CN116570684A - 一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，属于含有机有效物质的医药配制品技术领域。将纤维素酶置于玫瑰石斛粉末中，于40～60℃酶解处理1～3h后，升温使酶失活；取处理后的试样加入乙醇溶液，超声、热回流提取后，减压抽滤，收集滤液，加水混悬至无醇味；调节pH至9～10，以二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，旋蒸，冷冻干燥，得到提取物，即为玫瑰石斛总生物碱。将本申请应用于抗炎制剂或制备抗炎制剂，具有提取率高、纯度高、产物单一、抗炎活性高等优点。
Description
技术领域
本申请涉及一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，属于含有机有效物质的医药配制品技术领域。
背景技术
地塞米松是现在临床使用的较多的抗炎药物，但地塞米松属于合成药，属于皮质激素类药物，存在较多不良反应，长期使用不利用人体健康。
玫瑰石斛是一种可供人类食用的、具有滋阴润燥化痰止咳的中药材，其在收取之后可以直接食用，也可以晒干之后服用，食用功效与药用价值都特别出色。但做作为日常保健使用，功效利用率和药效反馈极慢，且使用不便。目前有关玫瑰石斛提取物的研究，虽然也有涉及到抗炎和抗癌（CN107926707A、CN108157176A、CN102188621A、CN11292469A、CN111358788A）等方面。但当将所获得的提取物用于临床时，存在以下两方面的问题：
（1）提取物成分驳杂，虽然相对直接服用成分具有了一定的针对性，但仍旧包含有大量的品类繁多的物质，而哪种物质可以起到什么样的效果，目前的研究中并未有见报道，在应用中仍然是以整体入药为主，利用率低。
（2）提取纯度较低，以有机溶剂、醇水等提取为例，其得率基本保持在1%以下，实用性不佳。
上述缺陷导致玫瑰石斛的整体利用率偏低，实际应用意义不大。
发明内容
有鉴于此，本申请首先提供了一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，该应用过程中的玫瑰石斛提取物不仅可实现提取率20%以上的提升率，且提取物也可以锁定为一类化合物，在用于抗炎制剂制备或抗炎制剂直接使用时，赋予其优较地塞米松更好的抗炎活性。
具体地，本申请是通过以下方案实现的：
一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，所述玫瑰石斛提取物的制备过程包括以下步骤：
（1）预处理：将纤维素酶置于玫瑰石斛粉末中，于40～60 ℃酶解处理1～3h后，升温使酶失活；
（2）提取：取步骤（1）处理后的试样加入乙醇溶液，超声、热回流提取后，减压抽滤，收集滤液，加水混悬至无醇味；
（3）萃取：调节pH至9～10，以二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，旋蒸，冷冻干燥，得到提取物，即为玫瑰石斛总生物碱。
上述应用过程中，以纤维素酶酶解进行预处理，提高了提取率，再配合二氯甲烷萃取得到高纯化率，所得产物仅为总生物碱这一类化合物，而非包含各种成分的复杂体系，有效物质的获取具有高提取率和高纯化率，可以实现玫瑰石斛的针对、有效应用，将其作为抗炎制剂使用，其抗炎活性较地塞米松更好。
进一步的，作为优选：
步骤（1）中，纤维素酶添加量为玫瑰石斛粉末质量比的0.2～1.0 %。
步骤（1）中，失活温度为80～100℃。
步骤（2）中，先以体积浓度90～95%的乙醇溶液处理试样，得到滤饼和第一次滤液，再以体积浓度为70～75%的乙醇溶液处理滤饼，得到第二次滤液，两次滤液合并，进入步骤（3）的处理环节。
步骤（2）中，超声处理时长为2～8h，热回流处理时长为2～8h。
步骤（2）中，乙醇添加比为8～10ml/g玫瑰石斛粉末。
步骤（1）中酶解温度为50 ℃，失活温度为90 ℃，纤维素酶添加量为玫瑰石斛粉末质量的0.5 %；步骤（2）中，超声处理时长为2～4 h，热回流处理时长为2～4 h；步骤（3）中，二氯甲烷相对玫瑰石斛粉末的添加料液比1:25 g/ml。
步骤（3）中，滤液调节pH时，先采用盐酸溶液调节至2～3，抽滤，滤液pH再调节至9～10。
同时，申请人还提供了上述方案的替换方案，所述玫瑰石斛提取物的制备过程包括以下步骤：
（1）预处理：将玫瑰石斛粉末置于石油醚中，石油醚的添加量为1:3～5ml/g玫瑰石斛粉末，超声处理1～3h后，减压抽滤；
（2）提取：取步骤（1）处理后的试样加入乙醇溶液，超声、热回流提取后，减压抽滤，收集滤液，加水混悬至无醇味；
（3）萃取：调节pH至9～10，以二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，旋蒸，冷冻干燥，得到提取物，即为玫瑰石斛总生物碱。
