CN116606902A - 一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。所述检测体系包括：含5‑甲基胞嘧啶和/或5‑羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5‑甲酰胞嘧啶和/或5‑羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。本发明设计全新的检测体系，以含5‑甲基胞嘧啶(5‑mC)和/或5‑羟甲基胞嘧啶(5‑hmC)的DNA片段为底物，结合特定的氧化、转化过程，将荧光值与酶活偶联，实现双加氧酶的酶活检测，成本低，操作简单，且只需利用PCR仪和酶标仪等常见仪器即可准确测定TET酶活。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。
背景技术
甲基化修饰是表观遗传学调控的一种重要方式，且5-甲基胞嘧啶(5mC)是DNA最常见的修饰碱基。双加氧酶，是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化酶的总称。铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶[α-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases(α-ODDs)]属于广泛分布于自然界中的非血红素铁蛋白，是一种参与多种氧化还原反应的重要酶类，其反应底物种类多样，可以是蛋白质，例如脯氨酰羟化酶(PHD)等；也可以是小分子化合物，例如核酸等。TET(ten-eleventranslocation)酶是生物体内存在的一种Fe2+和α-酮戊二酸依赖的双加氧酶，TET酶可通过一系列的氧化反应，可将5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，然后再转化为5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，而5caC能被DNA糖苷酶特异识别并切除，随后偶联碱基切除修复机制，实现DNA主动去甲基化。目前，TET酶广泛应用于甲基化测序试剂盒，如TET辅助的重亚硫酸盐测序，吡啶硼烷测序(TAPS)(TET-assisted pyridineboranesequencing)、TAPSβ及CAPS，以及基因组甲基化测序(WGBS)等。
目前，TET酶活性测定方法包括酶联免疫吸附法、点杂交法和液相色谱-串联质谱法等。多采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TET酶活，如市面上的成品试剂盒，通过抗体显色法精准定量分析TET氧化5mC生成的5hmC的含量，但是无法分析后续氧化产物5caC的含量，因此无法准确测定TET酶活。通过点杂交技术，5mCDNA经过TET氧化后，可用5mC、5hmC、5fC和5caC抗体分别进行杂交，虽然可以检测多个样本，但是操作复杂、效率低下，成本高昂。另外，液相色谱-串联质谱法，将TET氧化的5mCDNA回收经过核酸酶消解，通过LC-MS分析底物及各个阶段氧化产物的占比，背景重，操作复杂，成本高昂。
综上所述，开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法，对于双加氧酶应用领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法，本发明设计全新的检测方案，以期开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测体系，所述检测体系包括：含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5-甲酰胞嘧啶(5fC)和/或5-羧基胞嘧啶(5caC)转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。
本发明中，设计全新的检测体系，以含5-甲基胞嘧啶(5-mC)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的DNA片段为底物，双加氧酶能够将5-mC或5-hmC氧化成5fC和5caC，随后利用转化试剂化学标记5fC和5caC，使其转变为非胞嘧啶，例如胸腺嘧啶(T)；然后以两端含G碱基的引物进行扩增反应，由于5fC和5caC已经转变为T，所以引物不能扩增体系中标记后的DNA，只能扩增未被氧化的初始底物DNA，最后用双链DNA(dsDNA)荧光定量试剂检测扩增产物荧光值，即酶投入量越多，则剩余的未被氧化的底物越少，扩增产物越少，荧光值越低，因此，其酶投入量与荧光值成反比，能够利用已知浓度的双加氧酶构建荧光值和浓度的标准曲线，实现双加氧酶的酶活检测。
可以理解，含5-甲基胞嘧啶(5-mC)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的DNA片段，其中只要含5-mC或5-hmC即可，能够被双加氧酶氧化，其余部分具体序列可自由选择。
优选地，所述DNA片段的至少一端未被5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶甲基化修饰。
