CN116593555A - 葡萄糖测定用电极和包含该电极的电化学传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种葡萄糖测定用电极和包含该电极的电化学传感器。一种电极，其具有：包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层；以及覆盖上述酶电极层的透过限制层，在上述酶电极层与上述透过限制层之间具有包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。

Description

葡萄糖测定用电极和包含该电极的电化学传感器
技术领域
本发明涉及用于葡萄糖测定的电极和包含该电极的电化学传感器(葡萄糖传感器)。
背景技术
在现有的使用电化学传感器的葡萄糖持续测定(Continuous GlucoseMonitoring)系统中，使用了具有基板、电极层、酶层、透过限制层的至少4层结构的酶电极。例如，在专利文献1中公开了一种电化学分析物传感器，其具备电极和分析物检测膜，分析物检测膜包含障碍层和酶层，该传感器包含配置在电极与障碍层之间或障碍层与酶层之间的亲水性聚合物层。
另外，专利文献2中公开了一种生物传感器，其特征在于，在由疏水性材料构成的电极表面成膜有包含酶或酶底物中的任一者的亲水性高分子膜，进而公开了表面由透过限制膜覆盖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/107941
专利文献2：日本特开2002-211508
发明内容
在使用葡萄糖传感器的血糖值监测中，正确且持续稳定地监测血糖值是很重要的。因此，在葡萄糖传感器中，要求进一步提高检测电流值相对于葡萄糖浓度的直线性，并且要求提高电极的稳定性，以便即使长时间测定检测电流值和直线性也不降低。
因此，本发明人对现有的具备具有酶电极层和覆盖酶电极层的透过限制层的电极的葡萄糖传感器进行了评价，结果发现，随着葡萄糖浓度的增加，响应电流值的直线性降低；进而，在长期测定中响应电流值逐渐降低。
因此，本发明的课题在于，改进现有的具有酶电极层和覆盖酶电极层的透过限制层的电极，提供一种葡萄糖浓度与响应电流值之间的直线性提高、并且能够稳定地持续测定的酶电极以及具备该酶电极的葡萄糖传感器。
本发明人为了解决上述课题进行了研究。
首先，本发明人研究了现有的具有酶电极层和覆盖酶电极层的透过限制层的电极中的响应电流值的直线性降低或稳定性降低的原因，提出了下述假说：由于透过限制层的聚合物的结构的不均匀性等，酶电极层的酶分子仅有一部分能够用于反应，这或许是响应电流值的直线性降低的原因。并且，在该假说下，为了改善基于透过限制层的不均匀性的问题而进行了反复试验，结果发现，通过在包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层与覆盖该酶电极层的透过限制层之间设置包含亲水性物质的葡萄糖扩散层，葡萄糖在该葡萄糖扩散层内均匀地扩散，能够将酶电极层内的全部酶分子用于反应，其结果，葡萄糖浓度与响应电流值之间的直线性提高。此外，还发现通过在酶电极层与透过限制层之间设置葡萄糖扩散层，可得到长时间稳定的响应电流值，发现该电极能够用于可正确且稳定地持续测定的葡萄糖传感器，由此完成了本发明。
需要说明的是，在专利文献1中，如上所述，公开了一种电化学分析物传感器，其具备电极和分析物检测膜，分析物检测膜包含障碍层和酶层，该传感器包含配置在电极与障碍层之间或障碍层与酶层之间的亲水性聚合物层；但仅公开了在电极侧设置亲水性聚合物层，未公开在透过限制膜侧设置亲水性聚合物层，没有使透过了透过限制膜的葡萄糖均匀地扩散到酶层中的构思，该传感器原本就是以障碍层的存在为前提的。
另外，在专利文献2中，如上所述，公开了一种生物传感器，其特征在于，在由疏水性材料构成的电极表面成膜有包含酶或酶底物中的任一者的亲水性高分子膜，进而公开了表面由透过限制膜覆盖；但若将酶和亲水性高分子混合在同一层，则存在电子传递受到阻碍、电流值降低的问题。
根据本发明的一个方式，提供一种电极，其具有：包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层；以及覆盖上述酶电极层的透过限制层，在上述酶电极层与上述透过限制层之间具有包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。
