO抗体VL序列包含根据EU索引编号的S9、T13、A13、D17、R18、T20、T22、L24、R24、N31、S31、Q31、A31、D31、P40、A43、S43、I43、K45、D56、S56、D70、Y71、F71、T72、T74、S77、L78、M78、F83、E83、T85、Y87、F87、F92、T94、S100或Q100中的至少一者。

在一个实施方案中，来自人类抗体的恒定结构域融合至非人类物种的可变结构域。在另一个实施方案中，改变非人类抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人类抗体在其施用于人类受试者时的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体与其抗原的免疫特异性结合不重要，或者对氨基酸序列进行的改变是保守改变，使得人源化抗体与所述抗原的结合并不显著不如非人类抗体与所述抗原的结合。

“人类抗体”是具有与由人类或人类细胞产生或来源于利用人类抗体谱系或人类抗体编码序列的非人类来源的抗体(例如，获自人类来源或从头设计)的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体明确排除人源化抗体。在一个实施方案中，所有可变结构域和恒定结构域都来源于人类免疫球蛋白序列(完全人类抗体)。这些抗体可通过多种方式制备，包括通过用目标抗原对小鼠进行免疫，所述小鼠经基因修饰以表达来源于人类重链和/或轻链编码基因的抗体。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含抗体片段。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体由抗体片段组成。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体基本上由抗体片段组成。在一些实施方案中，所述抗体片段为Fv片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为Fab片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为F(ab')₂片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为Fab'片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为scFv(sFv)片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为scFv-Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体片段为单结构域抗体片段。

MARCO抗体的序列

表B提供本文中所提供的示例性抗MARCO抗体的名称和SEQ ID NO。

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CDR

在一些实施方案中，结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GFSLTSYH VS(SEQ ID NO:2)，CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)或XASEGISNDLA(SEQ ID NO:383)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列LASEGISNDLA(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASEGISNDLA(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:4的CDR-H3、SEQ ID NO:3的CDR-H2、SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:9的CDR-L3、SEQ ID NO:8的CDR-L2和SEQ IDNO:7的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:4的CDR-H3、SEQID NO:3的CDR-H2、SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:9的CDR-L3、SEQ ID NO:8的CDR-L2和SEQ ID NO:27的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:4的CDR-H3、SEQ ID NO:3的CDR-H2、SEQ ID NO:2的CDR-H1、SEQ ID NO:9的CDR-L3、SEQ ID NO:8的CDR-L2和SEQ ID NO:431的CDR-L1。在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:4的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:3的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H1与SEQ ID NO:2的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L3与SEQ ID NO:9的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ IDNO:8的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ ID NO:431、383、7或27的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:4的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:3的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H1为SEQ ID NO:2的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L3为SEQ ID NO:9的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:8的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ ID NO:431、383、7或27的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GYTFTDYAVN(SEQ ID NO:232)，CDR-H2包含序列WINTQTGKPT(SEQ ID NO:233)，CDR-H3包含序列DSYYYSSSLDY(SEQ ID NO:234)，CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ ID NO:432)或XASAGISNDLA(SEQ ID NO:381)，其中X为亮氨酸(L)或精氨酸(R)，CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:238)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPWT(SEQ ID NO:239)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列LASAGISNDLA(SEQ ID NO:237)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASAGISNDLA(SEQ ID NO:317)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ IDNO:432)。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:234的CDR-H3、SEQ IDNO:233的CDR-H2、SEQ ID NO:232的CDR-H1、SEQ ID NO:239的CDR-L3、SEQ ID NO:238的CDR-L2和SEQ ID NO:237的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ IDNO:234的CDR-H3、SEQ ID NO:233的CDR-H2、SEQ ID NO:232的CDR-H1、SEQ ID NO:319的CDR-L3、SEQ ID NO:318的CDR-L2和SEQ ID NO:317的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:234的CDR-H3、SEQ ID NO:233的CDR-H2、SEQ ID NO:232的CDR-H1、SEQ ID NO:239的CDR-L3、SEQ ID NO:238的CDR-L2和SEQ ID NO:432的CDR-L1。在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:234的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:233的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H1与SEQ ID NO:232的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L3与SEQ ID NO:239的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ ID NO:238的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ ID NO:432、237、317或381的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:234的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:233的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H1为SEQ ID NO:232的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L3为SEQ IDNO:239的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:238的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ ID NO:432、237、317或381的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GYTFTDYYLH(SEQ ID NO:252)，CDR-H2包含序列YINPNNAYTS(SEQ ID NO:253)，CDR-H3包含序列DTTDYYNLHFAY(SEQ ID NO:254)，CDR-L1包含序列LTSEGISNDLA(SEQ ID NO:257)，CDR-L2包含序列DASRLED(SEQ ID NO:258)，并且CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:259)。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:254的CDR-H3、SEQ IDNO:253的CDR-H2、SEQ ID NO:252的CDR-H1、SEQ ID NO:259的CDR-L3、SEQ ID NO:258的CDR-L2和SEQ ID NO:257的CDR-L1。在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:254的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:253的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H1与SEQ IDNO:252的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L3与SEQID NO:259的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ ID NO:258的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ ID NO:257的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:254的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:253的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H1为SEQ ID NO:252的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L3为SEQ ID NO:259的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:258的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ IDNO:257的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列KFTFSNYGMN(SEQ ID NO:142)，CDR-H2包含序列LIYYNSNNKY(SEQ ID NO:143)，CDR-H3包含序列SLTGGSDYFDS(SEQ ID NO:144)，CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ ID NO:433)或XASKSIGTFLA(SEQ ID NO:382)，其中X为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，CDR-L2包含序列SGSTLQS(SEQ ID NO:148)，并且CDR-L3包含序列QQHDEYPFT(SEQ ID NO:149)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列KASKSIGTFLA(SEQ ID NO:147)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASKSIGTFLA(SEQ ID NO:157)。在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ ID NO:433)。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:144的CDR-H3、SEQ IDNO:143的CDR-H2、SEQ ID NO:142的CDR-H1、SEQ ID NO:149的CDR-L3、SEQ ID NO:148的CDR-L2和SEQ ID NO:147的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ IDNO:144的CDR-H3、SEQ ID NO:143的CDR-H2、SEQ ID NO:142的CDR-H1、SEQ ID NO:149的CDR-L3、SEQ ID NO:148的CDR-L2和SEQ ID NO:157的CDR-L1。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:144的CDR-H3、SEQ ID NO:143的CDR-H2、SEQ ID NO:142的CDR-H1、SEQ ID NO:149的CDR-L3、SEQ ID NO:148的CDR-L2和SEQ ID NO:433的CDR-L1。在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:144的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:143的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H1与SEQ ID NO:142的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L3与SEQ ID NO:149的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ ID NO:148的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ ID NO:433、382、147或157的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:144的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:143的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H1为SEQ ID NO:142的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L3为SEQ IDNO:149的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:148的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ ID NO:433、382、147或157的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：CDR-H1包含序列GFSLTSYTLS(SEQ ID NO:362)，CDR-H2包含序列AIWGGDNTD(SEQ ID NO:363)，CDR-H3包含序列ELGGSFDY(SEQ ID NO:364)，CDR-L1包含序列KTSQNINKKLD(SEQ ID NO:367)，CDR-L2包含序列YTNNLQT(SEQ ID NO:368)，并且CDR-L3包含序列YQYDSGFT(SEQ ID NO:369)。

在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:364的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:363的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H1与SEQ ID NO:362的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L3与SEQ ID NO:369的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ ID NO:368的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ ID NO:367的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:364的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:363的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H1为SEQ ID NO:362的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L3为SEQ IDNO:369的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:368的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ ID NO:367的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，本文中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3。在一些方面，所述CDR-H3与SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为选自SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2。在一些方面，所述CDR-H2与SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H2为SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1。在一些方面，所述CDR-H1与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H1为SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3，SEQID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2，和SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1。在一些实施方案中，所述CDR-H3与SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-H2与SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-H1与SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-H3为SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、437、447、457、467或477的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；所述CDR-H2为SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、513、163、173、183、193、203、213、223、233、243、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、376、436、446、456、466或476的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；并且所述CDR-H1为SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、292、302、312、322、332、342、352、362、372、435、445、455、465或475的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3。在一些方面，所述CDR-L3与SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-L3为SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2。在一些方面，所述CDR-L2与SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-L2为SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1。在一些方面，所述CDR-L1与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-L1为SEQID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。

在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3，以及SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3，SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2，以及SEQ ID NO:77、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1。在一些实施方案中，所述CDR-L3与SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，所述CDR-L2与SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且所述CDR-L1与SEQ IDNO:77、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1具有至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，所述CDR-L3为SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279、289、299、309、319、329、339、349、359、369、379、442、452、462、472或482的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；所述CDR-L2为SEQ ID NO:8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、218、228、238、248、258、268、278、288、298、308、318、328、338、348、358、368、378、441、451、461、471或481的CDR-L2，其具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且所述CDR-L1为SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277、287、297、307、317、327、337、347、357、367、377、381、382、383、440、450、460、470或480的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的V_H结构域的一至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的V_H结构域的二至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的三个CDR。在一些方面，所述CDR为Kabat CDR。在一些方面，所述CDR为Chothia CDR。在一些方面，所述CDR为AbM CDR。在一些方面，所述CDR为Contact CDR。在一些方面，所述CDR为IMGT CDR。

在一些实施方案中，所述CDR-H1为选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的CDR-H1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述CDR-H2为选自SEQ IDNO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的CDR-H2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述CDR-H3为选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的CDR-H3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的一至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的二至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的三个CDR。在一些方面，所述CDR为Kabat CDR。在一些方面，所述CDR为Chothia CDR。在一些方面，所述CDR为AbM CDR。在一些方面，所述CDR为Contact CDR。在一些方面，所述CDR为IMGT CDR。

在一些实施方案中，所述CDR-L1为选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的CDR-L1，其具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述CDR-L2为选自SEQ IDNO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366或376的VL结构域的CDR-L2，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述CDR-L3为选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的CDR-L3，其具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的一至三个CDR，以及选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的一至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的二至三个CDR，以及选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的二至三个CDR。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的VH结构域的三个CDR，以及选自SEQID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、434、444、454、464或474的VL结构域的三个CDR。在一些方面，所述CDR为Kabat CDR。在一些方面，所述CDR为Chothia CDR。在一些方面，所述CDR为AbM CDR。在一些方面，所述CDR为ContactCDR。在一些方面，所述CDR为IMGT CDR。

V_H结构域

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:1的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:21的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:121的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:181的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:191的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:221的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:241的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:261的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:351的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:371的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:434的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:444的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:454的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:464的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:474的V_H序列。

在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:1的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:21具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:21的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ IDNO:121具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:121的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:181具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ IDNO:181的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:191具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:191的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:221具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:221的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:241具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:241的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:261具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:261的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:351具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQID NO:351的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:371具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:371的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:434具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:434的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:444具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:444的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:454具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQID NO:454的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:464具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:464的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:474具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:474的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:1具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:21具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:121具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:181具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:191具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:221具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:241具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:261具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:351具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:371具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:434具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:444具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:454具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:464具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:474具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474中所提供的说明性V_H序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474中所提供的V_H序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

在一些实施方案中，如本文中所描述的抗体或抗原结合片段是由如SEQ ID NO:385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425或426中的任一者中所示的多核苷酸序列编码。

V_L结构域

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:6的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:26的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:126的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:186的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:196的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:226的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:246的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:266的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:356的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:376的V_L序列。

在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:6的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:26具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:26的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ IDNO:126具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:126的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:186具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:186的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:196具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:196的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:226具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:226的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ IDNO:246具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:246的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:266具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:266的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:356具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:356的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:376具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:376的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ IDNO:439具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:439的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:449具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:449的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:459具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:459的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ ID NO:469具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:469的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_L序列与SEQ IDNO:479具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:479的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:6具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:26具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:126具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:186具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:196具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:226具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:246具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:266具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:356具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:376的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:439的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:449的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ IDNO:459的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:469的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:479的V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中所提供的说明性V_L序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中所提供的V_L序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

V_H-V_L组合

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474的V_H序列，以及选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479的V_L序列。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:1的V_H序列和SEQ IDNO:6的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:21的V_H序列和SEQID NO:26的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:121的V_H序列和SEQ ID NO:126的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:181的V_H序列和SEQ ID NO:186的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ IDNO:191的V_H序列和SEQ ID NO:196的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:221的V_H序列和SEQ ID NO:226的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:241的V_H序列和SEQ ID NO:246的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:261的V_H序列和SEQ ID NO:266的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:351的V_H序列和SEQ ID NO:356的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:371的V_H序列和SEQ ID NO:376的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:434的V_H序列和SEQ ID NO:439的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:444的V_H序列和SEQ ID NO:449的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:454的V_H序列和SEQ ID NO:459的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:464的V_H序列和SEQID NO:469的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:474的V_H序列和SEQ ID NO:479的V_L序列。

在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQID NO:1的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:6的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:21具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:26具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:21的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:26的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:121具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:126具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:121的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:126的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:181具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:186具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:181的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:186的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:191具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:196具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:191的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:196的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:221具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:226具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:221的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:226的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:241具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:246具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:241的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:246的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:261具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:266具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:261的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:266的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:351具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:356具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:351的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:356的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:371具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:376具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:371的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:376的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:434具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:439具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:434的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:439的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:444具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:449具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:444的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:449的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:454具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:459具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:454的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:459的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:464具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:469具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:464的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:469的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。在一些实施方案中，所述V_H序列与SEQ ID NO:474具有至少70％、80％或90％同一性，并且其中所述轻链可变区与SEQ ID NO:479具有至少70％、80％或90％同一性，其中SEQ ID NO:474的任何变异都未出现在CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3内，并且其中SEQ ID NO:479的任何变异都未出现在CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3内。

在某些方面，SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474中的任一者可与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中的任一者组合。例如，SEQ ID NO:11可与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中的任一者组合。作为另一实例，SEQ ID NO:16可与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474中的任一者组合。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361或371中所提供的说明性V_H序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_H序列；以及与SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中所提供的说明性VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的V_L序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、434、444、454、464或474中所提供的VH序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代，以及SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236、246、256、266、276、286、296、306、316、326、336、346、356、366、376、439、449、459、469或479中所提供的VL序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。在一些方面，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代。在一些实施方案中，此段中所描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体来源于本文中所提供的序列，例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或者本领域中已知或本文中所描述的任何其他方法。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文中所提供的序列，并且可例如根据本文中所提供的用于获得抗体的方法从头分离。

在一些实施方案中，可变重链或可变轻链的同源性百分比将在CDR以外计算。例如，可在框架区中计算同源性百分比。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、438、448、458、468或478中所提供的重链。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、210、220、230、240、250、260、270、280、290、310、320、330、340、350、360、370、380、443、453、463、473或483中所提供的轻链。

在某些方面，SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、438、448、458、468或478中的任一者可与SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、210、220、230、240、250、260、270、280、290、310、320、330、340、350、360、370、380、443、453、463、473或483中的任一者组合。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含与SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、438、448、458、468或478中所提供的说明性V_H序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的重链序列；以及与SEQ ID NO 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、210、220、230、240、250、260、270、280、290、310、320、330、340、350、360、370、380、443、453、463、473或483中所提供的说明性VL序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的轻链序列。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145、155、165、175、185、195、205、215、225、235、245、255、265、275、285、295、305、315、325、335、345、355、365、375、438、448、458、468或478中所提供的重链序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代；以及SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、210、220、230、240、250、260、270、280、290、310、320、330、340、350、360、370、380、443、453、463、473或483中所提供的轻链序列，其具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸取代。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段多核苷酸序列包含如SEQ ID NO:427或430中所示的信号序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段多肽序列包含如SEQ IDNO:428或429中所示的信号序列。

Fc区

术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链C末端区域。所述术语包括原生序列Fc区和变异Fc区。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。如本文所用，二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽之一，即，包含免疫球蛋白重链C末端恒定区的多肽，其能够进行稳定自缔合。例如，二聚IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。Fc可属于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类，并且这些类别中的若干种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。

术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合至抗体Fc区的受体。例如，FcR可为天然序列人类FcR。通常，FcR为结合IgG抗体的Fc受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要差异在于其细胞质结构域。其他同种型的免疫球蛋白也可被某些FcR结合(参见例如Janeway等人,Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier ScienceLtd.,NY)(第4版,1999))。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述于Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中)。FcR综述于以下文献中：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。在本文中，术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的那些FcR。所述术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。

在一些实施方案中，抗体为IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗体为IgG3抗体。

在一些实施方案中，抗体为IgG2抗体。

在一些实施方案中，抗体为IgG4抗体。

CH2结构域中的修饰可能影响FcR与Fc的结合。本领域中已知Fc区中的许多氨基酸修饰选择性地改变Fc对不同Fc-γ(Fcγ)受体的亲和力。在一个实施方案中，Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。

在一些实施方案中，本文中所描述的抗体包括改进其介导效应子功能的能力的修饰。此类修饰在本领域中是已知的，并且包括无岩藻糖基化，或工程改造Fc对活化受体、主要是FCGR3a(对于ADCC)和对C1q(对于CDC)的亲和力。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体包含具有一个或多个改进ADCC的氨基酸取代的Fc区。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含一个或多个改进或减少C1q结合和/或CDC的改变。参见美国专利第6,194,551号；WO 99/51642；和Idusogie等人,J.Immunol.,2000,164:4178-4184；所述文献各自通过引用整体并入。

因而，在一个实施方案中，本文中所描述的抗体可包括包含一个或多个赋予经改进的效应子功能的氨基酸修饰的二聚Fc。在另一个实施方案中，所述抗体可经无岩藻糖基化以改进效应子功能。

降低FcγR和/或补体结合和/或效应子功能的Fc修饰在本领域中是已知的。最近的出版物描述了用于工程改造具有降低或静默的效应子活性的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009),Curr Opin Biotech 20:685-691，以及Strohl,WR和Strohl LM,“Antibody Fcengineering for optimal antibody performance”,Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012),第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰、使用IgG2/IgG4支架或在Fc的铰链或CH2区中引入突变来降低效应子功能。例如，美国专利公开第2011/0212087号(Strohl)、国际专利公开第WO 2006/105338号(Xencor)、美国专利公开第2012/0225058号(Xencor)、美国专利公开第2012/0251531号(Genentech)和Strop等人((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了减少FcγR或补体与Fc结合的特定修饰。

在不改变氨基酸序列的情况下产生Fc糖基化位点(Asn 297，EU编号)上有极少或无岩藻糖的抗体的方法在本领域中是众所周知的。技术(ProBioGen AG)是基于引入酶的基因，由此将岩藻糖生物合成的细胞通路转移入用于抗体产生的细胞中。这可防止抗体产生细胞将糖“岩藻糖”添加至N连接的抗体碳水化合物部分。(von Horsten等人,(2010)Glycobiology.2010年12月；20(12):1607-18。)能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括稳定过度表达细菌氧化还原酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖还原酶(RMD)的CHO-DG44(参见Henning von Horsten等人,Glycobiol 2010,20:1607-1618)或缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(参见Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公开第2003/0157108号；WO 2004/056312；所述文献各自通过引用整体并入)和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因或FUT8敲除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等人,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；和WO 2003/085107；所述文献各自通过引用整体并入)。获得具有较低岩藻糖基化水平的抗体的另一种方法可见于美国专利8,409,572，所述专利教导针对在抗体上产生较低水平的岩藻糖基化的能力选择用于抗体产生的细胞系。

能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括稳定过度表达细菌氧化还原酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己糖还原酶(RMD)的CHO-DG44(参见Henning von Horsten等人,Glycobiol 2010,20:1607-1618)或缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(参见Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.,1986,249:533-545；美国专利公开第2003/0157108号；WO2004/056312；所述文献各自通过引用整体并入)和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因或FUT8敲除CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；Kanda等人,Biotechnol.Bioeng.,2006,94:680-688；和WO 2003/085107；所述文献各自通过引用整体并入)。

抗体可完全无岩藻糖基化(意指其不含可检测的岩藻糖)，或者其可部分无岩藻糖基化，意指经分离的抗体含有通常为针对由哺乳动物表达系统产生的类似抗体检测到的岩藻糖量的少于95％、少于85％、少于75％、少于65％、少于55％、少于45％、少于35％、少于25％、少于15％或少于5％的岩藻糖。

在一些方面，本文中所提供的抗体包含与天然存在的IgG1结构域相比在位置Asn297处具有降低的岩藻糖含量的IgG1结构域。已知此类Fc结构域具有改进的ADCC。参见Shields等人,J.Biol.Chem.,2002,277:26733-26740，所述文献通过引用整体并入。在一些方面，此类抗体在位置Asn 297处不包含任何岩藻糖。岩藻糖的量可使用任何适合的方法来测定，例如，如WO 2008/077546中所描述，所述文献通过引用整体并入。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含二等分寡糖，例如连接至由GlcNAc二等分的抗体Fc区的双触角寡糖。此类抗体变体可能具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如以下文献中：WO 2003/011878；美国专利第6,602,684号；和美国专利公开第2005/0123546号；所述文献各自通过引用整体并入。

可并入本文所提供的抗体中的其他说明性糖基化变体描述于例如以下文献中：美国专利公开第2003/0157108号、第2004/0093621号、第2003/0157108号、第2003/0115614号、第2002/0164328号、第2004/0093621号、第2004/0132140号、第2004/0110704号、第2004/0110282号、第2004/0109865号；国际专利公开第2000/61739号、第2001/29246号、第2003/085119号、第2003/084570号、第2005/035586号、第2005/035778号、第2005/053742号、第2002/031140号；Okazaki等人,J.Mol.Biol.,2004,336:1239-1249；和Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,2004,87:614-622；所述文献各自通过引用整体并入。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含Fc区，在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基。此类抗体变体可能具有改进的CDC功能。此类抗体变体的实例描述于例如以下文献中：WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764；所述文献各自通过引用整体并入。

在一些实施方案中，抗体具有抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。当抗体结合至致病性或致肿瘤性靶细胞表面上的抗原时，可能发生ADCP。在其细胞表面上带有Fc受体的吞噬细胞，包括单核细胞和巨噬细胞，识别并结合与靶细胞结合的抗体的Fc区。在Fc受体与抗体结合的靶细胞结合后，可起始靶细胞的吞噬作用。ADCP可被视为ADCC的一种形式。

在一些实施方案中，所述抗体能够形成免疫复合物。例如，免疫复合物可为由抗体覆盖的肿瘤细胞。

在一些方面，抗MARCO抗体基本上不结合癌组织外所存在的髓系细胞。在一些方面，抗MARCO抗体基本上不结合癌组织中所存在的刺激性髓系细胞。

在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗体为多克隆抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是由杂交瘤产生。在其他实施方案中，所述抗体是由经工程改造以表达所要可变结构域和恒定结构域的重组细胞产生。

在一些实施方案中，所述抗体可为单链抗体或保留抗原特异性和下铰链区的其他抗体衍生物或其变体。

在一些实施方案中，所述抗体可为多功能抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体、其片段或变体。在特定实施方案中，所述抗体片段或其衍生物选自Fab片段、Fab'2片段、CDR和ScFv。

在一些实施方案中，抗体对例如MARCO蛋白的表面抗原具特异性。在一些实施方案中，治疗性抗体对肿瘤抗原(例如，由肿瘤细胞特异性表达的分子)具特异性。在特定实施方案中，治疗性抗体可具有人类或非人类灵长类动物IgG1或IgG3 Fc部分。

结合

关于抗体与靶分子的结合，术语“结合”、“特异性结合”、“特异性结合至”、“特异性针对”、“选择性结合”和“选择性针对”特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位意指与非特异性或非选择性相互作用(例如，与非靶分子)明显不同的结合。例如，可通过测量与靶分子的结合并将其同与非靶分子的结合相比较来测量特异性结合。特异性结合还可通过与模拟靶分子上所识别的表位的对照分子进行竞争来测定。在所述情况下，如果抗体与靶分子的结合因对照分子而受到竞争性抑制，则指示特异性结合。抗原靶标交联是一种结合。在一些实施方案中，抗MARCO抗体使MARCO+细胞上的MARCO与MARCO交联。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对成员(例如，抗体与抗原或表位)之间的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力可由解离平衡常数(K_D)表示。以下更详细地描述有助于解离平衡常数的动力学分量。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，包括本文中所描述的那些方法，例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如)或生物层干涉术(例如)。

如本文所用，术语“k_d”(s^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。此值也称为k_解离值。

如本文所用，术语“k_a”(M^-1×s^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。此值也称为k_缔合值。

如本文所用，术语“K_D”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。K_D＝k_d/k_a。在一些实施方案中，抗体的亲和力根据此类抗体与其抗原之间的相互作用的K_D加以描述。为清楚起见，如本领域中已知，较小K_D值指示较高亲和力相互作用，而较大K_D值指示较低亲和力相互作用。

如本文所用，术语“K_A”(M^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。K_A＝k_a/k_d。

当在本文中用于两种或更多种抗体的情形时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示所述两种或更多种抗体竞争结合至抗原(例如，MARCO)。在一个示例性测定中，将MARCO包被于表面上并与第一MARCO抗体接触，此后添加第二MARCO抗体。在另一个示例性测定中，将第一MARCO抗体包被于表面上并与MARCO接触，然后添加第二MARCO抗体。在任一测定中，如果第一MARCO抗体的存在降低了第二MARCO抗体的结合，则所述抗体彼此竞争。术语“与……竞争”还包括抗体的组合，其中一种抗体减少另一抗体的结合，但其中当以相反顺序添加抗体时，未观测到竞争。然而，在一些实施方案中，第一和第二抗体抑制彼此的结合，不论其添加顺序如何。在一些实施方案中，一种抗体使另一抗体与其抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。熟练技术人员可基于抗体对MARCO的亲和力和抗体的价态来选择用于竞争测定的抗体浓度。此定义中所描述的测定是说明性的，并且熟练技术人员可利用任何适合的测定来确定抗体是否彼此竞争。例如，适合的测定描述于以下文献中：Cox等人,“Immunoassay Methods”,AssayGuidance Manual[Internet],2014年12月24日更新(ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日存取)；Silman等人,Cytometry,2001,44:30-37；和Finco等人,J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358；所述文献各自通过引用整体并入。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体结合人类MARCO。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体结合小鼠MARCO。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体结合恒河猴MARCO。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体结合食蟹猴MARCO。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体结合人类、恒河猴和/或食蟹猴MARCO。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以小于或等于约0.001、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.95、2、3、4、5、6、7、8、9或10×10^-9M的K_D结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体的K_D介于约0.001-0.01、0.01-0.1、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-1、0.25-0.75、0.25-0.5、0.5-0.75、0.75-1、0.75-2、1.1-1.2、1.2-1.3、1.3-1.4、1.4-1.5、1.5-1.6、1.6-1.7、1.7-1.8、1.8-1.9、1.9-2、1-2、1-5、2-7、3-8、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、7-10或5-10×10^-9M之间，如通过Biacore测定所测量。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以小于或等于约2、1.98、1.95、1.9、1.85、1.8、1.75、1.7、1.65、1.6、1.55、1.50、1.45或1.4×10^-9M或更小的K_D结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以介于1.9-1.8、1.8-1.7、1.7-1.6、1.6-1.5或1.9-1.5×10^-9M之间的K_D结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以小于或等于约10、9.56、9.5、9.0、8.88、8.84、8.5、8、7.5、7.32、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1×10^-4(1/s)或更小的K_d结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以介于7-10、7-8、8-9、9-10、7-7.5、7.5-8、8.-8.5、8.5-9、9-9,5或9.5-10×10^-4(1/s)之间的K_d结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以大于或等于约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、45、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、7、8、9或10×10⁵(1/Ms)或更大的K_a结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以介于4-7、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5或6.5-7、7-8、8-9或9-10×10⁵(1/Ms)之间的K_a结合人类MARCO，如通过Biacore测定所测量。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以小于或等于2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的EC50结合人类MARCO，如通过流式细胞术所测量。在一些实施方案中，所述抗体以介于0.6-1.4nM之间的EC50结合人类MARCO，如通过流式细胞术所测量。在一些实施方案中，所述抗体以约0.5、0.6、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5nM的EC50结合人类MARCO，如通过流式细胞术所测量。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体以小于或等于2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM的EC50结合小鼠MARCO，如通过流式细胞术所测量。在一些实施方案中，所述抗体以介于0.6-1.4nM之间的EC50结合小鼠MARCO，如通过流式细胞术所测量。在一些实施方案中，所述抗体以约0.5、0.6、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5nM的EC50结合小鼠MARCO，如通过流式细胞术所测量。

在一些实施方案中，本文中所提供的抗体不以大于或等于20nM或更大的EC50结合人类MARCO，如通过流式细胞术所测量。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体不以大于或等于3nM或更大的EC50结合小鼠MARCO，如通过流式细胞术所测量。

为了筛选结合至目标抗体所结合的靶抗原(例如，MARCO)上的表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定，例如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Harlow和David Lane编(1988)中所描述。替代地，或另外，可通过本领域中已知的方法进行表位定位。

抗体之间的竞争可通过测试抗体抑制或阻断参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定来确定(参见例如Junghans等人,Cancer Res.50:1495,1990；Fendly等人,CancerResearch 50:1550-1558；US 6,949,245)。如果过量测试抗体(例如，至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制或阻断参考抗体的结合达例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，则测试抗体与参考抗体竞争，如在竞争性结合测定中所测量。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和结合至与参考抗体所结合的表位足够邻近的相邻表位以发生空间位阻的抗体。例如，可鉴定与本文中所描述的第一抗体竞争结合至MARCO的第二竞争抗体。在某些情况下，所述第二抗体可阻断或抑制第一抗体的结合达例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，如在竞争性结合测定中所测量。在某些情况下，所述第二抗体可置换所述第一抗体超过50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。

在一些实施方案中，所述抗体结合至MARCO的清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域。

在一些实施方案中，所述抗体结合至SRCR上的表位，所述表位包含野生型人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基Q452、Y472或K473中的至少一者。在一些实施方案中，所述抗体结合至SRCR上的表位，所述表位包含野生型人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基H505、D507、S509或E511中的至少一者。在一些实施方案中，所述抗体结合至SRCR上的表位，所述表位包含野生型人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基E450、Q452、Q487或T499中的至少一者。在一些实施方案中，所述抗体结合至SRCR上的表位，所述表位包含野生型人类MARCO(SEQID NO:363)的残基E450、Q452、Q487、T499、H505、D507、S509或E511中的至少一者。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少一者：SEQ ID NO:363中所列出的MARCO的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个：SEQ ID NO:363的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少两个：SEQ ID NO:363的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少三个：SEQ ID NO:363的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少四个：SEQ ID NO:363的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至Q452。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至Y472。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至K473。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至E450。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至Q487。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至T499。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至H505。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至D507。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至S509。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段至少结合至E511。

功能

在一些实施方案中，所述抗体具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。当抗体结合至致病性或致肿瘤性靶细胞表面上的抗原时，可能发生ADCC。在其细胞表面上带有Fcγ受体(FcγR或FCGR)的效应细胞，包括细胞毒性T细胞、自然杀手(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞或单核细胞，识别并结合靶细胞所结合的抗体的Fc区。此类结合可触发细胞内信号通路的活化，导致细胞死亡。在特定实施方案中，所述抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人类IgG1和IgG3。如本文所用，ADCC是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后导致靶细胞溶解。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评定目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所描述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。替代地，或另外，可在体内，例如在动物模型，例如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评定目标分子的ADCC活性。

在一些实施方案中，所述抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体诱导的CDC是经由经典补体级联的蛋白质介导，并且是由补体蛋白Clq与所述抗体结合触发。与Clq结合的抗体Fc区可诱导补体级联活化。在特定实施方案中，所述抗体的免疫球蛋白Fc区亚型(同种型)包括人类IgG1和IgG3。如本文所用，CDC是指分子在补体存在下溶解靶标的能力。补体活化通路是由补体系统的第一组分(C1q)同与同源抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))结合而起始。为了评定补体活化，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述。

在一些实施方案中，抗体为激动性抗体。激动性抗体在所述抗体结合细胞上表达的MARCO蛋白之后可诱导(例如，增加)表达MARCO的细胞的一种或多种活性或功能。激动性抗体可结合至并活化表达MARCO的细胞，导致细胞增殖变化或改变抗原呈递能力。激动性抗体可结合至并活化表达MARCO的细胞，触发细胞内信号通路，导致细胞生长或凋亡改变。

