CN116593615A - 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法 - Google Patents

一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116593615A
CN116593615A CN202310632509.7A CN202310632509A CN116593615A CN 116593615 A CN116593615 A CN 116593615A CN 202310632509 A CN202310632509 A CN 202310632509A CN 116593615 A CN116593615 A CN 116593615A
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
sample
steroid hormones
detecting
ohp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310632509.7A
Other languages
English (en)
Inventor
刘志权
张杭君
张亦南
丁佳锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Normal University
Original Assignee
Hangzhou Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Normal University filed Critical Hangzhou Normal University
Priority to CN202310632509.7A priority Critical patent/CN116593615A/zh
Publication of CN116593615A publication Critical patent/CN116593615A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
    • G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N2030/77—Detectors specially adapted therefor detecting radioactive properties

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及化学分析定量检测技术领域，具体涉及一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法；一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本；将预处理后的待测血清样本采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，并采用稳定同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量；本发明公开了一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，用于同时定量多种类固醇激素，并同时检测低容量样本中的微量类固醇激素水平。

Description

一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法
技术领域
本发明涉及化学分析定量检测技术领域，具体涉及一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法。
背景技术
由于工业涂料、杀虫剂、增塑剂、食品添加剂和其它化合物在人类社会中的使用越来越多，人类和动物暴露在那些更容易破坏内分泌系统、影响性分化、生殖、生育和生理稳态的化学物质中。类固醇激素家族作为内分泌系统中的一类信号分子，是病理诊断的重要参考。在这种情况下，其准确测量尤为重要。然而，类固醇激素及其代谢产物的种类繁多及其结构的相似性为定量分析带来了重大的复杂性，此外，它们在生物体中的含量极低，从pgmL-1到ng mL-1，多种类固醇激素的快速定量已成为临床医学和实验室检测中公认的挑战。
实验室分析对具有突出灵敏度和特异性的定量方法提出了很高的要求。目前，免疫测定法如ELISA，酶联免疫吸附测定法，基于色谱的分析方法如GC-MS，气相色谱和质谱的结合；HPLC-UV，高效液相色谱和紫外线的结合最常用于常规类固醇激素的定量。用于测定多种内源性类固醇激素的最常见的采样矩阵是血清。然而，对于非洲爪蟾Xenopus laevis、斑蝥Danio rerio或肌肉鼠Mus musculus等模型实验动物来说，很难获得大量血清样本。因此，现有技术中通常使用LC-MS/MS液相色谱-质谱法技术进行测定，通过UPLC–MS/MS超高效液相色谱-串联质谱技术将U/HPLC的高效分离能力与MS的特异性、敏感性、多组分检测和结构分析能力相结合，从而实现类固醇激素的定量检测。UPLC–MS/MS技术在低浓度范围内表现出更高的特异性和敏感性。此外，UPLC–MS/MS具有同时多通道检测的能力，可以用更少的样本量同时测定多种甾体激素，有利于高通量和节省时间。
对于传统类固醇激素的UPLC-MS/MS分析，最常用的是正离子或负离子模式的电喷雾电离ESI，例如β-雌二醇和17α-乙炔雌二醇可以通过负离子模式下的电喷雾离子化有效电离ESI(-)；但是对于前体胆固醇CH，它仅适用于使用大气压化学电离APCI源而不是ESI源进行量化，并且物质之间的性质差异使得在利用UPLC-MS/MS进行检测时，无法实现批量定量。
因此，需要探索将ESI与ACPI相结合的技术，从而可以实现仅需收集少量动物血清样本，便可在数分钟之内完成内源性类固醇激素的检测的方法。
发明内容
为了实现类固醇生成途径中多种激素的同时定量，本发明目的在于提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，用于胆固醇(CH)、醛固酮(A)、可的松(E)、氢化可的松(F)、21-脱氧皮质醇(21-DF)、皮质酮(B)、11脱氧皮质醇(11-DF)、雄烯二酮(A2)、雌二醇(E2)、雌酮(E1)、2-甲氧基雌二醇(2-MeE2)、21-羟基孕酮(21-OHP)、17-α-羟基孕酮(17α-OHP)、睾酮(T)、脱氢表雄酮(DHEA)、孕酮(P4)、二氢睾酮(DHT)和孕烯醇酮(P5)在低容量动物血清样品中的含量。