该方案以石油醚配合超声氛围作为萃取的前处理，同样可以实现玫瑰石斛的高纯度、高针对性提取。
上述玫瑰石斛提取物即玫瑰石斛总生物碱用于抗炎制剂的制备时，其提取物的抗炎活性较地塞米松好，炎症因子的上调是导致炎症的主要原因之一，参与炎症反应的主要炎症因子有IL-β、TNF-α、IL-6等，玫瑰石斛总生物碱对IL-β、TNF-α有很好的抑制效果，能达到抗炎的作用，地塞米松是激素类抗炎，存在很多缺陷，而本案作为植物提取试剂，安全性好。
附图说明
图1为本申请中玫瑰石斛总生物碱细胞毒性对照表；
图2为LPS诱导3h细胞炎症因子IL-1β表达量（*P＜0.05，***P＜0.001）；
图3为LPS诱导12h细胞炎症因子IL-1β表达量（*P＜0.05，***P＜0.001）；
图4为LPS诱导3h细胞炎症因子TNF-α表达量（*P＜0.05，***P＜0.001）；
图5为LPS诱导12h细胞炎症因子TNF-α表达量（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。
具体实施方式
本实施例中，主要测定方法如下：
1.玫瑰石斛总生物碱含量测定方法
本申请中，总生物碱含量采用分光光度法测定，具体过程如下：
（1）标准溶液制备：称取石斛碱标准品2.04 mg，氯仿溶解并定容至100 mL，作为标准溶液。
（2）标准曲线制备：吸取石斛碱标准品溶液3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 ml.分别置于分液漏斗中，加氯仿至10.0 mL，再加入pH值4.5的缓冲溶液5.0 mL和0.04 %的溴甲酚绿溶液1.0 mL后剧烈振摇3 min，静置30 min，取下层溶液6.0 mL，加0.01 mol/L的NaOH无水乙醇溶液1.0 mL，摇匀。依同法以氯仿制备空白对照。于波长620 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
（3）样品溶液制备称取供试品1 mg，加氯仿溶解于10 mL容量瓶中并定容至刻度,再从中吸取2.5 ml置于25 mL容量瓶中以氯仿定容，摇匀作为样品液。
（4）精密量取样品液10 ml于分液漏斗，加入pH4.5缓冲溶液5.0 mL和 0.04 %溴甲酚绿溶液1 mL，摇晃3 min使充分混合，静置分层后，取下层溶液6.0mL于离心管中，加0.01moL/L的氢氧化钠无水乙醇溶液1.0 mL，摇匀，于波长620nm处测吸收度。
其中，上述过程中用到的溶液配制过程如下：
① pH 4.5缓冲液的配制：称取4.084 g 邻苯二甲酸氢钾，加蒸馏水溶解，定容至100 mL，再用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为4.5，即得。
② 0.04 %溴甲酚绿溶液的配制：称取溴甲酚绿20 mg，用pH值为4.5的缓冲液溶解，定容至50 mL，过滤，即得。
③ 0.01mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液的配制：称取氢氧化钠20 mg，用无水乙醇溶液溶解，定容至50 mL，即得。
④ 0.2 mol/L氢氧化钠溶液的配制：称取氢氧化钠80 mg，用蒸馏水溶解，定容至100 ml，即得。
2.酶标仪检测
按照上述方法配制溶液和样品溶液，取100 μl溶液加入酶标板，在波长620 nm下检测，即可。
3.细胞毒性实验
（1）计算：细胞活力=（实验组吸光度-对照组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）×100%。其中，空白组为添加无细胞的细胞培养液，对照组为添加含细胞不含提取物的细胞培养液，实验组为添加一定浓度梯度提取物的细胞培养液。
（2）方式：将正处于对数生长期的细胞按传代步骤操作，最后配成100 μL（细胞密度为1×105/mL）的细胞悬液加入到96孔培养板的每个孔中，96孔板四周加入100 μL的PBS，空白对照为无细胞的细胞培养液，细胞培养至贴壁后吸弃培养液， 加入配置好的含玫瑰石斛总生物碱提取物的培养液100 μL，终浓度为 0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、80、100 μg/mL，每剂量组设 5 个复孔，每组重复 3 次。空白组加 100 μL 培养液。于培养箱中继续培养 24 h 后加入 10 μL CCK-8 试剂，继续在培养箱中孵育2 h。于 450 nm 处测定玫瑰石斛总生物碱提取物处理后的 RAW 264.7 细胞吸光度值（OD）。计算各组对 RAW 264.7 细胞增殖的影响。
4.抗炎性能
抗炎性能主要测试玫瑰石斛总生物碱提取物对炎症模型促炎症因子分泌功能的影响。
阳性对照组为：地塞米松和槲皮素。