此处，在电极的一个方式中，上述酶电极层是由作为上述电极材料的金属或碳的层与载置于上述金属或碳的层上的上述葡萄糖氧化还原酶形成的层结构。
另外，在电极的另一方式中，上述酶电极层为包含作为上述电极材料的导电性物质与上述葡萄糖氧化还原酶的混合物的层。
根据本发明的另一方式，提供一种葡萄糖传感器，其包含上述电极。
根据本发明的另一方式，提供一种电极的制造方法，其包括：形成包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层的工序；在上述酶电极层上层积包含亲水性物质的葡萄糖扩散层的工序；和在上述葡萄糖扩散层上层积透过限制层的工序。
发明的效果
在本发明的电极中，通过在透过限制层与酶电极层之间设置包含亲水性物质的葡萄糖扩散层，能够使通过了透过限制层的葡萄糖均匀地扩散，葡萄糖被均匀地供给到酶电极层的全部酶分子，因此响应电流值相对于葡萄糖浓度的直线性提高。另外，在本发明的电极中，通过在透过限制层与酶电极层之间设置包含亲水性物质的葡萄糖扩散层，能够长时间维持高响应电流值。因此，本发明的电极能够制作不需要复杂的校正、可正确且长时间持续测定的葡萄糖传感器。
附图说明
图1是示出本发明的电极的一个方式的示意图。
图2是示出包含本发明的葡萄糖传感器的葡萄糖测定系统的一个方式(葡萄糖持续测定装置A)的图。
图3是示出使用了包含实施例1和比较例1的电极的葡萄糖传感器的葡萄糖响应电流值绘图的结果的图。
图4是示出使用了包含实施例1和比较例1的电极的葡萄糖传感器的葡萄糖响应电流值的经时变化的图。
图5是示出使用了包含实施例1～4的电极的葡萄糖传感器的葡萄糖响应电流值绘图的结果的图。
图6是示出使用了包含实施例5和比较例1的电极的葡萄糖传感器的葡萄糖响应电流值绘图的结果的图。
具体实施方式
<电极>
本发明的电极的特征在于，其具有：
包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层；以及
覆盖上述酶电极层的透过限制层，
在上述酶电极层与上述透过限制层之间具有包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。
<电极材料>
作为电极材料，可以举出金属材料、碳材料。作为金属材料，可以举出例如金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)和钯(Pd)等。作为碳材料，可以举出例如碳，作为碳，可以举出例如石墨、碳纳米管、石墨烯、介孔碳等。
<葡萄糖氧化还原酶>
葡萄糖氧化还原酶只要是能够将作为测定对象物质的葡萄糖氧化还原的酶即可，可以举出葡萄糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化还原酶优选包含吡咯并喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少一者作为催化亚基或催化结构域。例如，作为包含PQQ的葡萄糖氧化还原酶，可以举出PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)，作为包含FAD的氧化还原酶，可以举出具有包含FAD的α亚基的细胞色素葡萄糖脱氢酶(CyGDH)、葡萄糖氧化酶(GOD)。
另外，葡萄糖氧化还原酶可以包含电子传递亚基或电子传递结构域。作为电子传递亚基，可以举出例如具有具备电子转移功能的血红素的亚基。作为包含该具有血红素的亚基的氧化还原酶，可以举出例如包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶、PQQGDH与细胞色素的融合蛋白(国际公开WO2005/030807号)。
<酶电极层>
酶电极层包含上述的电极材料和葡萄糖氧化还原酶。
酶电极层可以包含其他任意成分以有效地进行葡萄糖氧化还原反应。作为其他任意成分，可以举出选自导电性物质、交联剂、糖等中的1种以上的成分。
作为导电性物质，可以举出导电性高分子、导电性颗粒。
作为导电性高分子，优选水溶性的物质，可以举出例如聚乙炔、聚对苯撑、聚苯胺、聚噻吩、聚对亚苯基亚乙烯基、聚吡咯、多并苯、石墨烯、聚乙烯二氧噻吩等。