第一方面，本申请提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，采用如下的技术方案：
一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，所述样本预处理方法的步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本。
优选的，所述样本预处理方法的步骤如下：
(1)将待测血清样本与稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛混匀；
(2)加入甲基叔丁基醚进行萃取后离心，合并有机相，吹干、用乙腈复溶、过滤，即可得到预处理后的待测血清样本。
优选的，待测血清样本的加入量为100-120μL；例如待测血清样本的加入量为100μL、103μL、105μL、108μL、110μL、113μL、115μL、118μL或120μL。
优选的，稳定同位素内标溶液的加入量为5μL。
优选的，甲醛的加入量为10-15μL；甲醛为体积浓度为2％的甲醛水溶液；例如甲醛的加入量为10μL、11μL、12μL、13μL、14μL或15μL。
优选的，甲基叔丁基醚的加入量为200-250μL；例如甲基叔丁基醚的加入量为200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL。
优选的，加入稳定同位素内标溶液后进行混合的时间为10-20分钟；例如混合的时间为10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟或20分钟。
优选的，加入甲基叔丁基醚后进行反应的时间为5-10分钟；例如反应的时间为5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。
本申请中加入甲醛、甲基叔丁基醚，通过加入甲醛使血清样本和内标中的类固醇激素从样本转移出来，再由甲基叔丁基醚进行液液萃取，目的是解决体内类固醇激素(如T和E2)与性激素结合球蛋白相结合，从而导致检测浓度低的问题。
本申请中选用甲醛、甲基叔丁基醚作为前处理物质，利用物质相似相溶的原理，将血清中的类固醇激素转移至有机相中，便于上机检测。
本申请中加入稳定同位素内标溶液，通过检测其上机的浓度，可以用来衡量整个前处理过程中待测样品实际的损耗，便于计算加标回收率。
本申请中根据物质的相似相溶性的原理，选择乙腈进行复溶，更易于溶解。
第二方面，本申请提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，采用如下的技术方案：
一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，步骤如下：
按照上述样本预处理方法制备得到预处理后的待测血清样本；
将预处理后的待测血清样本采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，并采用稳定同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。
优选的，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相A：0.1mM的氟化铵；
流动相B：乙腈；
柱温：45℃；
进样量：1μL；
采用梯度洗脱程序进行洗脱。
优选的，液相色谱梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.2 70 30
3.5 0.2 40 60
8 0.3 10 90
8.5 0.3 0 100
9 0.2 70 30
10 0.2 70 30
优选的，质谱检测条件如下：采用电喷雾电离ESI正离子模式、电喷雾电离ESI负离子和大气压化学电离APCI模式，毛细管电压为±1.5kV，去溶剂温度为550-600℃，去溶剂气体流量800L/h，锥形气体流量50-150L/h，MRM扫描模式。
本发明公开的检测方法开发了多电离模式，并应用在了仪器上，本申请中通过采用电喷雾电离ESI正离子模式、电喷雾电离ESI负离子模式和大气压化学电离(APCI)结合起来进行质谱检测，有效解决了因为物质之间的性质差异，使得在利用UPLC-MS/MS进行检测时，无法实现批量定量的问题。
在一个具体的可实施方案中，一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，即用于检测类固醇激素为(CH)、醛固酮(A)、可的松(E)、氢化可的松(F)、21-脱氧皮质醇(21-DF)、皮质酮(B)、11脱氧皮质醇(11-DF)、雄烯二酮(A2)、雌二醇(E2)、雌酮(E1)、2-甲氧基雌二醇(2-MeE2)、21-羟基孕酮(21-OHP)、17-α-羟基孕酮(17α-OHP)、睾酮(T)、脱氢表雄酮(DHEA)、孕酮(P4)、二氢睾酮(DHT)和孕烯醇酮(P5)在低容量动物血清样品中的含量，包括以下步骤：
步骤S1：样品前处理
将100-120μL待测血清样本与5μL稳定同位素内标溶液(IS)混合，转移到Eppendorf管中，并完全平衡10-20分钟。随后，添加10-15μL体积浓度为2％的甲醛水溶液。每次添加试剂后，将样品充分混合。随后，加入200-250μL甲基叔丁基醚进行萃取，并将样品涡旋5-10分钟，然后在室温下以5000rpm离心10分钟。将上述液-液萃取步骤重复至少三次，合并有机相，并将收集的液体在氮气下吹干。最后，加入100μL乙腈进行重新溶解，通过孔径为0.22μm的聚醚砜膜过滤，即可得到预处理后的待测血清样本。
步骤S2：对预处理后的待测血清样本中的类固醇激素的浓度进行检测：设定UPLC-MS/MS分析条件，并进行UPLC-MS/MS分析，数据使用TargetLynx软件进行处理；采用Microsoft软件和SPSS 11.0(SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥)进行一般统计分析。