优选地，所述DNA片段的长度为200～600bp，包括但不限于201bp、202bp、205bp、206bp、210bp、255bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、560bp、570bp、580bp、590bp、590bp、598bp或599bp，进一步优选为454bp。
本发明中，控制所述DNA片段的长度，能够节约反应时间。
优选地，所述引物中含有14～17个C-G碱基对。
优选地，所述引物的3’端末尾含有4～7个连续的C-G碱基。
本发明中，基于引物的结合特异性(引物无法与被氧化及转化后的DNA片段结合)实现特异扩增，进一步发现，引物富含C-G碱基对时，如3’端末尾含有4～7个连续的C-G碱基，可最大限度阻滞引物结合转变为T的DNA序列。
可以理解，能够将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂均适用于本发明，不作特殊限制。
可选地，所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂包括硼烷吡啶络合物、2-甲基吡啶硼烷、硼烷、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、1,3-茚满二酮或丙二腈中的任意一种或至少两种的组合。在本发明的一些实施例中，用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
可以理解，所述双加氧酶反应Buffer指为双加氧酶反应提供环境的Buffer，可根据具体使用的双加氧酶自由选择，本申请不作特殊限制。
可选地，所述双加氧酶反应Buffer含有10～100mM缓冲体系、10～300mM氯化钠、0.1～10mMα-酮戊二酸、0.1～10mML-抗坏血酸、0.1～10mM三磷酸腺苷、0.01～2mM二硫苏糖醇和0.1～50mM亚铁盐化合物。
可选地，所述缓冲体系包括：Tris-HCl。
第二方面，本发明提供第一方面所述的双加氧酶的酶活检测体系在制备双加氧酶的酶活检测产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的双加氧酶的酶活检测体系。
第四方面，本发明提供第一方面所述的双加氧酶的酶活检测体系或第三方面所述的双加氧酶的酶活检测试剂盒在双加氧酶的酶活检测体中的应用。
第五方面，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测方法，所述方法包括：
将含有双加氧酶的待测样品与第一方面中所述含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，根据标准曲线计算双加氧酶的酶活。
本发明的检测方法操作简单，对检测设备要求低，且可进行高通量检测。
优选地，所述标准曲线的构建方法包括：
将已知梯度浓度的双加氧酶分别与第一方面中所述末端含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，以荧光值为纵坐标双加氧酶的浓度为横坐标构建标准曲线。
可以理解，本发明方法可以对催化5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶的双加氧酶进行检测。
优选地，所述双加氧酶包括催化5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶的双加氧酶；
优选地，所述双加氧酶包括mYOX酶(methylpyrimidine oxygenase的mYOX家族)和TET酶(ten-eleven translocation)。
优选地，所述mYOX酶包括mYOXI等，TET酶包括TET1、TET2和TET3等。
与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
本发明中，设计全新的检测体系，以含5-甲基胞嘧啶(5-mC)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的DNA片段为底物，结合特定的氧化、转化过程，将荧光值与酶活偶联，该方法检测双加氧酶反应底物5-甲基胞嘧啶(5-mC)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的DNA剩余量，其酶投入量与荧光值成反比，实现双加氧酶的酶活检测，成本低，操作简单，且只需利用PCR仪和酶标仪等常见仪器即可准确测定双加氧酶酶活。
附图说明
图1为本发明酶活测定方法的原理图；
图2为本发明酶活测定方法获得的酶活-荧光标准曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明的目的是建立一种测定双加氧酶的酶活的方法。以TET酶为例，原理如图1所示。
如图1所示，首先通过PCR扩增合成含5hmC的DNA片段(两端含多个CG碱基对)，通过TET酶将5hmC氧化成5fC和5caC，随后利用硼烷吡啶络合物(pyridineborane)化学标记5fC和5caC，使其转变为T；然后以两端含G碱基的引物对扩增，由于5fC和5caC已经转变为T，所以引物不能扩增标记后的DNA，只能扩增初始底物5hmC-DNA，最后用dsDNA检测扩增产物荧光值，该方法检测TET反应底物5hmC-DNA剩余量，其酶投入量与荧光值成反比。TET酶氧化含5mC的DNA片段、同时含5mC和5hmC的DNA片段的原理与图1所示类似，不再赘述。
实施例1
本实施例进行荧光法TET酶活测定和标准曲线的测定。