将正在对数生长期的RAW 264.7细胞，按1×106个/孔接种于6孔培养板中，每孔2mL。放入CO2培养箱培养，贴壁6 h后更换为配置好的含玫瑰石斛总生物碱提取物的培养液，使培养液中浓度为20 μg/ml，加药分别孵育3 h和12 h后，加入LPS（脂多糖）诱导，使终浓度为1 μg/ml，每组设2个复孔，重复3次。阳性对照组采用地塞米松与槲皮素，地塞米松终浓度为20 μg/ml，槲皮素终浓度为200 μg/ml，其余操作同加药组。完全对照组加入含1×106个细胞的2 mL培养液。培养24 h后，按照RNA提取试剂盒操作，提取细胞中的RNA，测定RNA含量；按照PCR试剂盒的操作步骤，检测炎症因子TNF-α、IL-1β含量，内参基因选择为GAPDH，重复实验3次。
实施例1
本实施例一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，所述玫瑰石斛提取物为玫瑰石斛总生物碱，其获取的具体过程如下：
1. 取干燥的玫瑰石斛茎，打成粉末，取50 g玫瑰石斛粉末，加入适量的蒸馏水，置于50 ℃水浴锅中恒温加热，加入0.25 g纤维素酶（0.5 %玫瑰石斛粉末质量），搅拌均匀，酶解1.5 h后，升温至90 ℃失活。
2. 取上述酶解过后的粉末，加入500 mL95%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复三次。
3. 收集滤饼，加入500 mL70%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复两次。
4. 合并滤液，加水混悬，利用旋转蒸发仪旋蒸至无醇味。
5. 加5 %盐酸溶液，调节pH约为2，抽滤，收集滤液。
6. 滤液加氨水调节pH约为9，用二氯甲烷萃取，回收有机溶剂层，旋蒸至50 mL左右，冷冻干燥，得到玫瑰石斛总生物碱。
实施例2
本实施例一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，所述玫瑰石斛提取物为玫瑰石斛总生物碱，其获取的具体过程如下：
1. 取干燥的玫瑰石斛茎，打成粉末，取50 g玫瑰石斛粉末，用300 mL石油醚超声2h，减压抽滤。
2. 收集抽滤之后的粉末，加入500 mL95%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复三次。
3. 收集滤饼，加入500 mL70%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复两次。
4. 合并滤液，加水混悬，利用旋转蒸发仪旋蒸至无醇味。
5. 加5 %盐酸溶液，调节pH约为2，抽滤，收集滤液。
6. 滤液加氨水调节pH约为9，用二氯甲烷萃取，回收有机溶剂层，旋蒸至50 mL左右，冷冻干燥，得到玫瑰石斛总生物碱。
对比例1
本案例的制备过程具体如下：
1. 取干燥的玫瑰石斛茎，打成粉末。
2. 取50 g玫瑰石斛粉末，加入500 mL95%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复三次。
3. 收集滤饼，加入500 mL70%乙醇，超声2.5 h，热回流2.5 h，然后减压抽滤，收集滤液，滤饼重复上述提取步骤，重复两次。
4. 合并滤液，加水混悬，利用旋转蒸发仪旋蒸至无醇味。
5. 加5%盐酸溶液，调节pH约为2，抽滤，收集滤液。
6. 滤液加氨水调节pH约为9，用二氯甲烷萃取，回收有机溶剂层，旋蒸至50 mL左右，冷冻干燥，得到玫瑰石斛总生物碱。
实施例1、实施例2以及对比例1的提取效果对比如表1所示。
表1：不同提取方案玫瑰石斛总生物碱得率及含量
。
从上述表1可以看出：采用纤维素酶酶解处理的实施例1，其总生物碱的含量和得率明显提高，特别是含量方面，与实施例2的石油醚脱脂预处理后提取玫瑰石斛总生物碱相比，总生物碱含量提高了45.8%左右；与对比例1相比，总生物碱含量提高了21.1%左右。
（1）细胞毒性实验
根据细胞毒性实验的方式，加入实施例1所制备的玫瑰石斛总生物碱提取物作为实验组，结果如图1所示：未添加玫瑰石斛总生物碱时，细胞活力约为1.3；在5～30 μg/ml的浓度范围内细胞毒性较小，细胞活力保持在0.9附近，对细胞的影响较小；当玫瑰石斛总生物碱的浓度达到50μg/ml时，细胞活力保持在0.5附近。
加入实施例2所提取的玫瑰石斛总生物碱提取物作为抗炎药物时，同样具有类似的趋势：在药物浓度达到0～30μg/ml时，细胞活力基本保持在1.0以上。
基于上述毒性实验结果，针对实施例1获取的玫瑰石斛总生物碱作为提取物，与20μg/ml地塞米松、200μg/ml槲皮素、1μg/ml LPS进行对照，验证上述制备的玫瑰石斛总生物碱的抗炎活性。
1）IL-1β表达：
