CN116606836A - 一种酶活、热稳定性提高的脂肪酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶活、热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶工程技术领域。所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于米曲霉的脂肪酶进行定点突变，将第68位丙氨酸替换为丝氨酸，并将第147位赖氨酸替换为精氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得突变体1；或者将第22位脯氨酸替换为组氨酸，并将第162位天冬氨酸替换为赖氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得突变体2。本发明通过定点突变的方式，获得显著提高了脂肪酶的酶活和热稳定性，可以提高生产效率，更适合工业应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶活、热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶工程技术领域。
背景技术
脂肪酶能在油水界面催化三脂酰甘油酯水解为脂肪酸和甘油，还可以在疏水介质中催化转酯、酯化、酯交换等反应。它广泛应用于食品加工、手性化合物拆分、洗涤剂、造纸、废水处理及生物柴油等领域。脂肪酶在工业应用中，往往需要或遇到高温环境(温度通常会超过45℃)。天然脂肪酶热稳定性普遍较差，这阻碍了其应用范围。
脂肪酶主要来源于植物、动物、微生物，其微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。随着生物信息学的发展，以一级序列同源性较高酶三维结构为模板的同源建模，也是获得蛋白质三维结构的有效方法。定向进化指在实验室中模拟自然界的进化过程，将目的基因通过诱变与重组等技术加速改造，并通过特定的选择条件筛选出符合需要的突变子。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的脂肪酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于米曲霉的脂肪酶进行定点突变，将第68位丙氨酸替换为丝氨酸，并将第147位赖氨酸替换为精氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得突变体1；或者将第22位脯氨酸替换为组氨酸，并将第162位天冬氨酸替换为赖氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸获得突变体2。
本发明的第二个目的是提供表达所述脂肪酶突变体的重组菌。
本发明的第三个目的是提供一种重组菌，所述重组大肠杆菌是一种重组菌，其特征在于，以pPIC9K为载体，以毕赤酵母GS115为宿主，表达突变体。
本发明的第四个目的是提供一种酶活提高的重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将含有编码脂肪酶突变体的基因与表达载体连接后转化至宿主菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法以pPIC9K为载体、以毕赤酵母GS115为宿主表达脂肪酶突变体。
本发明的第五个目的是提供一种提高脂肪酶活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示蛋白质氨基酸序列的第68位丙氨酸替换为丝氨酸，并将第147位赖氨酸替换为精氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸；或者将第22位脯氨酸替换为组氨酸，并将第162位天冬氨酸替换为赖氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸。
本发明还提供所述脂肪酶突变体在生产食品、医药配制品领域生产含脂肪酶的产品的应用。
本发明还提供所述重组菌在食品、医药配制品领域生产含脂肪酶的产品方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过定点突变的方式，获得显著提高了脂肪酶的酶活和热稳定性，可以提高生产效率，更适合工业应用。
附图说明
图1示出了突变体和野生型的酶活柱形图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过对米曲霉脂肪酶的蛋白质序列分析和计算机软件模拟，确定一种酶活力提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于米曲霉的脂肪酶进行定点突变，将第68位丙氨酸替换为丝氨酸，并将第147位赖氨酸替换为精氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸得到突变体1；或将第22位脯氨酸替换为组氨酸，并将第162位天冬氨酸替换为赖氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸得到突变体2。
具体实施方案为：以米曲霉脂肪酶基因为模板，通过定点突变方法，获得了新的脂肪酶基因，将该突变基因与载体相连构建重组质粒，转入相应宿主菌中进行异源表达，发酵可以获得该脂肪酶突变体。该突变体酶活明显提高，并且具有较理想耐热特性，适合高温环境，因此适合工业上生产。
1实验材料
1.1菌株和载体
(1)基因来源菌株：米曲霉，由实验室保存；