(1)液相色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC I-Class(FTN)系统进行液相色谱。使用ACQUITY UPLCBEH C18(1.7μm，2.1×100mm)UPLC色谱柱。流动相A为0.1mM氟化铵水溶液，流动相B为乙腈；柱温度保持在45℃，自动进样器温度保持在4℃，进样量为1μL，液相色谱梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.2 70 30
3.5 0.2 40 60
8 0.3 10 90
8.5 0.3 0 100
9 0.2 70 30
10 0.2 70 30
(2)质谱条件
类固醇激素通过Xevo TQ-S微型质谱仪进行检测，该质谱仪配备有以正或负模式操作的电喷雾和大气压化学电离(APCI)Turbo离子喷雾源。
A、E1、2-MeE2、E2、E1-d2和E2-d2在负离子模式下检测，参数如下：毛细管电压，-1.5kV；去溶剂气体流量，800L/h；锥形气体流量，150L/h；去溶剂温度，550℃。
T-2,3,4-13C3、17α-OHP-d8、P4-2,3,4-13C3、A2-2,3,4-13C3、E、F、21-DF、B、11-DF、21-OHP、17α-OHP、DHT、A2、T、CH、CH-d7、P4、P5和DHEA通过正离子模式检测，参数如下：毛细管电压，1.5kV；去溶剂气体流量，800L/h；锥形气体流量，50L/h：电晕针电压，21μA；源温度为150℃，去溶剂温度为550℃；IntelliStart用于锥形电压和碰撞能量的优化；停留时间设置为自动；多重反应监测(MRM)转变和化合物参数如下所示。
其中，保留时间的单位为min；扫描时间范围的单位为min；母离子的单位为m/z；锥体电压的单位为V；子离子1的单位为m/z；子离子2的单位为m/z；CE的单位为eV。
本申请中流动相A为0.1mM氟化铵水溶液，流动相B为乙腈，选用缓冲盐氟化铵可以提供优异的色谱分离和峰形状，并大大增强信号强度。使用乙腈作为有机相，使用典型类固醇激素E2和T的单一标准物分别作为分析物，以负离子和正离子模式进行测定，有效提高了检测效果。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1、本发明公开了一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，能够同时批量定量检测低容量样本中的微量类固醇激素水平，受检生物样本采血量少，便捷性大大提高，实现了低剂量生物样本的内源性类固醇激素的快速检测，与现有技术相比具有样品消耗量少、灵敏度高等特点。
2、本申请中加入甲醛、甲基叔丁基醚，通过加入甲醛使血清样本和内标中的类固醇激素从样本转移出来，再由甲基叔丁基醚进行液液萃取，可以有效避了免体内类固醇激素与性激素结合球蛋白结合，从而导致检测浓度低的问题，有效提高了检测的准确性与可靠性。
3、本发明公开的检测方法开发了多电离模式，并应用在了仪器上，本申请中通过采用电喷雾电离ESI正离子模式、电喷雾电离ESI负离子模式和大气压化学电离APCI结合起来进行质谱检测，从而可以实现批量定量检测。
附图说明
图1为同时检测CH、CH-d7、A2、A2-2,3,4-13C3、E2、E2-d2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、T-2,3,4-13C3，17α-OHP-d8、P4-2,3,4-13C3、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、E1-d2、B和F的MRM色谱图。
图2为Female Mus musculus 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图3为Female Mus musculus 2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图4为Female Mus musculus 3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图5为Male Mus musculus 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图6为Male Mus musculus 2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图7为Male Mus musculus 3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图8为Female R.nigromaculata 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图9为Female R.nigromaculata 2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图10为Female R.nigromaculata 3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图11为Male R.nigromaculata 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图12为Male R.nigromaculata2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图13为Male R.nigromaculata3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图14为Female Carassius auratus 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图15为Female Carassius auratus 2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图16为Female Carassius auratus 3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图17为Female Rana catesbiana Shaw 1的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图18为Female Rana catesbiana Shaw 2的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图19为Female Rana catesbiana Shaw 3的血清样品中多种类固醇激素(CH、A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F)的浓度(ng/mL)，其中，CH被稀释100倍。