作为导电性颗粒，可以举出金属制颗粒或以碳为材料的高级结构体。
金属制颗粒可以举出例如金、银、铜、镍、钒、铂、钯、铁、铝、钛、锌、锡、钨、铬等。以碳为材料的高级结构体可以包括例如导电性炭黑、碳纳米管(CNT)、富勒烯之类的碳颗粒或碳微粒。作为导电性炭黑，可以举出例如油炉法炭黑、科琴黑、Black Pearl、乙炔黑等。
酶电极层还可以包含交联剂。关于交联剂的种类，只要能够使酶、导电性物质交联即可，没有特别限定，例如可以是包含醛基、马来酰亚胺基、碳二亚胺基、噁唑啉基、环氧基中的至少一个官能团的化合物。另外，交联剂的形态也没有限定，可以为单体、聚合物中的任一种形态。
酶电极层还可以包含糖。关于糖的种类，只要能够使葡萄糖氧化还原酶稳定化即可，没有特别限定，可以举出例如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、乳糖、麦芽三糖、棉籽糖等。
根据本发明的电极的一个方式，酶电极层是包括作为上述电极材料的金属或碳的层与载置于上述金属或碳的层上的包含上述葡萄糖氧化还原酶的层的层结构。
例如，通过在基板上形成金属或碳(电极材料)的层，并在该金属或碳的层上形成包含葡萄糖氧化还原酶的层(也称为酶层或试剂层)，能够形成酶电极层。
根据本发明的电极的另一方式，酶电极层为包含作为上述电极材料的导电性物质与上述葡萄糖氧化还原酶的混合物的层。
例如，通过将包含葡萄糖氧化还原酶、导电性物质和碳(电极材料)的试剂混合并涂布到基板上，能够形成酶电极层。
<基板>
电极优选设置在基板上。作为基板，可以使用电化学传感器中通常使用的基板，可以举出由热塑性树脂、各种树脂(塑料)或绝缘性材料形成的基板。作为热塑性树脂，可以举出例如聚醚酰亚胺(PEI)、聚醚醚酮(PEEK)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)等。作为各种树脂(塑料)，可以举出例如聚酰亚胺树脂、环氧树脂等。作为绝缘性材料，可以举出例如玻璃、陶瓷、纸等。其中，优选由绝缘性材料形成的基板。
<透过限制层>
透过限制层覆盖酶电极层。透过限制层是出于下述目的而设置的：为了防止传感器灵敏度立即饱和、即灵敏度饱和至达到传感器能够检测的葡萄糖浓度的上限；为了限制葡萄糖向葡萄糖扩散层和酶电极层的透过，调整到达葡萄糖扩散层和酶电极层的葡萄糖的量。
透过限制层由能够在限制葡萄糖的同时使其透过的材料、优选由不溶性的材料形成，例如，由包含亲水性基团的聚合物或多孔材料形成。
具体而言，可以举出乙烯与四氟乙烯的聚合物(Poly(ethylene-co-tetrafluoroethylene))、聚烯烃、聚酯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚四氟乙烯的均聚物、共聚物及三元共聚物、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醚醚酮、聚氨酯、纤维素聚合物、聚砜、硅系聚合物(聚硅氧烷)、醋酸纤维素、HEMA(甲基丙烯酸羟乙酯)和包含它们的共聚物、聚乙烯吡啶等。
其中，优选选自纤维素聚合物、聚氨酯和聚乙烯吡啶中的1种以上的材料。
关于透过限制层的厚度，只要是能够在限制葡萄糖的同时使其透过的厚度即可，例如，优选为1μm以上100μm以下、更优选为5μm以上50μm以下。
<葡萄糖扩散层>
葡萄糖扩散层存在于透过限制层与酶电极层之间，以使通过了透过限制层的葡萄糖扩散并被均匀地供给至酶电极层。葡萄糖扩散层包含亲水性物质。通过使葡萄糖扩散层包含亲水性物质，与透过限制层相比，葡萄糖扩散的能力优异。
由于通过透过限制层的葡萄糖是不均匀的，因此在以往的仅利用了透过限制层的电极的情况下，电极表面中葡萄糖到达的区域有限，由此引起仅有酶电极的一部分酶能够用于反应的现象，认为这会导致响应电流值相对于葡萄糖浓度的直线性的降低。
例如，在使用聚氨酯等聚合物作为透过限制层的情况下，聚氨酯等聚合物不规则地包含亲水性部分和疏水性部分，认为葡萄糖会从聚合物中的亲水性高的部分通过。在酶层上直接形成使用该聚合物的透过限制层的情况下，葡萄糖仅从聚合物的亲水性高的部分通过，葡萄糖不扩散到整个酶电极层，只能与酶电极层内的一部分酶反应。