1.5hmC-DNA底物制备
以dATP(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)、dGTP(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)、dTTP(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)和5-h-dCTP(abcam)为原料，以λDNA(New England Biolabs)为模板，合成含5hmC的DNA片段。PCR反应体系及扩增程序如表1和表2所示，扩增的5hmC-DNA产物经过纯化后备用。5hmC-DNA片段的获得不受本实施例的限制，本领域技术人员可以通过商业途径合成所需要的5hmc-DNA片段。
人工合成以下DNA单链引物片段(上海生工)：
TET-CpG F(SEQ ID NO.1)：5’-gtggtgatgccggatgatggcgcgc-3’；
TET-CpG R(SEQ ID NO.2)：5’-ttccgtcaaccaggcttatcagcgc-3’。
5hmC-DNA的核酸序列(SEQ ID NO.3)：人工合成以下DNA单链引物片段(上海生工)：
5hmC-DNA的核酸序列(SEQ ID NO.3)：
gtggtgatgccggatgatggcgcgccgttccgctacagcttcagcgccctgaaggaccgccataatgccgttgaggtgaactggattgacccgaacaacggctgggagacggcgacagagcttgttgaagatacgcaggccattgcccgttacggtcgtaatgttacgaagatggatgcctttggctgtaccagccgggggcaggcacaccgcgccgggctgtggctgattaaaacagaactgctggaaacgcagaccgtggatttcagcgtcggcgcagaagggcttcgccatgtaccgggcgatgttattgaaatctgcgatgatgactatgccggtatcagcaccggtggtcgtgtgctggcggtgaacagccagacccggacgctgacgctcgaccgtgaaatcacgctgccatcctccggtaccgcgctgataagcctggttgacggaa。
表1
表2
2.TET酶氧化反应
利用上述制备的底物进行TET酶氧化反应，反应体系如表3所示，5×mTET Buffer具体配方为：缓冲体系为Tris-HCl 100mM，氯化钠500mM，α-酮戊二酸10mM；L-抗坏血酸10mM，三磷酸腺苷10mM，二硫苏糖醇5mM和亚铁盐化合物20mM。
表3
| 组分 | 体积 |
| 5hmC-DNA | 400ng |
| 5×mTET Buffer | 5μL |
| FeSO4(4mM) | 1.2μL |
| TET酶(0.5-3U/μL) | 4μL |
| DEPC-H2O | To25μL |
上述体系除酶液之外，其他成分先配置成混合液，直接分装于八联排中(21μL/孔)，最后加入4μL各稀释梯度的酶(3、2、1.5、1.25、1、0.5U/μL)，振荡混匀，于PCR仪中37℃反应1h；反应结束后，迅速瞬离，加入1μL 20mg/mL蛋白酶K(翌圣)，振荡混匀，于PCR仪中50℃反应10min，使TET酶失活。
3.硼烷吡啶络合物标记
随后向上步反应液中加入1μL 10M硼烷吡啶络合物(AlfaAesar)和9μL 3M NaAC(pH4.3)，37℃孵育16h(600rpm振荡)。向上步反应液加入34μL3.5M Tirs base，再加入100μL DNA磁珠(翌圣)进行DNA纯化，用Qubit测定浓度待用。
4.PCR反应
取纯化后DNA进行PCR扩增，反应体系及扩增程序如表4和表5所示。
表4
表5
5.双链DNA(dsDNA)荧光检测及酶活计算
取1μLdsDNA(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)添加90μLddH2O，制成检测液，待用。待上述反应结束后，在黑色96孔酶标板中加入90μLdsDNA检测液，10μL待测PCR扩增产物，酶标仪震荡混匀，25℃孵育5min，在Ex/Em＝480nm/520nm(Auto Cutoff)条件下测定荧光值，检测结果如表6所示。
表6
| TET酶浓度(U/μL) | 荧光值 |
| 3 | 1494.6 |
| 2 | 2163.7 |
| 1.5 | 2500.5 |
| 1.25 | 2622.8 |
| 1 | 2776.7 |
| 0.5 | 2993.2 |
以TET酶浓度(U/μL)为横坐标，以荧光值为纵坐标，TET酶浓度和荧光值有很好的线性关系，R2可达0.99(图2)。根据待测样品荧光强度，带入标准曲线方程，即可计算出待测样的酶活。
实施例2
本实施例进行荧光法TET酶活测定和标准曲线的测定。
1.5hmc-DNA底物制备
以dATP(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)、dGTp(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)、dTTP(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)和5-h-dCTP(abcam)为原料，以λDNA(New England Biolabs)为模板，合成含5hmC的DNA片段。PCR反应体系及扩增程序如表1和表2所示，扩增的5hmc-DNA产物经过纯化后备用。