图20为E2和T在不同流动相下的MRM色谱图；其中，流动相A为0.1mM氟化铵、流动相B为乙腈(上)；流动相A为纯水、流动相B为乙腈(下)。
图21为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(DHEA)的影响。
图22为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(P5)的影响。
图23为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(DHT)的影响。
图24为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(E)的影响。
图25为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(F)的影响。
图26为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(21-DF)的影响。
图27为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(B)的影响。
图28为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(E2)的影响。
图29为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(E1)的影响。
图30为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(2-MeE1)的影响。
图31为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(T)的影响。
图32为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(17α-OHP)的影响。
图33为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(A)的影响。
图34为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(A2)的影响。
图35为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(21-OHP)的影响。
图36为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(P4)的影响。
图37为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(CH)的影响。
图38为不同流动相对检测动物血清中类固醇激素(11-DF)的影响。
具体实施方式
下面结合附图与实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。需要注意的是，本发明同样适用于其他内源性类固醇激素的测定，以下实施例用于说明本发明，但是不用来限制本发明的范围。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(一)、检测方法
一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，具体步骤如下：
步骤1、试剂以及样品制备
1.1、试剂
类固醇激素标准品CH、CH-d7、A2、A2-2,3,4-13C3、E2、E2-d2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、T-2,3,4-13C3，17α-OHP-d8和P4-2,3,4-13C3购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯市)。
A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF和E1-d2购自源叶生物技术有限公司(中国上海)。
B和F购自阿拉丁生化技术有限公司(中国上海)。
表1类固醇激素标准品的CAS和项目编号
类固醇激素标准 CAS 项目编号
胆固醇(CH) 57-88-5 C8667
CH-d7 83199-47-7 700041P
雄烯二酮(A2) 63-05-8 A-075
A2-2，3，4-13C3 327048-86-2 A-084
雌二醇(E2) 50-28-2 E8875
E2-d2 53866-33-4 E4260
雌酮(E1) 53-16-7 E-075
17-α-羟基孕酮(17α-OHP) 68-96-2 H-085
睾酮(T) 58-22-0 T-037
脱氢表雄酮(DHEA) 53-43-0 D-063
孕酮(P4) 57-83-0 P-069
孕烯醇酮(P5) 145-13-1 P-104
二氢睾酮(DHT) 521-18-6 D-073
T-2，3，4-13C3型 327048-83-9 T-070
17α-OHP-d3 850023-80-2 H-096
P4-2，3，4-13C3细胞 327048-87-3 737143
醛固酮(A) 52-39-1 S30644
可的松(E) 53-06-5 S47960
11-脱氧皮质醇(11-DF) 152-58-9 B27368
21-羟基孕酮(21-OHP) 64-85-7 B65163
2-甲氧基雌二醇(2-MeE2) 362-07-2 S46451
21-脱氧皮质醇(21-DF) 362-07-2 641-77-0
E1-d2 56588-58-0 B72569
皮质酮(B) 50-22-6 C104537
氢化可的松(F) 50-23-7 H110523
去离子水通过Milli-Q水系统(美国马萨诸塞州贝德福德)进行纯化。LC-MS级的甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、甲酸(FA)、乙酸铵(CH3COONH4)、氟化铵(NH4F)和氨(NH3·H2O)以及所有干扰测试试剂均由Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯市)提供。