与此相对，本发明的电极通过在透过限制层与酶电极层之间含有包含亲水性物质的葡萄糖扩散层，使通过了透过限制层的葡萄糖在葡萄糖扩散层内均匀化，其结果，能够使葡萄糖均等地到达整个酶电极层，能够提高响应电流值相对于葡萄糖浓度的直线性。
为了发挥这样的效果，葡萄糖扩散层优选设置成覆盖酶电极层的整个表面。
作为亲水性物质，只要是能够使葡萄糖扩散的物质就没有特别限制，可以举出例如亲水性高分子或其他亲水性物质。作为亲水性高分子，可以举出例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚-N-乙烯基-3-乙基-2-吡咯烷酮、聚-N-乙烯基-4,5-二甲基-2-吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚-N,N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、具有悬垂(pendant)离子性基团的聚合物、以及它们的共聚物或混配物等。作为其他亲水性物质，可以举出例如海藻酸钠、丙烯酸甲酯、壳聚糖、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、丙烯酸钠等亲水性高分子以外的亲水性物质。
其中，优选选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和海藻酸钠中的1种以上。
葡萄糖扩散层内的亲水性物质优选进行了交联处理，以使其不被样本(试样)液溶解。
交联处理例如可以通过交联剂进行。
关于交联剂的种类，只要是能够使亲水性物质交联而不溶解于样本液的物质即可，没有特别限制，根据亲水性物质的种类适当选择，可以举出例如具有噁唑啉基的交联剂、具有环氧基的交联剂、具有碳二亚胺基的交联剂等能够将羧基作为交联靶标的交联剂。
例如，在酶电极层上涂布混合有交联剂和亲水性物质的水溶液后，通过加热或UV照射等使交联反应进行，由此能够在酶电极层上形成包含经交联处理的亲水性物质的葡萄糖扩散层。
葡萄糖扩散层中的亲水性物质的量只要是足以使葡萄糖充分扩散的量即可，例如，优选为1.19μg/cm2以上1.19g/cm2以下、更优选为6μg/cm2以上119mg/cm2以下、进一步优选为11.9μg/cm2以上11.9mg/cm2以下。
葡萄糖扩散层的厚度只要是足以使葡萄糖在层内充分扩散的厚度即可，例如，优选为10nm以上10mm以下、更优选为50nm以上1mm以下、进一步优选为100nm以上100μm以下。
<电极的示例>
参照图1对本发明的一个方式的电极进行说明。
在基板(1)上设有由金属或碳等电极材料构成的电极层(2)，在电极层(2)上设有包含葡萄糖氧化还原酶的酶层(3)。
并且，设有覆盖酶层(3)的葡萄糖扩散层(4)，设有覆盖葡萄糖扩散层(4)的透过限制层(5)。此处，酶层(3)除了包含葡萄糖氧化还原酶以外，还可以包含上述的导电性物质、交联剂、糖等。
葡萄糖扩散层(4)优选设置成覆盖整个酶层(3)，也可以仅设置在酶层(3)上。
需要说明的是，在酶与电极材料混合而在基材上形成有酶电极层的情况下，代替电极层(2)和酶层(3)而形成包含酶和电极材料的一层酶电极层，在其上形成葡萄糖扩散层，进而形成透过限制层。该情况下，酶电极层除了包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶以外，还可以包含上述的导电性物质、交联剂、糖等。另外，葡萄糖扩散层(4)优选设置成覆盖整个酶电极层，也可以仅设置在酶电极层上。
当在透过限制层(5)上添加包含葡萄糖的液体试样时，葡萄糖从透过限制层(5)中透过，到达葡萄糖扩散层(4)。在葡萄糖扩散层(4)内，由于亲水性物质的存在，葡萄糖被均匀地扩散，均等地到达酶层(3)内的全部葡萄糖氧化还原酶分子，发生氧化(还原)反应。该反应中产生的电子移动到电极层(2)，通过对电极施加电压，流过正确反映液体试样中的葡萄糖浓度的电流。在葡萄糖氧化还原酶与电极材料被混合而形成了1个酶电极层的情况下，在葡萄糖扩散层(4)内由于亲水性物质的存在而被均匀扩散的葡萄糖均等地到达酶电极层内的葡萄糖氧化还原酶分子，发生氧化(还原)反应。并且，该反应中产生的电子移动到酶电极层内的电极材料，通过对电极施加电压，流过正确反映液体试样中的葡萄糖浓度的电流。
<电极的制作方法的示例>
上述电极例如如下制作。即，在绝缘性基板的单面上形成作为电极材料的金属或碳等的层。例如，在规定厚度(例如100μm左右)的膜状的绝缘性基板的单面上丝网印刷碳墨，能够形成具有所期望的厚度(例如10μm左右)的碳膜。代替碳层，也可以通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此形成具有所期望的厚度(例如30nm左右)的金属层。
接着，在电极上形成酶层。例如，制备包含氧化还原酶和导电性物质的溶液，将该溶液滴加到电极的表面。通过使该溶液在电极上干燥而固化，在电极上形成酶层。
接着，在酶层上形成包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。例如，通过在酶层上涂布亲水性物质的溶液并使其干燥，能够在酶层上形成包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。或者，可以使用亲水性物质的溶液，通过旋涂、浸涂或滴涂等形成包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。在葡萄糖扩散层中，优选对亲水性物质进行交联处理。
然后，在葡萄糖扩散层上形成透过限制层。例如，通过在葡萄糖扩散层上涂布纤维素聚合物、聚氨酯、聚乙烯吡啶等溶液并使其干燥，能够在葡萄糖扩散层上形成透过限制层。或者，可以使用纤维素聚合物、聚氨酯、聚乙烯吡啶等溶液，通过旋涂、浸涂或滴涂等形成透过限制层。
<葡萄糖传感器>
本发明的电极能够作为葡萄糖传感器的工作电极使用。即，本发明的葡萄糖传感器包含本发明的电极，优选进一步包含成为对电极的电极。作为对电极，只要是通常能够用作葡萄糖传感器的对电极的电极即可，例如可以使用银/氯化银电极或碳电极。关于对电极，也可以通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)、化学蒸镀(CVD)或丝网印刷在基板上形成对电极。葡萄糖传感器也可以是进一步包括参比电极的三电极系统。
葡萄糖传感器可以通过在基板上形成成为工作电极的本发明的电极和成为对电极的银/氯化银电极或碳电极来制作。
包含本发明的电极的葡萄糖传感器可以是体内埋入型的传感器，也可以是间歇式的传感器，还可以是用时测定用的传感器。
优选的是作为葡萄糖持续测定用传感器的、设置于皮下等的体内埋入型的传感器。
通过使用本发明的葡萄糖传感器，能够测定试样中包含的葡萄糖浓度。试样只要是包含葡萄糖的试样就没有特别限制，可以举出例如生物体试样。作为生物体试样，可以举出例如血液、间质液、血浆、淋巴液、脑脊液、尿、汗、唾液等，优选血液、间质液、血浆。
<葡萄糖的测定方法>
本发明的葡萄糖测定方法包括：
使包含葡萄糖的试样与葡萄糖传感器接触的步骤；
对葡萄糖传感器的电极施加电压，测定通过利用葡萄糖氧化还原酶的葡萄糖的氧化还原反应而流动的电流值的步骤；
基于该电流值计算出葡萄糖浓度的步骤。
使包含葡萄糖的试样与葡萄糖传感器接触的步骤可以通过使试样与葡萄糖传感器的电极的透过限制层上接触而进行。在体内埋入型传感器的情况下，也包括将传感器埋入体内、使血液或间质液等试样处于与葡萄糖传感器的电极的透过限制层接触的状态的方式。
通过使包含葡萄糖的试样与葡萄糖传感器的透过限制层上接触，试样中的葡萄糖通过透过限制层，在扩散层中被扩散，均匀地到达酶电极层。
通过葡萄糖氧化还原酶，发生葡萄糖的氧化反应，电子被传递到电极，通过对电极施加电位，在电极间流过与葡萄糖的量对应的电流。由于电流值取决于试样中的葡萄糖的浓度，因此可以基于所测定的电流值来计算出试样中的葡萄糖浓度。
施加到电极的电压例如相对于作为参比电极的银·氯化银电极优选为0mV～800mV、更优选为40mV～200mV。
<葡萄糖测定系统>
本发明的一个方式的葡萄糖测定系统至少包括：包含本发明的电极的葡萄糖传感器；对葡萄糖传感器的电极施加电压的电源；检测响应电流的检测部；和由响应电流值计算出葡萄糖浓度的运算部。
参照图2对包含本发明的葡萄糖传感器的葡萄糖测定系统的一个方式(葡萄糖持续测定装置A)进行说明。
如图2所示，电路基板10包括通信部11、电源12、控制部13、运算部14、存储部15和连接部16而构成。