人工合成以下DNA单链引物片段(上海生工)：
TET-CpG F(SEQ ID NO.1)：5’-gtggtgatgccggatgatggcgcgc-3’；
TET-CpG R(SEQ ID NO.2)：5’-ttccgtcaaccaggcttatcagcgc-3’；
5hmc-DNA的核酸序列(SEQ ID NO.3)。
2.TET酶氧化反应
利用上述制备的底物进行TET酶氧化反应，反应体系如表7所示。
表7
| 组分 | 体积 |
| 5hmC-DNA | 400ng |
| 5×mTET Buffer | 5μL |
| FeSO4(4mM) | 1.2μL |
| mYOXI酶(0.5-3U/μL) | 4μL |
| DEPC-H2O | 补至25μL |
上述体系除酶液之外，其他成分先配置成混合液，直接分装于八联排中(21μL/孔)，最后加入4μL各稀释梯度的酶(3、2、1.5、1.25、1、0.5U/μL)，振荡混匀，于PCR仪中37℃反应1h；反应结束后，迅速瞬离，加入1μL 20mg/mL蛋白酶K(翌圣)，振荡混匀，于PCR仪中50℃反应10min，使TET酶失活。
3.标记
随后向上步反应液中加入1μL10M硼烷吡啶络合物(Alfa Aesar)和9μL 3M NaAC(pH4.3)，37℃孵育16h(600rpm振荡)。向上步反应液加入34μL3.5MTirsbase，再加入100μLDNA磁珠(翌圣)进行DNA纯化，用Qubit测定浓度待用。
4.PCR反应
取纯化后DNA进行PCR扩增，反应体系及扩增程序如表4和表5所示。
参照实施例1操作。
5.双链DNA(dsDNA)荧光检测及酶活计算
参照实施例1操作。
综上所述，本发明设计全新的检测体系，以含5-甲基胞嘧啶(5-mC)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的DNA片段为底物，结合特定的氧化、转化过程，将荧光值与酶活偶联，实现双加氧酶的酶活检测，成本低，操作简单，且只需利用PCR仪和酶标仪等常见仪器即可准确测定TET酶活。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。
2.根据权利要求1所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述DNA片段的长度为200-600bp；优选为454bp；
优选地，所述DNA片段的至少一端未被5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶甲基化修饰；
优选地，所述引物中含有14～17个C-G碱基对；
优选地，所述引物的3’端末尾含有4～7个连续的C-G碱基。
3.根据权利要求1或2所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂包括硼烷吡啶络合物、2-甲基吡啶硼烷、硼烷、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、1,3-茚满二酮或丙二腈中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述双加氧酶反应Buffer含有10～100mM缓冲体系、10～300mM氯化钠、0.1～10mMα-酮戊二酸、0.1～10mML-抗坏血酸、0.1-10mM三磷酸腺苷和0.01～2mM二硫苏糖醇和0.1～50mM亚铁盐化合物。
5.如权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系在制备双加氧酶的酶活检测产品中的应用。
6.一种双加氧酶的酶活检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系。
7.权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系或权利要求6所述的双加氧酶的酶活检测试剂盒在双加氧酶的酶活检测体中的应用。
8.一种双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将含有双加氧酶的待测样品与权利要求1中所述含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，根据标准曲线计算双加氧酶的酶活。
9.根据权利要求8所述的双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述标准曲线的构建方法包括：
将已知梯度浓度的双加氧酶分别与权利要求1中所述含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，以荧光值为纵坐标双加氧酶的浓度为横坐标构建标准曲线。
10.根据权利要求8或9所述的双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述双加氧酶包括催化5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶的双加氧酶；
优选地，所述双加氧酶包括mYOX酶和TET酶。
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