牛血清白蛋白(BSA)溶液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自阿拉丁生化技术有限公司(中国上海)。
1.2样品制备
储备溶液的制备：通过将准确重量的A、E、F、21-DF、B、11-DF、A2、E2、E1、2-MeE2、21-OHP、17α-OHP、T、DHEA、P4、DHT和P5、CH分别溶解在乙腈中，得到10μg/mL储备溶液。
混合标准溶液的制备：将10μg/mL储备溶液用质量浓度3％BSA(溶质：BSA，溶液：PBS)逐步稀释获得不同浓度的混合标准溶液；其中，A、E、F、21-DF、B、11-DF、A2、E2、E1、2-MeE1、21-OHP、17α-OHP、T、DHEA、P4、DHT和P5的浓度范围为0.02-1000ng/mL；CH的浓度范围为0.1-1000μg/mL。
稳定同位素内标的制备：配置浓度为100ng/mL的稳定同位素内标溶液。
内标的标准曲线溶液的制备：
精确抽吸A2-2,3,4-13C3、T-2,3,4-13C3、P4-2,3,4-3C3、E1-d2、E2-d2、CH-d7、17α-OHP-d8和稳定同位素内标溶液，用甲醇稀释，制备得到浓度为1μg/mL的内标储备溶液；
通过将准确重量的A、E、F、21-DF、B、11-DF、A2、E2、E1、2-MeE2、21-OHP、17α-OHP、T、DHEA、P4、DHT和P5、CH分别溶解在乙腈中，得到10μg/mL储备溶液；将10μg/mL储备溶液的内标储备溶液用甲醇逐步稀释获得不同浓度的内标的标准曲线溶液；其中，A、E、F、21-DF、B、11-DF、A2、E2、E1、2-MeE2、21-OHP、17α-OHP、T、DHEA、P4、DHT和P5的浓度范围为0.01-500ng/mL；CH的浓度范围为0.05-500μg/mL。
内标工作液的制备：A2-2,3,4-13C3、T-2,3,4-13C3、P4-2,3,4-13C3、E1-d2、E2-d2和17-OHP-d8的浓度均为50ng/mL，CH-d7的浓度为250μg/mL。
低、中、高浓度水平的混合QC样品的制备：将准确重量的A、E、F、21-DF、B、11-DF、A2、E2、E1、2-MeE2、21-OHP、17α-OHP、T、DHEA、P4、DHT和P5、CH分别溶解在乙腈中，得到10μg/mL储备溶液；用10μg/mL储备溶液制备低浓度(浓度为30ng/ml)、中浓度(浓度为1000ng/ml)、高浓度(浓度为4000ng/ml)水平的混合QC样品。
步骤2、血清样品预处理
2.1、样品采集
雌性鲫鱼和蛙是从中国湖州当地的一家鱼类经销商那里获得的。
肌肉分枝杆菌来源于杭州师范大学实验动物中心。
从中国衢州的1号(118.5314°E，28.5319°N)、2号(118.5026°E，285410°N)和3号(118.50 6°E，285 246°N)采集了野生黑腹蛙。通过眼丛穿刺从M.musculus获得血液样本，通过心静脉穿刺从C.auratus和R.nigromaculata获得血液样本。将血液以1300rpm离心15分钟以获得血清。对血清进行澄清，去除溶血和脂质，并在-80℃下冷冻保存。
2.2、样品制备
将100μL待测血清样本与5μL稳定同位素内标溶液(IS)混合，转移到Eppendorf管中，并完全平衡10分钟。随后，添加10μL体积浓度为2％的甲醛水溶液。每次添加试剂后，将样品充分混合。随后，加入200μL甲基叔丁基醚进行萃取，并将样品涡旋5分钟，然后在室温下以5000rpm离心10分钟。将上述液-液萃取步骤重复至少三次，合并有机相，并将收集的液体在氮气下吹干。最后，加入100μL乙腈进行重新溶解，通过孔径为0.22μm的聚醚砜膜过滤，然后放入自动进样器中进行UPLC-MS/MS分析。
步骤3、检测仪器及分析条件
3.1、检测仪器
美国Waters ACQUITY UPLC I-Class(FTN)超高效液相色谱分离系统，以及配有ESI/APCI复合离子源的美国Waters Xevo TQ-S micro三重四极杆串联质谱系统。
3.2、液相色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC I-Class(FTN)系统进行液相色谱。使用ACQUITY UPLCBEH C18(1.7μm，2.1×100mm)UPLC色谱柱。流动相A由在水中的0.1mM氟化铵组成，流动相B为乙腈；柱温度保持在45℃，自动进样器温度保持在4℃，进样量为1μL；表2显示了梯度洗脱程序。
表2液相色谱梯度洗脱程序
时间(分钟) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.2 70 30
3.5 0.2 40 60
8 0.3 10 90
8.5 0.3 0 100
9 0.2 70 30
10 0.2 70 30
3.3、质谱条件
为了避免MS检测器受到污染，仅在3.86-9.57分钟的时间窗口内，通过分流阀将LC流出物引导至质谱仪。类固醇激素通过Xevo TQ-S微型质谱仪进行检测，该质谱仪配备有以正或负模式操作的电喷雾和大气压化学电离(APCI)Turbo离子喷雾源。A、E1、2-MeE2、E2、E1-d2和E2-d2在负离子模式下检测，参数如下：毛细管电压，-1.5kV；去溶剂气体流量，800L/h；锥形气体流量，150L/h；去溶剂温度，550℃。
T-2,3,4-13C3、17α-OHP-d8、P4-2,3,4-13C3、A2-2,3,4-13C3、E、F、21-DF、B、11-DF、21-OHP、17α-OHP、DHT、A2、T、CH、CH-d7、P4、P5和DHEA通过正离子模式检测，参数如下：毛细管电压，1.5kV；去溶剂气体流量，800L/h；锥形气体流量，50L/h；电晕针电压，21μA；源温度为150℃，去溶剂温度为550℃；IntelliStart用于锥形电压和碰撞能量的优化；停留时间设置为自动；多重反应监测(MRM)转变和化合物参数见表3。
表3多重反应监测(MRM)转变和化合物参数
/>
步骤4、数据处理
MassLynx 4.1用于进行UPLC–MS/MS实验，数据使用TargetLynx软件进行处理；采用Microsoft软件和SPSS 11.0(SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥)进行一般统计分析。