(2)表达宿主菌及载体：毕赤酵母(Pichiapastotis)GS115、载体pPIC9K，购于德国Novagen公司；
(3)克隆宿主菌：DMT感受态细胞，购于北京TransGen Biotech公司；
(4)原始质粒：脂肪酶TLL连接在载体pPIC9K上，由实验室构建保存。
1.2主要培养基：LB培养基
实施例1脂肪酶突变体的制备
利用定点突变试剂盒，进行定点突变扩增。扩增完成后，取10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证条带大小正确后加1μL DMT酶于PCR产物中，混匀，在37℃消化1小时。之后进行转化：加入2μL消化产物于40μL DMT感受态细胞中，冰浴30min，然后在42℃分子水浴锅中热激45s，冰浴3min，向产物中加入400μL LB培养基，在37℃、200rpm的摇床中孵育45min，最后取250μL菌液涂至kan+抗性的LB培养皿上，于37℃培养箱中过夜培养。第二天随机挑取平板上的单菌落进行阳性克隆验证，阳性菌进行测序比对，测序结果与模板序列进行比对，确定突变是否成功。测序验证突变成功后，提取突变体的重组质粒，用限制性核酸内切酶进行线性化处理，线性化后的重组载体电击转入毕赤酵母中，得到毕赤酵母重组菌株转化子。将上述重组菌株进行发酵，得到发酵液测定脂肪酶酶活。
实施例2脂肪酶突变体酶活及酶学性质的测定
1.脂肪酶突变体酶活的测定
酶活单位定义为：在一定条件下每分钟水解底物p-NP，生成1μmoL的对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活单位以U表示。对硝基苯酚法：吸取50mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液420μL于离心管中，再加入30μL10mM的底物p-NP，充分混匀后在37℃下预热5min，然后加入稀释好的酶液50μL，反应5min，加入50μL10％的SDS终止反应，最后加入500μL 0.5M的碳酸钠显色，用酶标仪在405nm的波长下测定其OD值。突变体酶活测定结果如表1所示：突变体1和2的酶活性较野生型分别提高了64.5％、28.1％。
表1突变体酶活测定结果
| 酶活 | 酶活升高百分比(％) | |
| 野生型 | 803.92 | |
| 突变体1 | 1322.61 | 64.5 |
| 突变体2 | 1029.59 | 28.1 |
2.脂肪酶突变体酶学性质的测定
最适温度测定：在最适pH条件下，将反应体系置于不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、)下反应。野生型最适温度为40℃、突变体1的最适温度为55℃，突变体2的最适温度为50℃，可见，突变体1和2热稳定性均有所提高。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其他方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种酶活力提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶为下述蛋白质中的任一种：
A1：氨基酸序列为SEQ ID No.3或4的蛋白质；
A2:将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3:与A1或A2所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
A4:在A1-A3中任一种蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
2.表达权利要求1所述脂肪酶突变体的重组菌。
3.一种重组菌，其特征在于，以pPIC9K为载体，以毕赤酵母GS115为宿主，表达权利要求1所述突变体。
4.一种酶活提高的重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将含有编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因与表达载体连接后转化至宿主菌中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以pPIC9K为载体、以毕赤酵母GS115为宿主表达权利要求1所述脂肪酶突变体。
6.一种提高脂肪酶活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示蛋白质氨基酸序列的第68位丙氨酸替换为丝氨酸，并将第147位赖氨酸替换为精氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸，将第22位脯氨酸替换为组氨酸，并将第162位天冬氨酸替换为赖氨酸，将第194位丝氨酸替换为苯丙氨酸。
7.权利要求1所述脂肪酶突变体在生产食品、医药配制品领域生产含脂肪酶的产品的应用。
8.权利要求2所述重组菌在食品、医药配制品领域生产含脂肪酶的产品方面的应用。
9.权利要求3所述重组菌在食品、医药配制品领域生产含脂肪酶的产品方面的应用。
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| WO2016169306A1 (zh) * | 2015-04-22 | 2016-10-27 | 江南大学 | 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用 |
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