CN116622841A - 一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用,涉及分子诊断技术领域。分子标记物包括胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2。通过检测MZF1‑V2和PRSS3‑V3基因的表达水平,进而实现肺癌诊断、化疗或预后检测。分子标记物的提出,在提高化疗敏感性的个体化精准治疗应用中具有重要的科学意义和临床价值,不仅为肺癌患者的个体化精准治疗提供了有效的分子靶标,还为干预新策略提供了新的依据。此外,分子标记物的提出还提供了更可靠的肺癌诊断和预后预测手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域,具体而言,涉及一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用。
背景技术
肺癌是全球高发肿瘤,位居我国恶性肿瘤发病的首位。2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例,占恶性肿瘤新发病例的20.03%,死亡人数约为63.1万例,占恶性肿瘤新发病例的26.99%。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型,占肺癌患者的85%左右(Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.GlobalCancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and MortalityWorldwide for 36Cancers in 185Countries.CA Cancer J Clin 2021,71(3):209-249.)。由于早期症状隐匿、易转移,缺乏有效的监测手段,大部分患者就诊时多为中晚期,导致肺癌患者的5年生存率较低。
遗传变异和表观遗传学紊乱所导致的癌基因扩增或突变和肿瘤抑癌基因的沉默与功能丧失,在肺癌的发生进展中起着重要作用。与基因突变相比,表观遗传改变在肿瘤发生过程中的渐进性和可逆性对肺癌的早期检测和靶向治疗具有重要意义。目前研究较为明确的是启动子区CpG岛甲基化及组蛋白修饰的异常变化所致基因表达异常与功能紊乱,尤其是抑癌基因启动子区高甲基化已作为表观遗传标志物与药物靶点应用于肿瘤等疾病的分子诊断、治疗及预后评估等方面(Oh JH,Jung SH,Hong SJ,and Rhyu MG,DNAMethylation as Surrogate Marker For Gastric Cancer.J Cancer Prev 20:172-178,2015.)。
人胰蛋白酶(trypsin)在多种生理和病理过程中发挥重要作用,并通过调控其他蛋白活性的特定功能参与癌症进展,成为新型分子靶标。多项研究针对胰蛋白酶前体分子丝氨酸蛋白酶3(serine protease 3,PRSS3)与肿瘤的联系,已开发出PRSS3抑制剂以阻止其促癌作用(Hockla A,Miller E,Salameh Ma et al,.PRSS3/mesotrypsin is atherapeutic target for metastatic prostate cancer.Molecular cancer research:MCR 2012,10(12):1555-1566.Radisky ES.PRSS3/mesotrypsin in prostate cancerprogression:implications for translational medicine.Asian journal ofandrology 2013,15(4):439-440.)。
然而,PRSS3无论是作为促癌因子促进肿瘤转移和复发,还是作为抑癌因子抑制肿瘤生长,其在恶性肿瘤中的生物学功能一直没有定论。即使在相同类型的肿瘤如非小细胞肺癌中,也有关于PRSS3表达与功能的相反报告。一方面,研究表明PRSS3在转移性NSCLC细胞中表达增加,且PRSS3的表达增加与病人不良预后相关。但另一面,却有研究显示,PRSS3在NSCLC中呈现表观沉默,并促进细胞的增殖和转移,具有潜在的抑癌基因样作用,且与PRSS3呈现异常高甲基化相关(Ma H,Hockla A,Mehner C,Coban M,Radisky ES.PRSS3/Mesotrypsin and kallikrein-related peptidase 5are associated with poorprognosis and contribute to tumor cell invasion and growth in lungadenocarcinoma.Scientific Reports 2019,9(1):1844.Marsit CJ,Chinedu O,Hadi D,Kelsey KT.Epigenetic silencing of the PRSS3 putative tumor suppressor gene innon-small cell lung cancer.Molecular Carcinogenesis 2010,44(2):146-150.)。
这些研究表明PRSS3在肿瘤发生发展过程中表达模式与功能表型呈现出争议性的“双向”作用,而且被认为是不同来源的组织细胞及其肿瘤微环境导致不同PRSS3表达与信号通路造成的。由于PRSS3剪接变异体序列的高度一致性,缺乏针对各异构体的特异抗体及精准检测方法,根据文献报道无法进一步确定肿瘤中PRSS3异常表达的剪接变异体及其异构体具体类型,提示PRSS3在肿瘤发生发展过程中表达与功能及其分子机制需进一步的深入系统研究。因此,研究PRSS3基因体甲基化对剪接变异体的调控机制,鉴定肺癌早期诊断相关标志物具有重要的科学意义和临床应用价值。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种用于肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物,分子标记物包括胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2,胰蛋白酶3剪接变异体3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
发明人发现胰蛋白酶3剪接变异体3(PRSS3-V3)和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2(MZF1-V2)在肺癌组织细胞表达明显降低,通过多色免疫组化分析表明,肺癌中PRSS3mRNA的差异表达是由于PRSS3-SVs的异常表达引起的,与癌旁组织相比,肿瘤组织中的PRSS3-V3的表达减少。而敲除PRSS3基因后,肿瘤细胞的增殖明显减慢,克隆形成明显减少,迁移能力明显减弱。而在过表达PRSS3的不同剪接变异体后,细胞生物学功能呈现明显不同,其中过表达PRSS3-V3基因后肿瘤细胞增殖、克隆形成数及迁移细胞数均明显降低,而细胞过表达PRSS3-V1或V2后,增殖、克隆形成及迁移较对照均显著增加。经体内裸鼠成瘤实验验证,PRSS3-V3呈现出抑癌基因的作用。表明PRSS3-V3基因可以作为肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物。
经MZF1的剪接变异体敲除实验以及染色质免疫共沉淀实验,结果表明:MZF1-V2可以与PRSS3-V3基因的启动子区域特异性结合,可以上调PRSS3-V3基因的表达。由此,可以通过检测MZF1-V2和PRSS3-V3基因的表达水平,进而实现肺癌诊断、化疗或预后检测。
本发明还提供了一种检测分子标记物的物质在制备肺癌诊断药物或预后检测制剂中的应用。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述物质为检测分子标记物的引物或试剂。上述检测引物或试剂为液体溶液、冻干粉剂或半固态制剂。
在一种可选的实施方式中,上述物质中还包括缓冲液或其他助剂、冻干保护剂。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示,检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如SEQ IDNO.5-6所示。
PRSS3-V3的反转录扩增引物如下(NM_001197097.3,扩增大小为140bp,扩增产物如SEQ ID NO.24所示);
上游引物(SEQ ID NO.3):5’-GTGCGCCATTGGTTTTCCAT-3’;
下游引物(SEQ ID NO.4):5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’。
MZF1-V2的反转录扩增引物如下(NM_198055.2,扩增大小为339bp,扩增产物如SEQID NO.25所示):
上游引物(SEQ ID NO.5):5’-GGGGGCATCTTCTCCCCA-3’;
下游引物(SEQ ID NO.6):5’-CACCTTGCCACATACATCGC-3’。
采用上述MZF1-V2的反转录扩增引物对逆转录得到的cDNA进行荧光定量PCR,荧光定量PCR反应条件如下:50℃2min,95℃10min,95℃15s;60℃1min;40个循环,收集荧光;95℃15s,60℃1min,95℃15s,60℃15s。
在一种可选的实施方式中,PRSS3-V3的反转录扩增条件与MZF1-V2的反转录扩增条件相同。
本发明还提供了一种检测上述分子标记物的物质在制备肺癌诊断或预后检测试剂盒中的应用。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述物质为检测分子标记物的引物或试剂;检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示,检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。
本发明还提供了一种分子标记物作为药物靶点在肺癌诊断、化疗和预后检测药物中的应用:转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2通过上调胰蛋白酶3剪接变异体3的表达,抑制肺癌的进程。
经实验验证,PRSS3-V3呈现出抑癌基因的作用,而MZF1-V2可以与PRSS3-V3基因的启动子区域特异性结合,可以上调PRSS3-V3基因的表达。表明PRSS3-V3基因和MZF1-V2可以作为药物靶点用于肺癌诊断、或预后检测的药物。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述肺癌为非小细胞肺癌,上调表达是上调非小细胞肺癌细胞系及组织的胰蛋白酶3剪接变异体3的表达。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述相对于正常细胞,胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2在肺癌细胞中的表达均呈现逐渐下降模式PRSS3-V3Low/MZF1-V2Low。
需要说明的是,上述表达下降包括不限于:与正常细胞相比,肺癌细胞中PRSS3-V3和MZF1-V2的表达水平有稍有下降或明显的下降。PRSS3-V3和MZF1-V2的表达水平的下降比例相同或不同。
经验证,转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2通过上调控胰蛋白酶3剪接变异体3的表达实现抑癌作用。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种用于肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物,通过检测MZF1-V2和PRSS3-V3基因的表达水平,进而实现肺癌诊断、化疗或预后检测。分子标记物的提出,在提高化疗敏感性的个体化精准治疗应用中具有重要的科学意义和临床价值,不仅为肺癌患者的个体化精准治疗提供了有效的分子靶标,还为干预新策略提供了新的依据。此外,分子标记物的提出还提供了更可靠的肺癌诊断和预后预测手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为PRSS3及其剪接变异体在非小细胞肺癌细胞系及组织中的表达结果图;
图2为敲除或过表达PRSS3及其剪接变异体对非小细胞肺癌细胞功能的影响结果图;
图3为MZF1促进PRSS3-V3启动子区的活化的实验验证结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例对肺癌细胞中PRSS3-V3基因的表达水平进行检测。具体采用qPCR的方法进行表达水平的检测。
一、实验材料
供试非小细胞肺癌细胞:A549、801-D、NCI-H1299、NCI-H460。
上述细胞均从国家生物医学实验细胞资源库购买获得,于申请者单位实验室正常条件培养传代。
供试石蜡包埋组织(肺腺癌临床组织标本以及对应的配对癌旁组织):180例组织,包括配对的组织86对及单独的8例肿瘤组织,购自上海芯超生物科技有限公司,货号:HLugA180Su06。
二、实验方法
1、细胞RNA提取及逆转录流程
(1)细胞RNA提取流程为选择生长状态良好的细胞,按1mL/106个细胞加入Trizol试剂(美国Invitrogen公司,货号:15596026)。组织RNA提取流程为从液氮罐中取出冻存的组织,切取约200mg,作为冷研钵研磨组织标本。每100mg组织标本加入1mLTrizol试剂。
(2)室温放置10min,充分裂解后氯仿抽提,每1mL Trizol加入0.2ml氯仿。剧烈震荡15s,室温放置5min,12000g,4℃离心15min。
(3)将分层后的上层无色液体转移至新的离心管中,使用预冷的异丙醇进行沉淀,每1mL Trizol加入0.5mL异丙醇,冰上放置20min。12000g,4℃离心10min,弃上清。
(4)用预冷的75%乙醇洗涤沉淀,1mL Trizol加入1ml 75%乙醇,7500g,4℃离心5min,弃上清。干燥后加入适量的DEPC-H2O溶解,0.8%琼脂糖凝胶电泳确认,NanoDrop测定RNA浓度,-80℃保存。
(5)取1.0μg RNA逆转录为cDNA,使用北京全式金生物技术公司生产的TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(货号:AH301-02):将1μL Anchored Oligo(dT)20、10μL 2×TS Reaction Mix和1μL RT/RI Enzyme Mix,加入DEPC-H2O至20μL。反应条件,42℃30min,85℃5min,逆转录得到的cDNA于-20℃放置。
2、qPCR检测
(1)qPCR引物设计参照图1中A所示,序列如下:
引物对1:PRSS3 mRNA公共区引物(大小为101bp),根据PRSS3的四种剪接体相同的外显子序列设计的PRSS3通用引物。
上游引物(SEQ ID NO.7):5’-ATTCTGGCTCCCACTTCTGC-3’;
下游引物(SEQ ID NO.8):5’-CTCTCCCAGTCTCACCTGGA-3’。
引物对2:PRSS3-V1 mRNA引物(NM_007343.4,大小为124bp)
上游引物(SEQ ID NO.9):5’-CTGCGAGGCGCTGGG-3’;
下游引物(SEQ ID NO.4):5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’。
引物对3:PRSS3-V2 mRNA引物(NM_002771.4,大小为129bp)
上游引物(SEQ ID NO.10):5’-ATCCTTGCCTTTGTGGGAGC-3’;
下游引物(SEQ ID NO.4):5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’。
引物对4:PRSS3-V3 mRNA引物(NM_001197097.3,大小为140bp)
上游引物(SEQ ID NO.3):5’-GTGCGCCATTGGTTTTCCAT-3’;
下游引物(SEQ ID NO.4):5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’。
引物对5:PRSS3-V4 mRNA引物(NM_001197098.1,大小为131bp)
上游引物(SEQ ID NO.11):5’-CGACTCGCATGGGACCTG-3’;
下游引物(SEQ ID NO.4):
5’-GCAGAAGTGGGAGCCAGAAT-3’。
其中,所述用于均一化的内参引物为以Beta-Aactin为内参的引物,上游引物(SEQID NO.12):
5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’;
下游引物(SEQ ID NO.13):5’-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。
(2)用于qPCR扩增的反应体系如表1所示。
表1、qPCR扩增的反应体系。
注:2×SYBR-Green:美国Zymo Research公司,货号E2004。
(3)PCR反应条件如下:
50℃2min,95℃10min,95℃15s;60℃1min;40个循环,收集荧光;95℃15s,60℃1min,95℃15s,60℃15s,制作溶解曲线。实验结果采用2-ΔΔCt法分析数据,溶解曲线保证产物的特异性。
3、Western blotting分析
(1)制备样品