(二)检测方法的方法学验证
对本发明进行了方法学验证，内容包括特异性、基质效应、回收率、标准曲线线性、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度、重复性、分析物稳定性、仪器残留效应。
1、特异性
计算质量控制(QC)样品和肌肉分枝杆菌血清的定量离子对(Qis)和定性离子对(CI)的比率，并与校准溶液的比率进行比较。相似的比率表明具有很高的特异性。对于每种激素，校准溶液、QC样品和肌肉分枝杆菌血清样品的QI/CI的相对标准偏差(RSD)均小于±5％，符合评估要求，并证明了该方法的良好特异性(表4)。此外，从色谱的角度来看，在低流速下可以实现目标类固醇的基线分离(图1)。说明类固醇激素17α-OHP和21-OHP的异构体显示出基线分离，证明了该柱的色谱选择性。
表4多种类固醇激素的特异性
/>
/>
2、基质效应
选择组合的ESCi源，在ESI锥体前面添加APCI离子源，以提供相对于ESI提供的过量电荷。如果中性分析物作为中性材料蒸发，APCI应该能够电离，从而降低单独使用ESI时观察到的电离抑制程度。然而，在电晕针存在的情况下，ESI的基质抑制没有显著变化，这表明从溶液中释放的气相中性分析物不能解释观察到的离子抑制(表5)。
表5多种类固醇激素的基质效应
3、回收率
使用质量浓度3％BSA(溶质：BSA，溶剂：PBS)作为空白血清制备低浓度(浓度为30ng/ml)、中浓度(浓度为1000ng/ml)、高浓度(浓度为4000ng/ml)混合类固醇激素的QC样品，并对每个浓度建立六个平行分析。QC样品的测量响应与标准对照样品的测量反应进行比较。所有类固醇激素的提取回收率在76.22％至113.66％之间，表明样品制备过程中分析组分的损失在可接受的范围内(表6)。
表6多种类固醇激素的提取回收率
4、标准曲线、检出限和定量限
以分析物的理论浓度为水平坐标(x)，分析物的响应与其对应的IS校正因子的比率为垂直坐标(y)进行加权线性回归，分析物的响应与其相应的IS校正因子的比率显示出与分析物的理论浓度的线性关系，见表7。此外，LOD被定义为S/N的三倍浓度，LOQ被定义为N/N的10倍浓度。根据表7可知，多种类固醇激素的标准曲线较为准确，r2稳定在0.990以上，检出限可以低至0.0001ng/mL，定量限低至0.0005ng/mL；表明该方法在0.3-1000μg/mL的分析物浓度范围内表现出线性(r2>0.99)。
表7多种类固醇激素的标准曲线、检出限和定量限
5、精密度和方法再现性
在低、中、高浓度(低30ng/ml、中1000ng/ml、高4000ng/ml)水平下制备QC样品，并在样品预处理后直接通过UPLC-MS/MS进行定量。每种浓度的精密度测量六次。然后，在三天内以低、中、高浓度制备QC样品，并通过相同的分析方法获得精密度(表8)。此外，为了确定再现性，制备低、中、高浓度的QC样品，并在样品预处理后进行分析。低浓度、中浓度和高浓度水平的精密度分别为6.43％-22.84％、3.63％-16.92％和2.13％-16.01％，表明该方法的精度符合要求，因此，对于中浓度和高浓度QC样品，精密度更好。三天内采用相同的方法测试精密度，低、中、高浓度水平的精密度分别为1.14％-6.01％、1.99％-6.28％和1.28％-7.52％。
表8多种类固醇激素的测定精度和重复性
6、残留效应
高浓度的样品进样分析后,在进样系统中残留一定量的待测物,从而影响了下一针进样时低浓度样品测定结果的准确度。因此，在高浓度样品检测后，检测了一针空白样品来评估残留效应。仪器检测了定量上限(ULOQ)的样品后再检测空白样品，空白样品的相关rt反应均小于定量下限(LLOQ)反应的20％，ISs rt反应均小于IS当天LLOQ反应的5％，说明后续注射未发生系统性残留污染。
7、分析物稳定性
为了评估短期和长期分析物的稳定性，将含有低浓度和高浓度类(低浓度：10ng/mL、高浓度：500ng/mL)固醇激素的新鲜血清样品在2℃下储存7天，在-20℃下存放2个月。对稳定性样品进行三次冻融循环，以评估冻融稳定性。所有样品在规定条件下储存后进行提取和分析，并将结果与新鲜样品的结果进行比较。此外，在4℃的自动进样器中储存44小时后，根据新制备的校准曲线对提取的样品进行重新分析，以确定提取后的分析物稳定性。如果与采集当天的偏差在±20％以内，则认为稳定性较好。表9显示，低、中、高浓度QC样品的长期稳定性范围为3.18％-16.27％，短期稳定性范围为2.02％-6.56％。
表9多种类固醇激素的分析物稳定性
8、方法应用
通过测定M.musculus、C.auratus、R.catesbiana Shaw和R.nigromaculata血清样品中的类固醇激素来评估本发明方法的适用性，不同性别之间类固醇浓度的差异(图2-图19)。雄性中检测到的雄激素浓度较高，但雄烯二酮除外，雄烯二酮类在两性中的含量相似；在雌性中观察到较高水平的雌激素；在糖皮质激素家族中发现了差异，男性11-DF水平高，女性21-OHP和F水平高，E和B没有显著差异(图2-图19)。
本发明公开了一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，用于同时定量18种类固醇激素，包括胆固醇(CH)、醛固酮(A)、可的松(E)、氢化可的松(F)，21-脱氧皮质醇(21-DF)，皮质酮(B)，11-脱氧皮质醇(11-DF)，雄烯二酮(A2)，雌二醇(E2)，雌酮(E1)，2-甲氧基雌二醇(2-MeE2)，21-羟基孕酮(21-OHP)，17-α-羟基孕酮(17α-OHP)，睾酮(T)，脱氢表雄酮(DHEA)，孕酮(P4)，二氢睾酮(DHT)和孕烯醇酮(P5)。该方法在0.3-1000μg/mL的分析物浓度范围内表现出线性(r2＞0.99)，测试浓度范围的加标回收率为76.22％-113.66％，相关精密度参数为7.52％-1.14％。通过测定小鼠(Mus musculus)血清样品中的类固醇，证明了该方法在高通量测量中的适用性，鲫鱼(Carassius auratus)、毛蛙(Rana catesbianaShaw)和黑腹蛙(R.nigromaculata)。因此，所开发的分析方法是一种有用且适用的血清学方法，用于检测和定量低容量样本中的微量类固醇激素水平。
实施例2：不同流动相对检测动物血清中多种内源性类固醇激素的影响
本实施例与实施例1的区别之处在于，所用的流动相A、流动相B不同；流动相的选择见表10。
表10不同流动相的选择