在一些实施方案中，抗体为拮抗性抗体。拮抗性抗体在所述抗体结合细胞上表达的MARCO蛋白之后可阻断(例如，降低)表达MARCO的细胞的一种或多种活性或功能。例如，所述拮抗性抗体可结合至并阻断配体结合至一种或多种MARCO蛋白，防止细胞分化和增殖或改变抗原呈递能力。所述拮抗性抗体可结合至并防止MARCO蛋白被其配体活化，从而改变细胞内信号通路，由此有助于细胞生长和存活。

在一些实施方案中，抗体为耗竭性抗体。耗竭性抗体为在接触后经由所述抗体与分子的其他免疫细胞相互作用来杀灭表达MARCO的细胞的抗体。例如，抗体当与带有MARCO蛋白的细胞结合时可啮合补体蛋白并诱导补体依赖性细胞溶解。抗体当与带有MARCO蛋白的细胞结合时也可触发带有Fc受体的邻近细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)将其杀灭。

在一些实施方案中，抗体为中和抗体，并且所述抗体中和表达MARCO的细胞的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，MARCO蛋白表达于表达MARCO的细胞的表面上，并且所述抗体识别MARCO蛋白的细胞外结构域。

在一些实施方案中，抗体对表达MARCO的细胞具有选择性(优先结合至MARCO)。在某些实施方案中，选择性结合至表达MARCO的细胞的抗体具有0.0001nM至1μM的解离常数(Kd)范围。在某些实施方案中，抗体特异性结合至在来自不同物种的蛋白质间保守的MARCO蛋白上的表位。在另一个实施方案中，选择性结合包括但不需要排他性结合。

在一个实施方案中，与其靶标结合的抗MARCO抗体负责引起与其结合的表达MARCO的细胞的体内耗竭。在一些实施方案中，由成簇抗体诱导的效应蛋白可触发多种应答，包括炎性细胞因子释放、抗原产生调控、内吞作用或细胞杀灭。在一个实施方案中，所述抗体能够在体内募集并活化补体或介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，或通过结合Fc受体在体内介导吞噬作用。所述抗体也可通过在结合后诱导表达MARCO的细胞的凋亡或坏死来耗竭表达MARCO的细胞。

在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能是在体外并通过以下实现：a)通过杀灭表达MARCO的细胞；b)磁珠耗竭表达MARCO的细胞；或c)荧光活化细胞分选(FACS)分选表达MARCO的细胞。

在一些实施方案中，抗体结合或缀合至效应分子。在特定实施方案中，抗体与选自由放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、二级抗体和二级抗体片段组成的组的至少一种治疗剂缀合。

在某些实施方案中，抗体与药物，例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素缀合。若干制备ADC(抗体药物缀合物)的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利8,624,003(罐法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中。抗体或其抗原结合片段可缀合至至少一种抗原结合剂，包括放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA、二级抗体和二级抗体片段。

在一些实施方案中，抗体调节免疫应答。在一些实施方案中，抗体增加免疫应答。在一些实施方案中，抗体增强或起始免疫应答。

治疗癌症的方法

在另一方面，本发明提供了在个体中治疗免疫相关疾患(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗MARCO抗体的组合物。在另一方面，本发明提供了在个体中增强免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含抗MARCO抗体的组合物。

在一些实施方案中，本文中所提供的方法可用于治疗个体的免疫相关疾患。在一个实施方案中，所述个体是人类。

在一些实施方案中，本文中所提供的方法(例如增强免疫应答的方法)可用于治疗癌症，并且因而接受抗MARCO抗体的个体患有癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体癌。在一些实施方案中，所述癌症是液体癌。在一些实施方案中，所述癌症是免疫逃避性的。在一些实施方案中，所述癌症是免疫应答性的。在一些实施方案中，所述癌症表达IL-10。在一些实施方案中，所述癌症是缺氧性癌症。在特定实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌、胃部癌症、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌、乳腺癌、基底样乳腺癌、卵巢癌或胃癌。

在一些实施方案中，所述治疗导致癌症体积或尺寸减小。在一些实施方案中，与施用所述抗体之前的癌症体积相比，所述治疗在减小癌症体积方面是有效的。在一些实施方案中，所述治疗导致癌症生长速率降低。在一些实施方案中，与施用所述抗体之前的癌症生长速率相比，所述治疗在降低癌症生长速率方面是有效的。在一些实施方案中，所述治疗在消除癌症方面是有效的。

在一些实施方案中，与非癌细胞相比，MARCO在癌症中以更高水平表达。在一些实施方案中，与非癌细胞相比，IL-10在癌症中以更高水平表达。可通过本领域中已知的任何技术评定MARCO和/或IL-10的水平，包括但不限于蛋白质测定或核酸测定，例如FACS、蛋白质印迹(Western blot)、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、单路免疫组织化学、多路免疫组织化学、流式细胞术、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、表面等离子体共振、光谱法、质谱法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、Luminex、MSD和FISH，以及其组合。

组合疗法

为了治疗癌症，所述抗MARCO抗体可与一种或多种抑制免疫检查点蛋白的抗体组合。特别关注的是肿瘤细胞表面所呈现的免疫检查点蛋白。在临床癌症免疫疗法的情形下研究最活跃的免疫检查点受体，即细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)，都是抑制性受体。阻断这些受体中任一者的抗体的临床活性暗示可在多个层面增强抗肿瘤免疫力，并且可在机械考虑和临床前模型的指导下智能地设计组合策略。

PD-1的两个配体是PD-1配体1(PD-L1；也称为B7-H1和CD274)和PD-L2(也称为B7-DC和CD273)。PD-L1表达于癌细胞上，并且通过结合至其处于T细胞上的受体PD-1，其抑制T细胞活化/功能。阻断PD-1与其处于癌细胞上的同源配体PD-L1和PD-L2相互作用的抑制剂可导致T细胞活化和功能增加，并防止癌细胞逃避免疫系统。

在一些实施方案中，所述免疫疗法是干扰PD-1与PD-L1或PD-L2结合的剂。在一些实施方案中，所述免疫疗法是抗PD1抗体。在一些实施方案中，所述免疫疗法是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，所述免疫疗法是抗PD-L2抗体。

各种PD-1、PD-L1和PD-L2抗体在本领域中是已知的。在一些实施方案中，额外治疗剂是以下中的至少一种：阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、阿维鲁单抗(Avelumab)(PD-L1)、度伐鲁单抗(Durvalumab)(PD-L1)、尼沃鲁单抗(Nivolumab)(PD-1)、派姆单抗(Pembrolizumab)(PD-1)、西米普利单抗(Cemiplimab)(PD-1)、伊匹单抗(Ipilimumab)(CTLA-4)、曲美木单抗(Tremelimumab)(CTLA-4)或其任何组合。

所述额外治疗剂可通过任何适合的方式施用。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体和额外治疗剂包括在相同药物组合物中。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体和额外治疗剂包括在不同药物组合物中。

在本文中所提供的抗体和额外治疗剂包括在不同药物组合物中的实施方案中，所述抗体的施用可在所述额外治疗剂的施用之前、同时和/或之后进行。

免疫调节方法

免疫抑制性M2样MARCO表达细胞，例如MARCO+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和MARCO+mMDSC，在富含IL-10并且缺氧的肿瘤微环境(TME)中上调。这些细胞抑制免疫细胞毒性活性。免疫抑制还导致血管生成和转移增加。

抗MARCO抗体可至少通过介导MARCO+髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，以及mMDSC再极化为促炎性单核细胞来激活肿瘤内免疫力。这种再极化可导致细胞因子、趋化因子和活化受体产生，进而导致T细胞、B细胞和NK细胞活化。髓系M2样TAM和mMDSC的再极化可激活T细胞、B细胞和NK细胞。一旦激活，这些NK细胞、CD8+T细胞、M1样TAM和炎性单核细胞就可诱导肿瘤破坏。另外，可通过减少M2样TAM和免疫抑制性mMDSC来调节抗肿瘤免疫力。抗肿瘤免疫力也可通过增加抗原呈递以及脾脏和淋巴结细胞活化来介导。抗MARCO抗体与骨髓巨噬细胞(MCM)结合可诱导淋巴结粘附和运动性变化，而抗MARCO抗体与脾脏边缘区巨噬细胞(MZM)结合可导致粘附和运动性变化，从而导致潜在B细胞活化。

在一些实施方案中，通过以下来观测MARCO+细胞的再极化：快速调节参与分子缔合、酶活性、转录、翻译和促炎性信号传导的磷酸化信号传导级联(Src、SYK、NF-kB、PI3K/AKT、TLR、STAT6、IL2RA、CAMK、PKC、Raf1、TPL2、MAPK、细胞周期、存活、细胞粘附和迁移、细胞骨架重排)；改变吞噬作用、粘附、运动性和趋化性；在作为单一剂和与TLR激动剂组合时激活NF-kB报告基因活性；诱导促炎性细胞因子和趋化因子分泌，包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF、嗜酸性粒细胞趋化因子；以及增加炎性体活化和吞噬作用。

如本文中所描述的MARCO抗体的施用方法可调节免疫应答。调节可为增加或减少免疫应答。在一些实施方案中，调节是免疫应答的增加。

在一个方面，施用如本文中所描述的MARCO抗体可诱导促炎性分子，例如细胞因子、趋化因子或髓系细胞表达髓系活化受体。通常，诱导的促炎性分子是以高于同种型对照所实现水平的水平存在。在一些实施方案中，所述髓系细胞是表达MARCO的(MARCO+)细胞。在一些实施方案中，所述MARCO+髓系细胞是单核细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MARCO+巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。此类促炎性分子进而激活抗肿瘤免疫力，包括但不限于T细胞活化、T细胞增殖、T细胞分化、M1样巨噬细胞活化、B细胞调控和NK细胞活化。因而，施用抗MARCO抗体可诱导多种抗肿瘤免疫机制，导致肿瘤破坏。

在另一方面，本文中提供了在个体中增加免疫应答的方法，其包括向所述个体施用有效量的包含抗MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物。在一些实施方案中，所述在受试者中增加免疫应答的方法包括向所述受试者施用结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的SRCR结构域的抗体。在一些实施方案中，所述在受试者中增加免疫应答的方法包括向所述受试者施用同参考抗体竞争结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的抗体。在一些实施方案中，所述在受试者中增加免疫应答的方法包括向所述受试者施用竞争结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基Q452、Y472和K473中的至少一者。在一些实施方案中，所述在受试者中增加免疫应答的方法包括向所述受试者施用竞争结合至人类MARCO(SEQ ID NO:363)的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基E450、Q452、Q487和T499中的至少一者。在一些实施方案中，所述在受试者中增加免疫应答的方法包括向所述受试者施用竞争结合至人类MARCO(SEQID NO:363)的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO(SEQ ID NO:363)的残基H505、D507、S509或E511中的至少一者。

在一些实施方案中，所述抗体存在于还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。

在如本文中所描述增加免疫应答的任何和所有方面，特征或功能的任何增加或减少或改变都与未与抗MARCO抗体接触的细胞进行比较。

增加免疫应答既可为增强免疫应答，也可为诱导免疫应答。例如，增加免疫应答涵盖开始或起始免疫应答，或者加速或放大进行中或现有免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗诱导免疫应答。在一些实施方案中，所述诱导的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述诱导的免疫应答是先天性免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗增强免疫应答。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是先天性免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗增加免疫应答。在一些实施方案中，所述增加的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，所述增加的免疫应答是先天性免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答是通过施用抗MARCO抗体开始或起始。在一些实施方案中，所述免疫应答是通过施用抗MARCO抗体来增强。

在另一方面，本申请提供了使细胞与抗MARCO抗体接触，由此调节细胞免疫功能的方法。所述调节可为增加免疫应答或使表达MARCO的细胞重新编程。在一些实施方案中，所述调节为免疫功能增加。在一些实施方案中，功能调节导致表达MARCO的髓系细胞活化。在一些实施方案中，功能调节导致表达MARCO的髓系细胞重新编程。

在一些实施方案中，所述细胞为髓系细胞。在一些实施方案中，所述细胞为表达MARCO的细胞(MARCO+细胞)。在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为单核细胞、巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和单核细胞源性巨噬细胞(MDM)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为单核细胞。在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为巨噬细胞。在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。在一些实施方案中，所述MARCO+细胞为单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞与MARCO抗体接触诱导所述细胞活化。

在一些实施方案中，MARCO+细胞的功能调节导致所述细胞刺激原生和活化CD8+T细胞的能力增加，例如，通过增加表达MARCO的细胞将MHCI分子上的肿瘤抗原交叉呈递至初始CD8+T细胞的能力或通过增加表达MARCO的细胞的细胞因子或趋化因子分泌。在一些实施方案中，MARCO+细胞的功能调节导致所述细胞刺激原生和活化CD4+T细胞的能力增加，例如，通过增加表达MARCO的细胞将MHCII分子上的肿瘤抗原交叉呈递至初始CD4+T细胞的能力。在一些实施方案中，所述功能调节增强或增加了细胞产生细胞因子、趋化因子或者共刺激或活化受体的能力。在一些实施方案中，所述调节增加了MARCO+细胞的T细胞刺激功能，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。

在一些实施方案中，所述增加的免疫应答是细胞因子和趋化因子分泌。在一些实施方案中，所述MARCO抗体具有激动剂活性。在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导细胞中至少一种细胞因子或趋化因子的表达增加。在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导细胞中至少一种促炎性细胞因子或趋化因子的表达增加。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。在一些实施方案中，所述细胞因子或趋化因子为IL-2。在一些实施方案中，所述细胞因子或趋化因子为IL-12。在一些实施方案中，与未处理的细胞或经同种型对照抗体处理的细胞相比，所述细胞因子或趋化因子分泌增加了约1-100倍、1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，所述趋化因子为IL-2，并且与未处理的细胞或经同种型对照抗体处理的细胞相比，所述分泌增加了约1-100倍、1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，所述细胞因子为IL-12，并且与未处理的细胞或经同种型对照抗体处理的细胞相比，所述分泌增加了约1-100倍、1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导细胞中至少一个基因的表达降低。在一些实施方案中，所述至少一个基因为ALK、MPB、TMEM37、NHSL2或SLC46A2。在一些实施方案中，与未处理的细胞或经同种型对照抗体处理的细胞相比，所述基因降低了约1-100倍、1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导炎性体活化。炎性体活化可通过测量IL-1β和/或IL-18分泌来测定。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体增加了CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII^高单核细胞、MHCII^中单核细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、嗜中性粒细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞和/或MHCII-单核细胞。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体通过改变肿瘤中的细胞骨架、肌动蛋白和肌肉以及细胞粘附相关通路来调节运动性和/或吞噬作用变化。在一些实施方案中，所述MARCO抗体导致TME内的促炎性活化，包括M2向M1巨噬细胞重新编程、吞噬作用和/或炎性体增加、NK细胞活化和/或T细胞活化。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体调节淋巴结中的细胞信号传导、细胞粘附、细胞骨架和运动性变化。在一些实施方案中，所述MARCO抗体结合至淋巴结中的骨髓巨噬细胞，并调节细胞粘附和运动性。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体调节脾脏中的细胞粘附、细胞骨架、迁移、运动性、细胞信号传导和B细胞活化。在一些实施方案中，所述MARCO抗体结合至脾脏中的边缘区巨噬细胞并调节细胞粘附、运动性和B细胞活化。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述调节增加细胞粘附、细胞骨架和细胞迁移。在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述调节诱导脾脏中的B细胞成熟。在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述调节诱导细胞信号通路，包括细胞周期、T细胞受体、吞噬作用、自噬作用和wnt通路。

在一些实施方案中，所述增强的免疫应答是抗肿瘤免疫细胞募集和活化。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导记忆免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是在随后暴露于免疫系统先前遇到的病原体或抗原时的保护性免疫应答。示例性记忆免疫应答包括感染或疫苗接种抗原之后的免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是由例如T细胞或B细胞的淋巴细胞介导。在一些实施方案中，所述记忆免疫应答是对癌症，包括癌细胞生长、增殖或转移的保护性免疫应答。在一些实施方案中，所述记忆免疫应答抑制、预防或减少癌细胞生长、增殖或转移。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：脾脏中的B细胞成熟、肌动蛋白介导的细胞收缩通路、激酶活化和活性通路、Toll样受体信号通路、TLR 4和9通路、GTP酶结合和活性，和/或RAS-Rho信号转导通路。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：体液免疫应答、NK介导的免疫、NK活化、IL-2和IL-12产生、细胞杀灭、效应过程调控、T细胞增殖、活化、分化、趋化和迁移、细胞-细胞粘附、吞噬作用和/或髓系分化。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：自然杀手细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路、JAK/STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IgA产生的肠免疫网络、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、II型糖尿病和Fc-εRI信号通路。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：同源重组、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、RNA聚合酶、精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、卟啉和叶绿素代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、不饱和脂肪酸生物合成、N-聚糖生物合成和氨酰基tRNA生物合成。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：细胞因子-细胞因子受体相互作用、自然杀手细胞介导的细胞毒性、原发性免疫缺乏症、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、JAK/STAT信号通路、T细胞受体信号通路、IgA产生的肠免疫网络、神经活性配体受体相互作用和Fc-εRI信号通路。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：糖解糖质新生、丙酸代谢、蛋白酶体、柠檬酸循环TCA循环、心肌收缩、阿尔茨海默病、亨廷顿病(Huntington's disease)、氧化磷酸化、核糖体和帕金森病(Parkinson's disease)。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：磷脂酰肌醇信号传导系统、粘着斑、磷酸肌醇代谢、轴突导向、粘附连接、癌症中的通路、肌动蛋白细胞骨架调控、孕酮介导的卵母细胞成熟、ERBB信号通路和Wnt信号通路。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：氨酰基tRNA生物合成、溶酶体、组氨酸代谢、药物代谢细胞色素p450、蛋白酶体、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、氧化磷酸化和核糖体。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：粘着斑、磷脂酰肌醇信号传导系统、神经营养因子信号通路、胰岛素信号通路、磷酸肌醇代谢、MAPK信号通路、癌症中的通路、肌动蛋白细胞骨架调控、ERBB信号通路和粘附连接。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：细胞色素p450对异生物质的代谢、造血细胞谱系、溶酶体、阿尔茨海默病、蛋白酶体、细胞因子-细胞因子受体相互作用、亨廷顿病、帕金森病、氧化磷酸化和核糖体。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：ECM受体相互作用、粘着斑、紧密连接、粘附连接、蛋白酶体、补体和凝血级联、细胞粘附分子和CAM、癌症中的通路、致心律失常性右心室心肌病ARVC、Wnt信号通路、肌动蛋白骨架调控、轴突导向、亨廷顿病、致病性大肠杆菌感染、阿尔茨海默病、白细胞跨内皮迁移、细胞因子-细胞因子受体相互作用、基底细胞癌、黑素生成和刺猬信号通路。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：细胞周期、氨酰基tRNA生物合成、错配修复、糖基磷脂酰肌醇GPI锚生物合成、甘油磷脂代谢和同源重组。

在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体诱导或增加以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：细胞周期、蛋白酶体、T细胞受体信号通路、DNA复制、泛素介导的蛋白水解、肌动蛋白细胞骨架调控、粘附连接、致病性大肠杆菌感染、基础转录因子、磷酸戊糖通路、FcγR介导的吞噬作用、神经营养因子信号通路、自噬作用调控、糖解糖质新生、卵母细胞减数分裂、慢性髓系白血病、柠檬酸循环TCA循环、Wnt信号通路、P53信号通路和自然杀手细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，与同种型抗体相比，所述MARCO抗体降低或抑制以下通路中的至少一种或与以下相关的基因：ABC转运蛋白、糖基磷脂酰肌醇GPI锚生物合成、RNA聚合酶、核糖体、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动性信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答、补体、炎症应答通路或同种异体移植物排斥通路。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体降低氧化磷酸化、mTOR信号传导、未折叠蛋白应答、胆固醇稳态、脂肪酸代谢、myc靶标、糖解通路、细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、E2F靶标通路、缺氧、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

在一些实施方案中，与同种型对照抗体相比，所述MARCO抗体诱导肿瘤细胞中至少一种促炎性或活化基因的表达增加。在一些实施方案中，所述MARCO抗体诱导或增加以下基因中至少一者的表达：Klrk1、Nrc1、Prf1、Cd40、Cd8α、Nod2、Tlr4、Tnf、Nlrp3、Cd274、Clec9α、Cd200r3、Il-27、Cxcl9、Cxcl10或Cxcl12。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体增加脾脏和/或肿瘤中的CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII高单核细胞和/或MHCII中单核细胞。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体增加脾脏和/或肿瘤中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体减少脾脏和/或肿瘤中的TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

在一些实施方案中，趋化因子、细胞因子、基因或通路的表达水平是通过核酸或蛋白质测定来检测。示例性核酸或蛋白质测定包括但不限于FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、单路免疫组织化学、多路免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱法、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、Luminex、MSD和FISH，以及其组合。

在一些实施方案中，所述MARCO抗体在结合至MARCO+细胞后诱导细胞粘附、细胞骨架、趋化性和细胞迁移变化。

在一些实施方案中，所述抗体使MARCO+细胞的细胞表面上的MARCO与MARCO交联。在一些实施方案中，所述接触是在体外。在一些实施方案中，所述接触是在体内。在一些特定实施方案中，所述接触是在人类体内。在一些实施方案中，所述接触是通过施用抗MARCO抗体来实现。在一些实施方案中，接受所述抗体的个体(例如人类)患有癌症。

使表达MARCO的细胞失能、杀灭或耗竭的方法

在一个方面，本申请提供了使细胞与抗MARCO抗体(例如人类或人源化抗体)接触，由此使表达MARCO的细胞失能的方法。使表达MARCO的细胞失能还涵盖杀灭和/或耗竭表达MARCO的细胞。

在另一方面，本申请提供了使表达MARCO的细胞与抗MARCO抗体接触，由此导致表达MARCO的细胞失能的方法。

在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞是髓系细胞。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞是单核细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞是TAM细胞和单核细胞源性巨噬细胞(MDM)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞是单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)。

在一些实施方案中，本申请提供了使表达MARCO的细胞失能的方法，所述方法包括使表达MARCO的细胞与MARCO抗体接触，从而杀灭表达MARCO的细胞。失能是指致使细胞部分或完全无功能。在一些实施方案中，使细胞失能诱导所述细胞生长停滞。在一些实施方案中，使细胞失能导致所述细胞凋亡。在一些实施方案中，使细胞失能导致所述细胞溶解，例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞坏死。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能诱导所述细胞生长停滞。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞失活。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能中和了所述细胞中MARCO蛋白的活性。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞增殖减少。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞分化。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能降低了所述细胞充当抑制性抗原呈递细胞的能力或增加了所述细胞充当活化性抗原呈递细胞的能力。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞在肿瘤组织或肿瘤微环境(TME)内的错误定位。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞在肿瘤组织或肿瘤微环境内的空间组织改变。在一些实施方案中，使表达MARCO的细胞失能导致所述细胞在肿瘤组织或TME内的时间表达改变。在一些实施方案中，所述方法还包括去除所述表达MARCO的细胞。

在如本文中所描述使表达MARCO的细胞失能的任何和所有方面，特征或功能的任何增加或减少或改变都与未与抗MARCO抗体接触的细胞进行比较。

在另一方面，本申请提供了使表达MARCO的细胞与抗MARCO抗体接触，由此调节表达MARCO的细胞的功能的方法。所述调节可为以下中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞是单核细胞、巨噬细胞、TAM和MDM中的一种或多种。在一些实施方案中，所述细胞的功能调节导致所述细胞刺激原生和活化CD8+T细胞的能力增加，例如，通过增加表达MARCO的细胞将MHCI分子上的肿瘤抗原交叉呈递至初始CD8+T细胞的能力。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞的功能调节导致所述细胞刺激原生和活化CD4+T细胞的能力增加，例如，通过增加表达MARCO的细胞将MHCII分子上的肿瘤抗原交叉呈递至初始CD4+T细胞的能力。在一些实施方案中，所述调节增加了髓系细胞的T细胞刺激功能，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。在一些实施方案中，所述功能调节增强或增加了细胞产生细胞因子、趋化因子或者共刺激或活化受体的能力。

在如本文中所描述降低表达MARCO的细胞的功能的任何和所有方面，特征或功能的任何增加或减少或改变都与未与抗MARCO抗体接触的细胞进行比较。

在一些实施方案中，本申请提供了杀灭(也称为诱导细胞死亡)表达MARCO的细胞的方法，所述方法包括使所述表达MARCO的细胞与抗MARCO抗体接触，从而杀灭所述表达MARCO的细胞。在一些实施方案中，所述杀灭相对于未与抗MARCO抗体接触的表达MARCO的细胞有所增加。在一些实施方案中，所述接触在表达MARCO的细胞中诱导细胞凋亡。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞在包含表达MARCO的细胞和非表达MARCO的细胞的免疫细胞群体中。在一些实施方案中，所述方法还包括去除所述表达MARCO的细胞。在一些实施方案中，10％-100％细胞被杀灭。在一些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％细胞被杀灭。

在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞在数目方面减少。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞被杀灭，例如通过坏死或细胞凋亡。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞经诱导以经历生长停滞。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞不再增殖。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞的空间定位被改变，并且比率在TME的特定区域中有所增加。在一些实施方案中，所述表达MARCO的细胞的时间表达被改变，并且比率在肿瘤发展过程中的特定时间有所增加。

其他方法

测定MARCO的表达

本文中还提供了治疗个体的癌症或调节个体的免疫应答的方法，所述方法包括：测定或已测定受试者的MARCO表达；以及向所述受试者施用或已施用结合至MARCO的经分离的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述方法还包括测定或已测定来自所述个体的生物样品中的MARCO表达水平。在一些实施方案中，所述生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿液、粪便、血液、唾液、CSF和其任何组合。在一些实施方案中，所述生物样品来源于肿瘤组织。在一些实施方案中，MARCO表达水平包括MARCO的mRNA表达水平。在一些实施方案中，MARCO表达水平包括MARCO的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，MARCO表达水平是使用选自由以下组成的组的方法在样品中进行检测：FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、单路免疫组织化学、多路免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱法、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、Luminex、MSD和FISH，以及其组合。

在一些方面，本文中提供了测定来自受试者的样品中MARCO蛋白的表达水平的方法，所述方法包括使所述样品与抗MARCO抗体接触并进行免疫组织化学测定。在一些实施方案中，所述抗体包括RDM5、RDM9、PI-3010.15、PI-3010.25或PI-3030.41。

在本文中所描述的用于检测和/或定量的实施方案中，所述抗MARCO抗体结合至MARCO蛋白，但未必影响生物应答，例如ADCC，尽管其可能对生物应答有影响。在一些实施方案中，所述抗体结合至可溶性MARCO。

在另一方面，本发明提供了用于鉴定可应答于免疫疗法(例如用抗MARCO抗体)的个体以治疗免疫相关疾患(例如癌症)的方法，所述方法包括：检测来自所述个体的生物样品中的MARCO表达水平；以及基于MARCO表达水平确定所述个体是否可应答于免疫疗法，其中所述个体的MARCO水平相对于健康个体的MARCO水平有所升高指示所述个体可应答于免疫疗法。在一些实施方案中，已测定所述个体的MARCO表达。在一些实施方案中，这些方法还可用于诊断个体的免疫相关疾患(例如癌症)并且是基于MARCO表达水平，其中所述个体的MARCO水平相对于健康个体的MARCO水平有所升高指示所述个体患有癌症。在一些实施方案中，MARCO表达水平包括MARCO的mRNA表达水平。在其他实施方案中，MARCO表达水平包括MARCO的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，使用核酸或蛋白质测定来检测样品中的MARCO表达水平。示例性核酸或蛋白质测定包括但不限于FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、单路免疫组织化学、多路免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹法、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光谱法、质谱法、qPCR、RT-qPCR、多路qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、Luminex、MSD和FISH，以及其组合。在这些实施方案中，所述抗MARCO抗体结合至MARCO蛋白，但未必影响生物应答，例如ADCC。在一些实施方案中，所述生物样品来源于肿瘤组织。在一些实施方案中，所述生物样品包括但不限于体液、组织样品、器官样品、尿液、粪便、血液、唾液、CSF和其任何组合。

施用方法

在一些实施方案中，所述抗MARCO抗体是经静脉内、肌肉内、皮下、局部、经口、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。可施用有效量的抗MARCO抗体以治疗癌症。抗MARCO抗体的适当剂量可基于待治疗的癌症类型、抗MARCO抗体的类型、癌症的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的应答，以及主治医师的判断来确定。

制备方法

可使用例如美国专利第4,816,567号中所描述的重组方法和组合物来产生本文中所描述的抗体。

在一个实施方案中，提供了编码本文中所描述的抗体的经分离核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)或包含单结构域抗体的VHH的氨基酸序列。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在一个实施方案中，所述核酸提供于多顺反子载体中。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，经转化而具有)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或人胚肾(HEK)细胞，或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制造抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达抗体的条件下培养如以上所提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗体，分离编码抗体的核酸(例如，如以上所描述)并插入一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离此类核酸并测序。

术语“基本上纯化”是指本文中所描述的构建体或其变体可能基本上或本质上不含其天然存在环境中所发现的通常伴随或与蛋白质相互作用的组分，即，在重组产生的异源多聚体的情况下，某些实施方案中基本上不含细胞材料的原生细胞或宿主细胞包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)污染蛋白质的蛋白质制剂。当异源多聚体或其变体是由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质是以细胞干重计约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当异源多聚体或其变体是由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质是细胞干重计约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少存在于培养基中。在某些实施方案中，通过本文中所描述的方法产生的“基本上纯化的”异源多聚体具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体而言，至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更具体而言，至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更高的纯度水平，如通过例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法所测定。

用于克隆或表达抗体编码载体的适合宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。

“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，与用于插入的方法无关，例如直接摄取、转导、f-交配或本领域中已知的其他用于产生重组宿主细胞的方法。外源多核苷酸可维持为非整合载体，例如质粒，或替代地，可整合至宿主基因组中。宿主细胞可包括CHO、CHO衍生物、NS0、Sp2O、CV-1、VERO-76、HeLa、HepG2、Per.C6或BHK。

如本文所用，术语“真核生物”是指属于真核生物系统发育域的生物体，例如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛类、微孢子虫、原生生物等。

如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。例如，非真核生物体可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪杆菌(Bacillusstearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域，或古细菌(包括不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、例如火山嗜盐菌(Haloferax volcanii)和盐杆菌属NRC-1的盐杆菌(Halobacterium)、嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、超嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。

例如，抗体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号。(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。)在表达后，抗体可呈可溶级分形式从细菌细胞浆分离并且可进一步纯化。

除原核生物以外，例如丝状真菌或酵母的真核微生物也是抗体编码载体的适合克隆或表达宿主，包括糖基化通路已“人源化”，从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

用于表达糖基化抗体的适合宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号和第6,417,429号(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能适用。其他可用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)所描述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支援细胞(TM4细胞，如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他可用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。

在一个实施方案中，本文中所描述的抗体是通过以下方法在稳定哺乳动物细胞中产生，所述方法包括：用预定比率的编码抗体的核酸转染至少一种哺乳动物细胞；以及在所述至少一种哺乳动物细胞中表达所述核酸。在一些实施方案中，在瞬时转染实验中测定核酸的预定比率以确定使表达产物中抗体百分比最高的输入核酸相对比率。

在一些实施方案中是在如本文中所描述的稳定哺乳动物细胞中产生抗体的方法，其中与单体重链或轻链多肽或其他抗体相比，所述至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含更大百分比的所要糖基化抗体。

在一些实施方案中是在本文中所描述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化抗体的方法，所述方法包括鉴定和纯化所要糖基化抗体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱法中的一者或二者来进行。

如果需要，则可在表达之后纯化或分离抗体。可用本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化蛋白质。标准纯化方法包括在大气压或高压下使用例如FPLC和HPLC的系统进行色谱技术，包括离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲和色谱法、筛分或凝胶过滤色谱法以及反相色谱法。纯化方法还包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术连同蛋白质浓缩也是有用的。如本领域中众所周知，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可用于本发明以纯化抗体。例如，细菌蛋白A和G结合至Fc区。同样，细菌蛋白L结合至一些抗体的Fab区。纯化通常可通过特定融合伴侣来启用。例如，如果采用GST融合，则可使用谷胱甘肽树脂来纯化抗体，如果采用His标签，则使用Ni+2亲和色谱法来纯化抗体，或者如果使用flag标签，则使用固定化抗flag抗体来纯化抗体。关于适合的纯化技术的一般指导，参见例如通过引用整体并入的Protein Purification:Principles andPractice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994，所述文献通过引用整体并入。必需纯化程度根据抗体的用途而改变。在一些情况下，无需纯化。

在某些实施方案中，使用阴离子交换色谱法纯化抗体，包括但不限于在Q-sepharose、DEAE sepharose、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上进行的色谱法。

在特定实施方案中，本文中所描述的蛋白质是使用阳离子交换色谱法进行纯化，包括但不限于SP-sepharose、CM sepharose、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱及其等效物和相当物。

另外，本文中所描述的抗体可使用本领域中已知的技术化学合成(例如，参见Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y，以及Hunkapiller等人,Nature,310:105-111(1984))。例如，可通过使用肽合成仪来合成对应于多肽片段的多肽。此外，在需要时，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己丙氨酸、丙氨酸、氟氨基酸、设计氨基酸如甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸和一般氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋)或L(左旋)。

药物组合物

本发明还涵盖治疗免疫相关疾病(例如，癌症)的方法。本发明的所述方法包括施用治疗有效量的抗MARCO抗体或抗原结合片段。MARCO抗体或抗原结合片段可配制于药物组合物中。除一种或多种抗MARCO抗体或抗原结合片段以外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应无毒并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。

用于口服施用的药物组合物可为片剂、胶囊、散剂或液体形式。片剂可包括固体载体如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或疾患部位注射，活性成分将呈具有适合的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备适合的溶液。根据需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

无论给与个体的是根据本发明的多肽、抗体或抗原结合片段还是其他药学上可用的化合物，施用优选都以“治疗有效量”或“预防有效量”(视情况而定，但预防可视为治疗)进行，这足以对个体显示益处。实际施用量、施用速率和时程将取决于所治疗的蛋白质聚集疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量决定等，在全科医师和其他医师的职责范围内，并且通常考虑待治疗的病症、个别患者的状况、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。以上所提及的技术和方案的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编),1980。

组合物可单独或与其他治疗组合同时或依序施用，取决于待治疗的疾患。

药盒和制品

本申请提供了包含本文中所描述的抗体组合物中的任何一种或多种的药盒。在一些实施方案中，所述药盒还含有选自二级抗体、免疫组织化学分析试剂、药学上可接受的赋形剂和说明书中的任一种和其任何组合的组分。在一个特定实施方案中，所述药盒包含药物组合物，所述药物组合物包含本文中所描述的抗体组合物中的任何一种或多种以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本申请还提供了包含本文中所描述的抗体组合物或药盒中的任一种的制品。制品的实例包括小瓶(包括密封小瓶)。

其他实施方案

在一个方面，本文中提供了结合至具有胶原结构的人类巨噬细胞受体(MARCO)(SEQ ID NO:384)并与参考抗体竞争结合的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，

CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，

CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，

CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)或XASEGISNDLA(SEQ ID NO:383)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，

CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且

CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)。

在一些实施方案中，CDR-L1包含序列RASEGISNDLA(SEQ ID NO:27)。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444或474中所示的VH序列。

在一些实施方案中，所述VL序列包含SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449或479中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述VH序列包含SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444或474中所示的VH序列，并且所述VL序列包含SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449或479中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示的序列的重链序列，以及选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示的序列的轻链序列。

在一些实施方案中，所述VH序列由SEQ ID NO:61中所示的VH序列组成；并且所述VL序列由SEQ ID NO:66中所示的VL序列组成。

在一些实施方案中，所述VH序列由SEQ ID NO:111中所示的VH序列组成；并且所述VL序列由SEQ ID NO:116中所示的VL序列组成。

在一些实施方案中，所述VH序列由选自SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444或474中所示的序列的VH序列组成；并且所述VL序列由选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449或479中所示的序列的VL序列组成。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，其中重链序列由SEQ ID NO:65中所示的重链序列组成，并且轻链序列由SEQ ID NO:70中所示的轻链序列组成。

在一些实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，其中重链序列由SEQ ID NO:115中所示的重链序列组成，并且轻链序列由SEQ ID NO:120中所示的轻链序列组成。

在一些实施方案中，所述抗体包含人类Fc区。

在一些实施方案中，所述人类Fc区为野生型人类IgG1 Fc。

在一些实施方案中，所述抗体包含野生型人类IgG1 Fc，并且其中所述VH序列包含SEQ ID NO:61中所示的VH序列，并且所述VL序列包含SEQ ID NO:66中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述抗体包含野生型人类IgG1 Fc，并且其中所述VH序列包含SEQ ID NO:111中所示的VH序列，并且所述VL序列包含SEQ ID NO:116中所示的VL序列。

在一些实施方案中，所述抗体以小于或等于约0.5、1、2、3、4、5、6或7×10-9M的KD结合至人类MARCO，如通过表面等离子体共振(SPR)测定所测量。

在一些实施方案中，所述抗体经人源化。

在一个方面，本文中提供了产生抗体的方法，所述方法包括从宿主细胞表达如本文中所公开的抗体并分离所表达的抗体。

在一个方面，本文中提供了包含本文中所公开的抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在一个方面，本文中提供了包括如本文中所公开的抗体和使用说明书的药盒。

在一个方面，本文中提供了结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)并与参考抗体竞争结合的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

CDR-H1包含序列GYTFTDYAVN(SEQ ID NO:232)，

CDR-H2包含序列WINTQTGKPT(SEQ ID NO:233)，

CDR-H3包含序列DSYYYSSSLDY(SEQ ID NO:234)，

CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ ID NO:432)或XASAGISNDLA(SEQ ID NO:381)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，

CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:238)，并且

CDR-L3包含序列QQSYKYPWT(SEQ ID NO:239)。

在一个方面，本文中提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用同参考抗体竞争结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的抗体，其中所述参考抗体包括重链，所述重链包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及轻链，所述轻链包括包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，

CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，

CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，

CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且

CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，所述受试者先前已接受、同时正接受或随后将接受免疫疗法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一种：检查点抑制剂；T细胞检查点抑制剂；抗PD1抗体；抗PDL1抗体；抗CTLA4抗体；过继性T细胞疗法；CAR-T细胞疗法；树突状细胞疫苗；单核细胞疫苗；结合T细胞与抗原呈递细胞二者的抗原结合蛋白；BiTE双抗原结合蛋白；toll样受体配体；细胞因子；细胞毒性疗法；化学疗法；放射疗法；小分子抑制剂；小分子激动剂；免疫调节剂；和表观基因调节剂。

在一些实施方案中，所述免疫疗法为抗PD1抗体、抗PDL1抗体或抗CTLA4抗体。

在一个方面，本文中提供了在受试者中增加免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用同参考抗体竞争结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的抗体，其中所述参考抗体包括重链，所述重链包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及轻链，所述轻链包括包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，

CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，

CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，

CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且

CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

实施例

以下是用于实施本发明的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但固然应允许一定的实验误差和偏差。

除非另外指示，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术在文献中有充分解释。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版本)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。

实施例1：MARCO表达于多种肿瘤类型中

多种癌症类型中的MARCO总RNA表达

癌症基因组图谱(TCGA)中所有适应症的肿瘤和正常组织中的MARCO mRNA表达是由firebrowse.org上的BROAD Institute基因表达查看器产生。

肿瘤(左侧条形)对比正常(右侧条形)组织中经排序的MARCO mRNA表达示于图1中。x轴列出以下肿瘤类型：ACC，肾上腺皮质癌；BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，浸润性乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌；CHOL，胆管癌；COAD，结肠腺癌；COADREAD，结肠腺癌和直肠腺癌；DLBC，弥漫性大b细胞淋巴瘤；ESCA，食道癌；GBM，多形性胶质母细胞瘤；GBMLGG，多形性胶质母细胞瘤和低级胶质瘤；HNSC，头颈部鳞状细胞癌；KICH，肾嫌色细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；KIRP，肾乳头状细胞癌；KIPAN，混合肾癌(KICH+KIRC+KIRP)；LAML，急性髓系白血病；LGG，脑低级胶质瘤；LIHC，肝细胞癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；MESO，间皮瘤；OV，卵巢浆液性囊腺癌；PAAD，胰腺腺癌；PCPG，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；PRAD，前列腺腺癌；READ，直肠腺癌；SARC，肉瘤；SKCM，皮肤黑色素瘤；STAD，胃腺癌；STES，胃癌和食道癌；TGCT，睾丸生殖细胞肿瘤；THYM，胸腺瘤；THCA，甲状腺癌；UCS，子宫癌肉瘤；UCEC，子宫体子宫内膜癌；UVM，葡萄膜黑色素瘤。y轴表示来自使用RNAseq通过期望最大化(RSEM)进行定量的RNA-seq数据的转录物丰度的log2转化通过scRNA-seq获得的原发性肿瘤中的MARCO表达

单一细胞RNA测序(scRNA-Seq)

各种肿瘤的1mL冷冻解离肿瘤细胞购自Discovery Life Sciences。在37C水浴中将冷冻团块解冻并用25mL含有10％ FBS和10mM HEPES的温RPMI逐渐稀释，并且以550rcf离心5分钟。用抗CD45-PE(克隆HI30，Biolegend)将细胞团块染色。在BD FACSAria Fusion上分选DAPI^-、CD45⁺细胞。分选后，用3mL 0.04％ BSA/PBS将细胞洗涤三次并以5×10⁵个细胞/mL重悬。将细胞装载至Chromium芯片B中以便对10,000个细胞进行靶向细胞封装，并且放置在Chromium控制器(10X Genomics，单一细胞3'v3试剂盒)中。根据得自10X Genomics的单一细胞3'v3使用者手册进行GEM-RT后清理、cDNA扩增和文库构建。由MedGenome Inc.在NovaSeq上对这些文库进行测序。

单一细胞数据处理

使用10X Genomics Cell Ranger v3.0.2管线处理测序数据。MedGenome Inc.通过使用Cell Ranger子例程mkfastq将原始Illumina bcl文档转化为fastq文档来提供每个样品的fastq文档。之后，运行Cell Ranger count，其利用STAR(Dobin等人,2013)将读段与GRCh38人类参考基因组进行比对。过滤具有冗余唯一分子标识符(UMI)的读段后，count产生基因-细胞条形码文档(filtered_feature_bc_matrix文件夹，由barcodes.tsv、features.tsv和matrix.mtx组成)。mkfastq和count都使用预设参数运行。

细胞鉴定、聚类和可视化

对于每个样品，将filtered_feature_bc_matrix文档传递至R(v.3.6.0)软件包Seurat(Satija等人,2015)(https://satijalab.org/seurat)(v2.3.4)以进行所有下游分析。将features.tsv文档重命名为genes.tsv以便与Read10X函数相容。过滤表达至少200个基因的细胞的数据，所有基因都表达于至少3个细胞中，并且不超过8500UMI。将含有>20％线粒体基因相关读段和>45％核糖体基因相关读段的细胞去除。然后使用其余每个细胞的UMI计数以及线粒体与核糖体基因比例作为干扰因素(在Seurat的ScaleData函数中实施)对计数数据进行对数转换和缩放，以校正下游聚类和差异表达分析中任何其余不需要的作用。对于每个样品，对由Seurat的FindVariableGenes函数定义的一组高度可变基因进行主要成分(PC)分析。然后将与所得顶部PC(通过对陡坡图进行目视检查来选择)相关的基因用于基于图形的群簇鉴定以及使用t分布随机邻域嵌入(tSNE)的后续维度缩减。对于所有群簇间比较，使用Seurat的FindAllMarkers进行基于群簇的标志物鉴定和差异表达。使用Seurat中的内置可视化函数(TSNEPlot、FeaturePlot)绘制图形。

如通过scRNA-seq分析(数据未示出)所测定，MARCO主要表达于人类肿瘤单核细胞和巨噬细胞中。来自肺癌、肾(RCC)癌、卵巢癌、结直肠癌和头颈癌的肿瘤细胞都显示MARCO表达于单核细胞和巨噬细胞上。

通过IL-10诱导MARCO RNA表达

通过在37C下向培养基中添加以下细胞因子使已分化的人类巨噬细胞极化24小时：50ng/ml脂多糖(LPS)(InvivoGen)、25ng/ml重组人类IFN-γ(PeproTech)、LPS+IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、TGF-β+或IL-10。然后去除培养基并在300μl RLT缓冲液+BME中溶解巨噬细胞，接着使用Qiagen试剂盒进行RNA提取。通过Nanodrop和Agilent生物分析仪评定mRNA数量和质量，然后将样品送至Medgenome以进行文库制备和RNAseq。然后从RNAseq分析提取每个极化条件下的MARCO mRNA表达，并以log2 CPM单位绘制。

如图2中所示，在人类单核细胞源性巨噬细胞(MDM)中，MARCO RNA表达是由IL-10诱导。

IL10和MARCO表达在适应症间相关

来自TCGA的所有单一2级适应症RNAseq数据都使用firehose_get从BroadInstitute下载。将来自肿瘤样品的MARCO、IL-10、PTPRC(CD45)和TREM2表达的RSEM值转化为log 2每百万计数。根据适应症，将MARCO和IL10表达的中值绘制于R中。斑点大小依据IL10-MARCO Spearman秩相关程度进行缩放。将以上所列出的基因的各适应症中值表达值的矩阵转化为Spearman相关矩阵，并使用R中的pheatmap套装绘制为热图。

图3A显示不同肿瘤类型中MARCO和IL-10表达的相关性，并且图3B显示TREM2表达、CD45表达、IL-10表达和MARCO表达之间的相关性的热图。如图3A和图3B中所示，IL10和MARCO表达在癌症适应症间具有良好相关性。

不同适应症中MARCO表达和与患者存活率的相关性

在结直肠癌(CRC)中

从NCBI的GEO网站(登录号GSE17537)下载55个结直肠肿瘤的预归一化MARCO表达概况和相关临床数据。基于MARCO的中值水平将表达概况分为两组。针对各组绘制Kaplan-Meier存活曲线，并使用R中的survival和survminer套装进行相关对数秩检验。如图4A中所示，MARCO表达与CRC中的患者存活概率负相关；较高MARCO表达与较低患者存活概率相关，并且较低MARCO表达与较高患者存活概率相关。

在肾细胞癌(RCC)中

基于通过http://gepia2.cancer-pku.cn/#index.的基因表达概况交互分析(GEPIA2)查看器产生的MARCO mRNA表达的中值分割的来自TCGA的两组肾癌(肾细胞癌)的存活关联。

如图4B中所示，在RCC中，MARCO表达与患者存活概率负相关；在RCC中，较高MARCO表达与较低患者存活概率相关，较低MARCO表达与较高患者存活概率相关。

在神经母细胞瘤中

从NCBI的GEO网站(登录号GSE62564)下载498个神经母细胞瘤肿瘤的预归一化MARCO表达概况和相关临床数据。基于MARCO的中值水平将表达概况分为两组。针对各组绘制Kaplan-Meier存活曲线，并使用R中的survival和survminer套装进行相关对数秩检验。

如图4C中所示，在神经母细胞瘤中，MARCO表达与患者存活概率负相关；在神经母细胞瘤中，较高MARCO表达与较低患者存活概率相关，并且较低MARCO表达与较高患者存活概率相关。

从NCBI的GEO网站(登录号GSE120572)下载394个神经母细胞瘤肿瘤的预归一化MARCO表达概况和相关临床数据。对具有所鉴定的INSS阶段的所有样品的MARCO表达概况进行绘图。配对比较的统计数据是使用R中的Wilcoxon秩和检验产生。如图4D中所示，根据INSS阶段，MARCO表达随神经母细胞瘤疾病严重程度变化而增加。

在基底样乳腺癌中

在gepia2.cancer-pku.cn/#index通过基因表达概况交互分析(GEPIA2)查看器产生的人类乳腺癌PAM50亚型间来自TCGA的MARCO表达。METABRIC表达概况和相关临床数据是在cbioportal.org从cBioPortal下载。基于PAM50亚型分型将各组的归一化MARCO表达概况绘制在R中。配对比较的统计数据是使用R中的Wilcoxon秩和检验产生。

如图5中所示，相对于其他乳腺癌亚型，MARCO在基底样乳腺癌中上调。左图显示来自TCGA的MARCO表达，右图显示来自METABRIC的MARCO表达。

MARCO高度表达于肿瘤内中间单核细胞群体上。在MARCO+群簇中，免疫沙漠和排斥的基因特征上调。来源于来自膀胱、乳腺、结直肠、子宫内膜、胃、头颈部、肾、肺和卵巢肿瘤的人类免疫细胞的单一细胞测序的聚集TAM和单核细胞产生在过渡性单核细胞中具有显著升高的MARCO表达的单一群簇(群簇2)。Hallmark通路(富MARCO群簇2对比所有其他巨噬细胞和单核细胞)的基因集富集分析(GSEA)显示MARCO表达与免疫抑制性基质相关基因集(例如血管生成、EMT)相关，并且因炎性基于干扰素的通路而下调。经鉴定在MARCO+细胞中上调的显著(FDR<0.05)通路为糖解、氧化磷酸化、上皮间质转化、缺氧、异生物质代谢、血管生成、胆固醇稳态、脂肪生成、脂肪酸代谢、活性氧通路和mTORC1信号传导。经鉴定在MARCO+细胞中下调的显著(FDR<0.05)通路为同种异体移植物排斥、TGF-b信号传导、KRAS信号传导DN、经由NF-kB的TNFα信号传导、IFNγ应答和IFNα应答。

实施例2：抗人类MARCO抗体的产生和表征

第一代杂交瘤

在Antibody Solutions(Sunnyvale,CA)进行抗体活动，其中对3只Balb/c小鼠进行两次快速活动，并使用人类MARCO His标签细胞外结构域(His-ECD 147-520，使用胶原样结构域(CLD)的残基147-419和清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域的残基424-520，Pi-114)作为免疫原对4只Balb/c小鼠进行一次标准活动。快速免疫程序由10次注射组成，每周2次，利用足垫作为途径。标准免疫程序由在12周的时程内注射5次组成，利用subQ作为途径。关于佐剂，快速1活动包括TLR+抗CTLA4，而快速2活动包括TLR+抗GITR。在不同的时间点通过ELISA测试小鼠血清的抗原滴度。使来自快速1活动的具有最高滴度的小鼠的脾脏和淋巴结融合，并创建杂交瘤文库以提供代表应答于抗原的经刺激B细胞群体的永生抗体产生细胞群体。通过FACS分选进行单细胞克隆以产生单克隆杂交瘤，以用于单克隆抗体培养。然后通过针对与小鼠和人类过度表达MARCO的293T细胞系的结合的双流式细胞术并使用表达GFP的细胞系(GFP-293T)作为不结合的阴性对照来筛选2,880个克隆。从初级筛选鉴定出33个与人类和小鼠MARCO具有交叉反应性并且具有无至低背景结合的克隆，并另外通过ELISA对MARCO人类抗原Pi-114进行筛选。通过流式细胞术检查来自33个克隆的杂交瘤上清液的细胞结合。

产生稳定过度表达细胞系

在Abmgood(Vancouver,Canada)将小鼠和人类MARCO DNA序列克隆于pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro慢病毒载体中，并使用标准细菌转化方案，使用大肠杆菌DH5-α菌株进行扩增，以产生高产率质粒供用于慢病毒包装。产生空GFP对照载体、人类MARCO和小鼠MARCO克隆慢病毒载体的病毒粒子并包装在293T细胞中，并且浓缩以获得高滴度。将293T细胞用作靶细胞，以供使用由Abmgood提供的病毒、遵循其方案和指南进行感染。使用嘌呤霉素选择感染库，并扩增表达均质高水平小鼠MARCO(293T_MuMARCO)、人类MARCO(293T_HuMARCO)和GFP(293T_GFP)的单一克隆。

随后产生pD2109-CMV-嘌呤霉素慢病毒骨架，以便克隆不具有和具有IRES-GFP的其他MARCO质粒：具有GFP(质粒3012)和不具有GFP(质粒3010)的人类MARCO全长、具有GFP(质粒3013)和不具有GFP(质粒3011)的小鼠MARCO全长、具有GFP(质粒3021)和不具有GFP(质粒3014)的食蟹猴MARCO(cyno MARCO)全长、仅人类MARCO CLD(1-419，质粒3022)，以及嵌合体小鼠MARCO CLD-具有IRES-GFP的人类MARCO SRCR(质粒3020)。使用Fugene，用以上构建体转染来自Sigma的293FT细胞以产生慢病毒粒子，随后转导293T细胞。使用嘌呤霉素选择阳性克隆，将其扩增以产生以下稳定细胞库供体外使用：3010(Hu_MARCO)、3012(Hu_MARC O_GFP)、3011(Mu_MARCO)、3013(Mu_MARCO_GFP)、3014(Cy_MAR CO)、3021(Cy_MARCO_GFP)、3020(MuCLD_HuSRCR_GFP)和3022(Hu_MARCO_CLD)。

表征抗MARCO杂交瘤和抗MARCO抗体与细胞表面表达的MARCO的结合

将表达人类MARCO(293T_HuMARCO)、小鼠MARCO(293T_MuMARCO)、食蟹猴MARCO(CyMARCO)的HEK293T细胞和表达GFP的对照细胞系(293T_GFP)维持在37℃含10％ FBS的DMEM(Gibco)中。对细胞进行计数，然后通过以400xg离心5分钟(min)来收集细胞。去除上清液并将细胞团块以1x10⁶个细胞/ml重悬于Ca²⁺+和Mg²⁺+杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)中。将100,000个细胞/孔接种在U型底96孔板上进行染色，并且所有离心步骤都在4℃下以1500rpm进行5分钟，并且在整个方案中保持样品避光。将细胞团块化并重悬于100μl通过在D-PBS中将Zombie NIR二甲亚砜(DMSO)储备液稀释1000倍而制备的Zombie NIR活力染料(BioLegend)中。通过在室温(RT)下在暗处温育10分钟对细胞进行染色，然后利用添加100μl染色培养基(含2％ FBS和2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的D-PBS)淬灭染色反应。将细胞团块化并重悬于100μl不同的抗体和杂交瘤上清液中以满足筛选需要，并且将例如PI-M014和mIgG2b同种型的相应同种型对照悬浮于新制备的染色培养基中。以100nM(15μg/ml)的最终最高浓度测试所有mAb，接着进行8点三倍连续稀释，包括0mg/ml对照。染色在冰上进行1小时(hr)，接着在染色培养基中洗涤2次。然后将细胞团块化并重悬于100ul通过将抗体储备液500倍稀释于染色培养基中而制备的别藻蓝蛋白(APC)缀合山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)二级抗体中，并在冰上温育30分钟。然后用染色培养基将平板洗涤两次，接着重悬于150ul相同缓冲液中，以便在流式细胞仪(Attune NxT，Life Technologies)上撷取。使用FlowJo软件(版本10.6.1)分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPad Prism软件(版本8)中处理和进一步分析数据。基于几何平均荧光强度(gMFI)计算半最大有效浓度(EC₅₀)。在不能够在细胞计数仪上对板进行分析的情况下，在洗涤后将细胞团块化并固定于100μl通过将16％(w/v)储备液(Thermo Fisher)稀释于DPBS中而制备的2％多聚甲醛(PFA)中，在室温下持续15分钟。然后将细胞团块化并去除固定剂，接着重悬于150μl染色培养基中，并储存在4℃下，直至在流式细胞仪上撷取。

图6A显示33种抗体与GFP-239T对照细胞(左侧条形)或者表达人类MARCO(中间条形)或小鼠MARCO的细胞(右侧条形)的结合。图6B显示与对照细胞(GFP对照)相比，一种MARCO抗体PI-M014结合至表达huMARCO、muMARCO和CynoMARCO的细胞的流式细胞术直方图。图6C显示PI-M014和同种型对照抗体结合至表达huMARCO的细胞的滴定。PI-M014结合至huMARCO，EC50为1.37nM。

通过ELISA表征抗MARCO杂交瘤和抗MARCO抗体与重组MARCO的结合

通过对重组人类MARCO蛋白(Pi-114 His标签)进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来筛选来自抗体溶液或抗MARCO抗体的杂交瘤。简言之，用处于D-PBS中的1ug/孔的重组MARCO蛋白包被96孔板(Biolegend)过夜。将板用PBS/0.1％ TWEEN-20/2mM EDTA(ELISA洗涤缓冲液)洗涤3次，并且在室温下用1％ BSA封闭2小时。在室温下以5μg/ml的最终最高浓度将抗体温育1小时，接着8点三倍连续稀释于PBS中，包括0mg/ml对照。如上对板进行洗涤，并与山羊抗小鼠IgG F(ab')2片段-HRP缀合二级抗体(Jackson Immuno)一起在1:5000稀释度下室温温育1小时。将板在上述ELISA洗涤缓冲液中洗涤4次，并用TMB底物显色10分钟(Thermo)，用TMB终止溶液(1M H₃PO₄磷酸)终止，并使用读板器(SpectraMax i3x)测定A450。

通过SPR进行MARCO抗体动力学表征

在BIAcore^TM T200(GE Healthcare)仪器上进行表面等离子体共振(SPR)，并且所有数据都在25℃下使用多循环动力学进行收集。使用胺偶联化学将抗小鼠Fc mAb(GEHealthcare)固定于CM4生物传感器芯片(GE Healthcare)上，以4500RU作为mAb的固定靶标。在含有10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％(v/v)表面活性剂P20的流动缓冲液中进行连续稀释。使用抗小鼠Fc mAb捕获针对人类MARCO抗原(配体)的所选单克隆抗体。所测试的抗MARCO抗体为PI-M014、PI-M015、PI-M017和PI-M018。所使用的相互作用分析物是被称为PI-RG-3000的N末端聚组氨酸标签人类MARCO ECD(147-520)。将以下范围的抗体浓度注入流动池中：0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM和10nM。流速为30μL/min，缔合和解离时间分别为90和600秒。在每个循环(包括抗原捕获、抗体缔合和解离阶段)之后，通过以50μL/min流速注射10mM甘氨酸HCl缓冲液pH 1.7持续100秒来再生细胞表面。使用BIAevaluation 3.1软件进行动力学评估以测定单循环和多循环动力学。

PI-M014单体在单一SPR循环中的K_D为3.91nM，并且在多循环测定中的K_D为1.32nM。在多循环测定中，PI-M015单体的K_D为0.39nM。在多循环测定中，PI-M017单体的K_D为0.96nM。在多循环测定中，PI-M018单体的K_D为1.65nM。

人类单核细胞源性巨噬细胞上的MARCO细胞表面表达

将使用负免疫磁性选择(StemCell Technologies)从外周血单核细胞分离的冷冻人类外周血CD14⁺单核细胞在补充有10％(v/v)热灭活FBS(HyClone)、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、55uM 2-巯基乙醇和抗霉菌抗生素(全部来自Gibco)的RPMI 1640培养基中解冻并培养。通过在存在50ng/ml人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)的情况下，在15cm培养皿中以12-15×10⁶个细胞的密度在完全RPMI 1640培养基中进行培养使单核细胞分化为巨噬细胞。在分化的第3天，通过添加新鲜M-CSF来补充培养基。分化7天后，使用无菌细胞刮刀(Nunc)以非酶促方式将巨噬细胞轻轻收集至FACS缓冲液(含有2mM EDTA和0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的D-PBS)中，接着在约20℃下以400xg离心5分钟。

对细胞进行计数，并且以250,000个细胞/孔接种至96孔板上。将100ul通过将储备液在D-PBS中稀释1000倍而制备的Zombie NIR活力染料(BioLegend)添加至每个孔中，并在室温下在暗处温育10分钟。通过添加150ul FACS缓冲液淬灭反应，接着在4℃下以400xg离心5分钟。然后在暗处在100ul含有2.5％小鼠和2.5％大鼠血清以及50倍稀释于Fc受体封闭剂(Innovex Biosciences)中的人类TruStain FcX(BioLegend)的封闭溶液中将细胞温育20分钟。然后将细胞洗涤并重悬于100μl在FACS缓冲液中新制备的筛选所需的不同抗体和相应同种型对照中(PI-M014、PI-M015、PI-M017、PI-M018、小鼠IgG2a和小鼠IgG2b，全部是APC缀合的，利用Thermo Fisher缀合试剂盒)。mAb以单点浓度(3.33μg/ml用于PI-M014，5μg/ml用于其他mAb)进行测试，并在冰上进行初次温育20-30分钟，接着在FACS缓冲液中洗涤2次。将细胞重悬于150ul相同缓冲液中，以便在流式细胞仪(Attune NxT，LifeTechnologies)上撷取。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPad Prism软件中处理和进一步分析数据。

PI-M014与人类单核细胞源性巨噬细胞结合，如图6D中所示。

小鼠抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定

如先前所证明，使用25ng/ml鼠类CSF-1(Peprotech)进行分化产生骨髓源性巨噬细胞。在培养的第6天，将25ng/ml鼠类IFN-γ(peprotech)添加至BMDM培养物中，持续18小时。第二天，用200ng/ml LPS(invivogen)刺激细胞2小时，然后用于ADCP测定。经IFN-γ/LPS诱导的BMDM充当效应细胞，并且经人类MARCO(293T Hu_MARCO)或对照(293T_GFP)转导的GFP+HEK293T细胞为靶标。在收集后，在37℃下用Cell-Trace Violet染料(invitrogen)将效应子BMDM染色20分钟。将50,000个靶细胞接种在96孔U型底板中，并与抗MARCO mAb或相应同种型(PI-M014至PI-M018)一起共同温育。将抗体连续稀释并在37℃下于培养基中制备30分钟。然后将效应细胞以3:1比率(150,000个效应细胞对50,000个靶标)添加至抗体-靶标板，并在37℃下温育2小时。温育后，使用Zombie NIR(BioLegend)对细胞进行活力染色，然后在室温下使用2％多聚甲醛(Invitrogen)固定20分钟，然后在Attune NXT流式细胞仪(ThermoFisher)上运行。ADCP活性是基于在活细胞下游闸控的Cell Trace Violet和GFP水平的双阳性来评定。

靶细胞与PI-M015和PI-M017一起温育都诱导效应细胞的ADCP活性。结果汇总于以下表1中。

HuMARCO抗体表位分箱(binning)

使用ForteBio Blitz无标记系统分析抗MARCO抗体的表位。

对于串联形式，将N末端his标签MARCO蛋白装载至ForteBio抗his探针上，接着是基线，然后与第一抗体缔合。在结合第一抗体后，添加第二抗体并测量第二组抗体的缔合。针对第二抗体观测到的任何额外结合(测量为信号增加)都指示第二抗体结合至与第一抗体不同的表位。

PI-M015和PI-M017彼此竞争结合至MARCO抗原，指示其结合至相同的MARCO表位(图7)。所有其他抗体都结合至不同的表位，并且不与任何其他抗体竞争结合至MARCO。然而，所述抗体仅结合至人类MARCO的CLD结构域，而不结合至人类MARCO的SRCR结构域。

原发性人类DTC肿瘤和外周血白细胞(PBL)上的MARCO表达

使用新开发的人类MARCO抗体，通过流式细胞术在三种适应症、卵巢癌和胃癌的人类肿瘤微环境中评定MARCO表达。将肿瘤组织先前解离为“解离肿瘤细胞”(DTC)并快速冷冻(Folio Conversant)。遵循制造商的指导方针将DTC解冻并计数以评定总活细胞。从血沉棕黄层(来自Stanford Blood Center的两名供体)分离PBL。将来自DTC和PBL的单细胞悬浮液于PBS(Gibco)中稀释，洗涤一次，并用Zombie NIR(Biolegend)染色以测定细胞活力。Fc受体也用人类血清(Jackson Immunoresearch)、人类FcX(Biolegend)和基于肽的FcR封闭溶液(Innovex Biosciences)封闭。与FcR封闭试剂一起温育后，DTC上的表面受体用涵盖主要肿瘤内免疫子集的标志物以及同种型对照(5μg/ml mIgG2a或mIgG2b或大鼠IgG2a)和直接缀合的抗人类MARCO抗体(5μg/ml PI-M017或PI-M018或PI-HX-3031)的流式细胞术混合液染色。也对细胞进行固定和透化(True-Nuclear Transcription Buffer Set，Biolegend)以测定细胞内CD68表达。PBL用涵盖主要血液免疫子集的标志物以及同种型对照(10μg/mlhIgG1，与PE Zenon标记缀合)和抗人类MARCO抗体(10μg/ml PI-3010、PI-3030和PI-3031，与PE Zenon标记缀合)的流式细胞术混合液染色。使用Attune NxT分析仪(ThermoFisher)撷取DTC和PBL的数据，并使用FlowJo(BD Biosciences)进行分析。

图8A和图8B显示MARCO表达于人类MDM(图8A)和来自原发性人类肿瘤样品(胃癌和卵巢癌)的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(图8B)中。在图8A和图8B中，右侧峰指示MARCO抗体PI-M018或PI-M017结合和染色，而左侧峰指示同种型mIgG2a结合。

来自第一抗体活动的所选抗体的结合和功能表征的汇总示于表1中。

*NB：无结合

实施例3：抗小鼠MARCO抗体的产生和表征

材料和方法

用于产生抗小鼠MARCO抗体的免疫

大鼠抗小鼠MARCO杂交瘤是通过使用单独Sigma佐剂系统(SAS)或替代地用也处于SAS中的表达小鼠MARCO的HEK293细胞，利用在Pionyr生产的重组N末端his标签小鼠MARCO蛋白对Sprague Dawley大鼠进行免疫而产生。所使用的重组N末端his标签小鼠MARCO蛋白的序列显示如下。通过SDS-PAGE分析重组小鼠MARCO蛋白，并使用尺寸排阻色谱法证实蛋白质分子量是正确的。

每周两次在跗关节处对大鼠进行免疫接种，并在第21天在Antibody Solutions(Santa Clara，CA)通过ELISA测试血清滴度。选择对小鼠MARCO具有足够血清抗体滴度的大鼠进行电融合以产生杂交瘤。在第-3天和第-2天给与两次最终加强免疫，然后收集于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

小鼠MARCO mAb RDM-9514购自R&D biosystems(CUST017 MABP，克隆57914)，作为在抗NS0衍生重组小鼠MARCO Gln70-Ser518大鼠中产生的定制纯化杂交瘤克隆。

杂交瘤产生

从经免疫大鼠收集淋巴结细胞并产生单细胞悬浮液。使用以BTX EC2000+电融合装置(Harvard Bioscience)进行的电融合使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag 14(ATCC)融合。将融合细胞接种至96孔平底板(Corning)中，并在含有HT(Stem Cell Technologies)的Clona-Cell培养基E中回收过夜。第二天，将氨基蝶呤(Sigma)添加至培养物中达至1X最终浓度。在第6天和第8天馈入融合物，并在第11天筛选。

杂交瘤筛选

取决于免疫，通过对重组小鼠MARCO蛋白或重组人类MARCO蛋白进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来筛选杂交瘤。简言之，将96孔Maxisorp板(Nunc)用0.1ug/孔的重组MARCO蛋白包被，在含有Ca2+和Mg2+的DPBS(Gibco，目录号14040117)中过夜。将板用PBS/0.05％TWEEN-20洗涤3次，并用含有2％胎牛血清的PBS/Ca2+封闭。将杂交瘤上清液1:1添加至含有PBS/Ca2+/2％ FBS缓冲液的孔中，并在室温下温育1小时。如上对板进行洗涤并且与山羊抗大鼠IgG-HRP缀合二级抗体(Jackson Immuno)或小鼠抗大鼠IgG(1、2a、2b)HRP缀合抗体(Southern Biotech)一起在室温下温育1小时。对板进行洗涤，用TMB底物(Thermo)显色，用TMB终止溶液(Suromodics)终止，并使用读板器(Tecan)测定A450。将产生抗MARCO抗体的杂交瘤转移至24孔板，并且再测试阳性克隆的上清液的MARCO反应性，并在其他结合测定中进一步测试。在重组人类MARCO、重组小鼠MARCO和对照重组his标签蛋白上筛选杂交瘤以消除任何非特异性或his标签特异性克隆，并且也在小鼠MSR1(R&D Systems)或人类MSR1(R&DSystems)上进行测试以检查与相关清除受体蛋白的交叉反应性。还测试了杂交瘤与两种嵌合蛋白(即，N末端重组人类MARCO SRCR/小鼠CLD蛋白和N末端重组小鼠MARCO SRCR/人类CLD蛋白)的结合，以确定MARCO蛋白上的抗体特异性结构域。这些研究中所使用的重组蛋白的序列如下：

N末端his标签小鼠MARCO蛋白：

HHHHHHHHGERGSPGPKGAPGAPGIPGLPGPAAEKGEKGAAGRDGTPGVQGPQGPPGSKGEAGLQGLTGAPGKQGATGAPGPRGEKGSKGDIGLTGPKGEHGTKGDKGDLGLPGNKGDMGMKGDTGPMGSPGAQGGKGDAGKPGLPGLAGSPGVKGDQGKPGVQGVPGPQGAPGLSGAKGEPGRTGLPGPAGPPGIAGNPGIAGVKGSKGDTGIQGQKGTKGESGVPGLVGRKGDTGSPGLAGPKGEPGRVGQKGDPGMKGSSGQQGQKGEKGQKGESFQRVRIMGGTNRGRAEVYYNNEWGTICDDDWDNNDATVFCRMLGYSRGRALSSYGGGSGNIWLDNVNCRGTENSLWDCSKNSWGNHNCVHNEDAGVECS

N末端his标签嵌合MARCO蛋白(人类SRCR/小鼠CLD结构域)：

HHHHHHHHKGERGSPGPKGAPGAPGIPGLPGPAAEKGEKGAAGRDGTPGVQGPQGPPGSKGEAGLQGLTGAPGKQGATGAPGPRGEKGSKGDIGLTGPKGEHGTKGDKGDLGLPGNKGDMGMKGDTGPMGSPGAQGGKGDAGKPGLPGLAGSPGVKGDQGKPGVQGVPGPQGAPGLSGAKGEPGRTGLPGPAGPPGIAGNPGIAGVKGSKGDTGIQGQKGTKGESGVPGLVGRKGDTGSPGLAGPKGEPGRVGQKGDPGMKGSSGQQGQKGEKGQKGENSVSVRIVGSSNRGRAEVYYSGTWGTICDDEWQNSDAIVFCRMLGYSKGRALYKVGAGTGQIWLDNVQCRGTESTLWSCTKNSWGHHDCSHEEDAGVECSV

N末端his标签嵌合MARCO蛋白(小鼠SRCR/人类CLD结构域)：

HHHHHHKGEQGAPGLQGHKGAMGMPGAPGPPGPPAEKGAKGAMGRDGATGPSGPQGPPGVKGEAGLQGPQGAPGKQGATGTPGPQGEKGSKGDGGLIGPKGETGTKGEKGDLGLPGSKGDRGMKGDAGVMGPPGAQGSKGDFGRPGPPGLAGFPGAKGDQGQPGLQGVPGPPGAVGHPGAKGEPGSAGSPGRAGLPGSPGSPGATGLKGSKGDTGLQGQQGRKGESGVPGPAGVKGEQGSPGLAGPKGAPGQAGQKGDQGVKGSSGEQGVKGEKGERGESFQRVRIMGGTNRGRAEVYYNNEWGTICDDDWDNNDATVFCRMLGYSRGRALSSYGGGSGNIWLDNVNCRGTENSLWDCSKNSWGNHNCVHNEDAGVECS

细胞结合

通过对人类MARCO-293细胞、小鼠MARCO-293细胞或对照293细胞进行染色并通过流式细胞术使用Intellicyt iQue流式细胞仪进行测试来测试根据ELISA关于与MARCO结合呈阳性的克隆与细胞表面MARCO的结合。选择根据ELISA关于与MARCO结合呈阳性并且根据流式细胞术关于与细胞表面MARCO结合呈阳性的杂交瘤用于亚克隆和纯化。

杂交瘤亚克隆和纯化

通过在FACSAria上进行单细胞分选对亲本杂交瘤进行亚克隆。将单细胞分选至平底96孔组织培养板中的Clona-Cell培养基E中。将单细胞培养7-9天，然后通过ELISA测定抗MARCO特异性克隆，如上文所描述。

然后通过在无血清扩增培养基(AOF，Stem Cell Technologies)中生长来培养单克隆杂交瘤以进行纯化，并使用蛋白A或蛋白G进行纯化。

杂交瘤抗体可变区序列产生

使用RNeasy纯化试剂盒(Qiagen，目录号74134)从(104至106个)单克隆杂交瘤细胞提取总RNA，然后使用Maxima H Minus First Strand cDNA合成试剂盒(Thermofisher，目录号K1651)和反向基因特异性引物(GSP1)进行逆转录(RT)以合成cDNA。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28104)纯化cDNA以去除RT反应中的GSP和酶。使用末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA的3'端添加一串oligo-dA(Thermo Scientific，目录号10533065)，再次纯化产物(QIAquick PCR纯化试剂盒，目录号28104)，然后扩增。然后使用第二基因特异性引物(GSP2)和结合先前添加至cDNA 3'端的Oligo-dA尾的Oligo-dT正向引物进行PCR。对PCR产物进行测序。在PCR产物产生质量不足的序列的情况下，对PCR产物进行TOPO克隆并转化至大肠杆菌中，并对单一菌落进行处理以进行测序。

所使用的引物如下列出：

GSP1-mk：TTGTCGTTCACTGCCATCAATC

GSP2-mk：ACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAG

GSP1-mHC：AGCTGGGAAGGTGTGCACAC

GSP2-mHC：GGGATCCAGAGTTCCAGGTC

GSP1-rk：GT GAG GAT GAT GTC TTA TGA ACA

GSP2-rk：GCCATCAATCTTCCACTTGACAC

GSP1-rHC：GAG ATG STT TTC TCG ATG GG

GSP2-rHC：GS GGG AAG ATG AAG ACA GAT G

钙依赖性ELISA测定

此测定的目的是确定抗MARCO抗体与MARCO结合的钙依赖性。此测定可适用于杂交瘤上清液和经纯化抗体二者。

使用以下条件将0.05μg/ml的人类或小鼠MARCO重组蛋白包被于4个Nunc-Immuno^TM微孔板上：在含Ca2+的DPBS(Gibco，目录号14040117)中；在不含Ca2+的DPBS(Gibco，目录号14190136)(含有2mM EDTA(Invitrogen，目录号15575020)-板B)中；在不含Ca2+并且含有10mM EDTA的DPBS中；以及在不含Ca2+并且含有50mM EDTA的DPBS中。

将板在室温下温育1小时或4℃过夜后，将板用ELISA洗涤缓冲液(PBS/0.05％TWEEN-20)洗涤3次，然后将杂交瘤上清液(1:5稀释)或经纯化抗体(1ug)稀释于DPBS/Ca2+/2％ FBS、无Ca2+/2mM EDTA/2％ FBS的DPBS、无Ca2+/10mM EDTA/2％ FBS的DPBS和无Ca2+/50mM EDTA/2％ FBS的DPBS中。再次在室温下将板温育1小时。

如上文对板进行洗涤并且与山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson)或小鼠抗大鼠IgG-HRP(1+2a+2b)1:1:1混合物(SouthernBiotech，目录号3060-05、3065-05、3070-05)一起温育，在室温下1:5000稀释于如上文的4种不同缓冲液中，持续1小时。然后对板进行洗涤并用TMB底物(Thermofisher)显色，并且用TMB终止溶液(Surmodics)终止，并使用Tecan读板器在A450读取。

使用ProbeLife Gator仪器的动力学和表位分箱

使用Probe-Life Gator^TM无标记系统分析抗MARCO抗体的结合动力学和表位。

动力学测定使用抗小鼠Fc或抗人类Fc探针将抗MARCO抗体捕获至探针上，然后使用五步动力学方案测量抗体对抗原的亲和力，包括以下步骤：基线、加载、基线、缔合和解离。使用由ProbeLife提供的动力学缓冲液(K缓冲液)建立基线，持续60秒，然后将抗mFc或抗hFc探针装载200nM抗体，持续120秒，直至捕获达到饱和，在K缓冲液中测量基线再进行60秒，然后使用200nM抗原(人类MARCO、小鼠MARCO或食蟹猴MARCO)进行缔合步骤，并且在K缓冲液中进行解离步骤，持续5-10分钟。所述测定在37℃下进行，以使抗体:抗原解离最大化。

对于抗体的表位分箱，使用串联和夹心形式。

对于串联形式，将200nM N末端his标签MARCO蛋白装载至ProbeLife抗his探针上，持续120秒或直到结合达到饱和，接着基线60秒，然后与以200nM装载的第一组饱和抗体缔合。在结合第一抗体后，以100-200nM添加第二抗体并测量第二组抗体的缔合。针对第二抗体观测到的任何额外结合(测量为信号增加)都指示第二抗体结合至与第一抗体不同的表位。

对于夹心测定形式，将第一抗体以200nM装载至抗mFc或抗hFc探针上，持续120秒，接着基线步骤，然后与MARCO抗原(200nM)缔合120秒。然后测量200nM第二抗体的缔合，持续120秒，以确定是否存在额外结合。在此形式中，在第一抗体浓度较低时，在第一缔合之后添加额外同种型对照抗体，以使探针上的自由结合位点饱和。所有探针和缓冲液都直接从ProbeLife订购。

用抗小鼠MARCO杂交瘤对BMDM进行MARCO染色

对来自三只雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories)的股骨和胫骨进行清洗，并且在染色培养基(0.5％(w/v)BSA(Sigma)和2mM EDTA/D-PBS)中使用研钵和研杵粉碎。然后使样品通过40um过滤器，用D-PBS洗涤并在室温下以400xg团块化5分钟。将细胞团块重悬于5ml BD Pharm溶解缓冲液(BD Biosciences)中，并且在室温下进行红细胞溶解，持续5分钟，接着用10倍体积的染色培养基淬灭。在室温下以400xg使细胞团块化5分钟，并且以15×106个细胞/ml的密度重悬于15cm板中由补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(HyClone)和抗生素-抗霉菌溶液(Gibco)的伊斯科夫改良杜尔贝科氏培养基(Iscove's modified DulbeccoMedium)组成的巨噬细胞培养基中。将这些骨髓单核细胞用25ng/ml小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)刺激7天以产生M0-巨噬细胞，并通过在第6天向培养基补充100ng/ml LPS而使其分化为M1样巨噬细胞，并且通过添加20ng/ml IL-10使其分化为M2样巨噬细胞。在37C下与极化细胞因子一起温育18小时后，用DPBS冲洗M0、M1和M2样巨噬细胞并在6ml 2mM EDTA中温育10分钟，以促进细胞脱离。将细胞轻轻刮至额外6ml上述染色培养基中，计数，并且以250,000个细胞/孔接种至96孔板上。将100ul通过将储备液在D-PBS中稀释1000倍而制备的Zombie NIR活力染料(BioLegend)添加至每个孔中，并在室温下在暗处温育10分钟。通过添加150ul染色培养基淬灭反应物，接着在4℃下以400xg离心5分钟。然后在暗处在100ul含有2.5％小鼠和2.5％大鼠血清以及50倍稀释于Fc受体封闭剂(InnovexBiosciences)中的小鼠TruStain FcX PLUS(BioLegend)的封闭溶液中将细胞温育20分钟。然后洗涤细胞，并重悬于100μl处于含有2％ FBS于含Ca2+的DPBS中的新制备FACS缓冲液中的不同筛选所需抗体和杂交瘤以及相应同种型对照(RDM-9514、HX-3012、HX-3014、HX-3016、HX-3017、大鼠IgG2a和大鼠IgG1，都是PE缀合型，利用PE Lightning试剂盒)中。以10μg/ml的最终最高浓度测试RDM-9514，接着8点三倍连续稀释于PBS中，最高剂量为10μg/ml。以5μg/ml的单点浓度测试内部杂交瘤。染色在冰上进行20-30分钟，接着在FACS缓冲液中洗涤2次。将细胞重悬于150ul相同缓冲液中，以便在流式细胞仪(Attune NxT，LifeTechnologies)上撷取。使用FlowJo软件(版本10.6.1)分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPad Prism软件(版本8)中处理和进一步分析数据。数据绘制为抗体与相应同种型之间的Δgmfi。在不能够在细胞计数仪上对板进行分析的情况下，在洗涤之后将细胞团块化并固定于100μl通过将16％(w/v)储备液(Thermo Fisher)稀释于DPBS中而制备的2％多聚甲醛(PFA)中，在室温下持续15分钟。然后将细胞团块化并去除固定剂，接着重悬于150μl染色培养基中，并储存在4℃下，直至在流式细胞仪上撷取。

用抗小鼠MARCO PE缀合mAb对肿瘤进行MARCO染色

Py8119和CT26肿瘤在其达到约400mm3体积时从小鼠收集。通过解剖从肿瘤去除脂肪和纤维物质。然后对肿瘤进行称重，并通过机械和酶促解离的组合加以处理以获得单细胞悬浮液。将组织切碎后，使用优化酶混合液(Miltenyi Biotec，肿瘤解离试剂盒，小鼠130-096-830)与gentleMACS C管(Miltenyi Biotec，130-093-235)在gentleMACS Octo解离器(Miltenyi Biotec，130-095-937)中对肿瘤进行酶促消化。解离后，将样品施加至过滤器以去除任何剩余的较大粒子。使用一组流式细胞术用抗体对肿瘤组织的单细胞悬浮液进行表面染色。用于评估髓系子集的抗体小组包括对CD45、XCR1、F4/80、CD64、CD11c、Ly6C、CD11b、Ly6G、CD24、MHC II类以及转储通道中的谱系标志物(CD45R、CD90.2、CD3e、NKp46、CD19、Siglec F)具有特异性的抗体。用于评估淋巴样子集的抗体小组包括对CD45、CD4、CD25、B220、NKp46、CD44、CD90.2、CD8a、CD11b和CD49b具有特异性的抗体。用于对小鼠肿瘤进行染色的抗MARCO抗体为5μg/ml的RDM-9514、PI-HX-3012、PI-HX-3021、PI-HX-3016、PI-HX-3017、大鼠IgG1和大鼠IgG2a同种型。所有数据都在Attune流式细胞仪(Thermo Fisher)上收集，并使用FlowJo软件进行分析。

对小鼠和人类重组MARCO的LDL竞争测定

用4μg/ml小鼠MARCO或4μg/ml人类MARCO(R&D biosystems)包被高结合96孔MSD板。用PBST和5％ BSA将板封闭1小时后，向板添加经滴定的抗小鼠或抗人类MARCO抗体并温育30分钟。向抗体添加生物素化hLDL(860pM或2μg/ml)，并且将抗体/LDL混合物温育1小时，使混合物达到结合平衡。对板进行洗涤，并且用当添加读取缓冲液并向MSD板中的电极通电时产生电化学发光信号的磺基标记链霉亲和素检测结合的生物素化LDL。IC50是使用GraphPad Prism软件中的4参数曲线拟合来计算。

结果

产生并表征了多种与小鼠MARCO的SRCR结构域结合的抗体。在初步ELISA筛选中使用经纯化的小鼠MARCO、人类MARCO、小鼠CLD-人类SRCR、人类CLD-小鼠SRCR和小鼠MSR1鉴定了909种候选抗体。对与表达小鼠MARCO的293T细胞或GFP对照的结合进行的二次筛选产生了275种候选物。对与内源小鼠BMDM的结合的筛选产生了40种候选物。仅针对SRCR结合剂的最终筛选产生了20种候选物。筛选候选物的额外生物物理特征。所产生的顶部抗小鼠MARCO抗体的生物物理表征示于表2中。这些抗体显示不与293T HuMARCO细胞或293T CyMARCO细胞结合。所选小鼠MARCO抗体的序列示于序列表中。CDR是使用AbM定义进行定义。

RDM-9514与MARCO的SRCR结构域结合。RDM-9514也以剂量依赖性方式阻断LDL与MARCO结合(图9)，并且与从CT26肿瘤和Py8119肿瘤分离的MHCII^高TAM和MHCII^低TAM上的表面表达MARCO结合(图10A)。用小鼠抗体RDM-9514染色还显示MARCO表达于CT26同基因型肿瘤模型中的TAM和单核细胞上(图10B)。

也用新产生的小鼠MARCO抗体评定巨噬细胞和IL-10极化后小鼠BDMD上的MARCO表达。PI-HX-3017(左侧条形，更名为PI-3009)、PI-HX-3016(左中条形，更名为PI-3008)、PI-HX-3021(右中条形，更名为PI-3007)和PI-HX-3012(右侧条形)各自与小鼠BMDM结合(图11A)。相同抗体也与从CT26同基因型肿瘤模型中的肿瘤分离的TAM(右侧条形)和单核细胞(左侧条形)上的MARCO结合(图11B，n＝2)。

实施例4：抗小鼠MARCO抗体在单一和组合疗法中的体内功效

材料和方法

CT26同基因型模型中与PD-1抗体的体内组合疗法

对供体内使用的抗体全部测试内毒素，并且以等于或低于0.2EU/mg蛋白质使用。获得呈小鼠IgG1 D265A形式的抗PD-1[克隆RMP1-14]。获得小鼠IgG1[克隆MOPC-21]和小鼠IgG2a[克隆C1.18.4]同种型对照。在HEK293细胞中产生PI-3006、PI-3007、PI-3008和PI-3009，并通过SEC和CE-SDS评估单分散性和纯度，以及测试内毒素。还通过流式细胞术测试抗体与过度表达小鼠MARCO的293T细胞的结合以及缺乏与亲本293T细胞的结合。

约八周龄雌性BALB/c小鼠获自Taconic Biosciences(Rensselaer,NY)。小鼠肿瘤细胞系CT26.WT(CRL-2638)获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，并根据其指南进行培养。将低传代细胞以1×10⁷个细胞/ml重悬于无血清1×DPBS(Gibco)中。在异氟烷麻醉下，将肿瘤细胞悬浮液经皮下注射于BALB/c小鼠的已剃毛右下腹侧。每周两次经由垂直肿瘤直径测量来监测肿瘤体积生长，并使用公式(mm³)＝0.5×(长度)×(宽度)²来计算。当肿瘤达到97mm³平均值时，随机分配六个治疗组，每组10只动物。对于药物处理，小鼠每5天一次经腹膜内给药，总计4次剂量(Q5Dx 4)，其中有15mg/kg抗小鼠同种型对照IgG2a(克隆C1.18.4)；5mg/kg抗小鼠同种型对照IgG1(克隆MOPC-21)；5mg/kg抗小鼠PD-1(克隆RMP1-14，重组产生为小鼠IgG1 D265A形式并且称为PI-0004-AB)，单独或与10mg/kg抗小鼠MARCO抗体(PI-3006、PI-3007、PI-3008和PI-3009)组合。所有研究都根据Explora Biolabs机构动物照护和使用委员会按方案EB17-010进行。根据USDA实验动物福利法案，在NIH实验室动物照护和使用指南中概述的条件下圈养小鼠。允许动物随意获取实验室饮食啮齿动物饲料和水。研究人员或兽医工作人员每周至少两次就可能需要施以安乐死的临床异常对小鼠进行监测。对与基线体重测量相比显示净体重减轻>20％的小鼠施以安乐死。

抗肿瘤免疫记忆测定

来自用如以上所描述的抗MARCO抗体加抗PD-1抗体处理进行的CT26肿瘤模型研究的无肿瘤BALB/c小鼠在左腹侧用1×10⁶个CT26肿瘤细胞再次攻击。在研究时段期间，将EMT6细胞经皮下注射至相对的右腹侧作为对照细胞系，以跟踪肿瘤生长。在研究时段期间未向小鼠提供额外治疗。再次攻击植入物之后，测量肿瘤体积，持续35天。

CT26模型中的药效学(PD)和体内抗MARCO抗体单剂功效

约八周龄雌性BALB/c小鼠获自Taconic Biosciences(Rensselaer,NY)。小鼠肿瘤细胞系CT26.WT(CRL-2638)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并根据其指南进行培养。将低传代细胞以1×10⁷个细胞/ml重悬于无血清1×DPBS(Gibco)中。在异氟烷麻醉下，将肿瘤细胞悬浮液经皮下注射于BALB/c小鼠的已剃毛右下腹侧。每周两次经由垂直肿瘤直径测量来监测肿瘤体积生长，并使用公式(mm³)＝0.5×(长度)×(宽度)²来计算。当肿瘤达到109mm³平均值时，随机分配两个治疗组，每组10只动物。对于药物处理，每7天一次(Q7D)向小鼠静脉内给与10mg/kg抗小鼠同种型对照IgG2a(克隆C1.18.4)和抗小鼠MARCO抗体(PI-3008)。所有研究都根据Explora Biolabs机构动物照护和使用委员会按方案EB17-010进行。根据USDA实验动物福利法案，在NIH实验室动物照护和使用指南中概述的条件下圈养小鼠。允许动物随意获取实验室饮食啮齿动物饲料和水。研究人员或兽医工作人员每周至少两次就可能需要施以安乐死的临床异常对小鼠进行监测。对与基线体重测量相比显示净体重减轻>20％的小鼠施以安乐死。研究时间线的示意图示于图15A中。

药物动力学(PK)测定

使用小鼠MARCO PK测定对小鼠血清中的药物抗体水平进行定量。用2μg/mlmMARCO(PI-RG-3016)包被高结合96孔MSD板。用封闭缓冲液(PBST，5％ BSA(PBS，0.01％Tween-20，BSA)封闭一小时后，向板添加标准曲线和经稀释血清样品并在板振荡器上温育2小时。样品和标准曲线都相对于5％小鼠血清最终浓度进行归一化。在DPBS++(Gibco)、0.05％ Tween-20、1％BSA中对板进行洗涤，并使用磺基标记抗小鼠IgG2a(JacksonImmuno)检测结合的MARCO抗体。当添加读取缓冲液并对MSD板中的电极通电时，磺基标记抗体产生电化学发光信号。血清样品中的抗体水平是通过使用MSD软件中的4参数曲线拟合由标准曲线内插进行定量。

对来自CT26 PD研究的肿瘤、LN和脾脏的RNAseq和通路分析

PD突检的第一时间点为静脉内给与抗体后4小时。收集每个小鼠的血液(血清)、脾脏、肿瘤和肿瘤引流淋巴结，并且将组织在液氮中快速冷冻。第二时间点为第二次静脉内给与抗体后4小时，发生在第一次静脉内给药后6天。收集每个小鼠的血液(血清)、脾脏、肿瘤和肿瘤引流淋巴结，并且将组织在液氮中快速冷冻。将快速冷冻样品运送至MedgenomeInc.，使用Biospec Beadbeater在缓冲液RLT+BME中进行组织匀浆化，并使用Qiagen AllPrep试剂盒和Biospec Beadbe进行RNA提取。通过Nanodrop和Agilent生物分析仪评定mRNA数量和质量，然后进行文库制备和RNAseq分析，以测定MARCO在早期和晚期PD时间点诱导的基因表达变化。产生具有FDR(<0.05)和cpm>2截止值的差异表达基因(上调和下调)，并且使用Cytoscape、KEGG和Hallmarks分析进行GSEA通路分析并绘图。使用热图绘制在4小时用PI-3008处理的脾脏的差异表达基因列表中观测到的IgV基因。

无岩藻糖基化抗体测定

在体内产生并测试具有mIgG2a小鼠Fc的无岩藻糖基化PI-3008。使用岩藻糖基化PI-3008抗体和mIgG2a同种型抗体作为对照。

在第0天植入CT26肿瘤细胞(1×10^6个细胞/小鼠)。当肿瘤体积达到约100mm3的平均值时，开始静脉内给与无岩藻糖基化PI-3008抗体(10mg/kg；Q7dx3)。

效应子死亡抗体测定

将N297A突变工程改造于PI-3008的小鼠IgG2a Fc中以产生效应子死亡mAb，PI-3021。在CT26小鼠模型中单独和与抗PD-1抗体组合测试PI-3008和效应子死亡PI-3021。第0天将Balb/c雌性小鼠经皮下接种同基因型CT26肿瘤细胞(1×10^6个细胞/小鼠)，并且当肿瘤体积达到约100mm3的平均值时，开始给与作为单一剂或与抗PD1组合的PI-3008(WT Fc；10mg/kg)、PI-3021(效应子死亡；10mg/kg)、抗PD-1(5mg/kg)和适当同种型对照(10mg/kg)(N＝10/组)。每5天对动物进行腹膜内给药，总计四次剂量。随时间监测肿瘤体积并呈现为每组的平均值、研究结束时个别肿瘤体积或TGI％。

结果

小鼠抗MARCO抗体与抗PD-1抗体组合时在CT26模型中显示显著抗肿瘤功效。图12显示用同种型抗体、仅PD-1抗体或PI-3008加PD-1抗体、PI-3007加PD-1抗体、PI-3009加PD-1抗体和PI-3007加PD-1抗体处理的小鼠群组的肿瘤体积。PI-3006和PD-1抗体引起10％癌症缓解(CR)，而PI-3007和PI-3009与PD-1抗体组合引起20％ CR。PI-3008具有最佳应答和总体TGI。图13A至图13D显示用同种型对照、抗PD-1、PI-3008+PD-1抗体或PI-3009+PD-1抗体处理后个别小鼠的应答。PI-3008(图13C)和PI-3009(图13D)在与抗PD-1抗体组合时显示最佳抗肿瘤功效。

无岩藻糖基化抗体测定

PI-3008显示比Fc增强变体(PI-3008-Afuc)更好的单剂(单一疗法)抗肿瘤活性。当与岩藻糖基化PI-3008相比时无岩藻糖基化PI-3008未显示有价值的单一疗法(图13E、图13F和图13G)。不希望受理论束缚，此数据表明单一疗法不需要增强Fc介导的参与。

效应子死亡抗体测定

效应子死亡PI-3008(PI-3021)也未引起抗肿瘤功效增加。PI-3008与抗PD-1组合的抗肿瘤功效稳定并且比PI-3021/抗PD-1组合更显著(图13H)。在CT26模型中，PI-3021与抗PD1组合未引起与在PI-3008下所观测相同的抗肿瘤活性水平(图13H)。在第22天研究结束时，与单独抗PD-1相比，PI-3008在肿瘤体积方面显著减小，而PI-3021未达到统计学显著性(图13I)。另外，与用组合疗法处理的个别小鼠中的PI-3021相比，PI-3008的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)更高(图13J和图13K)。最后，用PI-3021体外处理的小鼠BMDM在处理4小时后未显示促炎性通路活化，如在PI-3008的情况下所见(数据未示出)。不希望受理论束缚，此数据表明关于在抗PD-1抗性CT26小鼠模型中的所要体内抗肿瘤活性而言，具有岩藻糖基化Fc的PI-3008是最佳Fc形式。然而，PI-3021在E0771抗PD1敏感模型中显示与PI-3008相同的抗肿瘤活性(实施例11和图38)，表明抗MARCO抗体活性也可归因于对MARCO的靶活性以及Fc介导的信号传导。

抗MARCO和PD-1组合治疗在CT26肿瘤攻击后也产生长期抗肿瘤免疫记忆(图14)。将第一抗MARCO抗体处理后无肿瘤的小鼠重新植入CT26肿瘤细胞或EMT6肿瘤细胞。如图14所示，在先前已用抗MARCO和抗PD-1抗体处理的小鼠中未观测到重新植入的CT26肿瘤细胞生长。

也在CT26结直肠肿瘤模型中评定一种抗MARCO抗体PI-3008作为单剂单一疗法的药效学(PD)和抗肿瘤功效(图15A至图15C)。PI-3008抗MARCO抗体在CT26模型中显示显著单一疗法。图15A显示PD研究的时间线。图15B显示与同种型对照抗体相比，用PI-3008处理在第一剂量后6天减小了小鼠肿瘤尺寸。图15C显示第一和第二剂量后小鼠中PI-3008抗体的定量。

也对在PI-3008和同种型抗体的第一和第二剂量后4小时获取的样品进行CT26肿瘤分子概况分析。抗MARCO抗体活化了多个免疫通路。在第1剂量后，肌动蛋白介导的细胞收缩通路中的基因上调，通路FDR<0.1。在第二剂量后4小时，激酶活化和活性通路、Toll样受体信号通路、TLR 4和9通路、GTP酶结合和活性以及RAS-Rho信号转导通路中的基因上调。在第一和第二剂量之后，以下通路上调：体液免疫应答、NK介导的免疫、NK活化、IL-2和IL-12产生、细胞杀灭、效应过程调控、T细胞增殖、活化、分化、趋化和迁移、细胞-细胞粘附、吞噬作用和髓系分化。

体内测定CT26肿瘤中由抗MARCO抗体诱导的KEGG通路。在第1剂量后，前10个最差异性上调的通路为：自然杀手细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路、JAK/STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IgA产生的肠免疫网络、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、II型糖尿病和Fc-εRI信号通路。在第1剂量后，前10个最差异性下调的通路为：同源重组、阿尔茨海默病、RNA聚合酶、精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、卟啉和叶绿素代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、N-聚糖生物合成和氨酰tRNA生物合成。

在第2剂量后，CT26肿瘤中前10个最差异性上调的通路为：细胞因子-细胞因子受体相互作用、自然杀手细胞介导的细胞毒性、原发性免疫缺陷、趋化因子信号通路、造血细胞谱系、JAK/STAT信号通路、T细胞受体信号通路、IgA产生的肠免疫网络、神经活性配体受体相互作用和Fc-εRI信号通路。在第2剂量后，前10个最差异性下调的通路为：糖解糖质新生、丙酸代谢、蛋白酶体、柠檬酸循环TCA循环、心肌收缩、阿尔茨海默病、亨廷顿病、氧化磷酸化、核糖体和帕金森病。

也测定了体内肿瘤引流淋巴结中由抗MARCO抗体诱导的KEGG通路。在第1剂量后，前10个最差异性上调的通路为：磷脂酰肌醇信号传导系统、粘着斑、磷酸肌醇代谢、轴突导向、粘附连接、癌症中的通路、肌动蛋白细胞骨架调控、孕酮介导的卵母细胞成熟、ERBB信号通路和Wnt信号通路。在第1剂量后，前10个最差异性下调的通路为：氨酰tRNA生物合成、溶酶体、组氨酸代谢、药物代谢细胞色素p450、蛋白酶体、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、氧化磷酸化和核糖体。

在第2剂量后，肿瘤引流淋巴结中前10个最差异性上调的通路为：粘着斑、磷脂酰肌醇信号传导系统、神经营养因子信号通路、胰岛素信号通路、磷酸肌醇代谢、MAPK信号通路、癌症中的通路、肌动蛋白细胞骨架调控、ERBB信号通路和粘附连接。在第2剂量后，前10个最差异性下调的通路为：细胞色素p450对异生物质的代谢、造血细胞谱系、溶酶体、阿尔茨海默病、蛋白酶体、细胞因子-细胞因子受体相互作用、亨廷顿病、帕金森病、氧化磷酸化和核糖体。

也体内测定了脾脏中由抗MARCO抗体诱导的KEGG通路。在第1剂量后，上调的通路包括：ECM受体相互作用、粘着斑、紧密连接、粘附连接、蛋白酶体、补体和凝血级联、细胞粘附分子和CAM、癌症中的通路、致心律失常性右心室心肌病ARVC、Wnt信号通路、肌动蛋白骨架调控、轴突导向、亨廷顿病、致病性大肠杆菌感染、阿尔茨海默病、白细胞跨内皮迁移、细胞因子-细胞因子受体相互作用、基底细胞癌、黑素生成和刺猬信号通路。下调的通路包括：细胞周期、氨酰tRNA生物合成、错配修复、糖基磷脂酰肌醇GPI锚生物合成、甘油磷脂代谢和同源重组。

在第2剂量后，脾脏中上调的通路包括：细胞周期、蛋白酶体、T细胞受体信号通路、DNA复制、泛素介导的蛋白水解、肌动蛋白细胞骨架调控、粘附连接、致病性大肠杆菌感染、基础转录因子、磷酸戊糖通路、FcγR介导的吞噬作用、神经营养因子信号通路、自噬作用调控、糖解糖质新生、卵母细胞减数分裂、慢性髓系白血病、柠檬酸循环TCA循环、Wnt信号通路、P53信号通路和自然杀手细胞介导的细胞毒性。下调的通路包括：ABC转运蛋白、糖基磷脂酰肌醇GPI锚生物合成、RNA聚合酶、核糖体、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢。

也对第1剂量和第2剂量后经PI-3008处理的CT26肿瘤中差异性表达的基因进行了更深入分析。与NK细胞相关的基因，例如Klrk1、Nrc1和Prf1；与促炎性和免疫活化相关的基因，例如Cd40、Cd8α、Nod2、Tlr4、Tnf、Nlrp3、Cd274、Clec9α和Cd200r3；以及促炎性细胞因子，例如Il-27、Cxcl9、Cxcl10和Cxcl12，得以上调。图16A显示用PI-3008或同种型对照抗体处理后CT26肿瘤微环境中Klrk1、Nrc1、Tlr4、Il-27、Cd8α、Cxcl9、Cxcl10和Tnf的表达水平。在每种情况下，用PI-3008处理都增加了基因的表达。图16B显示用PI-3008处理后BMDM和CT26肿瘤中上调的基因的比较。

另外，抗Marco抗体3008在第一剂量后上调CT26脾脏中的IG-V基因。已知154个CPM>1的标注IG-V基因。在PI-3008处理下，所有154个标注IG-V基因都上调，而138/154个差异性表达，FDR<0.05。因而，在抗MARCO抗体处理以活化自身抗原或肿瘤抗原(例如NK活化)时，可能发生脾脏边缘区中浆细胞或活化B细胞的多克隆扩增。

实施例5：其他抗人类MARCO抗体的产生和表征

材料和方法

进行另一项抗体活动以开发结合至人类MARCO的SRCR结构域的抗体。

用于产生抗小鼠MARCO抗体的免疫

大鼠抗人类MARCO杂交瘤是通过在单独Sigma佐剂系统(SAS)中或替代地用表达人类MARCO的HEK 293细胞，利用重组N末端his标签人类MARCO蛋白对Sprague Dawley大鼠进行免疫而产生。重组N末端his标签人类MARCO蛋白包含人类MARCO的残基147-520。重组人类MARCO蛋白是适当折叠和三聚体形成的质量控制。相比之下，先前用于实施例2中所描述的不成功抗人类MARCO活动的人类MARCO蛋白(Pi 114)由包含CLD结构域的残基147-419和SRCR结构域的残基424-520的经修饰MARCO ECD结构域组成。

每周两次在跗关节处对大鼠进行免疫接种，并在第21天在Antibody Solutions(Santa Clara，CA)测试血清滴度。选择对人类MARCO具有足够血清抗体滴度的大鼠进行电融合以产生杂交瘤。在第-3天和第-2天给与两次最终加强免疫，然后将免疫收集于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

杂交瘤产生和筛选

如实施例3中所描述对人类MARCO抗体进行杂交瘤产生和筛选测定。

细胞结合

如实施例3中所描述对人类MARCO抗体进行细胞结合测定。

杂交瘤亚克隆和纯化

如实施例3中所描述对人类MARCO抗体进行杂交瘤亚克隆和纯化。

杂交瘤抗体可变区序列产生

如实施例3中所描述来产生人类MARCO抗体的杂交瘤抗体可变区序列。

嵌合和人源化抗体产生

通过用人类IgG1或IgG4结构域置换大鼠IgG1或IgG2a Fc结构域来制造嵌合抗体。

也由大鼠亲本杂交瘤合成了人源化抗体。

将大鼠杂交瘤的VH和VL序列与NCBI网站(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/；Ye,J.等人,Nucleic Acids Research 41:W34-W40(2013))上的已知人类生殖系序列库相比较。所使用的数据库是如NCBI IgBLAST程序所使用的IMGT人类VH基因(F+ORF，273个生殖系序列)和IMGT人类VLκ基因(F+ORF，74个生殖系序列)。受体人类生殖系选自序列最接近亲本抗体者。

选择人类生殖系IGHV1-46(等位基因1)作为受体序列，并且人类重链IGHJ4(等位基因1)连接区(J基因)选自the international ImMunoGeneTics informationimgt.org(创始人兼董事:Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France)编译的人类连接区序列。

选择人类生殖系IGKV1-39(等位基因1)作为受体序列，并且人类轻链IGKJ2(等位基因1)连接区(J基因)选自the international ImMunoGeneTics informationimgt.org(创始人兼董事:Marie-Paule Lefranc,Montpellier,France)编译的人类连接区序列。HX-3061大鼠亲本和人源化VH和VL序列的序列比对分别示于图17A和图17B中。HX-3031大鼠亲本和人源化VL序列的序列比对示于图18中。

在来源于HX-3061杂交瘤的人源化抗体VH和来源于HX-3031杂交瘤的VL中进行额外回复突变。基于人类框架VH序列，在HX-3061VH中进行的回复突变为：V37I、V48I和S49A。基于人类框架VL序列，在HX-3031VL中进行的回复突变为：A13T、A43P、S56D、F71Y、L78M、F83E和Y87F。

根据AbM定义(bioinf.org.uk/abs/，用于比较CDR定义的表)来定义CDR。

钙依赖性ELISA测定

如实施例3中所描述进行钙依赖性ELISA测定。

使用ProbeLife Gator仪器的动力学和表位分箱

如实施例3中所描述对新产生的抗人类MARCO抗体进行动力学和表位分箱分析。

对小鼠和人类重组MARCO的LDL竞争测定

如实施例3中所描述对小鼠和人类重组MARCO进行LDL竞争测定。

MARCO细菌竞争测定

表达人类或小鼠MARCO的293T细胞与亲本293T细胞一起收集。通过在D-PBS中将储备液稀释1000倍来制备Zombie NIR活力染料(BioLegend)，并添加至细胞。在室温下将细胞与染料一起在暗处温育10分钟。通过添加1m 4x染色缓冲液(2％ FBS/含Ca²⁺的DBPS)淬灭反应物，接着在4℃下以400xg离心5分钟。然后将细胞以100,000个细胞的密度接种在V形96孔板中。以10μg/ml添加A488荧光标记细菌(来自Invitrogen的大肠杆菌)，与目标抗人类或抗小鼠抗体一起在37C下温育30分钟。然后将板洗涤两次，接着重悬于100ul染色缓冲液中，以便在流式细胞仪(Attune NxT,Life Technologies)上撷取。使用FlowJo软件(版本10.6.1)分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPad Prism软件(版本8)中处理和进一步分析数据。

结果

经由对与人类MARCO的结合进行ELISA筛选而对抗人类MARCO抗体进行的初步筛选产生了304种候选物。二次筛选

使用经纯化的人类MARCO在初步ELISA筛选中鉴定304种候选抗体。对与表达人类、食蟹猴和小鼠MARCO的293T细胞或GFP对照细胞的结合进行的二次筛选产生了138种候选物。还经由ELISA对SRCR对比CLD结合进行了额外二次筛选。鉴定了90种SRCR结合抗体和47种CLD结合抗体。然后针对在内源细胞上的结合、结合动力学、LDL竞争以及与人类MSR1的结合筛选候选抗体。鉴定出42种候选抗体，即37种SRCR结合抗体和5种CLD结合抗体。其中，11种候选抗人类MARCO抗体经鉴定具有良好结合特征。所选人类MARCO抗体的序列示于序列表中。CDR是使用AbM定义进行定义。

所产生的大鼠杂交瘤抗人类MARCO抗体的表征示于表3中。

基于CDR序列分析，选择十一种候选抗MARCO抗体中的五种进行进一步开发：PI-HX-3011、PI-HX-3031、PI-HX-3043、PI-HX-3061和PI-HX-3092。通过将大鼠IgG2a Fc区与人类IgG1(对于PI-HX-3011和PI-HX-3043)或IgG1和IgG4(对于PI-3031和PI-HX-3061)交换来制造人类嵌合抗体。还通过用小鼠IgG2a(对于PI-HX-3036和PI-HX-3092)交换大鼠IgG2aFc区来制造其他嵌合抗体。对来源于PI-HX-3011、PI-HX-3031和PI-HX-3061大鼠亲本抗体的抗体进行VH和VL框架的进一步人源化。

表4提供所选大鼠亲本抗体、所产生的嵌合抗体和人源化抗体的汇总。

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如先前所描述来表征新产生的大鼠杂交瘤抗人类MARCO抗体。大鼠亲本抗体HX-3031和HX-3061的表征示于表5中。抗体都不与MSR1结合。经由多循环动力学分析，使用如先前描述的huMARCO抗原来测定结合动力学。

一种抗huMARCO抗体(PI-HX-3061)经测定与人类和小鼠MARCO交叉反应。

在细菌结合测定中进一步表征三种抗体，即两种抗小鼠MARCO抗体PI-3008和PI-3009，以及交叉反应性抗人类MARCO抗体PI-HX-3061。如图19中所示，muMARCO 293T细胞与增加浓度的PI-3008、PI-3009或PI-HX-3061一起温育以剂量依赖性方式降低细菌结合，而与同种型对照大鼠IgG1或小鼠IgG2a一起温育不影响细菌与细胞结合。

表6中提供PI-3008、PI-3009和PI-HX-3061的物理性质的比较。

在4种EDTA浓度下对重组人类MARCO进行所选大鼠杂交瘤亲本抗体的ELISA筛选显示MARCO与各种抗MARCO抗体和不同表位的结合差异性依赖于二价阳离子。结果示于表7中。

还表征了所选人类嵌合体和其他人源化抗体的物种结合特异性、二价阳离子结合要求、SRCR和CLD结构域结合动力学以及细胞结合。

如图52中所示，一些抗MARCO抗体与MARCO的结合具有钙依赖性。添加2mM EDTA消除了PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41与MARCO的结合，而非钙依赖性mAb PI-3032的结合不受影响。替代物抗小鼠MARCO mAb PI-3008-AB也以钙依赖性方式与小鼠MARCO结合。添加2mM EDTA消除了结合，而非钙依赖性抗小鼠MARCO mAb PI-3000不受影响。

PI-3010(hIgG1)、PI-3030(hIgG1)和PI-3031(hIgG1)的表征结果汇总示于

表8中。

PI-3031(hIgG1)嵌合体和基于PI-3031嵌合体的两种其他人源化抗体的结果示于表9中。

还评估了嵌合体抗体PI-3010、PI-3030和PI-3031的PBL结合。如图20A中所示，嵌合体抗体与过度表达MARCO的293T细胞结合，但不与PBL中所存在的免疫细胞结合。与嗜酸性粒细胞结合在所有测试抗体(包括hIgG1同种型对照)中都是非特异性的。PI-3010示于左侧，PI-3030示于左侧中间，PI-3031示于右侧中间，并且同种型对照hIgG1示于右侧。还评定了来自子宫内膜癌(原发性人类肿瘤)的免疫细胞中PI-HX-3031的结合。如图20B中所示，抗体与来自肿瘤样品的TAM和单核细胞结合。抗体结合为右侧峰，同种型对照结合为左侧峰。

实施例6：通过表面残基交换进行的表位定位

材料和方法

使用小鼠MARCO SRCR晶体结构(PDB登录号2OY3)设计构建体。比对小鼠和人类MARCO SRCR序列，并且将蛋白质表面上的不同残基彼此成簇交换。将N末端his标签和CLD结构域添加至SRCR序列以产生重组蛋白。这些研究中所使用的重组蛋白的序列在以下列出。粗体加下划线残基是交换的表位残基：

hMARCO(His-CLD-SRCR)(RG3033)

HHHHHHKGEQGAPGLQGHKGAMGMPGAPGPPGPPAEKGAKGAMGRDGATGPSGPQGPPGVKGEAGLQGPQGAPGKQGATGTPGPQGEKGSKGDGGLIGPKGETGTKGEKGDLGLPGSKGDRGMKGDAGVMGPPGAQGSKGDFGRPGPPGLAGFPGAKGDQGQPGLQGVPGPPGAVGHPGAKGEPGSAGSPGRAGLPGSPGSPGATGLKGSKGDTGLQGQQGRKGESGVPGPAGVKGEQGSPGLAGPKGAPGQAGQKGDQGVKGSSGEQGVKGEKGERGENSVSVRIVGSSNRGRAEVYYSGTWGTICDDEWQNSDAIVFCRMLGYSKGRALYKVGAGTGQIWLDNVQCRGTESTLWSCTKNSWGHHDCSHEEDAGVECSV*

hVar1(RG3034)

hVar2(RG3035)

hVar3(RG3036)

hVar4(RG3037)

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hVar5(RG3038)

hVar6(RG3039)

hVar7(RG3040)

mMARCO(RG3016)

mVar1(RG3026)

mVar2(RG3027)

mVar3(RG3028)

mVar4(RG3029)

mVar5(RG3030)

mVar6(RG3031)

mVar7(RG3032)

野生型人类和小鼠SRCR结构域的序列比较，以及所制造的小鼠和人类变体序列示于图21中。

使用ProbeLife Gator仪器的结合动力学

使用Probe-Life Gator^TM无标记系统来分析顶部抗人类和抗小鼠抗体与小鼠/人类SRCR抗原变体的结合。

动力学测定使用抗小鼠Fc或抗人类Fc探针将抗MARCO抗体捕获至探针上，然后使用五步动力学方案测量抗体对以上所描述的不同变体抗原的亲和力，包括以下步骤：基线、加载、基线、缔合和解离。由ProbeLife提供的动力学缓冲液(K缓冲液)建立基线，持续60秒，然后将抗mFc或抗hFc探针装载200nM抗体，持续120秒，直至捕获达到饱和，在K缓冲液中测量基线再进行60秒，接着使用200nM抗原(人类SRCR MARCO变体和小鼠SRCR MARCO变体)进行缔合步骤，并且在K缓冲液中进行解离步骤，持续5-10分钟。所述测定在37℃下进行，以使抗体:抗原解离最大化。

用于装载的抗体为PI-3010、PI-3008、PI-3019、PI-3030、PI-3031和PI-3035。PI-3008、PI-3010和PI-3030是Ca²⁺依赖性结合剂，而PI-3019和PI-3035是Ca²⁺非依赖性结合剂。PI-3019和PI-3035也与人类和小鼠MARCO具有交叉反应性。

结果

PI-3008与mMARCO结合受mVar2、mVar 3、mVar 4、mVar 5和mVar6中突变影响最大(数据未示出)。然而，PI-3008与mMARCO SRCR结合受mVar6突变影响最大，并且因而mVar6中经改变的残基可能是mMARCO表位的一部分(小鼠MARCO的D450、D452、N487、S499)。mVar 1和mVar 7中的突变对PI-3008与mMARCO结合具有最小不利影响。野生型(wt)mMARCO SRCR结构域和mVar6序列的序列比较示于图22中。

用小鼠和人类MARCO变体测试具有Ca2+非依赖性结合的交叉反应性抗体PI-3019和PI-3035。PI-3019受hVar3突变(人类MARCO的Q452D、Y472S和K473S)的不利影响最大，而PI-3035受hVar5和hVar6不利影响(数据未示出)。对于PI-3019的mVar3以及PI-3035的mVar3和mVar 5，观测到类似的结合减少。野生型(wt)hMARCO SRCR结构域与hVar3、hVar5和hVar6序列的序列比较示于图22中。与野生型人类或小鼠MARCO相比，粗体加下划线氨基酸发生了突变。

仅人类Ca2+依赖性抗体PI-3010、PI-3030和PI-3031都显示与hVar3的结合显著降低(数据未示出)。因而，hVar3影响PI-3010、PI-3030、PI-3031和PI-3019的结合，而hVar5和hVar6影响PI-3035的结合。

抗体结合和阳离子依赖性的汇总示于表10中。

如通过ELISA测量的各种人类抗体与hVar3的结合示于图23中。使用hIgG1和mIgG2a作为抗体对照。使用PI-3008和PI-300作为阴性对照。对人类MARCO具有单一反应性的抗体(PI-3010、PI-3020、PI-3030、PI-3031)不结合至hVar3，而来源于交叉反应性HX-3061杂交瘤(PI-3028、PI-3029、PI-319)或HX-3092(PI-3035)的抗体结合至hVar3。

为了证实在hVar3中鉴定的残基(Q452、Y472和K473)作为单一反应性hMARCO抗体的结合表位的重要性，使PI-3010结合至具有突变Q452D、Y472S和K473S残基的hVar3，以及具有与野生型人类MARCO相同的残基Q452、Y472和K473的mVar3。PI-3010的结合在hVar3上丧失，但在mVar3上恢复(数据未示出)。这证实至少一个、一些或所有残基Q452、Y472和K473可能是针对来源于HX-3011、HX-3043、HX-3031和HX-3061的人类MARCO产生的抗体(例如，包括但不限于PI-3010、PI-3020、PI-3030、PI-3031、PI-3019和PI-3033的那些抗体)的MARCO表位的一部分。这些残基也在MARCO上的D447 D448 E511酸性簇附近。

hVar5中影响PI-3035结合的突变残基为H505、D507、S509和E511。hVar6中影响PI-3035结合的突变残基为E450、Q452、Q487和T499。因而，残基E450、Q452、Q487、T499、H505、D507、S509和E511中至少一个、一些或全部可能代表来源于HX-3092的抗体(例如，包括但不限于PI-3035的那些抗体)的另一结合表位。

小鼠和人类抗体在SRCR结构域中具有重叠表位，其中一个重叠残基为人类SRCR的Q452与小鼠SRCR的D452，如图24中所示。重叠残基在左侧的小鼠SRCR结构域和右侧的人类SRCR结构域上都被圈出。

实施例7：非人类灵长类动物药物动力学研究

为了评定人源化药物候选物的药物暴露和安全性，开发两种药物动力学(PK)测定，即总体和游离(配体结合)，以便在探索性单剂量非人类灵长类动物(NHP)PK和耐受性研究中对PI-3025-AB2(IgG1形式)和PI-3048-AB(IgG4形式)抗体浓度进行定量。单剂量研究由四只动物(每组1只雄性和1只雌性)组成，以10mg/kg给与PI-3025-AB2(IgG1)和PI-3048-AB(IgG4)。表11显示研究设计。

配体结合测定

将标准MSD板(Meso Scale Discovery，目录号L15XA-3)用1μg/mL重组人类MARCO蛋白包被。在室温下将板温育60分钟，然后洗涤。然后在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)将板封闭60分钟。

将PI-3025-AB2和PI-3048-AB蛋白质标准物和质量控制样品，以及动物样品稀释于缓冲液(PBS/0.5％ BSA/0.05％ Tween+Ca2+/Mg2+)中，并添加至经包被板的盐缓冲液中。在室温下将板温育60分钟并洗涤。添加0.5μg/mL检测抗体、抗人类IgG CH2(ThermoFisher，目录号MA5-16929)，并且在室温下将板温育60分钟。对板进行洗涤，并且将1×读取缓冲液(Meso Scale Discovery，目录号R92TC-1)添加至MSD板。在MSD Sector成像仪上对板进行读取。

总PK测定形式

将链霉亲和素MSD板(Meso Scale Discovery，目录号L15SA-1)用1μg/mL生物素化抗人类κ抗体(Invitrogen，目录号SA1-19155)包被。在室温下将板温育60分钟，然后洗涤。将PI-3025-AB2和PI-3048-AB蛋白质标准物和质量控制样品，以及动物样品稀释于缓冲液(PBS/0.5％ BSA/0.05％ Tween+Ca2+/Mg2+)中，并添加至经包被板的盐缓冲液中。在室温下将板温育60分钟并洗涤。添加0.5μg/mL检测抗体、抗人类IgG CH2(Thermo Fisher，目录号MA5-16929)，并且在室温下将板温育60分钟。对板进行洗涤，并且将1×读取缓冲液(MesoScale Discovery，目录号R92TC-1)添加至MSD板。在MSD Sector成像仪上对板进行读取。

结果

单剂量研究显示PI-3025和PI-3048抗体具有可接受的PK，并且得到良好耐受。对于每个抗体，总体和游离测定形式都测量到类似的药物浓度。

PI-3025-AB2的PK校准曲线示于图25A和表12中。

PI-3048-AB的PK校准曲线示于图25B和表13中。

在探索性NHP研究中，成功开发了PK测定以测量药物浓度。PK测定范围为1.85ng/mL至300ng/mL(测定中)，最低要求稀释度(MRD)为20。LLOQ为1.85ng/mL并且ULOQ为240ng/mL。质量控制(QC)范围为5ng/mL至240ng/mL。

体内配体结合PK测定结果示于图26A中。在配体结合测定中，PI-3025-AB2在第21天(504小时)后未显示可检测的药物水平(图26A)。在配体结合测定中，检测到PI-3048-AB直至第28天(672小时)(图26A)。体内总PK测定结果示于图26B中。检测到PI-3025-AB2直至第21天(504小时)和第28天(672小时)(图26B)。检测到PI-3048-AB直至第28天(672小时)(图26B)。给与PI-3048-AB的动物比给与PI-3025-AB2的动物显示稍微更好的暴露。

PI-3025-AB2和PI-3048-AB的PK结果在使用总体和游离测定时相当。PI-3025-AB2和PI-3048-AB抗体在单剂量研究后具有可接受的耐受性和良好暴露。

实施例8：抗人类MARCO抗体的额外表征

材料和方法

抗MARCO抗体细胞结合、SPR结合动力学(K_D)和巨噬细胞结合如先前于实施例2和实施例5中所描述来进行。

配体结合阻断测定

表达人类MARCO的293T细胞与亲本293T细胞一起收集。将通过在D-PBS中将储备液稀释1000倍而制备的Zombie NIR活力染料(BioLegend)添加至细胞，并在室温下在暗处温育10分钟。通过添加1m 4×染色缓冲液(2％FBS/含Ca²⁺的DBPS)淬灭反应物，接着在4℃下以400xg离心5分钟。然后将细胞以100,000个细胞的密度接种在V形96孔板中。以10μg/ml添加A488荧光标记细菌(来自Invitrogen的大肠杆菌)，与目标抗人类MARCO抗体一起在37C下温育30分钟。然后将板洗涤两次，接着重悬于100ul染色缓冲液中，以便在流式细胞仪(AttuneNxT,Life Technologies)上撷取。使用FlowJo软件(版本10.6.1)分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPad Prism软件(版本8)中处理和进一步分析数据。

T细胞结合测定

使用从ATCC获得的Jurkat T细胞进行标准流式结合测定。将100,000个细胞/孔的Jurkat T细胞接种至U型底96孔板上以进行染色，并且所有离心步骤都在4℃下以1500rpm进行5分钟，并且整个方案中保持样品避光。将细胞团块化并重悬于100μl通过在D-PBS中将Zombie NIR二甲亚砜(DMSO)储备液稀释1000倍而制备的Zombie NIR活力染料(BioLegend)中。通过在室温(RT)下在暗处温育10分钟对细胞进行染色，接着利用添加含10％FBS的常规培养基淬灭染色反应。使细胞团块化并重悬于100μl含不同抗人类MARCO抗体以及相应hIgG1和hIgG4同种型对照的新制备染色培养基(2％FBS/含Ca2+的DBPS)中。以100nM(15μg/ml)的最终最高浓度测试所有mAb，接着进行8点三倍连续稀释，包括0mg/ml对照。染色在冰上进行1小时(hr)，接着在染色培养基中洗涤2次。然后将细胞团块化并重悬于100ul通过将抗体储备液500倍稀释于染色培养基中而制备的别藻蓝蛋白(APC)缀合山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)二级抗体中，并在冰上温育30分钟。然后用染色培养基将平板洗涤两次，接着重悬于150ul相同缓冲液中，以便在流式细胞仪(Attune NxT，Life Technologies)上撷取。使用FlowJo软件(版本10.6.1)分析流式细胞术数据，并且在Microsoft Excel和GraphPadPrism软件(版本8)中处理和进一步分析数据。基于几何平均荧光强度(gMFI)计算半最大有效浓度(EC50)。

使用动态光散射(DLS)的mAb热稳定性评定

动态光散射利用粒子在溶液或悬浮液中的布朗运动来测量其大小。波动率直接对应于散射粒子的扩散率。较大粒子扩散得较慢，引起缓慢光学波动，而较小粒子扩散得较快，引起快速光学波动。粒子扩散系数可通过对原始光学信号进行自相关分析并拟合所得自相关函数来确定。然后使用斯托克斯-爱因斯坦方程(Stokes-Einstein equation)由扩散系数确定粒度。

DLS测量是使用Dynapro读板器III(Wyatt Technology)来进行。将待评估的抗体稀释于1×PBS(Gibco，目录号14190-144)中，通过0.02um过滤器进行过滤以去除颗粒物质和大聚集体，最终浓度为1-2mg/mL。将二十五微升抗体溶液添加至384孔板(Aurora，目录号ABA210100A)的孔中，接着添加5uL硅油(Alfa Aesar，目录号A12728)。覆盖所述板并以1000xg离心1分钟以确保去除气泡。然后将板装载至DLS仪器上，并使用以下装置以及默认仪器设置收集数据。

初始温度设为25℃，接着以1℃/min稳定增至85℃，并启用激光强度的自动衰减。对每个孔进行连续测量以测定扩散系数和流体动力学半径。聚集起始温度(Tagg)值是通过使用整合Dynamics7.1软件获得，所述软件分析温度变化对应的半径变化，并将流体动力学半径增加对应的温度确定为Tagg。

使用差示扫描荧光法(DSF)的mAb热稳定性评定

DSF是使用QuantStudio5实时PCR仪器(Life Technologies)，使用蛋白质热位移Protein Thermal Shift^TM染料试剂盒(Life Technologies，目录号4461146)遵循制造商的方案来进行。使用MicroAmp 384孔板(Thermo Fisher，目录号AB1384/W)，其中每孔20μL样品。将单克隆抗体在相应配制缓冲液中稀释至1mg/mL浓度，并且如下制备样品：一起添加五微升Protein Thermal Shift^TM缓冲液、12.5μL抗体(1mg/mL)或缓冲液(阴性对照)和2.5μL经稀释Protein Thermal Shift^TM染料(8x)，每个反应的总体积为20.0μL。在所提供的热位移缓冲液中将SYPRO Orange从1000倍浓缩储备溶液稀释125倍至工作染料溶液，然后添加至反应混合物。为防止漂白，实验之前将SYPRO Orange工作溶液添加至反应混合物。每个样品以一式四份进行测量。通过将温度以0.017℃/s的速率从25℃增至95℃来进行热变性。以0.07℃间隔收集荧光强度(在490nm激发，在600至630nm发射，使用ROX滤光器)，并使用Protein Thermal Shift软件(Life Technologies)进行分析，使用一阶导数方法计算Tm。在此方法中，Tm是对应于DSF熔融曲线一阶导数最大值的温度。

人类解离肿瘤细胞(DTC)中的免疫通路活化

来自四名NSCLC患者的解离肿瘤细胞(DTC)购自DLS，并根据制造商的推荐进行解冻。对细胞进行计数并以约2M个细胞/24孔接种于3个孔中含抗病毒剂(anti-anot)但不含血清的离体培养基中。将5μg/ml的R&D、RDM5和RDM9、PI-3030和hIgG1(ultra-LEAF)添加至含有1ml培养基的每个孔。在37C下四小时后，将细胞收集于15ml标准管中并在4℃下以400xg离心5分钟。将每个团块重悬于600ul含B-巯基乙醇(1:100稀释)的RLT缓冲液中。

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒和对照处理人类从以上DTC样品分离总RNA，并提交以进行高通量RNA测序。使用Illumina的TruSeq Stranded mRNA试剂盒制备文库，并且在Illumina Novaseq 6000上测序。将后续数据与人类基因组(GRCh38.p12)进行比对，并使用STAR比对器将每基因的表达值制表。将所得表达矩阵用作输入，以便使用DESeq2进行差异性表达分析。将所有蛋白质编码基因的PI-3010对比对照比较物产生的倍数变化提交至基因集富集分析(GSEA)软件，使用可在https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp获自Broad Institute的preRanked测试。评定MSigDB的Hallmark通路，并使用R中的ggplot2绘制所得归一化富集评分。FDR值是经由使用标准参数植入GSEA内的置换测试来确定。

人类抑制性巨噬细胞(M2c)的促炎性特征

将使用负免疫磁性选择(StemCell Technologies)从外周血单核细胞分离的四种冷冻人类外周血CD14+单核细胞在补充有10％(v/v)热灭活FBS(HyClone)、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、55uMβ-巯基乙醇和抗霉菌抗生素(全部来自Gibco)的RPMI1640培养基中解冻并培养。通过在存在50ng/ml人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)的情况下，在24孔板中以500,000个细胞/孔的密度在完全RPMI 1640培养基中进行培养使单核细胞分化为巨噬细胞。在分化的第3天，通过添加新鲜M-CSF来补充培养基。通过在37C下向培养基中添加以下细胞因子使已分化的人类巨噬细胞极化24小时：M0(不添加细胞因子)和25ng/ml重组人类IL-10(M2条件)在37C下持续24小时。第7天，吸出培养基并轻轻洗涤细胞。将含有5μg/ml PI-3010.15、PI-3030.41和hIgG1(来自Biolegend的Ultra-LEAF)的新鲜完全RPMI 1640培养基巨噬细胞培养基添加至来自以上2种条件的每个孔。4小时后，吸出培养基并且在含β-巯基乙醇(1:100稀释)的RLT缓冲液中溶解细胞。

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从IL-10极化hMDM分离总RNA，并提交以进行高通量RNA测序。使用Illumina的TruSeq Stranded mRNA试剂盒制备文库，并且在IlluminaNovaseq 6000上测序。将后续数据与人类基因组(GRCh38.p12)进行比对，并对所有MDM都使用STAR比对器将每基因的表达值制表。将所得表达矩阵用作输入，以便使用DESeq2进行差异性表达分析。将所有蛋白质编码基因的PI-3010.15对比对照比较物产生的倍数变化提交至基因集富集分析(GSEA)软件，使用可在www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp获自Broad Institute的preRanked测试。评定MSigDB的Hallmark通路，并使用R中的ggplot2绘制所得归一化富集评分。FDR值是经由使用标准参数植入GSEA内的置换测试来确定。

Hallmark通路：经PI-3008处理的BMDM对比经PI-3008处理的CT26肿瘤

对来自四只雌性BALB/c小鼠的个别股骨和胫骨进行清洗，并且在由伊斯科夫改良杜尔贝科氏培养基组成并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(HyClone)和抗生素抗霉菌溶液(Gibco)的巨噬细胞培养基中使用研钵和研杵粉碎。然后使样品通过40um过滤器，用培养基洗涤并在室温下以400xg团块化5分钟。将细胞团块重悬于5ml BD Pharm溶解缓冲液(BDBiosciences)中，并且在室温下进行红细胞溶解，持续5分钟，接着用10倍体积的巨噬细胞培养基淬灭。在室温下以400xg使细胞团块化5分钟，并且以500,000个细胞/孔的密度重悬于24孔板中的巨噬细胞培养基中。将这些骨髓单核细胞用25ng/ml小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)刺激6天以产生M0-巨噬细胞，并通过在37C下分别用LPS(1ng/ml)和小鼠IL-10(20ng/ml)补充培养基后持续24小时而使其极化为M1样和M2样巨噬细胞。

在第7天，吸出培养基并用巨噬细胞培养基轻轻洗涤细胞。将含有5ug/ml PI-3008或其mIgG2a同种型对照的新鲜培养基添加至来自以下三种条件的每个孔中：M0、M1和M2。4小时后，吸出培养基并在含B-巯基乙醇(1:100稀释)的RLT缓冲液中溶解细胞。

使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒和CT26肿瘤(如先前针对图12C至图12H所描述)从这些BMDM分离总RNA，并提交以进行高通量RNA测序。使用Illumina的TruSeq StrandedmRNA试剂盒制备文库，并且在Illumina No vaseq 6000上测序。将后续数据与鼠类基因组(GRCm38.p6)进行比对，并分别对所有BMDM样品和CT26样品使用STAR比对器将每基因的表达值制表。将所得表达矩阵用作输入，以便使用DESeq2进行差异性表达分析。将所有蛋白质编码基因的PI3008对比对照比较物(来自BMDM和CT26子集二者)产生的倍数变化提交至基因集富集分析(GSEA)软件，使用可在gsea-msigd b.org/gsea/index.jsp获自BroadInstitute的preRanked测试。针对BMDM和CT26比较物评定MSigDB的Hallmark通路，并使用R中的ggplot2绘制所得归一化富集评分。

细胞因子qPCR测定

将使用负免疫磁性选择(StemCell Technologies)从外周血单核细胞分离的两种冷冻人类外周血CD14+单核细胞在补充有10％(v/v)热灭活FBS(HyClone)、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、55uMβ-巯基乙醇和抗霉菌抗生素(全部来自Gibco)的RPMI1640培养基中解冻并培养。通过在存在50ng/ml人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)的情况下，在24孔板中以500,000个细胞/孔的密度在完全RPMI 1640培养基中进行培养使单核细胞分化为巨噬细胞。在分化的第3天，通过添加新鲜M-CSF来补充培养基。在第6天通过添加25ng/ml重组人类IL-10(M2条件)在37C下使已分化的人类巨噬细胞极化24小时。在第7天，吸出培养基并轻轻洗涤细胞。将含5μg/ml PI-3010.15(PI-3015)、PI-3010.25(PI-3025)、PI-3030.41(PI-3041)或hIgG1同种型对照(来自Biolegend的Ultra-LEAF)和5μg/ml PI-3010.46(PI-3046)、PI-3030.47(PI-3047)、PI-3010.48(PI-3048)或hIgG4同种型对照(来自Biolegend的Ultra-LEAF)的新鲜完全RPMI 1640巨噬细胞培养基添加至相应孔中。4小时后，将培养基收集至96孔板中以进行Luminex细胞因子分泌，并且在含β-巯基乙醇(1:100稀释)的RLT缓冲液中溶解细胞。使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从经IL-10极化的hMDM分离总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)将250ng RNA制成单链DNA。使用5ul SYBR green混合物和IL-6、IL-1b、IL10、TNFa、CXCL10、IL18、CCL20、CCL24、IL1A特异性引物进行qPCR。所测试的内源管家引物是GAPDH和RPL37A。所述板在Thermo Fisher的QuantStudio 5qPCR机器上运作。

在多个hMDM供体和不同的运作中重复此细胞因子表达qPCR测定，其中滴定hIgG1先导抗体的浓度与hIgG1同种型(PI-0003)相比降为1ug/ml。另外，使用此测定证实促炎性基因特征的活化。评定IL-6、TNFa、IL-1b、IL10、IL18、CCL20、CCL24、CXCL8、IL1A的表达以便测试所有测定中的促炎性活化。

另外，使用此测定证实过度表达人类全长MARCO的THP-1单核细胞中PI-3010.15-AB下游的促炎性基因特征的活化。

通过使用2^-(ddCT)计算经处理样品相对于相应同种型对照的倍数变化来进行qPCR分析。将每个基因CT值相对于所使用的内源对照(例如GAPDH或RPL37A)的CT值进行归一化。

由MSD分泌的人类细胞因子和趋化因子

从经人类抗MARCO PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41以及同种型处理的hMDM细胞收集200ul上清液，并使用得自Meso Scale Discovery的测量10种细胞因子的V-PLEX人类促炎性小组1人类试剂盒(MSD，目录号K15049D)和测量10种趋化因子的V-PLEX人类趋化因子小组1人类试剂盒(MSD，目录号K15049D)(MSD，目录号K15047D)或得自ThermoFisher的定制人类PrecartaPlex 26路试剂盒(目录号PPX-26-MX-3222A)来评估细胞因子水平。用捕获抗体预包被MSD多路测定板。用测定稀释剂预稀释原始样品之后，以50μl/孔的体积添加分析用样品或试剂盒标准物。在室温下随搅拌温育两小时后对板进行洗涤。

对于V-PLEX测定，添加磺基标记检测抗体并在室温下随搅拌再温育两小时。温育后，再次对板进行洗涤。添加2X Read Substrate并在MSD读取器上读板。所有数据都通过MSD Discovery 软件4.0进行分析。

对于定制人类26路试剂盒，添加生物素化经标记检测抗体并在室温下随搅拌温育一小时。对板进行洗涤。添加PE(藻红素)标记的链霉亲和素并在室温下随搅拌温育30分钟。对板进行洗涤后，添加Luminex读取缓冲液并在Luminex 200分析仪上对板进行读取。所有数据都通过xPONENT软件进行分析。

结果

对抗体PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41的重链和轻链的DNA序列进行密码子优化并且并入Atum(Newark,CA)的专有载体中。将重链和轻链编码载体以2L规模转染至CHO细胞中，接着使用MabSelect Sure蛋白A树脂进行纯化。两种候选物在蛋白A纯化后都显示高滴度和<5％聚集体。数据汇总于表14中。

通过Biacore评定重组人类和食蟹猴MARCO蛋白上的PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41结合，并证明与人类和食蟹猴MARCO的高结合亲和力，其中与食蟹猴MARCO结合的亲和力在人类MARCO亲和力的2-3倍内。

使用流式细胞术评定抗体与表达人类和食蟹猴MARCO的细胞系的结合，包括HEK293T细胞中的MARCO转染子和表达内源MARCO的人类单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。抗体以相当的EC50与人类和食蟹猴MARCO结合，并以高亲和力与人类MDM上的内源MARCO结合。通过流式细胞术未观测到与不表达MARCO的亲本HEK 293T细胞或与Jurkat T细胞的脱靶结合(表15和图53)。

分别使用差示扫描荧光法(DSF)和动态光散射(DLS)测定熔融温度(Tm1)和聚集温度(Tagg)的热稳定性评定显示所有3种抗体都具有可接受且类似的性质。另外，所有3种抗体在高达30mg/ml时都可溶且稳定，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)和DLS在pH 5.0-6.5范围内的柠檬酸盐和组氨酸缓冲液中所测定。数据汇总示于以下表16中。

还评定了hMDM中由人类抗MARCO抗体诱导的细胞因子表达。如表17中所示，PI-3010.15、PI-3010.46、PI-3010.25、PI-3010-48、PI-3030-41和PI-3030.47都诱导供体1中所指示细胞因子的表达。来自两个不同供体(供体1和供体2)的hMDM中的细胞因子和其他相关基因表达(MIP-1α、IL-27、LIF、IL-1β、IL-2、IL-4、IP-10、IL-6、IL-10、CD40、IL-12p70、G-CSF、IFNγ、GM-CSF、TNFα、MIP-1β、MCP-1、MIG、gro-α、IL-1α、IL-15、MCP-3、M-CSF和VEGF-A)也示于图27中。

图28提供PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41以及hIgG1对照的qPCR mRNA数据(TNFα、IL-1β、IL-18和CXCL8)以及MSD细胞因子数据(TNFα、IL-1β、IL-6、MIP1-α)。促炎性基因的qPCR mRNA分析绘制为相对于一个代表性供体(顶行)的hIgG1对照同种型的诱导倍数。数据表示为技术重复的平均值±标准偏差(SD)。还通过MSD测量了细胞因子分泌，并且绘制代表性促炎性细胞因子水平(pg/ml)和趋化因子水平(底行)的数据。数据表示为相同代表性供体的技术重复的平均值±标准偏差(SD)。

如以上所描述对经PI-3010.15hIgG1对照处理的人类解离肿瘤细胞和经PI3008/对照处理的CT26肿瘤进行处理(图16B)。使用R中的ggplot2绘制来自两个实验的GSEA衍生归一化富集评分。如图29中所示，人类和小鼠MARCO mAb驱动类似的通路调控。

PI-3010.15活化人类解离肿瘤细胞(DTC)中的抗肿瘤免疫通路(图30)。hDTC中通过抗MARCO抗体增加的顶部免疫活化基因和通路包括IL-2-STAT5信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、炎症应答、IFNγ应答和IFNα应答(图30)。如实施例4中所示，这些通路在小鼠肿瘤细胞和BMDM中也通过PI-3008上调。hDTC中通过抗MARCO抗体降低的通路包括缺氧、顶端连接、Myc靶标、PI3K-AKT-mTOR、E2F靶标和氧化磷酸化。如实施例4中所示，这些通路在小鼠肿瘤细胞和BMDM中也通过PI-3008下调。使用Hallmark通路集来定义通路。

PI-3010.15在人类抑制性巨噬细胞(M2c)中也诱导促炎性特征(图31)。上调的细胞因子和基因为CXCL3、CXCL8、TNFα、CCL3、IL7R、CCL4、CCL5、CCL24、CCL20、IL-1α、IL-6、IDO、CD274、SF2、LAMP3、CCR7、CXCL11和CXCL9。下调的细胞因子和基因为ALK、MPB、TMEM37、NHSL2、SLC46A2。上调的通路为经由NF-kB的TNFa信号传导、炎症应答、INFg应答、Myc靶标、缺氧、IL6/JAK/STAT3信号传导、IFNa应答、未折叠蛋白应答、IL2/STAT5信号传导、UV应答、同种异体移植物排斥、上皮间质排斥、细胞凋亡、mTORC1信号传导、雌激素应答早期、KRAS信号传导上调、胆固醇稳态、notch信号传导、顶端连接、wntβ连环蛋白信号传导、氧化磷酸化、补体、PI3k Akt mTOR信号传导、活性氧通路、刺猬信号传导、血管生成、糖解、KRAS信号传导DN、DNA修复、p53通路、肌生成、凝血、顶端表面、雄激素应答、TGFβ信号传导、脂肪酸代谢和异生物质代谢。

下调的通路为胆汁酸代谢、雌激素应答晚期、脂肪生成、过氧化物酶体、血红素代谢、UV应答DN、有丝分裂纺锤体、蛋白质分泌、精子形成、G2M检查点和E2F靶标。M2c hMDM中通过PI-3010.15诱导的关键促炎性基因和通路包括IL-2-STAT5信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、炎症应答、IFNγ应答和IFNα应答。使用Hallmark通路集来定义通路。在经PI-3008处理的BMDM中诱导类似通路。

PI-3010.15和PI3030.41在细胞因子表达中诱导的变化倍数比较示于图32中。与PI-3030.41相比，PI-3010.15诱导更高水平的IL-1β、CSF3、CSF2、IL-1α、IL-6、TNFα、CCL4、CXCL1、CCL3和CXCL10。

表18和表19提供选择抗MARCO抗体和特征的比较汇总。(-)表示抗体之间无差异，(+)表示优势。

为了测定三个所选抗体的序列中是否存在任何潜在倾向，使用Sentinel APART算法(Lonza)对候选物进行计算机序列分析。通过计算机分析标记的关注点为：增加的疏水性、聚集倾向、天冬氨酸异构化和氧化倾向。先前计算机评定显示经标记的类似倾向，但在各种压力条件和强制降解测定下测试时证明为轻微倾向。以下表20显示实验数据与理论数据相比较的汇总。

使用疏水性相互作用色谱法(HIC)评估主要候选物的总疏水性。较长保留时间指示较大疏水性。抗TREM1抗体在此测定中用作阳性对照。PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41抗体都显示抗体的疏水性在预期范围内(表21)。高水平的主峰％指示较少修饰，并且较低保留时间对应于较低疏水性。

进行强制降解研究以了解所选抗体的倾向。在压力条件(氧化、低pH和高pH)下温育PI-3010.15-H1、PI-3010.25-H1和PI-3030.41-H1样品，并通过肽图(LC-MS/MS)分析来鉴定mAb中的蛋白质修饰。焦点为分析异构化和氧化倾向。另外，使用其他参数评定每个抗体在不同压力条件下的稳定性(表22)。

异构化

在以下条件下温育PI-3010.15：40℃，在PBS中持续2周，对照在PBS中在-80℃下，40℃(PBS)+1mM AAPH持续6小时，以及40℃在pH 5.5乙酸钠中持续2周。处理后，通过LC-MS/MS分析样品，由此鉴定胰蛋白酶消化后来源于抗体的经分离肽的修饰百分比。

在低pH下长时间温育后对PI-3010.15进行LC/MS肽图分析，以鉴定潜在热点。PI-3010.15未显示任何异天冬氨酸(IsoAsp)、脱酰胺化或琥珀酰亚胺形成。PI-3010.25显示轻链残基D56(>2％，仅在pH 5.5、40℃下)和重链D72(3.7％，在pH 3.5下)处的IsoAsp形成，而PI-3030.41显示轻链D56中的IsoAsp(>2.7％，在pH 5.5、40℃下)和重链残基N52处的琥珀酰亚胺(6-9％，在所有条件下，包括对照)。

氧化：

在以下条件下温育PI-3010.15：对照，在PBS中在-80℃下，40℃(PBS)+1mM AAPH持续6小时，0.5％和1.5％ H2O2/PBS持续24小时，与在40℃(PBS)+1mM AAPH下持续6小时的先前实验相比较。处理后，通过LC-MS/MS分析样品，由此鉴定胰蛋白酶消化后来源于抗体的经分离肽的修饰百分比。

PI-3010.15显示Met-48和Trp-52在AAPH和H2O2处理下氧化。Trp-52在计算机评定中标记为潜在倾向。预期Met-48残基将嵌埋于结构中并且是非溶剂可及的。由于在LC-MS/MS分析期间发现其为相同肽的一部分，因此不可能明确地将氧化倾向指定给任一残基。

通过Biacore评定受应力样品与重组人类MARCO的结合。与对照条件相比，受应力样品的结合具有类似的KD和Rmax水平，表明结合效力未显著受影响(表23)，包括来自PI-3010.15的各种氧化应力样品(表24)。

3种抗体(PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41)在以下缓冲液中成功浓缩至30mg/mL，pH范围为5.0-6.0，无任何其他赋形剂。PBS用作对照。在4℃下温育抗体过夜，然后进行以下分析：根据SEC-HPLC的聚集％；使用DLS的粒度(半径)和多分散性；热稳定性[Tagg(DLS)，Tm(DSF)]；根据SLS的胶体稳定性(kd)。

在以下缓冲液中浓缩PI-3010.25(表25)。

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PI-3010.25可浓缩至30mg/mL而不增加HMW聚集体。

实施例9：抗MARCO抗体诱导炎性体活化

材料和方法

mBMDM中的炎性体测定

对来自三只雌性C57BL/6小鼠和三只雌性BALB/c的股骨和胫骨进行清洗，并在染色培养基(0.5％(w/v)BSA(Sigma)和2mM EDTA/D-PBS)中使用研钵和研杵粉碎。然后使样品通过40um过滤器，用D-PBS洗涤并在室温下以400xg团块化5分钟。将细胞团块重悬于5ml BDPharm溶解缓冲液(BD Biosciences)中，并且在室温下进行红细胞溶解，持续5分钟，接着用10倍体积的染色培养基淬灭。在室温下以400xg使细胞团块化5分钟，并且以15×10^6个细胞/ml的密度重悬于15cm板中由补充10％(v/v)胎牛血清(FBS)(HyClone)和抗生素-抗霉菌溶液(Gibco)的伊斯科夫改良杜尔贝科氏培养基组成的巨噬细胞培养基中。将这些骨髓单核细胞用25ng/ml小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)刺激7天以产生M0-巨噬细胞，并通过在第6天在37C下向培养基补充20ng/ml小鼠IL-1b后持续24小时而使其分化为M2样巨噬细胞。在第7天，用DPBS冲洗巨噬细胞，并且在6ml 2mM EDTA中温育10分钟以促进细胞脱离。将细胞轻轻刮入另外6ml以上所描述的染色培养基中，计数并以100,000个细胞/孔接种至96孔板上。

在37C下30分钟至1小时使细胞附着后，用5μg/ml抗小鼠MARCO抗体PI-3008和其相应同种型对照mIgG2a处理BMDM。与抗体一起温育3小时后，添加LPS(经测试为0.5和50ng/ml)以便再激发炎性体通路2.5小时。然后添加ATP(5mM)，持续30分钟以活化炎性体并诱导IL-1β的细胞因子分泌，通过MSD进行测量。使用Sidak多重比较检验计算分泌IL-1β倍数变化相对于未处理同种型(无LPS和无ATP)的统计显著性。Sidak多重比较检验，**P<0.01。

hMDM中的炎性体测定

将使用负免疫磁性选择(StemCell Technologies)从外周血单核细胞分离的冷冻人类外周血CD14+单核细胞在补充有10％(v/v)热灭活FBS(HyClone)、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、55uM 2-巯基乙醇和抗霉菌抗生素(全部来自Gibco)的RPMI 1640培养基中解冻并培养。通过在存在50ng/ml人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)的情况下，在15cm培养皿中以12-15×10^6个细胞的密度在完全RPMI 1640培养基中进行培养使单核细胞分化为巨噬细胞。在分化的第3天，通过添加新鲜M-CSF来补充培养基。通过在37C下向培养基中添加以下细胞因子使已分化的人类巨噬细胞极化24小时：100ng/ml IFNγ(M1条件)和25ng/ml重组人类IL-10(M2条件)，在37C下持续24小时。在第7天，使用无菌细胞刮刀(Nunc)以非酶促方式将极化巨噬细胞轻轻收集至FACS缓冲液(含有2mM EDTA和0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的D-PBS)中，接着在约20℃下以400xg离心5分钟。

对细胞进行计数并且以100,000个细胞/孔接种至96孔板上。在37℃下持续30分钟至1小时以允许细胞附着后，用5μg/ml抗人类MARCO抗体PI-3010.15、PI-3010.25(PI-3025)、PI-3030.41(PI-3041)和PI-3010.48(PI-3048)以及其相应同种型对照hIgG1和hIgG4(来自Biolegend的Ultra-leaf)处理hMDM。与抗体一起温育3小时后，添加LPS(经测试为0.1和1μg/ml)以便再激发炎性体通路2.5小时。然后添加ATP(5mM)，持续30分钟以活化炎性体并诱导IL-1β的细胞因子分泌，通过MSD进行测量。使用Tukey多重比较检验计算分泌IL-1β倍数变化相对于未处理(无LPS和无ATP)的hIgG1的统计显著性。Tukey多重比较检验(*P<0.05；***P<0.0006，****P<0.0001)。

大肠杆菌吞噬作用测定

人类单核细胞源性巨噬细胞(MDM)是通过在15cm板中补充有10％胎牛血清(Gibco)、1％β-巯基乙醇(ThermoFisher)、1X非必需氨基酸(Gibco)、1x丙酮酸钠(Gibco)、1X GlutaMax(Gibco)、1x抗抗(Gibco)、50ng/ml M-CSF(Peprotech)的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养CD14+人类单核细胞而产生。3天后更新培养基。在培养的第6天，向培养物中添加100ng/ml人类IFN-g(Peprotech)+50ng/ml LPS(Invivogen)或25ng/ml IL-10(Peprotech)。第二天，收集细胞，将200,000个细胞接种至96孔平底板的每孔，并与PI-3101.15、PI-3010.25或PI-3030.41的剂量滴定和同种型对照抗体一起在37℃和5％ CO2下温育2小时以允许细胞粘附。

为了测量吞噬作用，使用Vybrant吞噬作用测定试剂盒(Molecular Probes)。在2小时抗体温育后，去除培养基，并且将细胞与大肠杆菌荧光BioParticles溶液一起在37℃和5％ CO2下温育2小时。去除粒子溶液并用台盼蓝溶液代替。在室温下温育1分钟后，去除溶液，并且在Tecan微板读板器上使用480nm激发波长和520nm发射波长测量荧光。

结果

PI-3008在非极化巨噬细胞(图33A和图33C)和IL-10极化巨噬细胞(图33B和图33D)中都诱导炎性体产生统计学上显著的IL-1β分泌。在两个单独鼠类谱系C57BL/6小鼠(图33A和图33B)和Balb/c小鼠(图33C和图33D)中观测到此效应。因而，PI-3008增强并增加小鼠BMDM中的炎性体活化。

在人类MDM中观测到类似的结果(图34A、图34B和图35)。PI-3010.25(IgG1形式)和PI-3010.48(IgG4形式)在与0.1μg/ml LPS+ATP和1μg/ml LSP+ATP一起温育后在IL-10极化巨噬细胞中诱导统计学上显著的IL-1β分泌(图34A)。在IFN-γ极化的hMDM中，PI-3025在与0.1μg/ml LPS+ATP一起温育后诱导IL-1β分泌，而PI-3010.48在用1μg/ml LPS+ATP处理后诱导IL-1β分泌(图34B)。PI-3010.25的条形示于每个组中左起第二个，PI-3010.48的条形示于每个组中的右侧。

在单独测定中，与未处理的条件相比，当用LPS和ATP处理时，PI-3010.15、PI-3010.25和PI-3030.41都诱导IL-1β产生(图35)，指示抗人类MARCO抗体诱导炎性体活化。

表26中提供IL-10hMDM供体细胞中PI-3010.15、PI-3101.25和PI-3030.41对吞噬作用的诱导百分比。

当hDMM用IL-10极化时，PI-3010.25和PI-3010.15在多个供体之间显示更一致的吞噬作用诱导。

实施例10：抗小鼠MARCO抗体在EMT6模型中的体内单一疗法功效

方法

在第0天植入EMT6乳腺癌肿瘤细胞(1×10^6个细胞/小鼠)，并且当肿瘤达到约90mm3的平均体积时开始给药(10mg/kg；Q5dx4；ip)。每5天对动物进行腹膜内给药，总计四次剂量。随时间监测肿瘤体积并呈现为每组的平均值、研究结束时个别肿瘤体积或TGI％。

结果

PI-3008作为单一剂在EMT6模型中显示抗肿瘤活性(图36)。在一些组中，实现了高达20％的完全缓解(CR)(应答者)。

实施例11：抗小鼠MARCO抗体在E0771模型中的体内单一疗法功效

方法

E0771同基因型小鼠模型

小鼠研究在Explora BioLabs(South San Francisco，CA)的机构动物照护与使用委员会的指导下并经其批准而进行。

将八至十周龄雌性C57/BL6小鼠(Taconic)植入以对数期生长的亚汇合E0771细胞(ATCC)。在异氟烷麻醉下，将一百万个与Matrigel一起重悬于无血清培养基中的肿瘤细胞原位植入小鼠乳腺脂肪垫中。当大多数肿瘤在110-120立方毫米(mm³)之间时，将小鼠随机分至治疗组(PI-3008-AB和PI-0002mIgG2a同种型)，然后开始治疗。

PD研究

基于每个组的组平均体重，将随机分成2组的小鼠经腹膜内给与10mg/kg PI-3008-AB或PI-0002-AB(同种型)。在使用数字卡尺测量两个正交直径后，使用公式[长度×(宽度)2]/2计算肿瘤体积。在三个不同的时间点(第1剂量后2天、第1剂量后5天、第2剂量后24小时Q5dx2)，将每组15只小鼠处死并收集肿瘤、脾脏和血液。9只动物用于对肿瘤和脾脏进行流式细胞术处理，并且6只小鼠用于对肿瘤和脾脏进行IHC评估。随时间监测肿瘤体积并呈现为每组的平均值、研究结束时个别肿瘤体积或TGI％。

效应子死亡抗体功效

也在E0771模型中评定效应子死亡抗MARCO抗体PI-3021(具有N297A突变的PI-3008)。如实施例4中所描述对小鼠给药。简言之，当肿瘤为约100mm³时开始对每组10只小鼠IP给药。剂量为10mg/kg；Q5dx4。使用PI-3008和效应子死亡PI-3021二者的mIgG2a同种型。也使用抗PD-1抗体。

在E0771同基因型小鼠模型中的PK/PD功效

为了确定PK-PD功效关系，使用E0771原位乳腺癌模型，因为PI-3008在此模型中起始单一疗法。研究设计包括在第二剂量后24小时收集肿瘤和脾脏的PD组，以及用于测定PI-3008血清水平的“PK”组。研究时间线的示意图示于图39A中。

在第0天将同基因型E0771肿瘤细胞(5×10⁵个细胞/小鼠)注入C57BL/6雌性小鼠的乳腺脂肪垫中，并且在肿瘤体积达到约100mm3的平均值时开始给与PI-3008或同种型对照(10mg/kg，N＝10/组)。每5天对动物进行腹膜内给药，总计四次剂量。在第二剂量后24小时对动物子集进行取样，以用于评定肿瘤和脾脏中的PD变化。在第一剂量后2天和5天进行额外PD突检。经由Luminex和流式细胞术取样的组织是肿瘤、脾脏和血液。

监测其余动物的抗肿瘤功效，并在研究结束时取样以用于药物暴露分析。终点PD测定包括对肿瘤和脾脏进行流式细胞术分析以确定髓系和淋巴样组成变化，通过IHC(单路和多路)测量肿瘤和脾脏中的细胞因子/趋化因子以及评定CD8 T细胞、NK细胞、MARCO细胞和CD19 B细胞频率和组织分布。

流式细胞术测定

收集小鼠肿瘤组织并置于冰冷RPMI-1640(Invitrogen)培养基中。根据制造商的推荐，使用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi)对肿瘤进行酶促解离。解离后，使单细胞悬浮液团块化并收集肿瘤上清液，高速旋转以去除不溶性物质，使用Halt^TM蛋白酶抑制剂混合液(Thermo Scientific)进行酶促灭活，并在-80℃下快速冷冻直至下游分析。将细胞团块重悬于染色培养基(DPBS/1％ BSA/2mM EDTA)中，并通过100uM过滤器以去除未解离的物质。在ViCell XR(Beckman Coulter)上对单细胞悬浮液进行计数，并接种于96孔V型底板中以进行流式细胞术染色。

将细胞与Zombie NIR(BioLegend)一起温育，接着使用TruStain FcX PLUS(Biolegend)、小鼠血清、大鼠血清、仓鼠血清(Jackson Immuno Research)的组合混合液(都在Fc受体封闭剂(Innovex)中制备)进行FcgR封闭。在冰上将细胞表面蛋白染色30分钟，接着进行二次染色步骤或在4℃下用1％ PFA固定过夜。为了染色细胞内蛋白质，用FoxP3/转录因子染色缓冲液集合(Thermo Fisher Scientific)固定并透化细胞。在含有2％大鼠血清的透化缓冲液中制备细胞内抗体，并将细胞在室温下温育至少30分钟。在Attune NXT(ThermoFisher)上运作细胞。使用FlowJo(Beckton Dickinson)进行流式细胞术分析。

用于各组的流动抗体描述于以下表27中，并且通过将适当抗体添加至含Ca2+/Mg2+PBS和2％ FBS的FACS缓冲液中来制备。

受体占用率(RO)测定

对于肿瘤/脾脏髓系和血液流式细胞术抗体组，将在BioLegend与PE缀合的PI-3008抗体或来自BioLegend的mIgG2a-PE以10μg/ml添加至染色混合液中，以评定肿瘤、脾脏和血液中各种髓系细胞的受体占用率(RO)。

体内血清浓度

使用标准配体结合ELISA(LBA)形式和经包被重组细胞外结构域(ECD)小鼠MARCOHis标签融合构建体蛋白来测定抗小鼠MARCO mAb的血清水平。针对多项研究和不同时间点评定带CT26肿瘤的小鼠血清中的PI-3008mAb水平。对于PD研究，在第一IV剂量后4小时和第二IV剂量后4小时测量PI-3008，间隔7天。

也评定了使用抗MARCO抗体和抗PD-1抗体的CT26组合研究中的体内抗体血清水平以进行比较。在CT26功效研究(实施例4)中，PI-3008和PD-1以10mg/kg或5mg/kg以Q5d X4IP给与。在第三剂量前(剂量前)和最终剂量后24小时(剂量后)收集血清样品用于PI-3008和PD-1浓度测定。

通过Luminex的小鼠细胞因子和趋化因子分泌

使用来自ThermoFisher Scientific的ProcartaPlex多路免疫测定(目录号PPX-25-MX47WJ7)评估小鼠血浆、脾脏上清液或肿瘤上清液的细胞因子水平。所述试剂盒使用有色编码珠粒经由Luminex xMAP技术测量多种细胞因子。珠粒用不同比例的对应于不同光谱区的红色和红外荧光团进行内部染色。对于实验，首先将50μl磁性捕获珠粒添加至板中。以25μl/孔体积添加分析用样品或试剂盒标准物，并添加等量的通用测定缓冲液以调节基质。在室温下温育两小时后，将珠粒捕获于磁板上，然后洗涤，接着添加25μl/孔的检测抗体。在室温下温育一小时后，再次洗涤珠粒并以50μl/孔添加链霉亲和素藻红素(SAPE)。最后一小时温育后，洗涤珠粒并添加120μl/孔的读取缓冲液。所述板在Luminex 200仪器上运作。使用Luminex Xponent软件v4.3分析数据，将分析物水平(以pg计)相对于肿瘤或脾脏重量归一化。细胞因子/趋化因子数据呈现为经PI-3008处理的上清液相对于每个分析物的经同种型处理的上清液的平均值的变化倍数。

检测小鼠组织和血清中的IgG/IgM

将25μL/孔的稀释剂100(MSD，目录号R50AA-4)添加至以捕获抗体(MSD，目录号K15183B-1和K15203D-1)预包被的板。在室温下将板随剧烈摇动温育30分钟。标准物(小鼠同种型分析小组1，MSD目录号K15183B-1)和样品稀释于稀释剂100(MSD，目录号R50AA-4)中并添加至经包被的板。在室温下在剧烈摇动下将板温育120分钟并洗涤。向每个孔添加25μL1X检测抗体溶液，并且在室温下随剧烈振荡温育120分钟。对板进行洗涤并且将2x读取缓冲液(MSD，目录号R92TC-3)添加至MSD板。在MSD Sector成像仪上对板进行读取。小鼠同种型分析小组的IgG/IgM测定范围为24pg/mL至100,000pg/mL。LLOQ为97.7pg/mL，并且ULOQ为100,000pg/mL。小鼠组织样品中的IgG水平范围为0.8μg/mL至1μg/mL。小鼠组织样品中的IgM水平范围为0.2μg/mL至1μg/mL。小鼠血清样品中的IgG水平范围为41μg/mL至56μg/mL。小鼠血清样品中的IgM水平范围为15μg/mL至24μg/mL。

单路DAB IHC测定中小鼠组织的组织学和抗体染色

根据机构批准的CO2窒息和颈椎脱位的标准操作程序(SOP)对动物实施安乐死。用70％乙醇喷洒动物以确保无菌并减少空气中过敏原。然后将肿瘤和脾脏收集于10％中性缓冲福尔马林(VWR,16004)中。24小时后去除福尔马林，并且将肿瘤和脾脏转移至70％乙醇。

所有肿瘤和脾脏都运送至Cureline(Brisbane,CA)。Cureline根据其机构SOP和完全自动化的工作流程进行组织学。将较大肿瘤切成两半，而较小肿瘤保持完整，然后进行处理，包埋于石蜡中，并切成5μm薄切片。将脾脏横切，然后处理，包埋于石蜡中，并切成3μm薄切片。

CD8a(Cell Signaling,98941S)免疫组织化学(IHC)使用Bond Rx自动染色仪(Leica Biosystems)和热诱导表位修复(HIER)在pH 9.0下进行20分钟。CD8a初级抗体(98941S，Cell Signaling Technologies，经稀释以供使用，3.2μg/ml)和Bond聚合物精化检测(Leica Biosystems)是根据制造商的方案使用。脾脏和肿瘤组织都进行染色。

Marco(Abcam,ab239369)IHC是使用具有HIER的Bond Rx自动染色仪(LeicaBiosystems)在pH 6.0下进行20分钟。Marco初级抗体(ab239369，Abcam，经稀释以供使用，1.5μg/ml)和Bond聚合物精化检测(Leica Biosystems)是根据制造商的方案使用。脾脏和肿瘤组织都进行染色。

NCR1 IHC是使用具有HIER的Bond Rx自动染色仪(Leica Biosystems)在pH 9.0下进行20分钟。NCR1初级抗体(ab233558，Abcam，经稀释以供使用，1.25μg/ml)和Bond聚合物精化检测(Leica Biosystems)是根据制造商的方案使用。脾脏和肿瘤组织都进行染色。

CD19(Abcam，ab245235)IHC是使用具有HIER的Bond Rx自动染色仪(LeicaBiosystems)在pH 9.0下进行20分钟。CD19初级抗体(ab245235，Abcam，经稀释以供使用，0.91μg/ml)和Bond聚合物精化检测(Leica Biosystems)是根据制造商的方案使用。脾脏和肿瘤组织都进行染色。

CD206(MRC1；Invitrogen，PA5-114370)IHC是使用具有HIER的Bond Rx自动染色仪(Leica Biosystems)在pH 9.0下进行20分钟。CD206初级抗体(PA5-114370，ThermoFisherScientific，经稀释以供使用，0.5μg/ml用于脾脏并且1μg/ml用于肿瘤)和Bond聚合物精化检测(Leica Biosystems)是根据制造商的方案使用。脾脏和肿瘤组织都进行染色。

在染色后，在dH2O中冲洗切片并用二甲苯和Cytoseal XYL(ThermoFisherScientific)封固介质封固。在Aperio AT2(Leica Biosystems)上进行全玻片扫描(40x)，并且所有扫描都以电子方式寄存于Pionyr Pathcore网页上。

CD8a、MARCO、NCR1、CD19和CD206定量

使用图像分析软件HALO v3.3.2541.202(Indica Labs)分析组织切片。将图像输入HALO数据库中，并使用画笔注释工具识别分析区域(标记为第1层)。整个脾脏和肿瘤组织区域包括在内，使用剪刀注释工具排除任何伪影染色、褶皱、坏死区域、玻璃或皮肤区域。使用Indica Labs–面积定量v2.1.11算法分别对所有标志物的每个注释层(CD8a、MARCO、NCR1、CD19和CD206)进行IHC分析。设定所述算法以检测苏木精染色的蓝色像素和DAB IHC染色的棕色像素。将数据输出为excel文件，并且针对每个个别标志物收集总注释区域的阳性DAB染色％并用于在prism中绘制数据。

多路免疫荧光(IF)染色和图像分析

来自小鼠脾脏和肿瘤的FFPE切片是使用5路IF小组染色的。对来自6只经PI-3008处理和6只经同种型处理的小鼠的脾脏以及来自4只经PI-3008处理和4只经同种型处理的小鼠的肿瘤进行染色和分析。首先通过DAB IHC在FFPE小鼠脾脏和肿瘤切片(E0771肿瘤)上对多路小鼠脾脏小组和小鼠肿瘤(E0771)小组中所包括的所有IHC抗体进行优化。然后在开发多路小组时考虑最佳抗体浓度和染色条件。所使用的抗体为：来自Cell Signaling的CD8a，98941S；来自Abcam的MARCO，ab239369；来自Abcam的CD19，ab245235；来自Invitrogen的CD206(MRC1)；PA5-114370；来自Abcam的NCRI，ab233558；和来自Akoya的细胞核，SKUFP1490。

切片用每个初级抗体接着二级HRP缀合聚合物进行4轮连续染色，并使用TSA-Opal荧光团进行信号扩增。在各轮染色后进行热诱导表位修复步骤以去除初级-二级-HRP复合物。然后用光谱DAPI对载玻片进行对比染色，并使用抗褪色封固介质封固。

使用Vectra 3成像系统(Akoya Biosciences)对染色的载玻片进行成像。在低放大扫描后，通过使用Phenochart查看器(Akoya Bioscience)对目标区域(ROI)作出印记，随后以更高分辨率(20x)扫描这些印记。通过选择包括代表性白髓、红髓和边缘区区域的区域来选择每个脾脏切片的四个印记。在肿瘤切片中，选择印记以覆盖大部分肿瘤区域，有目的地选择边缘区域和中心区域，以有助于对这些肿瘤区域进行比较分析。在InForm(AkoyaBiosciences)中打开所撷取的ROI图像文件并且不进行光谱混合，接着去除自动荧光染色。在InForm中通过首先将脾脏组织手动分割为红髓、白髓和边缘区进行图像分析。玻璃区域排除在分析之外。手动分割肿瘤组织以仅包括肿瘤并排除皮肤、玻璃和坏死区域。使用DAPI对比染色剂鉴定并分割细胞核，接着训练细胞表型分析算法以鉴定目标细胞类型。然后将由InForm生成的数据加载至Rstudio，并使用phenoptrReports软件包(AkoyaBiosciences)由其生成数据，包括不同组织隔室的细胞计数、细胞百分比、细胞密度和最近邻分析。

结果

与同种型对照抗体相比，PI-3008-AB作为单一剂在原位E0771模型中也显示抗肿瘤活性(图37)。在第33天研究结束时，与同种型对照相比，给与PI-3008的小鼠显示肿瘤体积在统计学上显著减小(p＝0.0037)(图38A)。同种型抗体和PI-3008的肿瘤生长抑制(TGI)百分比示于图38B中。

另外，PI-3008和效应子死亡PI在原位E0771模型中起始类似的单剂活性(图38C)。个别图显示用所指示抗体或同种型对照处理之后个别小鼠的肿瘤体积。右上图显示第28天时每只小鼠的肿瘤体积。右下图显示PI-3008和PI-3021的血清中抗体浓度。

PK-PD-功效测定

E0771中的体内PK-PD研究显示在4剂量处理后，与同种型抗体相比，PI-3008起始单剂活性。从第二剂量开始观测到肿瘤尺寸的显著差异(图39B)。同种型对照小鼠的个别肿瘤体积提供于图39C中。PI-3008小鼠的个别肿瘤体积提供于图39D中。第28天时的最终肿瘤体积提供于图39E中。另外，PI-3008的血清水平保持稳定暴露直至研究结束(图39F)。

当与PI-3008组合时，抗PD-1的血清浓度也在预期暴露范围内，如先前研究中作为单一剂给药时所见(图40A和图40B)。图40A提供利用PD-1抗体的单一和组合实验中的PI-3008浓度，而图40B提供组合实验中的PD-1浓度。

PI-3008也激活了E0771模型中的肿瘤内免疫，如施用抗体后TME中CD8+T细胞和NK细胞增加所见。图41A提供施用同种型对照或PI-3008后用DAB染色的CD8 T细胞和NCR1(NK细胞)的IHC图像。图41B提供通过IHC染色的HALO图像分析对肿瘤区域中的细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞进行定量。PI-3008促进TME变化，指示改进的抗肿瘤应答。通过流式细胞术，抗MARCO抗体增加了TME中的MHCII^高Ly6C+单核细胞、DC浸润和NK1.1 NK细胞(图41C)。不希望受理论束缚，这些细胞的增加可能增加肿瘤内免疫活化并改进TME中的抗原呈递。

通过多路IF还观测到TME中的CD8+T细胞和NK细胞增加。图41D提供用同种型抗体或PI-3008处理后小鼠中肿瘤边缘的CD206+细胞、MARCO+细胞、NCR1+细胞和CD8a+细胞的定量、肿瘤边缘的所指示细胞的细胞密度、CD206的最近邻与所指示细胞类型的中值距离，以及MARCO的最近邻与所指示细胞类型的中值距离。同种型抗体的数据以圆圈图标提供于每个数据对的左侧，而PI-3008的数据以菱形图标提供于每个数据对的右侧。这种多路分析显示，在抗MARCO处理后，肿瘤中的NK细胞和CD8T细胞增加。空间作图显示，与同种型相比，经PI-3008处理的肿瘤中的TME中CD8+T细胞和NK细胞与MARCO+细胞的距离更近。

还评定了E0771模型肿瘤上清液中由PI-3008诱导的促炎性细胞因子和趋化因子(图42A)。PI-3008处理在E0771模型中的肿瘤上清液中诱导细胞因子和趋化因子。如CT26研究中经由RNAseq所鉴定，E0771模型中诱导相同的细胞因子。在第2剂量后第1天，在肿瘤上清液中还观测到与T细胞活化和NK细胞活化相关的细胞因子(图42B)。

MARCO高度表达于脾脏中，主要表达于边缘区巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞上(图43)。来自经同种型抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的左侧，来自经PI-3008抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的右侧。图43中的数据是基于用于流式细胞术分析的PI-3008-PE和mIgG2a-PE同种型抗体之间的ΔgMFI而绘制。在此测定中，MARCO流式抗体与先前施用的治疗性PI-3008竞争结合于样品中的MARCO+细胞上。因而，在样品对右侧所提供的来自经PI-3008处理的小鼠的样品中预期并观测到受体占用和竞争，如指示流式测定中的低抗MARCO结合的低ΔgMFI水平所证明(图43)。在样品对左侧所提供的经同种型处理的小鼠样品中，在流式细胞术测定中未观测到受体占用和MARCO染色竞争，如指示流式测定中的高抗MARCO结合的高ΔgMFI水平所证明(图43)。与每个髓系目标群体的同种型处理样品相比，经PI-3008处理的样品中的较高RO和较低gMFI证实MARCO在每个特定群体上的表达。因而，同种型处理组显示可在不存在治疗性抗体时检测髓系目标群体上的MARCO水平的MARCO表达(使用PI-3008流式抗体)。在树突状细胞、CD11b中F480+巨噬细胞、TM4+边缘巨噬细胞、Ly6C+MHCII^高单核细胞和Ly6C+MHCII^中单核细胞上观测到MARCO表达。MARCO表达在边缘区巨噬细胞上最高，如通过CD11b中F480+和TIM4+边缘区巨噬细胞所鉴定。MARCO也表达于MHCII+单核细胞上。在那些髓系群体中，在PI-3008抗体处理组(第2剂量后24小时)中实现受体占用。

总之，图43显示同种型组中的ΔgMFI显示脾脏中的MARCO受体表达，而PI-3008处理组的ΔgMFI证实PI-3008结合于MARCO阳性髓系细胞上，因而用PI-3008流式抗体无法检测到。来自经同种型抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的左侧，来自经PI-3008抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的右侧。

PI-3008不影响脾脏中的髓系群体，但可能在第二剂量后24小时影响B细胞。如图44A、图44B和图44C中所示，PI-3008处理未改变脾脏中的MARCO+髓系或淋巴样细胞群体。然而，PI-3008处理确实导致脾脏中CD19+B细胞和浆B细胞减少(图44D)。来自经同种型抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的左侧，来自经PI-3008抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的右侧。

在第2剂量时，PI-3008处理降低了脾脏和血清中的IgM产生并增加了IgG产生(图45)。

当通过IHC测量时，脾脏中边缘区巨噬细胞上的MARCO表达随PI-3008处理而降低(图46)。在第二剂量和研究结束时评定脾脏中的MARCO+细胞。与同种型抗体处理的小鼠相比，PI-3008小鼠显示MARCO+边缘区巨噬细胞的数目减少。Monoplex IHC也用于测定PI-3008处理后脾脏中的变化(图47A至图47D)。在PI-3008处理后，在总区域中观测到CD8+T细胞和NK细胞增加(图47A和图47B)。CD19+细胞群体是可变的，并且对通过IHC测量具有挑战性(图47C)。PI-3008处理后观测到CD206(红髓巨噬细胞)显著增加(图47D)。来自经同种型抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的左侧，来自经PI-3008抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的右侧。

用同种型抗体和PI-3008处理后每个组织隔室的阳性细胞百分比是经由多路IF的图像分析来确定(图48A至图48D)。观测到PI-3008处理后红髓中和总区域中MARCO减少(图48A)。在PI-3008处理后，观测到总区域中所有组织隔室中的CD19小幅减少(图48B)。在PI-3008处理后，观测到所有组织隔室中的CD8a增加(图48C)。在PI-3008处理后，观测到红髓中的CD206小幅增加(图48D)。来自经同种型抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的左侧，来自经PI-3008抗体处理的小鼠的样品提供于每个样品对的右侧。

第2天和第5天PD样品分析

经由Luminex分析来自抗体处理后第2天和第5天取样的肿瘤、脾脏和血液的经消化上清液和血浆。抗MARCO处理在早期时间点在E0771模型的肿瘤上清液中诱导细胞因子和趋化因子(图58和图59)。第2天的样品示于右侧，第5天的样品示于左侧。在两个时间点都观测到细胞因子和趋化因子变化，G-CSF、IL27、IL10和TNFα在第2天增加，IL12p70、IL10、IL6和IL4在第5天增加。第一抗体剂量后第2天，脾脏中参与迁移和趋化的趋化因子增加。

抗MARCO处理也调节小鼠肿瘤中的IgG1产生(表28)。

在脾脏中，抗MARCO处理在第2天降低IgM产生并且在第5天稍微降低IgG1(表29)。

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在PI-3008处理后，抗MARCO处理降低血浆中的IgG1和IgG2b(表30)。

首先，在一个剂量MARCO抗体处理后第2天和第5天评定肿瘤髓系细胞。抗MARCO影响D2和D5肿瘤中TAM(减少，图60)和单核细胞(增加，图61)的总数。抗MARCO也在第2天使TAM从免疫抑制性MHCII-重新编程为促炎性MHCII+(图60)，并在第2天使单核细胞从免疫抑制性MHCII-重新编程为促炎性MHCII+(图61)。

抗MARCO在D2和D5增加CD11c+MHCII+DC，并且在D2和D5稍微减少Ly6G+嗜中性粒细胞(图62)。总之，在肿瘤髓系细胞中，抗MARCO抗体增加了促炎性单核细胞和DC，并减少了肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)和TAM。另外，在第一剂量后2天，抗MARCO使MHCII-TAM重新编程为MHCII+TAM，并且将MHCII-单核细胞重新编程为MHCII+单核细胞。

接下来，在一个剂量MARCO抗体处理后第2天和第5天评定肿瘤淋巴样细胞。在第2天和第5天，抗MARCO增加了肿瘤中的CD8+T细胞和CD4+T(图63)。抗MARCO也在第5天增加了肿瘤中的NK1.1 NK细胞(图63)。

接下来，在1剂量MARCO抗体处理后第2天和第5天评定脾脏淋巴样细胞。抗MARCO在所述两天都减少CD19+B细胞并且未改变浆B细胞(图64并且数据未示出)。在第5天，抗MARCO增加脾脏中的滤泡B细胞并减少边缘区B细胞(图64)。在第5天，抗MARCO通过减少CD19+B细胞、减少边缘区B细胞和增加滤泡B细胞来影响脾脏中的B细胞群体(图64)。抗MARCO在所述两天都增加脾脏CD8+和CD4+T细胞(图65并且数据未示出)。抗MARCO在第2天未改变NK1.1NK细胞，但在第5天使其增加(图65并且数据未示出)。抗MARCO也增加了脾脏DC，并且不改变脾脏中的嗜中性粒细胞水平(图65)。

在一个剂量MARCO抗体处理之后第5天也评定了脾脏髓系细胞。通过将Ly6C+单核细胞亚分型至不同MHCII水平细胞中，抗MARCO在第5天减少MHCII-单核细胞并增加MHCII+单核细胞(高和中)(图66)。抗MARCO在D2和D5增加了脾脏中总巨噬细胞的数目，包括红髓巨噬细胞(图67并且数据未示出)。抗MARCO在D5也增加了边缘区巨噬细胞(MZM)、MHCII+DC的数目，并且在D5增加了非边缘区巨噬细胞(图67和图68)。

在第5天还通过流式细胞术对血液进行概况分析。在第5天，Ly6C^高单核细胞和DC略有减少，并观测到T细胞增加。未观测到B细胞的变化。(图69)。

还评定了第5天小鼠脾脏、E0771肿瘤和血液中的MARCO表达和受体占用率(图70)。如图70中所示，MARCO以高水平表达于脾脏中，特别是由CD11b^中F480+和TIM4+Mac闸控的边缘区(MZ)巨噬细胞上。MARCO未表达于非边缘区巨噬细胞(非MZ)上，如mIgG2a同种型样品的MARCO流式细胞术染色所证明，其中流式细胞术MARCO抗体不与先前MARCO抗体竞争结合至细胞。MARCO表达于MHCII+单核细胞(MHCII^高和MHCII^中)上和DC上。MARCO也表达于边缘区外CD206+红髓巨噬细胞和MHCII+Mac上。在以上列出的图70的阳性MARCO表达细胞中实现治疗性MARCO抗体的受体占用，如通过MARCO样品缺乏MARCO流式细胞术染色所证明，其中流式细胞术MARCO抗体在与先前治疗性MARCO抗体竞争结合至细胞中出局。

在E0771肿瘤中，MARCO以低水平表达于肿瘤内。第2天无法准确测量受体占用率，但第5天在MHCII^高和中单核细胞；MHCII+DC；以及MHCII+TAM和MHCII-TAM中得以实现(图70)。在血液免疫细胞上未观测到MARCO表达(图70)。

总之，PI-3008诱导肿瘤运动性和/或吞噬作用变化，如细胞骨架、肌动蛋白和肌肉中基因表达、迁移以及细胞粘附和迁移相关通路的改变所证明。PI-3008还诱导免疫活化，如NK细胞活化、T细胞活化和髓系细胞分化所证明。在淋巴结中，PI-3008改变与细胞信号传导、细胞粘附、细胞骨架和运动基因相关的通路中的基因表达。在脾脏中，PI-3008改变与细胞信号传导、细胞粘附、细胞骨架、趋化性和运动基因以及B细胞活化相关的通路中的基因表达。不希望受理论束缚，总而言之，此数据指示抗MARCO抗体至少通过介导MARCO+髓系M2样TAM再极化为M1样TAM以及mMDSC再极化为促炎性单核细胞来活化肿瘤内免疫力。这种再极化导致产生细胞因子、趋化因子和活化受体，进而导致T细胞和NK细胞活化。髓系M2样TAM和mMDSC再极化以及T细胞和NK细胞活化然后导致由NK细胞、CD8细胞和M1样巨噬细胞介导的肿瘤破坏。此外，不希望受理论束缚，抗MARCO抗体与骨髓巨噬细胞(MCM)的潜在结合可能诱导淋巴结粘附和运动性变化，而抗MARCO抗体与脾脏边缘区巨噬细胞(MZM)的潜在结合可能导致粘附和运动性变化，从而导致潜在B细胞活化。

实施例12：CT26体内模型中的药效学测定

方法

在携带CT26肿瘤的小鼠中进行PD研究。将八至十周龄雌性BALB/c小鼠(Taconic)植入以对数期生长的亚汇合CT26.WT细胞(ATCC，储存于Pionyr)。在异氟烷麻醉下，将一百万个重悬在无血清培养基中的肿瘤细胞皮下植入小鼠右腹侧。对于试点CT26 PD研究，对肿瘤体积为150-200mm3的小鼠静脉内给与一次10mg/kg PI-3008-AB或PI-0002-AB(同种型)，并且在处理之后4天将肿瘤和脾脏收集于10％福尔马林中以便用抗小鼠MARCO、抗CD8和抗颗粒酶B进行IHC染色。使用HALO图像分析软件(Indica Labs)对整个肿瘤区域的CD8+T细胞和颗粒酶B+细胞的百分比进行定量。脾脏用非PI-3008竞争性抗小鼠MARCO IHC相容性抗体染色。

结果

与经同种型对照处理的肿瘤相比，抗MARCO抗体PI-3008在肿瘤中诱导CD8+T细胞和细胞毒性标志物颗粒酶B增加(图49)。数据表示为每个处理组内3只小鼠的平均百分比值±平均值标准误差(SEM)。

在脾脏中，观测到边缘区巨噬细胞上MARCO水平的变化，其中边缘区区域有明显空隙(图50)。对照脾脏在边缘区显示若干层MARCO+染色的细胞。各层仍围绕大部分小动脉周围淋巴鞘(PALS)和B细胞滤泡帽。来自经PI-3008处理的小鼠的脾脏显示少得多的MARCO+染色，包括更少细胞和层。PALS和B细胞帽的覆盖范围中也存在空隙。因而，用PI-3008处理的动物的脾边缘区中的MARCO阳性细胞减少。不希望受理论束缚，这些数据表明抗MARCO在TME内诱导促炎性启动并导致粘附和运动变化，如脾脏中所见。

实施例13：免疫组织化学MARCO测定

为了鉴定适合的抗人类MARCO IHC抗体以分析人类FFPE组织中的MARCO表达，筛选15种市售和内部抗体。初步筛选包括染色FFPE包埋的MARCO过度表达(CL3010)、内源性(L1236)和阴性对照(不表达MARCO的HEK-293T细胞和Jurkat细胞)细胞团块。通过初步筛选的抗体包括在二次筛选中，其中使用不同的IHC染色条件(不同的抗体浓度、温育时间和抗原修复)对通过原位杂交(ISH)鉴定为具有高RNA表达的肺癌和结肠癌FFPE切片进行染色。鉴定了来自R&D的两种潜在人类MARCO特异性货架IHC抗体，即RDM5(克隆编号858428.11，目录CUST0l7MABP)和RDM9(克隆编号858423.11，目录CUST0l7MABP)。RDM5略优于RDM9，并且因而选择用于进一步优化其他对照组织的IHC测定条件。当在自动化Leica平台上以2.5μg/mL与高pH抗原修复(ER2)一起使用时，RDM5显示对MARCO阳性细胞的特异性、强烈且灵敏的标记(图51A)。在正常和肿瘤组织微阵列(TMA)上验证染色，并且由认证学会病理学家确认MARCO特异性。另外，正常组织中的MARCO表达局限于肺、肝脏和脾脏中的组织驻留巨噬细胞，证实了之前的RNA数据。

接下来，在来自17个不同肿瘤适应症的20个组织微阵列(TMA)上探索MARCO表达的进一步分析，并含有每个具有不同诊断的受试者的重复核心(病理学、等级和TNM分期)。在Reveal Biosciences通过获取于10％中性缓冲福尔马林中固定24小时并使用相同SOP处理的组织来制造TMA。将切片拣选至Superfrost Plus或Startfrost Adhesive载玻片上，并且在订购后将所有TMA新鲜切成4um连续切片并储存在4℃下，然后进行IHC染色。

使用Aperio AT2扫描仪在40倍下对每个TMA进行全载玻片扫描后，由学会认证的病理学家使用以下评分系统对肿瘤介入基质中的MARCO+细胞进行定量：0＝<1％阳性细胞，0.5＝1-10％阳性细胞，1＝10-25％阳性细胞，1.5＝25-50％阳性细胞，2＝大约50％阳性细胞，2.5＝50-75％阳性细胞，3＝大约75％阳性细胞，以及3.5＝>75％阳性细胞(超过基质)。从分析去除超过一半区域扭曲的损失或折叠核心，并且不计分。如果MARCO+细胞表达超过基质1％或1％以上，则每个患者的染色被视为阳性。每个点代表一个病例，并且每个适应症的中值描绘为一条线。

以基质中1％ MARCO+细胞为截止值，阳性病例的百分比在结肠癌中最高(92％)，接着是肺癌(87％)、子宫内膜癌(78％)、间皮瘤(64％)、卵巢癌(61％)、淋巴瘤(60％)、甲状腺癌(60％)、TNBC(53％)、乳腺癌(51％)、头颈癌(45％)、胃癌(44％)、胰腺癌(43％)、肝癌(39％)和肾癌(33％)(图51B)。结肠、肺、甲状腺和间皮瘤中的中值MARCO IHC评分最高，评分为1，接着是所有肿瘤等级的淋巴瘤和子宫内膜癌中的中值评分0.75(数据未示出)。当仅聚焦于晚期III级肿瘤时，中值MARCO IHC评分在乳腺癌中从0.5增至1并且在肾癌中从0增至0.5，指示在这些肿瘤适应症中，MARCO表达增加与更高肿瘤等级相关(图51C)。此外，正常组织中的MARCO IHC评分在正常肝脏、肺、脾脏、结肠、卵巢和神经组织中最高，证实了先前描述的MARCO RNA表达数据。因而，基于使用RDM5抗体的MARCO IHC评分，结肠癌、肺癌、间皮瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌具有最高IHC评分和MARCO阳性病例数。

实施例14：用于MARCO抗体产生的细胞系开发

对每个双基因载体进行两次独立转染，每次转染使用三个静态96浅孔板。将悬浮液培养物转移至96深孔板，然后从顶部培养物产生四个转染库。在6天培养中，所有培养物都维持活力≥97％。

在部分纯化(即，MabSelect^TM SuRe^TM亲和色谱法和样品中和至pH 7)后，对转染库产物质量进行评估。Lonza通过凝胶渗透高效液相色谱法(GP-HPLC)、十二烷基硫酸钠(SDS)电泳(还原型和非还原型)和成像毛细管等电聚焦(iCIEF)进行产物质量评估。与其他候选物相比，PI-3030.41的聚集数据显著升高。转染库分析的结果示于以下表31至表36中。

表31：转染库浓度数据

表32：根据GP-HPLC数据的转染库聚集

表33：转染库SDS电泳(还原型)数据

*值的差异可能是由于未完全还原的样品所致(由还原电泳图和样品非还原数据支持)。3010.15(4)有少量高分子量物质，并且3010.25(1)有大量高分子量物质。这些值不包括在每种候选物的纯度范围内。

表34：转染库SDS电泳(非还原型)数据

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表35：转染库iCIEF同工型数据

*LOQ为4.9％。

3010.15：计算pI：9.1；同工型5：pI 8.87至8.89；同工型4：pI 8.96；同工型3：pI9.04至9.05；同工型2：pI 9.15至9.16；同工型1：pI 9.24至9.25。

3010.25：计算pI：8.8；同工型5：pI 8.30至8.31；同工型4：pI 8.46至8.47；同工型3：pI 8.61至8.62；同工型2：pI 8.75；同工型1：pI 8.90。

3030.41：计算pI：9.1；同工型5：pI 8.80至8.82；同工型4：pI 8.89；同工型3：pI8.99至9.00；同工型2：pI 9.10至9.11；同工型1：pI 9.20。

表36：转染库iCIEF汇总数据

通过ELISA和流式细胞术在MARCO转染细胞上测试3种抗体的转染库的结合。将库材料的结合与通过在CHO-S细胞中进行瞬时转染而产生的参考抗体进行比较。通过稳定转染方法产生的抗体显示与经由瞬时转染产生的参考抗体相当的结合(图53)。

实施例15：可溶性MARCO测定

材料和方法

将链霉亲和素MSD板(MSD，目录号L15SA-1)用2μg/mL生物素化抗MARCO抗体(PI-3041-AB，Pionyr)包被。在室温下将板温育60分钟，然后洗涤。

将蛋白质标准物(RG-3000A，Atum)和血清样品(BioVT)稀释于缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％ Tween+Ca2+/Mg2+)中，并且在含2mM Ca2+的D43稀释剂(MSD，目录号R50AG-2)中添加至经包被的板。在室温下将板温育90分钟并洗涤。添加1μg/mL检测抗体抗MARCO(PI-3071-AB，Pionyr)，并且在室温下将板温育60分钟。对板进行洗涤并且将1x读取缓冲液[MSD，目录号R92TC-1)添加至MSD板。在MSD Sector成像仪上对板进行读取。

结果

sMARCO测定范围为0.1ng/mL至100ng/mL。LLOQ为0.1ng/mL，并且ULOQ为100ng/mL。RG-3000A的sMARCO校准曲线如图55A和表37中所示。

正常人类血清样品中的sMARCO水平范围为9ng/mL至13ng/mL。癌症血清样品中的sMARCO水平范围为6ng/mL至22ng/mL。sMARCO水平示于图55B中。

成功开发了一种从血清样品(人类、食蟹猴和小鼠)检测sMARCO的免疫测定。sMARCO测定因其特异性、灵敏度、稀释线性和选择性而合格，并且可准确测定获自商业来源的患者血清样品中的sMARCO水平。据观测sMARCO水平在诊断为患有乳房、结直肠、间皮瘤、子宫颈、小淋巴细胞性淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的患者中较高(图55B)。

实施例16：体内B细胞缺乏小鼠研究

方法

具有J B细胞突变的Balb/c小鼠获自Taconic。如实施例4中所描述设置小鼠实验。简言之，当CT26肿瘤达到约100mm³的中值时开始IP给药。以Q5dx4对小鼠给与10mg/kg PI-3008或5mg/kg PD-1抗体。使用WT小鼠作为对照。

结果

不存在B细胞减弱PI-3008与抗PD1在CT26肿瘤中的组合功效(图56)。与B细胞敲除小鼠(中间行)的组合处理相比，PI-3008抗体与PD-1抗体组合致使WT小鼠(顶行)的肿瘤减少更多。下图提供个别小鼠在每个条件下的肿瘤体积。

实施例17：PI-3010.15诱导NF-kB信号通路

材料和方法

THP1-Blue^TM NF-κB细胞获自Invivogen，并且在补充有10％胎牛血清(Gibco)、25mM HEPES(Gibco)、1x GlutaMax(Gibco)、100ug/ml诺吗新(Normacin)(Gibco)、10ug/mL杀稻瘟素(Blasticidin)(ThermoFisher)的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养。在24孔板的每孔中含有8ug/mL聚凝胺的500ul培养基中将大约50,000个细胞用含有全长MARCO构建体(CL#3010)的慢病毒以MOI 10进行转导。在37℃下与5％ CO₂一起温育过夜后，在PBS中洗涤细胞并接种于6孔板中的完全生长培养基中。2-3天后，将培养基更换为含有0.3ug/ml嘌呤霉素(Invitrogen)的生长培养基以进行稳定细胞选择，并对所汇集的细胞进行培养和扩增。

对于报告基因测定，将96孔U型底板的每孔接种300,000个细胞，并与剂量滴定的PI-3010.15或同种型抗体对照和10e6/ml HKLM(Invivogen)或10ng/ml FALSTup(Invivogen)激动剂一起共同温育，并在37℃和5％ CO₂下温育4小时或过夜。温育后，将20ul上清液转移至新96孔板，并且与180ul/孔的QuantiBlue溶液(Invivogen)一起在37℃和5％ CO₂下温育30-60分钟。通过使用Tecan微板读取器测量650nm下光学密度(OD)来计算碱性磷酸酶活性。

还使用THP-1MARCO过度表达细胞验证PI-3010.15处理后活化的促炎性基因的生物标志物特征。将处于1ml培养基中的1×10^6个细胞接种于24孔板的每孔。PI-3010.15和PI-0003(对应hIgG1同种型)以1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml添加至细胞，持续4小时和24小时。用RLT缓冲液溶解细胞，并提取RNA以用于qPCR测试，使用人类引物测量TNFα、IL-6、IL-1β、IL-10、CCL24、CXCL8、IL-1α、IL-18和CCL20表达。

结果

PI-3010.15在4小时后诱导NF-kB信号通路，其中在24小时后添加HKLM、FSL-1和FLA-ST UP。PI-3010.15在24小时后也诱导未处理细胞中的NF-κB通路(图57)。

也使用THP-1OVX细胞作为初代hMDM细胞的替代物，以测试MARCO抗体PI-3010.15对促炎性细胞因子的活化。将细胞与PI-3010.15或同种型抗体一起以1μg/ml、5μg/ml或10μg/ml(仅TNFα)温育4小时或24小时。收集细胞并经由qRT-PCR评定TNFα、IL-6、IL-1β、CXCL8、CCL20、CCL24和IL-18基因表达。在所有测试抗体浓度下，PI-3010.15在4小时和24小时后都诱导TNFα基因表达(图71)。PI-3010.15也在4小时和24小时诱导促炎性细胞因子IL-6、IL1β和CXCL8表达(图71)。5μg/ml剂量的PI-3010.15也在24小时诱导促炎性细胞因子，例如CCL20、CCL24和IL18(图71)。

实施例18：hMDM中的磷酸化阵列测定

方法

使用Full Moon Biosystems Phospho Explorer抗体阵列对用IL10极化的初代人类单核细胞源性巨噬细胞(hMDM)(2个供体)进行磷酸化阵列测定。

将使用负免疫磁性选择(StemCell Technologies)从外周血单核细胞分离的两份冷冻人类外周血CD14+单核细胞在补充有10％(v/v)热灭活FBS(HyClone)、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、55uM 2-巯基乙醇和抗霉菌抗生素(全部来自Gibco)的RPMI1640培养基中解冻并培养。通过在存在50ng/ml人类巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)的情况下，在24孔板中以500,000个细胞/孔的密度在完全RPMI 1640培养基中进行培养使单核细胞分化为巨噬细胞。在分化的第3天，通过添加新鲜M-CSF来补充培养基。在第6天通过添加25ng/ml重组人类IL-10(M2条件)在37℃下使已分化的人类巨噬细胞极化24小时。在第7天，吸出培养基并轻轻洗涤细胞。将500μl温育培养基(含0.5％ BSA的1xRPMI)添加至含有5μg/ml PI-3010.15或hIgG1同种型对照(PI-0003)的孔。在5分钟和15分钟后通过用冰冷PBS洗涤并用300μl mPer和1:100HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂溶解细胞来终止处理。将大约300μg蛋白质溶解物送至Full Moon Biosystems以执行PhosphoExplorer抗体阵列。Full Moon Biosystems使用其标准方案来标记、偶联和检测每对位点特异性抗体和磷酸化位点特异性抗体的复制点平均信号强度，并确定成对抗体的信号比率。使用以下公式计算对照与对照样品之间的变化倍数：处理样品/对照样品(经hIgG1处理或未处理)。

当PI-3010.15/同种型和PI-3010.15/未处理比率分析的变化倍数小于0.6或大于1.8时，磷酸化命中被视为显著。另外，如果同种型本身由于hMDM中Fc介导的信号传导变化而相对于未处理具有显著影响(与未处理相比降低小于0.75倍或增加大于1.5倍)，则几乎不包括命中。对于那些命中，如果PI-3010.15/同种型比率落在显著范围内(<0.6和高于1.8倍)，则当在0.75倍降低以下和在1.5倍增加以上时，PI-3010.15/未处理比率被视为显著的。

结果

表38显示5分钟时PI-3010.15对比经同种型处理的细胞和PI-3010.15对比未处理(UT)细胞的显著磷酸化。

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表39提供5分钟样品落在第一过滤桶(filtering bucket)外的额外命中。

表40提供5分钟样品的额外命中，其中同种型降低了信号(相对于未处理在<0.6倍以下)并且PI-3010.15以生物学意义挽救了效应。相对于PI-3010.15/未处理的增加倍数可能>0.9。

表41显示15分钟时经PI-3010.15对比经同种型处理的细胞和PI-3010.15对比未处理(UT)细胞的显著磷酸化。

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表42提供15分钟样品落在第一过滤桶外的额外命中。

基于磷酸化阵列筛选，5分钟后下调的通路为：细胞粘附：紧密连接蛋白3、连接蛋白43、突触蛋白；14-3-3β和δ：调节多个炎症通路的衔接蛋白；PI3K主调控通路：AKT1；PKCδ(在Src上游)；TGFb信号传导：Smad1；c-Abl信号传导(调节STAT信号传导)；和Src通路：LCK、Src(细胞骨架重排、吞噬作用和存活)。

5分钟后上调的通路为：细胞周期：细胞周期蛋白B1、CDK1/CDC2、CDK5、PAK3；IRS-1：通过胰岛素和IL-4激活的胰岛素受体，在AKT上游；PDGFR：血小板衍生因子受体激活Ras/ERK，用以调节血管生成、增殖、迁移基因；ELK1：炎性体期间在ERK/PDGFR和Rac/JNK下游的转录因子；Raf1：由LPS或mCSF激活，并且在ERK1/2活化上游进行增殖和活化；LYN：由CD36和BCR上的LDL激活，并且使AKT和SYK等磷酸化(代谢重新编程)；IL-2RA/CD25：激活JAK/STAT、PI3K和Ras信号传导；核纤层蛋白A/C、埃兹蛋白、PAK3(Ras相关Rho GTP酶Cdc42和Rac的第1组PAK下游效应子，以及AKT)，细胞骨架重排；MAPK38(TPL2)：(MAP3 K)在TNFαR、IL1R、TLR、CD40、IL17R下游激活。TPL2调控MEK1/2和ERK1/2通路以调控炎症应答级联；BAD：存活，在AKT下游；以及染色质修饰：HDAC5。

15分钟后上调的通路为：调控：钙调蛋白、GLUR1、HSP90；诱导酶活性：SYK、GLUR1、SHP-2、MKK4、CAMK4；分子缔合：DOK1、GLUR1、SHP-2、HSP90；细胞运动和细胞骨架重组：细丝蛋白A、IKKa/b、SHP-2；转录活化：IKKa/b、CAMK4、MKK4；IL2受体活化；mTOR和翻译修饰：P70S6K、4E-BP1；和钙信号传导、内吞作用、胞吐作用、突触、微管：突触结合蛋白、CAMK4、突触核蛋白α。

15分钟后下调的通路为：调控(存活)：Raf1、VEGFR2、PKCδ、EGFR、STAT6；分子缔合：DOK1、GLUR1、SHP-2、HSP90；细胞运动和细胞骨架重组：紧密连接蛋白7、皮层肌动蛋白、PKCδ、p130Cas、埃兹蛋白、PAK3；NfkB通路调控：NFkb p100、Rel、Nfkb-p65；细胞周期进展：CDK1、p27Kip1、AurA、PKC、CAMK2；钙信号传导：PKC、CaMK2；TCR信号传导：CD3z在LCK信号传导下游并且在ZAP70上游。

尽管已参考优选实施方案和各种替代实施方案特定地显示并描述本发明，但相关领域的技术人员应理解，可在不偏离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节方面对其进行各种改变。

本说明书主体部分内所引用的所有参考文献、已颁发专利和专利申请都出于所有目的通过引用整体并入本文。

序列表

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Claims

1.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，所述经分离的抗体或其抗原结合片段结合至具有胶原结构的人类巨噬细胞受体(MARCO)(SEQ ID NO:384)的清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)。

2.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述抗体包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，

b.CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，

c.CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，

d.CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)或XASEGISNDLA(SEQ ID NO:383)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，

e.CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且

f.CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

3.如权利要求1或2所述的经分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至以下残基中的至少一者：MARCO(SEQ ID NO:384)的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。

4.如权利要求1-3所述的经分离的抗体，其中所述抗体或抗原结合片段包含嵌合、人类、人源化或大鼠抗体或抗原结合片段。

5.一种结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列GFSLTSYHVS(SEQ ID NO:2)，

b.CDR-H2包含序列AIWTGGSIA(SEQ ID NO:3)，

c.CDR-H3包含序列DLSDYYSSYTSFDY(SEQ ID NO:4)，

e.CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:8)，并且

f.CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:9)。

6.如权利要求5所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列ASEGISNDLA(SEQ ID NO:431)。

7.如权利要求5所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列RASEGISNDLA(SEQ ID NO:27)。

8.如权利要求5所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列LASEGISNDLA(SEQ ID NO:7)。

9.如权利要求5-7中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含SEQ ID NO:61中所示的VH序列。

10.如权利要求5-7中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含SEQ ID NO:111中所示的VH序列。

11.如权利要求5-8中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列。

12.如权利要求5-11中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含SEQ ID NO:66中所示的VL序列。

13.如权利要求5-11中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含SEQ ID NO:116中所示的VL序列。

14.如权利要求5-11中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含选自SEQ IDNO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列。

15.如权利要求5-14中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含SEQ ID NO:61中所示的VH序列；并且所述VL序列包含SEQ ID NO:66中所示的VL序列。

16.如权利要求5-14中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含SEQ ID NO:111中所示的VH序列；并且所述VL序列包含SEQ ID NO:116中所示的VL序列。

17.如权利要求5-14中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列。

18.如权利要求5-14中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含与选自SEQID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、434、444和474中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:6、16、26、36、46、57、66、76、86、96、106、116、126、136、439、449和479中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

19.如权利要求5-18中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:65中所示的重链序列。

20.如权利要求5-18中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:115中所示的重链序列。

21.如权利要求5-20中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示的序列的重链序列。

22.如权利要求5-21中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:70中所示的轻链序列。

23.如权利要求5-21中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:120中所示的轻链序列。

24.如权利要求5-23中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示的序列的轻链序列。

25.如权利要求5-24中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:65中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:70中所示的轻链序列。

26.如权利要求5-24中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:115中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:120中所示的轻链序列。

27.如权利要求5-24中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示的序列的重链序列；以及选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示的序列的轻链序列。

28.如权利要求5-24中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ IDNO:5、15、125、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、145、438、448和478中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的重链序列；和/或与选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、6、70、80、90、100、110、120、130、140、443、453和483中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的轻链序列。

29.一种结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列GYTFTDYAVN(SEQ ID NO:232)，

b.CDR-H2包含序列WINTQTGKPT(SEQ ID NO:233)，

c.CDR-H3包含序列DSYYYSSSLDY(SEQ ID NO:234)，

d.CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ ID NO:432)或XASAGISNDLA(SEQ ID NO:381)，其中X为精氨酸(R)或亮氨酸(L)，

e.CDR-L2包含序列AASRLQD(SEQ ID NO:238)，并且

f.CDR-L3包含序列QQSYKYPWT(SEQ ID NO:239)。

30.如权利要求29所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列ASAGISNDLA(SEQ IDNO:432)。

31.如权利要求29所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列RASAGISNDLA(SEQ IDNO:317)。

32.如权利要求29所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列LASAGISNDLA(SEQ IDNO:237)。

33.如权利要求29-32中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ IDNO:454中所示的VH序列。

34.如权利要求29-32中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列。

35.如权利要求29-34中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含如SEQ IDNO:459中所示的VL序列。

36.如权利要求29-34中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含选自SEQ IDNO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列。

37.如权利要求29-36中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ IDNO:454中所示的VH序列；并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:459中所示的VL序列。

38.如权利要求29-36中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQID NO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列。

39.如权利要求29-36中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含与选自SEQID NO:241、311、321、331、341、351、454和464中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:246、316、326、336、346、356、459和469中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

40.如权利要求29-38中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:458中所示的重链序列。

41.如权利要求29-38中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示的序列的重链序列。

42.如权利要求29-41中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:463中所示的轻链序列。

43.如权利要求29-41中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示的序列的轻链序列。

44.如权利要求29-43中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:458中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:463中所示的轻链序列。

45.如权利要求29-43中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示的序列的重链序列；以及选自SEQ ID NO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示的序列的轻链序列。

46.如权利要求29-43中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ IDNO:245、315、325、335、345、355、458和468中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的重链序列；和/或与选自SEQ ID NO:250、320、330、340、350、360、463和473中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的轻链序列。

47.一种结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，所述经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列KFTFSNYGMN(SEQ ID NO:142)，

b.CDR-H2包含序列LIYYNSNNKY(SEQ ID NO:143)，

c.CDR-H3包含序列SLTGGSDYFDS(SEQ ID NO:144)，

d.CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ ID NO:433)或XASKSIGTFLA(SEQ ID NO:382)，其中X为精氨酸(R)或赖氨酸(K)，

e.CDR-L2包含序列SGSTLQS(SEQ ID NO:148)，并且

f.CDR-L3包含序列QQHDEYPFT(SEQ ID NO:149)。

48.如权利要求47所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列ASKSIGTFLA(SEQ IDNO:433)。

49.如权利要求47所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列KASKSIGTFLA(SEQ IDNO:147)。

50.如权利要求47所述的经分离的抗体，其中：CDR-L1包含序列RASKSIGTFLA(SEQ IDNO:157)。

51.如权利要求47-50中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列。

52.如权利要求47-51中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含选自SEQ IDNO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列。

53.如权利要求47-52中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含选自SEQ IDNO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列，并且所述VL序列包含选自SEQ ID NO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列。

54.如权利要求47-52中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含与选自SEQID NO:141、151、161、171、181、191、201、211和221中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与选自SEQ ID NO:146、156、166、176、186、196、206、216和226中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

55.如权利要求47-54中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示的序列的重链序列。

56.如权利要求47-55中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示的序列的轻链序列。

57.如权利要求47-56中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自SEQ IDNO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示的序列的重链序列和选自SEQ ID NO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示的序列的轻链序列。

58.如权利要求47-54中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与选自SEQ ID NO:145、155、165、175、185、195、205、215和225中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和/或轻链序列，所述轻链序列包含与选自SEQ ID NO:150、160、170、180、190、200、210、220和230中所示序列的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

59.一种结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，所述经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列GYTFTDYYLH(SEQ ID NO:252)，

b.CDR-H2包含序列YINPNNAYTS(SEQ ID NO:253)，

c.CDR-H3包含序列DTTDYYNLHFAY(SEQ ID NO:254)，

d.CDR-L1包含序列LTSEGISNDLA(SEQ ID NO:257)，

e.CDR-L2包含序列DASRLED(SEQ ID NO:258)，并且

f.CDR-L3包含序列QQSYKYPLT(SEQ ID NO:259)。

60.如权利要求59所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ ID NO:251或261中所示的序列。

61.如权利要求59或60所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含如SEQ ID NO:256或266中所示的序列。

62.如权利要求59-61中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ IDNO:251或261中所示的序列；并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:256或266中所示的序列。

63.如权利要求59-61中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含与SEQ IDNO:251或261中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与SEQ ID NO:256或266中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列。

64.如权利要求59-62中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:255或265中所示的重链序列。

65.如权利要求59-64中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:260或270中所示的轻链序列。

66.如权利要求59-65中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:255或265中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:260或270中所示的轻链序列。

67.如权利要求59-65中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与如SEQ ID NO:255或265中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和轻链序列，所述轻链序列包含与如SEQ ID NO:260或270中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

68.一种结合至人类MARCO(SEQ ID NO:384)的经分离的抗体或其抗原结合片段，所述经分离的抗体或其抗原结合片段包括包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的可变重链(VH)序列，以及包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的可变轻链(VL)序列，其中：

a.CDR-H1包含序列GFSLTSYTLS(SEQ ID NO:362)，

b.CDR-H2包含序列AIWGGDNTD(SEQ ID NO:363)，

c.CDR-H3包含序列ELGGSFDY(SEQ ID NO:364)，

d.CDR-L1包含序列KTSQNINKKLD(SEQ ID NO:367)，

e.CDR-L2包含序列YTNNLQT(SEQ ID NO:368)，并且

f.CDR-L3包含序列YQYDSGFT(SEQ ID NO:369)。

69.如权利要求68所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ ID NO:361或371中所示的序列。

70.如权利要求68或69所述的经分离的抗体，其中所述VL序列包含如SEQ ID NO:366或376中所示的序列。

71.如权利要求68-70中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含如SEQ IDNO:361或371中所示的序列；并且所述VL序列包含如SEQ ID NO:366或376中所示的序列。

72.如权利要求68-70中任一项所述的经分离的抗体，其中所述VH序列包含与SEQ IDNO:361或371中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列，和/或所述VL序列包含与SEQ ID NO:366或376中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98或99％同一性的序列。

73.如权利要求68-72中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:365或375中所示的重链序列；和如SEQ ID NO:370或380中所示的轻链序列。

74.如权利要求68-72中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含重链序列，所述重链序列包含与如SEQ ID NO:365或375中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；和轻链序列，所述轻链序列包含与如SEQ ID NO:370或380中所示的序列具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

75.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体、中性抗体、拮抗性抗体、激动剂抗体、多克隆抗体、无岩藻糖基化抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和scFv。

76.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体为scFv。

77.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

78.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。

79.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体为人类抗体。

80.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含Fc区。

81.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述Fc区包括人类Fc区。

82.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含活性人类Fc区。

83.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM类的重链人类恒定区。

84.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含IgG类和选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4子类的人类重链恒定区。

85.如权利要求84所述的经分离的抗体，其中所述人类Fc区包括野生型人类IgG1 Fc区。

86.如权利要求84所述的经分离的抗体，其中所述人类Fc区包括野生型人类IgG4 Fc区。

87.如权利要求80-86中任一项所述的经分离的抗体，其中所述Fc区包含一个或多个氨基酸取代，其中与不存在所述一个或多个取代的Fc区相比，所述一个或多个取代导致抗体半衰期增加、ADCC活性增加、ADCP活性增加、CDC活性增加、ADCC活性降低、ADCP活性降低或CDC活性降低。

88.如权利要求80-84中任一项所述的经分离的抗体，其中所述Fc区结合选自由以下组成的组的Fcγ受体：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb。

89.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体以小于或等于约0.5、1、2、3、4、5、6或7×10^-9M的K_D结合至人类MARCO，如通过表面等离子体共振(SPR)测定所测量。

90.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人类MARCO的结合是二价阳离子依赖性的。

91.如权利要求1-89中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体与人类MARCO的结合是二价阳离子非依赖性的。

92.如权利要求90或91所述的经分离的抗体，其中所述二价阳离子包括Ca2⁺或Mg2⁺。

93.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO的细胞外结构域。

94.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合至可溶性MARCO。

95.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO、食蟹猴MARCO或人类和食蟹猴MARCO的SRCR结构域。

96.如权利要求95所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)。

97.如权利要求96所述的经分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至以下中的至少一者：MARCO(SEQ ID NO:384)的Q452、Y472、K473、E450、Q487、T499、H505、D507、S509或E511。

98.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体具有受体-配体阻断活性。

99.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在与细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导至少一种细胞因子或趋化因子的表达增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

100.如权利要求99所述的经分离的抗体，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。

101.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导增加的NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

102.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

103.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

104.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

105.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

106.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII^高单核细胞或MHCII^中单核细胞。

107.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加脾脏中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

108.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

109.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中在施用于受试者后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导抗肿瘤记忆应答增加。

110.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中细胞为MARCO+细胞。

111.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述细胞为人类MARCO+细胞。

112.如权利要求110或111所述的经分离的抗体，其中所述MARCO+细胞为单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

113.如权利要求112所述的经分离的抗体，其中所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。

114.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体结合至MARCO+细胞的细胞表面上的MARCO。

115.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体：

a.与人源化PI-HX-3011、PI-HX-3031、PI-HX-3043、PI-HX-3061、PI-HX-3092抗体竞争结合至人类MARCO；

b.结合至人类MARCO；

c.结合至食蟹猴MARCO；

d.结合至人类和食蟹猴MARCO；

e.结合至人类MARCO的SRCR结构域；

f.结合至食蟹猴MARCO的SRCR结构域；

g.结合至人类和食蟹猴MARCO的SRCR结构域；

h.以二价阳离子依赖性方式结合至人类或食蟹猴MARCO；

i.以二价阳离子非依赖性方式结合至人类或食蟹猴MARCO；

j.在结合至MARCO+细胞后刺激MARCO信号传导；

k.在结合至MARCO+细胞后诱导一个或多个免疫信号通路；

l.在结合至MARCO+细胞后诱导细胞因子或趋化因子分泌，任选地其中所述细胞因子或趋化因子为IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子；

m.在结合至MARCO+细胞后，诱导增加的NK细胞活化、B细胞调控、T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化；

n.诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答；

o.降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路；

p.诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定；

q.诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞；

r.在结合至MARCO+细胞后调节脾脏中的B细胞；

s.增加脾脏和/或肿瘤中的CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII^高单核细胞和/或MHCII^中单核细胞；

t.增加脾脏和/或肿瘤中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞；

u.减少脾脏和/或肿瘤中的TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞；

v.在结合至MARCO+细胞后，诱导细胞粘附、细胞骨架、趋化性和细胞迁移变化；

w.在结合至MARCO+细胞后诱导细胞信号通路，包括粘附、迁移、趋化性细胞周期、T细胞受体、吞噬作用、自噬作用和wnt通路；

x.使MARCO+髓系细胞失能；或者

y.能够进行a.至x.的任何组合。

116.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，所述经分离的抗体用作药物。

117.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，所述经分离的抗体用于治疗癌症或感染。

118.如前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体，所述经分离的抗体用于治疗癌症，其中所述癌症选自实体瘤和液体瘤。

119.一种经分离的多核苷酸或多核苷酸集，所述经分离的多核苷酸或多核苷酸集编码前述权利要求中任一项所述的抗体、其VH、其VL、其轻链、其重链或其抗原结合部分；任选地所述经分离的多核苷酸或多核苷酸集为cDNA。

120.一种载体或载体集，所述载体或载体集包含权利要求119所述的多核苷酸或多核苷酸集。

121.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求119所述的多核苷酸或多核苷酸集或者权利要求120所述的载体或载体集。

122.一种产生抗体的方法，所述方法包括用权利要求121所述的宿主细胞表达所述抗体或其抗原结合片段以及分离所表达的抗体。

123.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至118中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。

124.一种药盒，所述药盒包含权利要求1至118中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段或者权利要求123所述的药物组合物以及使用说明书。

125.一种在受试者中增加免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物。

126.如权利要求125所述的方法，其中所述组合物包含结合至人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)的抗体。

127.如权利要求125或126所述的方法，其中所述组合物包含权利要求11至118中任一项所述的经分离的抗体或权利要求123所述的药物组合物。

128.如权利要求127所述的方法，其中所述抗体具有受体-配体阻断活性。

129.如权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答是适应性免疫应答。

130.如权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答是先天性免疫应答。

131.如权利要求125-130中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括细胞的至少一种细胞因子或趋化因子的表达与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

132.如权利要求131所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。

133.如权利要求125-129中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

134.如权利要求125-133中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，所述抗体诱导在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

135.如权利要求125-134中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

136.如权利要求125-135中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

137.如权利要求125-136中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

138.如权利要求125-137中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII^高单核细胞或MHCII^中单核细胞。

139.如权利要求125-138中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加脾脏中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

140.如权利要求125-139中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

141.如权利要求125-140中任一项所述的方法，其中所述抗体诱导增加的记忆免疫应答。

142.如权利要求125-141中任一项所述的方法，其中所述细胞为MARCO+细胞。

143.如权利要求125-142中任一项所述的方法，其中所述细胞为人类MARCO+细胞。

144.如权利要求142或143所述的方法，其中所述MARCO+细胞为单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

145.如权利要求144所述的方法，其中所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。

146.如权利要求125-145中任一项所述的方法，其中所述抗体结合至MARCO+细胞的细胞表面上的MARCO。

147.如权利要求125-146中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

148.如权利要求125-147中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

149.如权利要求148所述的方法，其中所述癌症是实体癌。

150.如权利要求148或149所述的方法，其中所述癌症是液体癌。

151.如权利要求148-150中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌、胃部癌症、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。

152.如权利要求151所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、乳腺癌、基底样乳腺癌、卵巢癌或胃癌。

153.如权利要求148-152中任一项所述的方法，其中与非肿瘤免疫细胞相比，MARCO以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

154.如权利要求148-153中任一项所述的方法，其中与非肿瘤免疫细胞相比，IL-10以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

155.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物。

156.如权利要求155所述的方法，其中所述组合物包含结合至人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)的抗体。

157.如权利要求155或156所述的方法，其中所述组合物包含权利要求1至118中任一项所述的抗体或权利要求123所述的药物组合物。

158.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含权利要求1至118中任一项所述的抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段或权利要求123所述的药物组合物的组合物。

159.如权利要求155-158中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已接受、同时正接受或随后将接受免疫疗法。

160.如权利要求159所述的方法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞检查点抑制剂；和抗PD1抗体。

161.如权利要求160所述的方法，其中所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

162.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段的组合物和免疫疗法。

163.如权利要求162所述的方法，其中所述组合物包含结合至人类MARCO的SRCR结构域(SEQ ID NO:384的残基424-519)的抗体。

164.如权利要求162或163所述的方法，其中所述组合物包含权利要求1至118中任一项所述的抗体或权利要求123所述的药物组合物。

165.如权利要求162-164中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞检查点抑制剂；和抗PD1抗体。

166.如权利要求165所述的方法，其中所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

167.如权利要求155-190中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

168.如权利要求155-167中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌。

169.如权利要求155-168中任一项所述的方法，其中所述癌症是液体癌。

170.如权利要求155-169中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌、胃部癌症、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。

171.如权利要求170所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、乳腺癌、基底样乳腺癌、卵巢癌或胃癌。

172.如权利要求155-171中任一项所述的方法，其中与非肿瘤免疫细胞相比，MARCO以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

173.如权利要求155-172中任一项所述的方法，其中与非肿瘤免疫细胞相比，IL-10以更高水平表达于肿瘤免疫细胞上。

174.如权利要求155-173中任一项所述的方法，其中与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导增加的抗肿瘤记忆应答。

175.如权利要求155-174中任一项所述的方法，其中与同种型对照抗体相比，所述施用增加所述受试者的免疫应答。

176.如权利要求175所述的方法，其中所述增加的免疫应答是适应性免疫应答。

177.如权利要求175所述的方法，其中所述增加的免疫应答是先天性免疫应答。

178.如权利要求175-177中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括细胞的至少一种细胞因子或趋化因子的表达与同种型对照抗体相比，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

179.如权利要求178所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。

180.如权利要求175-179中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

181.如权利要求175-180中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，所述抗体诱导在一些实施方案中，在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

182.如权利要求175-181中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

183.如权利要求175-182中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

184.如权利要求175-183中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

185.如权利要求175-184中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII^高单核细胞或MHCII^中单核细胞。

186.如权利要求175-185中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加脾脏中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

187.如权利要求175-186中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

188.如权利要求155-187中任一项所述的方法，其中所述细胞为MARCO+细胞。

189.如权利要求188所述的方法，其中所述细胞为人类MARCO+细胞。

190.如权利要求188或189所述的方法，其中所述MARCO+细胞为单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

191.如权利要求190所述的方法，其中所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。

192.如权利要求155-191中任一项所述的方法，其中所述抗体结合至MARCO+细胞的细胞表面上的MARCO。

193.一种使在细胞表面上表达MARCO的髓系细胞失能的方法，所述方法包括使所述髓系细胞与抗人类MARCO抗体或其抗原结合片段接触。

194.一种使在细胞表面上表达MARCO的髓系细胞失能的方法，所述方法包括使所述髓系细胞与权利要求1至118中任一项所述的抗体或权利要求123所述的药物组合物接触。

195.如权利要求193或194所述的方法，其中所述抗体通过ADCC活性、CDC活性或ADCP活性中的至少一者使所述髓系细胞失能，任选地其中所述抗体通过ADCC活性使所述髓系细胞失能，任选地其中所述抗体通过CDC活性使所述髓系细胞失能，并且任选地其中所述抗体通过ADCP活性使所述髓系细胞失能。

196.如权利要求193-195中任一项所述的方法，其中所述髓系细胞是MARCO+细胞。

197.如权利要求196所述的方法，其中所述髓系细胞是人类MARCO+细胞。

198.如权利要求193-197中任一项所述的方法，其中所述髓系细胞是单核细胞、单核细胞髓源性抑制细胞(mMDSC)或巨噬细胞。

199.如权利要求198所述的方法，其中所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或单核细胞源性巨噬细胞(MDM)。

200.如权利要求193-199中任一项所述的方法，其中所述髓系细胞是肿瘤内或脾脏髓系细胞。

201.如权利要求200所述的方法，其中所述接触是在体外或体内。

202.如权利要求201所述的方法，其中所述接触在受试者体内发生，任选地其中所述受试者患有癌症。

203.如权利要求202所述的方法，其中所述受试者是人类。

204.如权利要求202所述的方法，其中所述癌症是实体癌。

205.如权利要求202所述的方法，其中所述癌症是液体癌。

206.如权利要求202-205中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺小细胞癌、肾癌、肝癌、肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、结肠癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、基底样乳腺癌、胃癌、胃部癌症、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、头颈癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSC)。

207.如权利要求206所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、乳腺癌、基底样乳腺癌、卵巢癌或胃癌。

208.如权利要求194-207中任一项所述的方法，其中与同种型对照抗体相比，所述接触增加所述受试者的免疫应答。

209.如权利要求208所述的方法，其中所述增加的免疫应答是适应性免疫应答。

210.如权利要求208所述的方法，其中所述增加的免疫应答是先天性免疫应答。

211.如权利要求208-210中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括细胞的至少一种细胞因子或趋化因子的表达与同种型对照抗体相比，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

212.如权利要求211所述的方法，其中所述至少一种细胞因子或趋化因子包括以下中的至少一者：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL7R、IL-12、IL12-p70、IL-15、IL-18、IL-27、IP-10、IFN-γ、TNFα、MIP1-α、MIP1-β、MIP-2、CSF2、CSF3、G-CSF、M-CSF、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL24、CXCL1、CXCL3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、gro-α、MCP-1、MCP-3、LIF或嗜酸性粒细胞趋化因子。

213.如权利要求208-212中任一项所述的方法，其中所述增加的免疫应答包括NK细胞活化、B细胞调控T细胞增殖、T细胞活化或T细胞分化与同种型对照抗体相比有所增加，任选地如通过核酸或蛋白质测定所测量。

214.如权利要求208-213中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体诱导IL-2-STAT5信号传导、NF-kB信号传导、TLR信号传导、粘附和运动信号传导、细胞骨架重排信号传导、经由NF-kB的TNFα信号传导、IL-6-JAK-STAT3信号传导、SYK信号传导、MAPK信号传导、TPL2信号传导、钙信号传导、IFNγ应答或IFNα应答。

215.如权利要求208-214中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体降低细胞周期通路、细胞存活、细胞粘附、Myc靶标通路、E2F靶标通路、缺氧通路、mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、Src信号通路、PKC信号通路、上皮间质转化信号通路、氧化磷酸化或MAPK信号通路。

216.如权利要求208-215中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，所述抗体诱导炎性体活化，如通过IL-1β和/或IL-18分泌和/或吞噬作用所测定。

217.如权利要求208-216中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，所述抗体诱导髓系M2样TAM再极化为M1样TAM，和/或mMDSC再极化为促炎性单核细胞。

218.如权利要求208-217中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、树突状细胞、MHCII+巨噬细胞、MHCII^高单核细胞或MHCII^中单核细胞。

219.如权利要求208-218中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体增加脾脏中的巨噬细胞、边缘区巨噬细胞、滤泡B细胞和/或红髓巨噬细胞。

220.如权利要求208-219中任一项所述的方法，其中在细胞接触后，与同种型对照抗体相比，所述抗体减少TAM、肿瘤相关嗜中性粒细胞、浆B细胞、边缘区B细胞、CD19+B细胞、MHCII-单核细胞和/或MHCII-巨噬细胞。

221.如权利要求194-220中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已接受、同时正接受或随后将接受免疫疗法。

222.如权利要求221所述的方法，其中所述免疫疗法是以下中的至少一者：检查点抑制剂；T细胞检查点抑制剂；和抗PD1抗体。如权利要求222所述的方法，其中所述免疫疗法包含抗PD1抗体。

223.一种测定来自受试者的样品中MARCO蛋白的表达水平的方法，所述方法包括使所述样品与抗MARCO抗体接触以及进行免疫组织化学测定或可溶性MARCO测定。

224.如权利要求223所述的方法，其中所述测定是免疫组织化学测定，并且所述抗体包括RDM5、RDM9、PI-3010.15、PI-3010.25或PI-3030.41。