结合图2，LPS诱导3h时：20μg/ml提取物对细胞炎症因子IL-1β表达量显著低于20μg/ml地塞米松的效果，对比200μg/ml槲皮素对IL-1β表达量的效果没有显著性差异。
结合图3，LPS诱导12h时：20μg/ml提取物对细胞炎症因子IL-1β表达量显著低于1μg/ml LPS诱导的细胞炎症因子IL-1β表达量，效果较地塞米松好，与200μg/ml槲皮素对细胞炎症因子IL-1β表达量效果相差无几。
2）TNF-α表达：
结合图4，LPS诱导3h时：20μg/ml提取物的炎症因子TNF-α表达量约为3.7附近，20μg/ml地塞米松的TNF-α表达量则高达4.9，而200μg/ml槲皮素的TNF-α表达量则为2.0左右。
结合图5，LPS诱导12h时：20μg/ml提取物的炎症因子TNF-α表达量约为2.2附近，20μg/ml地塞米松的TNF-α表达量则达到2.5，而200μg/ml槲皮素的TNF-α表达量则为2.6左右。
综上：上述案例应用玫瑰石斛总生物碱作为抗炎制剂时，其抗炎活性远优于常规抗药药物地塞米松，5-30 μg/ml的浓度范围内细胞毒性较小，且玫瑰石斛总生物碱浓度为20 μg/ml时，对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7有良好的抗炎效果，能有效的抑制炎症因子IL-1β的表达量，对TNF-α也有一定的抑制效果。在相同浓度下，比阳性对照地塞米松有更好的抗炎效果。
Claims (10)
1.一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于，所述玫瑰石斛提取物的制备方法包括以下步骤：
（1）预处理：将纤维素酶置于玫瑰石斛粉末中，于40～60 ℃酶解处理1～3h后，升温使酶失活；
（2）提取：取步骤（1）处理后的试样加入乙醇溶液，超声、热回流提取后，减压抽滤，收集滤液，加水混悬至无醇味；
（3）萃取：调节pH至9～10，以二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，旋蒸，冷冻干燥，得到提取物，即为玫瑰石斛总生物碱。
2. 根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（1）中，纤维素酶添加量为玫瑰石斛粉末质量比的0.2～1.0 %。
3.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（1）中，失活温度为80～100℃。
4.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（2）中，先以体积浓度90～95%的乙醇溶液处理试样，得到滤饼和第一次滤液，再以体积浓度为70～75%的乙醇溶液处理滤饼，得到第二次滤液，两次滤液合并，进入步骤（3）的处理环节。
5.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（2）中，超声处理时长为2～8h，热回流处理时长为2～8h。
6.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（3）中，滤液调节pH时，先采用盐酸溶液调节至2～3，抽滤，滤液pH再调节至9～10。
7.根据权利要求1所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（1）中酶解温度为50 ℃，失活温度为90 ℃，纤维素酶添加量为玫瑰石斛粉末质量的0.5 %；步骤（2）中，超声处理时长为2～4h，热回流处理时长为2～4h；步骤（3）中，二氯甲烷与玫瑰石斛粉末的料液比是1:25。
8.一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于，所述玫瑰石斛提取物的制备方法包括以下步骤：
（1）预处理：将玫瑰石斛粉末置于石油醚中，超声处理1～3h后，减压抽滤；
（2）提取：取步骤（1）处理后的试样加入乙醇溶液，超声、热回流提取后，减压抽滤，收集滤液，加水混悬至无醇味；
（3）萃取：调节pH至9～10，以二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，旋蒸，冷冻干燥，得到提取物，即为玫瑰石斛总生物碱。
9.根据权利要求8所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（1）中，石油醚与玫瑰石斛粉末的料液比1:3～5。
10.根据权利要求8所述的一种玫瑰石斛提取物作为抗炎制剂的应用，其特征在于：步骤（2）中，先以体积浓度90～95%的乙醇溶液处理试样，得到滤饼和第一次滤液，再以体积浓度为70～75%的乙醇溶液处理滤饼，得到第二次滤液，两次滤液合并，进入步骤（3）的处理环节。
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