流动相A 流动相B
组1 0.1mM氟化铵 甲醇
组2 0.1mM甲酸 乙腈
组3 0.1mM甲酸 甲醇
组4 纯水 乙腈
组5 纯水 甲醇
组6 0.1mM氨 乙腈
组7 0.1MM氨 甲醇
组8 0.1mM碳酸氢铵 乙腈
组9 0.1mM碳酸氢铵 甲醇
采用本实施例中组4的流动相对动物血清中多种内源性类固醇激素进行检测，将检测结果与实施例1进行比对，验证了雌二醇(E2)和睾酮(T)在不同流动相下的MRM色谱图，MRM色谱图如图20所示。根据图20可知，本申请中选用流动相A：0.1mM的氟化铵；流动相B：乙腈；MRM色谱图数更准确。
采用本实施例中组1-9的流动相对动物血清中多种内源性类固醇激素进行检测，将检测结果与实施例1进行比对，验证了不同流动相对检测动物血清中多种内源性类固醇激素的影响，检测结果见附图21-38，根据附图21-38可知，本发明中在水相中加入0.1mM的氟化铵可以增强A2、E2、E1、17α-OHP、T、DHEA、P4、P5、DHT、A、E、11-DF、21-OHP、2-MeE2、21-DF、B和F的电离。当选择乙腈作为有机相时，在负离子检测模式下，水相中加入氟化铵可使待测类固醇激素的响应提高3.82倍，其中E1、E2、A和2-MeE2的响应分别提高1.78倍、2.21倍、1.87倍和1.52倍；然而，在正离子分析模式下，在水相中加入氟化铵可以使甾体激素的响应提高1.99倍，其中DHEA、P5、DHT、E、F、21-DF、B、T、17α-OHP、A2、21-OHP、P4和11-DF的响应分别提高3.27倍、1.32倍、2.96倍、2.13倍、2.01倍、2.28倍、1.64倍、1.62倍、1.35倍和1.99倍。
因此，对于本发明中涉及到的类固醇激素，选择乙腈-氟化铵(0.1mM)作为流动相都可以获得较好的电离效果。
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，其特征在于，所述样本预处理方法的步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本。
2.根据权利要求1所述的样本预处理方法，其特征在于，所述样本预处理方法的步骤如下：
(1)将待测血清样本与稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛混匀；
(2)加入甲基叔丁基醚进行萃取后离心，合并有机相，即可得到预处理后的待测血清样本。
3.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于，步骤如下：待测血清样本的加入量为100-120μL；稳定同位素内标溶液的加入量为5μL；甲醛的加入量为10-15μL；甲醛为体积浓度为2％的甲醛水溶液；甲基叔丁基醚的加入量为200-250μL。
4.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于：加入稳定同位素内标溶液后进行混合的时间为10-20分钟。
5.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于：加入甲基叔丁基醚后进行反应的时间为5-10分钟。
6.根据权利要求2所述的样本预处理方法，其特征在于：步骤(2)中还包括对合并的有机相进行吹干、用乙腈复溶、过滤，即可得到预处理后的待测血清样本。
7.一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，其特征在于，步骤如下：
按照权利要求1-6任一项所述样本预处理方法制备得到预处理后的待测血清样本；
将预处理后的待测血清样本采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，并采用稳定同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。
8.根据权利要求7中所述的一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相A：0.1mM的氟化铵；
流动相B：乙腈；
柱温：45℃；
进样量：1μL；
采用梯度洗脱程序进行洗脱。
9.根据权利要求8中所述的一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，其特征在于，液相色谱梯度洗脱程序如下：
时间(分钟) 流速(mL/min) A(％) B(％) 0 0.2 70 30 3.5 0.2 40 60 8 0.3 10 90 8.5 0.3 0 100 9 0.2 70 30 10 0.2 70 30
。
10.根据权利要求7中所述的一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，其特征在于，质谱检测条件如下：采用电喷雾电离ESI正离子模式、电喷雾电离ESI负离子和大气压化学电离APCI模式，毛细管电压为±1.5kV，去溶剂温度为550-600℃，去溶剂气体流量800L/h，锥形气体流量50-150L/h，MRM扫描模式。
CN202310632509.7A 2023-05-30 2023-05-30 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法 Pending CN116593615A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310632509.7A CN116593615A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310632509.7A CN116593615A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116593615A true CN116593615A (zh) 2023-08-15

Family

ID=87600623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310632509.7A Pending CN116593615A (zh) 2023-05-30 2023-05-30 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116593615A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ke et al. A sensitive, simple and robust LC–MS/MS method for the simultaneous quantification of seven androgen-and estrogen-related steroids in postmenopausal serum