连接部16与传感器部17的本发明的电极、即酶电极层电连接，用于对传感器部17施加电压而得到响应电流。传感器部17相当于本发明的葡萄糖传感器。
通信部11在葡萄糖持续测定装置A与外部的信息处理装置之间进行数据通信。通信部11至少具备发送部，根据需要包括接收部而构成。数据通信的手段例如可以使用红外线通信或蓝牙(注册商标)等无线通信手段。另外，也可以构成为通过有线进行数据通信，该情况下，通过在葡萄糖持续测定装置A的通信部11设置电缆连接部，并用电缆与外部的信息处理装置等连接来进行数据通信。
需要说明的是，作为外部的信息处理装置，可以举出例如向人体给药胰岛素的胰岛素供给装置、简易血糖值测定装置、手表型显示装置、个人计算机等。
电源12是用于向电路基板10和传感器部17供给电力的直流电源，例如可以使用1～3V的电力供给电压的电池。
控制部13进行葡萄糖持续测定装置A整体的控制。例如，控制电压施加的时机、响应电流的采样、葡萄糖浓度的运算处理、与外部的信息处理装置的通信等。
运算部14例如执行包括葡萄糖浓度的运算在内的葡萄糖持续测定装置A中的处理中所需的各种运算。
在存储部15中存储有用于执行后述的检查模式处理例程的程序等由控制部13执行的各种程序、在运算部14的运算中使用的校正曲线、订正数据、施加电压模式等数据。另外，在存储部15中存储由传感器部17检测出的响应电流以及由运算部14运算出的葡萄糖浓度的数据。
需要说明的是，控制部13、运算部14和存储部15由安装在电路基板10上的CPU或MPU、ROM和RAM等电子部件构成。
实施例
以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例的方式。
<电极的制造例：实施例1>
在由聚醚醚酮构成的基板上溅射金属(金)，形成金属层，通过蚀刻除去一部分金属，由此形成电极图案。
在电极(金属层)上涂布12nL下述试剂(按照达到各自终浓度的方式溶解于水中)，干燥、加热，由此形成酶层(试剂层)。
接着，将电极的包含酶层的部分浸渍到包含交联剂的6w/w％聚乙烯醇水溶液中，由此用聚乙烯醇被覆酶层，在酶层上形成葡萄糖扩散层，进而干燥、加热，由此进行葡萄糖扩散层的交联处理。
接着，将电极的包含被葡萄糖扩散层被覆的酶层的部分浸渍到聚氨酯的二甲基甲酰胺溶液中，用聚氨酯被覆葡萄糖扩散层，在葡萄糖扩散层上形成透过限制层，制造电极。
<电极的制造例：比较例1>
除了不设置包含聚乙烯醇的葡萄糖扩散层以外，与实施例1同样地制作电极。
<电极的评价：实施例1、比较例1>
使用如上所述得到的实施例1和比较例1的电极，将包含葡萄糖的磷酸缓冲生理盐水作为样本添加到透过限制层上后，对Ag/AgCl的参比电极施加150mV的电压，使用电化学测定装置测定流过电极的电流值。葡萄糖浓度以70mg/dl开始测定，约20小时后将葡萄糖浓度设为180mg/dl，再1小时后将葡萄糖浓度设为500mg/dl。之后持续测定14天。
将该评价中的葡萄糖浓度70、180、500mg/dl时的响应电流值绘图示于图3，将测定14天时的响应值的经时变化示于图4。
由图3可知，在实施例1中确认到响应电流值直线上升至葡萄糖的高浓度侧。另一方面，在比较例1中确认到在葡萄糖浓度180mg/dl的时刻响应值未直线上升。
另外，由图4可知，在实施例1中，在14天的测定中响应电流值相对于测定开始1天后的响应值减少了10％左右，而在比较例1中减少了90％左右。
<葡萄糖扩散层中的聚乙烯醇的浓度的研究>
将聚乙烯醇溶液的浓度设为约4w/w％，形成葡萄糖扩散层，除此之外，与实施例1同样地制作电极(实施例2)。
将聚乙烯醇溶液的浓度设为约8w/w％，形成葡萄糖扩散层，除此之外，与实施例1同样地制作电极(实施例3)。
将聚乙烯醇溶液的浓度设为约10w/w％，形成葡萄糖扩散层，除此之外，与实施例1同样地制作电极(实施例4)。
对于实施例1和实施例2、3、4的电极，将包含葡萄糖的磷酸缓冲生理盐水作为样本添加到各自的透过限制层上后，对Ag/AgCl的参比电极施加150mV的电压，使用电化学测定装置测定流过电极的电流值。葡萄糖浓度以70mg/dl开始测定，约20小时后将葡萄糖浓度设为180mg/dl，再1小时后将葡萄糖浓度设为500mg/dl。之后持续测定14天。
将该评价中的葡萄糖浓度70、180、500mg/dl时的响应值绘图示于图5。
由图5可知，确认到随着所使用的聚乙烯醇的浓度升高，相对于葡萄糖的响应电流值也提高。推测这是因为，由于葡萄糖扩散层的厚度增加，葡萄糖的扩散增强。
<使用海藻酸钠作为葡萄糖扩散层的实施例>
使用6w/w％海藻酸钠代替聚乙烯醇作为葡萄糖扩散层，利用氯化钙进行交联，除此以外与实施例1同样地制作电极(实施例5)。
对于实施例5和比较例1的电极，将包含葡萄糖的磷酸缓冲生理盐水作为样本添加到各自的透过限制层上后，对Ag/AgCl的参比电极施加150mV的电压，使用电化学测定装置测定电极的电流值。葡萄糖浓度以70mg/dl开始测定，之后葡萄糖浓度设为180mg/dl，进而葡萄糖浓度设为500mg/dl。
将该评价中的葡萄糖浓度70、180、500mg/dl时的电流值绘图示于图6。
由图6可知，确认到通过使用海藻酸钠，与比较例1相比，相对于葡萄糖的响应电流值提高，可知海藻酸钠也能够用作葡萄糖扩散层。
符号说明
1···基板、2···电极层、3···酶层、4···葡萄糖扩散层、5···透过限制层
A···葡萄糖持续测定装置、10···电路基板、11···通信部、12···电源、13···控制部、14···运算部、15···存储部、16···连接部、17···传感器部。

Claims (15)

1.一种电极，其具有：
包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层；以及
覆盖所述酶电极层的透过限制层，
在所述酶电极层与所述透过限制层之间具有包含亲水性物质的葡萄糖扩散层。
2.如权利要求1所述的电极，其中，所述酶电极层是由作为所述电极材料的金属或碳的层与载置于所述金属或碳的层上的所述葡萄糖氧化还原酶形成的层结构。
3.如权利要求1所述的电极，其中，所述酶电极层为包含作为所述电极材料的导电性物质与所述葡萄糖氧化还原酶的混合物的层。
4.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述葡萄糖氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
5.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述亲水性物质为亲水性高分子。
6.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述亲水性物质为选自由聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和海藻酸钠组成的组中的1种以上的物质。
7.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述亲水性物质进行了交联处理。
8.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，葡萄糖扩散层中的所述亲水性物质的量为1.19μg/cm2以上1.19g/cm2以下。
9.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述葡萄糖扩散层的厚度为10nm以上10mm以下。
10.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述葡萄糖扩散层设置成覆盖酶电极层的整个表面。
11.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述葡萄糖扩散层仅设置于所述酶电极层上。
12.如权利要求1～3中任一项所述的电极，其中，所述透过限制层包含选自由纤维素聚合物、聚氨酯和聚乙烯吡啶组成的组中的1种以上的材料。
13.一种葡萄糖传感器，其包含权利要求1～3中任一项所述的电极。
14.如权利要求13所述的葡萄糖传感器，其用于葡萄糖持续测定。
15.一种电极的制造方法，其包括：
形成包含电极材料和葡萄糖氧化还原酶的酶电极层的工序；
在酶电极层上层积包含亲水性物质的葡萄糖扩散层的工序；和
在所述葡萄糖扩散层上层积透过限制层的工序。
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