将供试的肺鳞癌细胞接种于直径10cm培养皿中,待细胞长到60-80%左右,每组收集3-5个培养皿。
(2)收集并洗涤样品
用室温预热的PBS洗涤细胞1-2次,然后用1%福尔马林37℃处理10min。用冰冷PBS清洗细胞2次,然后用细胞刮棒移入1ml冰冷的PBS中,4℃离心3,000rpm,2min,弃上清。用400μl的裂解缓冲液重悬细胞沉淀,冰上孵育10min。
(3)Western blotting
将定量后的样品,取30μg/孔计算加样量,将样品加入5×SDS凝胶加样缓冲液(中国Genstar公司,货号:E153-05),100℃加热10min,顺序加样,电压120V进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后放入湿式电转仪中进行转膜,转膜结束后,将PVDF膜(美国Millipore公司,货号:IPVH00010)取出。5%脱脂牛奶封闭1h后,孵育一抗:PRSS3抗体(美国Thermo Fisher公司,货号:PA5114077)和PRSS3-V1抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:RPGRVERGGAQRGGAG),PRSS3-V2抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:NP_002762.2),PRSS3-V3抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:TLKKGRSAPLVFHPPDA),PRSS3-V4抗体(武汉戴安生物技术有限公司,免疫片段:GPAGEVAVP)4℃过夜。加入抗兔的辣根过氧化物酶(英国abcam公司,货号:ab6721)标记的二抗孵育1h,加入ECL化学发光试剂盒(美国Themo Fisher公司,货号:32132)进行显色反应,用Smart Gel Image AnalysisSystem进行显影。
4、多色免疫组化分析
使用Opal 7色荧光免疫组化试剂盒(美国Akoya Biosciences公司,货号:NEL797001KT)对组织阵列进行多色免疫组化分析。将4μm组织切片放于70℃烤片1h。二甲苯脱蜡,每20min一次,共两次。梯度乙醇(100%、95%、80%)依次水化5min。将组织切片置于枸橼酸修复液中,高温高压修复,室温冷却后,1×PBS清洗三次,每次5min。3%过氧化氢溶液室温孵育15min,双蒸水冲洗后,1×PBS清洗三次,每次5min。用5%脱脂奶粉封闭1h,倾去牛奶,1×PBS清洗三次,每次5min。孵育一抗:CK抗体(苏州百道医疗科技有限公司,货号:PA125)PRSS3抗体(美国Thermo Fisher公司,货号:PA5114077)和PRSS3-V1抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:RPGRVERGGAQRGGAG),PRSS3-V2抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:NP_002762.2),PRSS3-V3抗体(武汉戴安生物技术有限公司,抗原免疫:TLKKGRSAPLVFHPPDA),PRSS3-V4抗体(武汉戴安生物技术有限公司,免疫片段:GPAGEVAVP),4℃过夜。次日,室温放置半小时,1×PBS清洗三次,每次5min。滴加二抗,室温孵育30min,1×PBS清洗三次,每次5min。使用TissueFAXS Spectra S系统(美国tissuegnostic公司)获取多色荧光图像,使用自动定量分析系统(美国tissuegnostic,软件版本:StrataQuest7.0.1.165)对蛋白表达进行定量分析。
三、结果与分析
结果显示:
我们检测PRSS3在4株NSCLC细胞系(A549、801-D、NCI-H1299和NCI-H460)的表达水平,结果表明在PRSS3High和PRSS3Low肺癌细胞中,V1和V2是促进PRSS3表达的两个主要剪接变异体(图1中的A-C所示)。并进一步在肿瘤组织中证实了PRSS3-V1/V2在高表达,PRSS3-V3呈现出低表达的状态,PRSS3-V4则不表达(图1D),结果表明肺癌中PRSS3 mRNA的差异表达是由于PRSS3-SVs的异常表达引起的。图1中的B和C分别为NSCLC细胞中PRSS3和剪接变异体的RT-qPCR表达分析图。图1中D为RT-qPCR检测NSCLC肿瘤组织与其配对正常对照组织中PRSS3及剪接变异体mRNA的表达量结果图(n=13)。本实施例使用抗PRSS3公共区的抗体分析PRSS3,使用蛋白异构体特异性抗体分析PRSS3 V1~V4剪接变异体。
为了评估PRSS3蛋白异构体的表达,应用针对PRSS3保守区的抗体进行WesternBlot检测,在A549和801-D细胞裂解样中检出多个条带,且在收集的细胞培养上清中检出PRSS3的表达(图1E)。进一步我们使用针对PRSS3各个异构体的抗体进行检测,发现在A549细胞中检测到PRSS3-V1~V3蛋白异构体,其中PRSS3-V2在细胞裂解液和上清液中均存在,而801-D细胞中PRSS3-V1和V2则只在细胞裂解液中检测到(图1F)。应用针对PRSS3各个蛋白异构体的抗体进行免疫荧光,结果显示PRSS3-V1定位于胞浆,PRSS3-V2可分泌至细胞外,PRSS3-V3在细胞质和细胞核均有表达,PRSS3-V4定位于胞浆(图1G)。
图1中E和F分别为NSCLC细胞裂解液和培养基上清中PRSS3(E)和剪接变异体(F)的Western Blot表达分析;图1中G为免疫荧光检测PRSS3剪接变异体在A549细胞中的表达与定位结果图。
我们使用针对PRSS3各蛋白异构体和细胞角蛋白(CK)的抗体进行多重免疫组化检测,在180例组织样本中显示PRSS3-V1、V2、V4定位于CK阳性(CK+)组织区域,PRSS3-V3则定位于CK阴性(CK-)组织区域(图1中H)。荧光定量分析显示,与癌旁组织相比肿瘤组织中PRSS3-V1/V2表达增加,PRSS3-V3表达减少,且在CK+区域中PRSS3-V1/V2表达增加,而CK-区域内PRSS3-V3表达增加(图1I)。图1中H和I分别为多重免疫组化(mIHC)检测了组织芯片中86对配对的肿瘤和癌旁组织及8例肿瘤组织的PRSS3蛋白异构体的表达水平(H),对于肿瘤组织和正常组织中PRSS3各蛋白异构体进行蛋白表达荧光定量(I图上半部分),肿瘤组织(CK+)和肿瘤间质(CK-)中PRSS3各剪接变异体进行蛋白表达荧光定量(I图下半部分),*p<0.05,**p<0.01。
这些结果表明,PRSS3各剪接变异体在mRNA和蛋白水平上呈现出差异表达,其中PRSS3-V3特异的在肿瘤间质(CK-)和癌旁组织中呈现出高表达状态,这种差异表达也提示了PRSS3-V3与其他剪接变异体之间的功能差异性。
实施例2
本实施例检测肺癌细胞中PRSS3剪接变异体的生物学功能。
一、实验材料
供试非小细胞肺癌细胞:A549、801-D、NCI-H1299、NCI-H460。
上述细胞均从国家生物医学实验细胞资源库购买获得,于申请者单位实验室正常条件培养传代。
二、实验方法
1、敲除A549及过表达NCI-H460和NCI-H1299细胞中PRSS3基因表达
CRISPR/CAS9双载体慢病毒系统,由上海吉凯基因制作。
PRSS3敲除序列(sgRNA)
5’-GGCACTGAGTGCCTCATCTC-3’;
通用型空载质粒,购自美国GeneCopoeia公司,货号:EX-NEG-M35。
PRSS3-V1质粒,NM_007343.3,由上海吉凯基因合成
PRSS3-V2质粒,购自GeneCopoeia公司,货号:EX-F0190-M35
PRSS3-V3质粒,购自GeneCopoeia公司,货号:EX-A3595-M35
PRSS3-V4质粒,购自GeneCopoeia公司,货号:EX-Z9306-M35
选择非小细胞肺癌细胞系A549进行稳定慢病毒感染。处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液。将细胞悬液(细胞数约为5×104)接种于6孔板中,37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。根据细胞MOI值,加入适宜量的病毒。继续培养24h后更换培养基。感染3天后,加入适宜浓度的Puromycin(美国ApexBio Technology公司,货号:A3740)筛选3天,之后维持低浓度的Puromycin继续培养,并继续感染sgRNA慢病毒。通过荧光对感染成功sgRNA的细胞进行分选,通过RT-qPCR进行检测。
选择非小细胞肺癌细胞系A549和BEAS-2B进行稳定转染。将细胞接种于6孔细胞培养板中,待细胞长至60%融合度时,分别取200μL DMEM加入20nM表达质粒和空载质粒中,混匀后室温放置5min。再分别取200μL DMEM加入6μL Lipofectamine 2000中,混匀后室温放置5min。将200mL Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher公司,货号:11668019)稀释液加入200μL表达质粒中,混匀后室温放置20min。将400μL混合液加入细胞培养板中,37℃无血清培养8h后,更换10%FBS DMEM,37℃孵育24h后通过RT-qPCR进行检测。
2、细胞生物学功能实验
(1)MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)实验将处于对数生长期、生长情况良好的步骤一构建的含空载及敲除A549及过表达NCI-H460和NCI-H1299中PRSS3基因的细胞系进行消化计数,调整细胞悬液的浓度,每孔加入100μL于96孔细胞培养板,每孔铺2000个细胞设置8个复孔,连续观察4天;每天定时在每孔中加入10μL MTT(美国sigma公司,货号:M2128),使其终浓度为5μg/mL,共培养4h后,弃去培养基。4天后,每孔加入150μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,美国sigma公司,货号:D2650),避光轻摇10min后,在酶联免疫检测仪OD 490nm处检测各孔吸光值,对所得数据进行分析。
(2)细胞克隆形成实验
将处于对数生长期的含空载及敲除A549及过表达NCI-H460和NCI-H1299中PRSS3基因的细胞系分别消化计数,接种于6孔细胞培养板中,每孔100个细胞,每三天更换一次培养基。待细胞克隆长到肉眼可见的大小后,吸去培养基,1×PBS清洗两次。4%多聚甲醛固定30min,用1×PBS清洗两次。0.5%结晶紫染色30min,冲洗晾干后拍照,并计算克隆个数。
(3)迁移实验
步骤一构建的含空载及敲除A549及过表达NCI-H460和NCI-H1299中PRSS3基因的细胞系分别消化计数,分别加入到8.0μm孔径的Transwell小室(美国corning公司,货号:CLS3422)的上室,每个上室加入200μL不含血清的细胞悬液,每孔加入2×104个细胞,下室中加入600μL完全培养基;37℃细胞培养箱中培养,细胞培养24h,用1×PBS小心清洗数次;4%多聚甲醛固定30min,用1×PBS清洗三次;0.5%结晶紫染色30min,冲洗至漂洗液为无色,用棉棒小心移去上室细胞,置于显微镜(100×)下统计迁移细胞的数目。
3、裸鼠成瘤实验
稳定转染PRSS3剪接变异体或空载体的NCI-H460细胞,并计数,将细胞离心1000rpm/min,5min,弃上清,PBS液洗3遍,插冰,备用。每次选取4只SPF级4周龄Balb/c雌性裸鼠,在裸鼠臀部皮下注射细胞(细胞的浓度为1×106/0.1mL),双侧接种。每隔4天观察裸鼠,测量瘤体体积并记录。
4、统计学分析
实验均重复至少三次。实验结果均采用双侧t检验,其结果用平均值±标准差表示,*p<0.05代表具有显著统计学差异,**p<0.01代表具有极显著有统计学差异。
三、结果与分析
结果显示:我们建立功能筛选模型以明确PRSS3剪接变异体在NSCLC发挥作用的分子基础。通过CRISPR/Cas9技术在高表达PRSS3的A549细胞中敲除PRSS3基因(图2A),MTT、克隆形成及Transwell实验检测细胞增殖的结果显示,与转染空载的对照细胞相比,敲除PRSS3基因后A549细胞增殖明显减慢(p<0.01)、克隆形成明显减少(p<0.01)以及迁移能力明显降弱(p<0.01)。我们进一步在低表达PRSS3的NCI-H460和NCI-H1299中分别稳定转染质粒过表达PRSS3-V1~V4(图2B)。在外源性过表达PRSS3剪接变异体的NCI-H460和NCI-H1299细胞中,细胞生物学功能呈现明显不同:细胞过表达PRSS3-V1或V2后,增殖、克隆形成及迁移较对照均显著增加(p<0.01);而过表达PRSS3-V3的肿瘤细胞增殖、克隆形成数及迁移细胞数均明显降低(p<0.01);肿瘤细胞过表达PRSS3-V4则对增殖、克隆形成及迁移的影响不明显。
图2中A为在高表达PRSS3的肺癌细胞系A549中采用CRISPR/Cas9双载体慢病毒感染敲除PRSS3基因,通过MTT法、克隆形成实验和Transwell实验检测敲除A549细胞中的PRSS3对细胞增殖和侵袭的影响,定量数据显示在A图上半部分,代表性图像显示A图下半部分;B.选择低表达PRSS3剪接变异体的肺癌细胞系NCI-H460和NCI-H1299,分别建立外源性稳定高表达PRSS3剪接变异体V1、V2、V3和V4的转染细胞系。通过MTT法、克隆形成实验和Transwell实验检测过表达NCI-H460和NCI-H1299细胞中的PRSS3各剪接变异体对细胞增殖和侵袭的影响,定量数据显示在B图上半部分,代表性图像显示B图下半部分。
我们通过体内裸鼠成瘤实验,比较NCI-H460细胞的致瘤能力在过表达PRSS3剪接变异体后的变化。裸鼠成瘤生长曲线显示,与对照组相比,过表达PRSS3-V1或V2后,裸鼠荷瘤体积均明显增高(p<0.01),过表达PRSS3-V3则致裸鼠荷瘤体积明显降低(p<0.01),而过表达PRSS3-V4对裸鼠荷瘤无显著影响(图2C)。于细胞接种16天终止生长后,测量瘤体重量结果显示,相比于过表达PRSS3-V4的无影响,过表达PRSS3-V1或V2的肿瘤细胞瘤体重量明显增加,而过表达PRSS3-V3的瘤体重量显著减少。这些结果初步表明,PRSS3各剪接变异体在肺癌细胞在具有不同的细胞生物学功能,PRSS3-V1或V2促进肿瘤生长,而其中PRSS3-V3呈现出抑癌基因的作用。结果初步表明,PRSS3各剪接变异体具有不同的细胞生物学功能,其中PRSS3-V3呈现出抑癌基因样作用。
图2中C显示了观察过表达PRSS3剪接变异体的NCI-H460细胞在裸鼠体内致瘤性。裸鼠皮下注射NCI-H460细胞(1×106),分组为转染空载对照组以及分别转染PRSS3剪接变异体组。左图:裸鼠体内致瘤生长曲线,接种细胞四天以后开始测量肿瘤体积,每四天测量一次。中图:裸鼠体内肿瘤剥离。右图:剥离肿瘤重量比较。
实施例3
本实施例验证了转录因子MZF1结合于PRSS3基因体区域上调PRSS3-V3的表达。
一、实验材料
供试非小细胞肺癌细胞:A549和NCI-H460。
上述细胞均从国家生物医学实验细胞资源库购买获得,于申请者单位实验室正常条件培养传代。
二、实验方法
1、敲除A549细胞中MZF1基因表达后过表达MZF1各剪接变异体。
CRISPR/CAS9双载体慢病毒系统,由上海吉凯基因制作。
MZF1敲除序列(sgRNA)
5’-AGGGCTCCATCTTCTCTGAT-3’;
通用型空载质粒,购自美国GeneCopoeia公司,货号:EX-NEG-M02。
MZF1-V2质粒,购自GeneCopoeia公司,货号:EX-T3148-M02-5。
MZF1-V3质粒,NM_001267033.2,由上海吉凯基因合成。
选择非小细胞肺癌细胞系A549进行稳定慢病毒感染。处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液。将细胞悬液(细胞数约为5×104)接种于6孔板中,37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。根据细胞MOI值,加入适宜量的病毒。继续培养24h后更换培养基。感染3天后,加入适宜浓度的Puromycin(美国ApexBio Technology公司,货号:A3740)筛选3天,之后维持低浓度的Puromycin继续培养,并继续感染sgRNA慢病毒。通过荧光对感染成功sgRNA的细胞进行分选,通过RT-qPCR进行检测。
选择敲除MZF1基因的非小细胞肺癌细胞系A549进行稳定转染。将细胞接种于6孔细胞培养板中,待细胞长至60%融合度时,分别取200μL DMEM加入20nM表达质粒和空载质粒中,混匀后室温放置5min。再分别取200μL DMEM加入6μL Lipofectamine 2000中,混匀后室温放置5min。将200mL Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher公司,货号:11668019)稀释液加入200μL表达质粒中,混匀后室温放置20min。将400μL混合液加入细胞培养板中,37℃无血清培养8h后,更换10%FBS DMEM,37℃孵育24h后通过RT-qPCR和免疫荧光进行检测。
qPCR检测
(1)qPCR引物序列如下:
PRSS3引物见实施例1中的引物对1-5。
引物对6:MZF1 mRNA公共区引物(大小为162bp)
上游引物(SEQ ID NO.14):5’-ATGCAGGAATCACCACTGGG-3’;
下游引物(SEQ ID NO.15):5’-AAAGATCTGGTCCAGCACGG-3’。
引物对7:MZF1-V2 mRNA引物(NM_198055.2,大小为339bp)
上游引物(SEQ ID NO.5):5’-GGGGGCATCTTCTCCCCA-3’;
下游引物(SEQ ID NO.6):5’-CACCTTGCCACATACATCGC-3’。
引物对8:MZF1-V3 mRNA引物(NM_001267033.2,大小为116bp)
上游引物(SEQ ID NO.16):5’-CCGTGCTGGACCAGATCTTT-3’;
下游引物(SEQ ID NO.17):5’-GGCCCCTGGGGAGAAGA-3’。
其中,所述用于均一化的内参引物为以Beta-Aactin为内参的引物,
上游引物(SEQ ID NO.18):
5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’;
下游引物(SEQ ID NO.19):5’-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。
(2)用于qPCR扩增的反应体系如表2所示。
表2、qPCR扩增的反应体系
注:2×SYBR-Green:美国Zymo Research公司,货号E2004。
(3)PCR反应条件如下:
50℃2min,95℃10min,95℃15s;60℃1min;40个循环,收集荧光;95℃15s,60℃1min,95℃15s,60℃15s,制作溶解曲线。实验结果采用2-ΔΔCt法分析数据,溶解曲线保证产物的特异性。
免疫荧光染色检测:
将上述各组细胞进行免疫荧光染色。具体步骤如下:
将生长状态良好的细胞滴在盖玻片上,放入6孔细胞培养板中培养24h,1×PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定10min。1×PBS清洗三次后,加入0.5%Triton X-100,室温放置5min。1×PBS清洗三次,每次5min。加入适量体积的5%BSA室温封闭1h。孵育一抗:Anti-MZF1(南京巴傲得生物科技有限公司,货号:BS5810,稀释比:1:100,),4℃过夜。1×PBS清洗三次,每次5min。加入二抗:山羊抗兔IgG-FITC(中国proteintech公司,货号:SA00013-4,稀释比1:100),室温孵育1h。1×PBS清洗三次,每次5min。DAPI(美国Sigma-Arich公司,货号:D9542)染色2min,1×PBS清洗三次,每次5min。ddH2O清洗2min后,90%甘油封片,Vectra3类流式分析仪(美国PerkinElmer公司)下观察蛋白分子的细胞中的定位。
2、MZF1促进PRSS3-V3启动子区的活化
(1)双荧光报告基因表达载体的构建:
双荧光报告基因载体选择pGL-3-basic报告基因载体(美国Promega公司,货号:E1751),pRL-TK作为阴性对照(美国Promega公司,货号:E2241)实验中选择Kpn I和Xho I分别为5’及3’端的酶切位点。通过JASPAR预测PRSS3-V1/V3基因启动子区MZF1结合位点:
结合位点1:GGAGGGGATA;
结合位点2:CTAGGGGAGG;
结合位点3:TCCCACCGCC;
结合位点4:TGAGGGGAAG。
通过化学合成得到结合位点的插入片段:
pGL3-FA(SEQ ID NO.20)
GGGGTACCCCGGGGGAGGGTACGCGGACAGGGAGGGGATACCGACTGGGAGGGGCTCAGGGACAGGGATGGAGGCTCCTCTAGGGGAGGACGGGAGGGGATGGAGGGCCCTGGTGTCGCAGAAGCCCACCTGGGGCCCCCTCCGGGCTGCGGCACCGATGCGCACACTACTCCCACCGCCCCCGAGTGCCTATGTCCGGCTGGCCGCGGCCCTGGAATGAATATTGCTCAGTCCCCCGCGAGTCAGGTCTGCCGCGTTGCAGGGTGAGGGGAAGCCGCTCGAGCGG。
pGL3-FB(SEQ ID NO.21)
GGGGTACCCCCTAGGGGAGGACGGGAGGGGATGGAGGGCCCTGGTGTCGCAGAAGCCCACCTGGGGCCCCCTCCGGGCTGCGGCACCGATGCGCACACTACTCCCACCGCCCCCGAGTGCCTATGTCCGGCTGGCCGCGGCCCTGGAATGAATATTGCTCAGTCCCCCGCGAGTCAGGTCTGCCGCGTTGCAGGGTGAGGGGAAGCCGCTCGAGCGG。
pGL3-FC(SEQ ID NO.22)
GGGGTACCCCTCCCACCGCCCCCGAGTGCCTATGTCCGGCTGGCCGCGGCCCTGGAATGAATATTGCTCAGTCCCCCGCGAGTCAGGTCTGCCGCGTTGCAGGGTGAGGGGAAGCCGCTCGAGCGG。
pGL3-FD(SEQ ID NO.23)
GGGGTACCCCTGAGGGGAAG CCGCTCGAGCGG。
将结合位点的片段序列插入到报告基因,我们利用Kpn I(英国NEB公司,货号:R0142L)和Xho I(英国NEB公司,货号:R0146L)分别对目的片段和克隆载体进行双酶切。参照琼脂胶DNA回收试剂盒(北京全式金生物有限公司,货号:EG101-02)说明书操作流程进行胶回收,将目的片段和载体进行连接,得到重组质粒,并经酶切鉴定。
将连接产物加入到50μl刚解冻的DH-5α感受态细胞(北京全式金生物有限公司,货号:CD201-01)内,使其混匀后置于冰上,反应30min。42℃反应90s,迅速置于冰上2min。在1.5ml的离心管中加入250μl无抗性的LB液体培养基,200rpm,37℃孵育1h。在氨苄抗性的LB培养板上加入8μl 500mM IPTG(北京全式金生物有限公司,货号:GF101-01),40μl 20mg/mlX-gal(北京全式金生物有限公司,货号:GF201-01)将其均匀地涂开,倒置于37℃恒温培养箱,30min。取出菌液,4000rpm离心1min,弃上清,保留150μl液体,加入到培养板上,均匀涂布,倒置于培养箱内,培养14h。用枪头挑取挑大的、白色的克隆,将其置于含有0.1%氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃,培养14h。质粒提取参照质粒提取试剂盒(北京全式金生物有限公司,货号:EM101-01)操作手册。提取后的质粒进行测序,鉴定无误后扩大培养。
(2)双荧光报告素酶检测
选择NCI-H460细胞于检测前48小时进行瞬时转染,转染组如下:(1)pGL3-basic,pGL3-FA~FD与PRSS3-V1共转染(2)pGL3-basic,pGL3-FA~FD与PRSS3-V3共转染。吸尽细胞培养基,用PBS洗涤细胞。加入配制好的细胞裂解液CLB,使细胞充分裂解,室温放置10-20min进行检测。将100μl Luciferase Assay Reagent加入测定管底部,加入20μl样品,混匀后,放入仪器进行检测。取100μl稀释好的Stop Reagent加入测定管中,混匀后,放入仪器进行检测。按照Promega双荧光报告素酶检测试剂盒美国Promega公司,货号:E1910)的操作说明书,对前后两组数据汇总分析。
3、PRSS3基因启动子区域MZF1-V2结合位点检测
从NCBI呈现的PRSS3基因序列中选取特定的PRSS3基因序列,其针对的靶序列覆盖PRSS3基因转录起始位点+341bp~+541bp(201bp)。
引物具体序列如下:
上游引物:5'-CTGTGATGGAGAGGGGGTTC-3',
下游引物:5'-GAGTAGTGTGCGCATCGGT-3'。所有引物由华大公司(北京)合成。
ChIP-qPCR分析
供试细胞:上述制备的敲除A549细胞中MZF1基因表达后过表达MZF1各剪接变异体的细胞。
1、制备样品
将供试的细胞接种于直径10cm培养皿中,待细胞长到60-80%左右,阴性对照组中加入生理盐水每组收集3-5个培养皿。
2、收集并洗涤样品
用室温预热的PBS洗涤细胞1-2次,然后用1%福尔马林37℃处理10min。用冰冷PBS清洗细胞2次,然后用细胞刮棒移入1ml冰冷的PBS中,4℃离心3,000rpm,2min,弃上清。用400μl的裂解缓冲液重悬细胞沉淀,冰上孵育10min。
3、染色质DNA超声片段化,超声处理16次,每次2s,4℃,14,000g离心15min,收集上清。
4、免疫共沉淀:
参照QIAGEN EpiTech ChIPOneDay kit protocol(德国,QIAGEN,货号334471)说明书进行操作。取100μl样品,加入900μl IP Buffer A,50μl Protein A Beads,4℃,360°垂直旋转50min。4℃,5000rpm离心1min,冰上放置1min。将上清移入新的离心管内,并吸取10μl作为Input。孵育一抗:阴性对照组,加入4μg Control IgG;阳性对照组,加入4μganti-RNA Polymerase II抗体;实验组,分别加入4μg anti-MZF1抗体。4℃,360°垂直旋转过夜。加入60μl Protein A Beads,4℃,360°垂直旋转1h。4℃,5000rpm离心1min,冰上放置1min,弃上清。依次加入1ml IP Wash Buffer I、IP Wash Buffer II、IP Wash Buffer III和IP Wash Buffer IV。加入每个Buffer溶液后将样品4℃,360°垂直旋转4min。4℃,5000rpm离心1min,冰上放置1min,弃上清后加入下一个Buffer溶液。加入30μlElutionBuffer和2μl ChIP-Grade Proteinase K,45℃水浴30min。加入100μl DNA ExtractionBeads,涡旋震荡10s,95℃水浴10min。12000rpm离心1min,将上清转移到新的离心管内。
5、核酸提取
将洗脱液置于65℃水浴中6h,以使免疫复合物中蛋白和DNA分离。参照QIAquickPCR Purification Kit(德国,QIAGEN,货号28004)说明书进行核酸提纯。产物放置于20℃保存。核酸产物进行下一步的半定量和实时定量PCR,步骤见下。
6、PCR扩增:
目的基因:PRSS3基因的启动子结合区引物对
用制备的PRSS3基因启动子区特异性引物进行定量PCR扩增(下述结果是引物对1对应的结果)。
试剂:2×SYBR-Green:美国thermo fisher公司,货号4334973
扩增仪器:AB7500 Fast
扩增条件:95℃,10min;95℃15s,60℃,1min(40循环)。
数据结果通过2-△△Ct方法进行计算。
试验或对照样品沉淀的标准化(normalization):
首先计算每个样品中MZF1抗体(Ab)或对照IgG(IgG)相对样品投入控制(Input)的量:
ΔCt"标准化样品沉淀"=Ct[样品沉淀]-(Ct[样品投入控制]-Log2 (投入稀释因子))
其中,Ct[样品沉淀]为加入抗MZF1抗体的样品沉淀或IgG样品的沉淀。当Ct[样品沉淀]为加入抗MZF1抗体的样品沉淀时,ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗MZF1抗体的标准化样品沉淀;当Ct[样品沉淀]为加入IgG的样品沉淀时,ΔCt"标准化样品沉淀"为加入IgG的标准化样品沉淀。
当样品投入控制为投入免疫共沉淀样品的1%时,投入稀释因子=6.6。
计算样品的沉淀=2(-ΔCt"标准化样品沉淀")×100%。
ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗MZF1抗体的样品沉淀或IgG样品的标准化样品沉淀。
每一个样品同时用抗MZF1的抗体和IgG处理样品,IgG作为非特异性结合的对照,在计算样品的有效沉淀时需用该样品MZF1抗体的沉淀减去对照IgG的非特异沉淀:
样品有效沉淀(%of Input)=2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(Ab))×100%-2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(IgG))×100%。
三、结果与分析
结果显示:
我们采用JASPAR数据库分析预测PRSS3基因上潜在的转录因子结合位点时,发现在位其第一外显子上游1000nt至下游1000nt区域内评分最高的为转录因子MZF1结合基序,共计4个,分别命名为FA、FB、FC和FD(图3中A)。
MZF1已知剪接变异体有三个(MZF1-V1、-V2和-V3),其中MZF1-V1与-V2具有不同的5’-UTR和TSS,但编码区相同,即编码完整的异构体1(Isoform 1)具有功能域包括酸性域、SCAN结构域、TAD域,以及DNA结合域即由13个锌指组成的锌指域,且该C2H2型锌结构域识别的核心序列都富含G位点,推测可能会受到CpG甲基化修饰的影响。而MZF1-V3编码截断型异构体2(Isoform 2),只具有氨基N末端的酸性域、SCAN域,而缺失羧基C末端,因而类似MZF1的DNA结合域截短模型(图3B)。因此我们探讨MZF1异构体对PRSS3剪接变异体表达调控的影响。
首先通过CRISPR/Cas9技术在A549细胞中敲除MZF1,再分别稳定过表达MZF1-V2或-V3(图3C)。结果显示对PRSS3-V1的表达均无明显影响;敲除后PRSS3-V2表达升高,再表达MZF1-V2或-V3,则均显著降低PRSS3-V2表达,提示MZF1抑制PRSS3-V2的表达;而MZF1敲除后PRSS3-V3表达降低,再表达MZF1-V2,显著上调PRSS3-V3表达,再表达MZF1-V3,则无影响(图3D和3E),提示MZF1可上调PRSS3-V3表达,可能与其锌指域相关。
为此,我们构建4个结合基序逐个截短的质粒pGL3-FA、pGL3-FB、pGL3-FC和pGL3-FD(图3F),分别与PRSS3-V1或V3质粒共转染于NCI-H460细胞。与转染对照质粒的细胞相比,共转染PRSS3-V3和pGL3-FB、pGL3-FC的细胞荧光素酶活性均显著增加,其余无明显变化。结果初步提示,MZF1结合于PRSS3基因体特异性上调PRSS3-V3的表达。提示MZF1上调PRSS3-V3表达,可能通过其锌指域与PRSS3基因体区域上的MZF1结合基序FB和FC发生结合而实现,而FB和FC所在区域则是基因体甲基化调控PRSS3-V3的核心DMR区域。
最后我们进行染色质免疫共沉淀实验确定PRSS3基因启动子区PRSS3-V3的结合位点。定量PCR结果见图3G,ChIP-qPCR分析MZF1蛋白在PRSS3启动子区域特异性富集状态。A549细胞中敲除MZF1后特异性表达MZF1-V2,用MZF1抗体或对照IgG抗体沉淀染色质。qPCR分析沉淀DNA片段,提示MZF1在PRSS3启动子区域的特异富集。结果以输入数量的百分比表示(%of INPUT)。
综上,经实验验证,PRSS3-V3呈现出抑癌基因的作用,而MZF1-V2可以与PRSS3-V3基因的启动子区域特异性结合,可以上调PRSS3-V3基因的表达。表明PRSS3-V3基因和MZF1-V2可以作为药物靶点用于肺癌诊断、或预后检测的药物。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院
北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 一种肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物及其应用
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 932
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acttggcgag cggcgcggga tgcagacggc tgcgaggcgc tgggcacagg ttgccaggac 60
aaccgtgagg ctgcataaaa agaacctatg acaggatgca catgagagag acaagtggct 120
tcacattgaa gaaggggagg agtgcgccat tggttttcca tcctccagat gcactgattg 180
ctgtcccctt tgacgatgat gacaagattg ttgggggcta cacctgtgag gagaattctc 240
tcccctacca ggtgtccctg aattctggct cccacttctg cggtggctcc ctcatcagcg 300
aacagtgggt ggtatcagca gctcactgct acaagacccg catccaggtg agactgggag 360
agcacaacat caaagtcctg gaggggaatg agcagttcat caatgcggcc aagatcatcc 420
gccaccctaa atacaacagg gacactctgg acaatgacat catgctgatc aaactctcct 480
cacctgccgt catcaatgcc cgcgtgtcca ccatctctct gcccaccacc cctccagctg 540
ctggcactga gtgcctcatc tccggctggg gcaacactct gagctttggt gctgactacc 600
cagacgagct gaagtgcctg gatgctccgg tgctgaccca ggctgagtgt aaagcctcct 660
accctggaaa gattaccaac agcatgttct gtgtgggctt ccttgaggga ggcaaggatt 720
cctgccagcg tgactctggt ggccctgtgg tctgcaacgg acagctccaa ggagttgtct 780
cctggggcca tggctgtgcc tggaagaaca ggcctggagt ctacaccaag gtctacaact 840
atgtggactg gattaaggac accatcgctg ccaacagcta aagcccccgg tccctctgca 900
gtctctatac caataaagtg gccctgctct ca 932
<210> 2
<211> 2666
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggcggtgct gccgtctgtt gtacctgaga ggcttgcgca tgccgacgca cggattcgag 60
gcggggagca tgggaagaag cggccaggag tatgacctga tcattgcgac caccgctagg 120
ggaagggagg agagggtgta gaaacgggga cgagggtggg ggaagggcaa ggaggcgctc 180
gagctggtgc gcggagcatc ctgggagacg tagtccagcg ggagggggaa gtcgaagact 240
gcgcgtgctc aggagcgcgg agcggcccgc tgagcgcaga ggggcagaca ctggcctcag 300
atacctgacc tggtaccctc tatgaggcct gcggtgctgg gctccccaga ccgagcaccc 360
ccagaagatg aggggcctgt catggtgaag ctagaggact ctgaggagga gggtgaggct 420
gccttatggg acccaggccc tgaagctgca cgcctgcgtt tccggtgctt ccgctatgag 480
gaggccacag ggccccaaga ggccctggcc cagctccgag agctgtgtcg ccagtggctg 540
cgtccagagg tacgctccaa ggagcagatg ctggagctgt tggtgctgga gcagttcctg 600
ggcgcactgc cccctgagat ccaggcccgt gtgcaggggc agcggccagg cagccccgag 660
gaggctgctg ccctagtaga tgggctgcgc cgggagccgg gcggaccccg gagatgggtc 720
acagtccagg tgcagggcca ggaggtccta tcagagaaga tggagccctc cagtttccag 780
cccctacctg aaactgagcc tccaactcca gagcctgggc ccaagacacc tcctaggact 840
atgcaggaat caccactggg cctgcaggtg aaagaggagt cagaggttac agaggactca 900
gatttcctgg agtctgggcc tctagctgcc acccaggagt ctgtacccac cctcctgcct 960
gaggaggccc agagatgtgg gaccgtgctg gaccagatct ttccccacag caagactggg 1020
cctgagggtc cctcatggag ggagcacccc agggccctgt ggcatgagga agctgggggc 1080
atcttctccc cagggttcgc gctgcagcta ggcagcatct ccgcaggtcc aggtagtgta 1140
agccctcacc tccacgtccc ctgggacctc ggcatggctg gcctttctgg ccagatccaa 1200
tcaccctccc gcgaaggtgg ctttgcgcat gcgcttctgc tccccagcga tctgaggagt 1260
gaacaggacc ccacggacga ggatccctgc cggggtgtgg gccctgctct gatcaccacc 1320
cgctggcgct cccccagggg ccggagccgg ggccgcccca gcactggggg cggggtggtt 1380
aggggcggcc gttgcgatgt atgtggcaag gtgttcagcc aacgcagcaa cctgctgagg 1440
caccagaaga tccacacggg tgagcgacca ttcgtgtgca gcgagtgcgg ccgcagcttc 1500
agccgcagct cgcacctgct gcgccaccag cttacgcaca ccgaggagcg gccgttcgtg 1560
tgcggcgact gtggccaggg cttcgtgcgc agcgcgcgcc tggaagagca tcggagagtg 1620
cacacgggcg aacagccttt ccgttgcgct gagtgcggcc agagcttccg gcagcgctcc 1680
aatctgctgc agcaccagcg catccacggc gatcccccgg gccctggcgc taagcccccg 1740
gcccctcctg gtgcgcccga gcctcccggc ccctttccgt gcagcgagtg ccgcgagagc 1800
ttcgcgcggc gcgccgtgct gctggagcac caggcggtac acacgggcga caagtccttt 1860
ggctgcgtcg agtgcggcga gcgcttcggc cgccgctcag tgctgctgca gcaccggcgc 1920
gtgcacagtg gcgagcggcc cttcgcctgt gccgagtgcg gccagagctt ccggcagcgc 1980
tccaacctga cgcagcaccg gcgcatccac accggggagc ggcccttcgc ctgcgccgag 2040
tgtggcaagg ccttccgcca gcggcctacg ctcacgcagc atctccgcgt acacacgggc 2100
gagaaaccct ttgcctgccc cgagtgtggc cagcgcttca gccagcgcct caagctcacg 2160
cgtcatcaga ggacacacac cggcgaaaag ccctaccact gcggtgagtg cggcctgggc 2220
ttcacgcagg tctcgcggct caccgagcac cagcgcatcc acacgggcga acggcccttc 2280
gcctgccccg agtgcggcca gagctttcgg cagcacgcca acctcaccca gcaccggcgc 2340
atccacacgg gtgaacggcc ctacgcatgc cctgagtgtg gcaaggcctt ccgccagcgg 2400
cccacgctca cgcagcatct gcgcacccac cgacgagaga agcccttcgc ctgccaggac 2460
tgtggccgcc gcttccacca gagcaccaag ctcattcagc accagcgcgt ccacagcgcc 2520
gagtagctcc agccgggacg cactgtgtcc gccatggtca gaacacctac ctcccctggt 2580
tattgtgagg ctggcgatta cataagtata agcaggtccg cccagggctt ggctactgta 2640
ggtgtccaat aaacagtaga tggaaa 2666
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgcgccatt ggttttccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagaagtgg gagccagaat 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggggcatct tctcccca 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caccttgcca catacatcgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attctggctc ccacttctgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctctcccagt ctcacctgga 20
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgcgaggcg ctggg 15
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atccttgcct ttgtgggagc 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgactcgcat gggacctg 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttagttgcgt tacacccttt c 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accttcaccg ttccagttt 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgcaggaat caccactggg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaagatctgg tccagcacgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccgtgctgga ccagatcttt 20
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggcccctggg gagaaga 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttagttgcgt tacacccttt c 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
accttcaccg ttccagttt 19
<210> 20
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggggtacccc gggggagggt acgcggacag ggaggggata ccgactggga ggggctcagg 60
gacagggatg gaggctcctc taggggagga cgggagggga tggagggccc tggtgtcgca 120
gaagcccacc tggggccccc tccgggctgc ggcaccgatg cgcacactac tcccaccgcc 180
cccgagtgcc tatgtccggc tggccgcggc cctggaatga atattgctca gtcccccgcg 240
agtcaggtct gccgcgttgc agggtgaggg gaagccgctc gagcgg 286
<210> 21
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggggtacccc ctaggggagg acgggagggg atggagggcc ctggtgtcgc agaagcccac 60
ctggggcccc ctccgggctg cggcaccgat gcgcacacta ctcccaccgc ccccgagtgc 120
ctatgtccgg ctggccgcgg ccctggaatg aatattgctc agtcccccgc gagtcaggtc 180
tgccgcgttg cagggtgagg ggaagccgct cgagcgg 217
<210> 22
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggggtacccc tcccaccgcc cccgagtgcc tatgtccggc tggccgcggc cctggaatga 60
atattgctca gtcccccgcg agtcaggtct gccgcgttgc agggtgaggg gaagccgctc 120
gagcgg 126
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggggtacccc tgaggggaag ccgctcgagc gg 32
<210> 24
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtgcgccatt ggttttccat cctccagatg cactgattgc tgtccccttt gacgatgatg 60
acaagattgt tgggggctac acctgtgagg agaattctct cccctaccag gtgtccctga 120
attctggctc ccacttctgc 140
<210> 25
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gggggcatct tctccccagg gttcgcgctg cagctaggca gcatctccgc aggtccaggt 60
agtgtaagcc ctcacctcca cgtcccctgg gacctcggca tggctggcct ttctggccag 120
atccaatcac cctcccgcga aggtggcttt gcgcatgcgc ttctgctccc cagcgatctg 180
aggagtgaac aggaccccac ggacgaggat ccctgccggg gtgtgggccc tgctctgatc 240
accacccgct ggcgctcccc caggggccgg agccggggcc gccccagcac tgggggcggg 300
gtggttaggg gcggccgttg cgatgtatgt ggcaaggtg 339
Claims (10)
1.一种用于肺癌诊断、化疗或预后检测的分子标记物,其特征在于,所述分子标记物包括胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2,所述胰蛋白酶3剪接变异体3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种检测如权利要求1所述的分子标记物的物质在制备肺癌诊断药物或预后检测制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述物质为检测所述分子标记物的引物或试剂。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示,检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如SEQ IDNO.5-6所示。
5.一种检测如权利要求1所述的分子标记物的物质在制备肺癌诊断或预后检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述物质为检测所述分子标记物的引物或试剂;检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示,检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。
7.一种肺癌诊断或预后检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测权利要求1所述的分子标记物的引物或试剂,检测胰蛋白酶3剪接变异体3的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示,检测转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2的引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。
8.一种如权利要求1所述的分子标记物作为药物靶点在肺癌诊断、化疗和预后检测药物中的应用,其特征在于:转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2通过上调胰蛋白酶3剪接变异体3的表达,抑制肺癌的进程。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述肺癌为非小细胞肺癌,上调表达是上调非小细胞肺癌细胞系及组织的胰蛋白酶3剪接变异体3的表达。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,相对于正常细胞,所述胰蛋白酶3剪接变异体3和转录因子骨髓锌指基因1剪接变异体2在肺癌细胞中的表达均呈现逐渐下降模式PRSS3-V3Low/MZF1-V2Low。
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