Márta et al. Simultaneous determination of thirteen different steroid hormones using micro UHPLC-MS/MS with on-line SPE system
Suyagh et al. Development and validation of a dried blood spot—LC–APCI–MS assay for estimation of canrenone in paediatric samples
WO2022193697A1 (zh) 一种用于定量样品中目标分析物的天然同位素校准曲线法
Dury et al. Validated LC–MS/MS simultaneous assay of five sex steroid/neurosteroid-related sulfates in human serum
Mendu et al. Simultaneous determination of levetiracetam and its acid metabolite (ucb L057) in serum/plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry
CN114674961A (zh) 一种非衍生化同步检测血清中17种类固醇激素的试剂盒及其应用
CN111323507A (zh) 基于固相萃取法同时检测血清中11种类固醇的检测方法
CN112485341A (zh) 一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法
Chen et al. A novel UPLC/MS/MS method for rapid determination of metapristone in rat plasma, a new cancer metastasis chemopreventive agent derived from mifepristone (RU486)
US11536733B2 (en) Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS
CN112986433A (zh) 检测人血清样本中类固醇含量的方法
Ferreira et al. High sensitivity method validated to quantify estradiol in human plasma by LC–MS/MS
Wang et al. Ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for simultaneous determination of natural steroid hormones in sea lamprey (Petromyzon marinus) plasma and tissues
CN110927264A (zh) 一种血清中糖皮质激素的检测方法及试剂盒
CN113009036A (zh) 一种检测性激素的试剂盒、性激素样品前处理方法及同时检测多种性激素的方法
Li et al. Rapid quantitation of three synthetic cathinones in urine by magnetic dispersive solid-phase extraction combined with DART-HRMS
CN116593615A (zh) 一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法
Jeong et al. Simultaneous determination of β-agonists and monitoring in bovine tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Ke et al. Impact of sample extraction on the accurate measurement of progesterone in human serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry
Hong et al. Simultaneous determination of residual stilbenes and stilbene metabolites in animal tissue by liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Jia et al. Liquid chromatography–tandem mass spectrometry measurement of 26 steroid hormones in human serum and plasma samples
Liu et al. Quantification of estrogens in infant formulas by isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Vlase et al. New LC-MS/MS method for testosterone and dihydrotestosterone analysis in male rat plasma
Bianchi et al. Porcine follicular fluids: comparison of solid-phase extraction and matrix solid-phase dispersion for the GC–MS determination of hormones during follicular growth

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination