CN116536452A - 一种环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病毒检测及环境监测领域，公开了一种环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法。该检测方法在单管中进行逆转录重组酶聚合酶扩增(RT‑RPA)、Cas12a酶激活、G‑四链体(G4)切割和基于G4的比色反应，可避免假阳性结果，提高了检测可靠性，同时具有灵敏度高、特异性好和成本低等优点，且该方法中用于单管测定的致病微生物基因组是在没有进一步纯化的情况下通过酸处理快速获得的，监测过程简单。本发明提供的检测方法可广泛应用于致病微生物现场环境监测中。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测及环境监测领域，具体涉及一种环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法。
背景技术
病毒的环境监测对于识别和控制病毒感染和传播越来越重要。通过监测内部空间、物流链和废水处理厂中病毒的存在、生存能力和变异，公共卫生系统可以识别位置，切断传染源，并尽早警告传染病的流行。因此我们要重视环境中新冠病毒的监测。尽管新冠病毒的环境监测可以预防和控制流行病，但缺乏简单可靠的监测方法阻碍了其广泛应用，尤其是在资源有限的地区。
由于高灵敏度和特异性，基于核酸的分子诊断已成为新冠病毒的主要检测手段。基于病毒基因组测序，聚合酶链式反应(PCR)或逆转录PCR(RT-PCR)已成为临床诊断和环境监测中病毒检测的主要技术。然而，聚合酶链式反应和逆转录聚合酶链式反应有几个局限性。复杂的RNA提取程序和较长的周转时间限制了这些方法用于快速和现场病毒检测。此外，对训练有素的技术人员、昂贵的仪器和超清洁的工作台的需求是大规模检测的挑战，尤其是在资源有限的地区。
最近，等温扩增已被开发为一种简单的核酸检测方法。与PCR相比，它不需要复杂的热循环仪器和训练有素的技术人员。指数放大可以在恒定的温度下有效地进行。重组酶聚合酶扩增(RPA)是一个典型的例子，其中新链在37～41℃下短时间合成。然而，RPA中引物二聚体或非特异性扩增子的出现可能导致高假阳性率，限制了它们的实际应用。
为了解决这一瓶颈，将等温扩增与CRISPR-Cas系统相结合用于病毒检测，由于CRISPR-Cas系统的结合诱导切割，只有正确扩增的复制子才能激活CRISPR-Cas系统，避免了引物二聚体或非特异性扩增子产生的假阳性结果。
具有富含鸟嘌呤重复序列的G-四链体(G4)倾向于折叠成四个G-四重奏结构，这些结构存在于癌基因启动子序列和染色体的端粒区域。G4的结构单元对应于由八个Hoogstein氢键连接在一起的四个平面G-碱基的结合。并通过π-π疏水相互作用稳定。与血红素结合后，G4表现出类似过氧化物酶的活性，促进靶分子与过氧化氢之间的氧化还原反应，导致氧化产物的出现(颜色变化)。作为DNA酶，G4-hemin复合物被广泛用于开发简单、高灵敏度的视觉生物传感器。作为单链DNA，G4可以被激活的Cas12a切割。因此，G4 DNA酶活性丧失。因此，在基于CRISPR-Cas的病毒检测中，未标记的G4-hemin可以被开发为一种具有成本效益、简单和高效的可视化方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法，该快速检测方法通过快速提取病毒核酸物质RNA，一管法进行RT-RPA扩增和CRISPR-Cas12a反应，以及G4介导的显色反应，从而实现环境介质中新冠病毒监测，该法具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉，操作步骤简便。
本发明提供的技术方案如下：
一种用于环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法，包括以下步骤：
S1.核酸提取：对环境采样进行处理，得到核酸提取溶液；
S2.一管法反应：在试管底部加入A组分、10×RPA-Cas缓冲液、100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，然后将B组分、所述核酸提取溶液和280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，35-41℃孵育20min，得检测试剂；
其中，A组分含有Cas12a和crRNA，B组分为RPA干粉(含DNA聚合酶，dNTP)，再水化缓冲液，10μM的正引物，10μM的反引物，200U/μL的逆转录酶和40U/μL的RNase抑制剂，称为RT-RPA混合物，这是等温扩增(RT-RPA)所需的试剂，G4的序列如SEQ NO.1所示；
G4的核酸序列如下：
S3.向所述检测试剂中加入显色试剂，室温条件下2-7min后，读取吸光度，根据所述吸光度检测新冠病毒。
进一步的，所述对环境采样后进行处理，具体为：将采样棉签放于环境采样的采样液中，1M HCl溶液与所述采样液按比例1:10混合，处理2-7min后，加入与HCl等浓度等量的NaOH溶液，进行中和，中和后，得到核酸提取溶液。
进一步的，RPA-Cas缓冲液为：NaCl的浓度为50mM，Tris-HCl的浓度为10mM，MgCl2的浓度为10mM，BSA的浓度为10μg/mL，pH为7.9。
进一步的，A组分的配置方法为：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。
进一步的，B组分的配置方法为：在装有RPA干粉(含DNA聚合酶，dNTP)管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL 10μM的正引物，2.4μL 10μM的反引物，1μL200U/μL的逆转录酶和2μL40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
进一步的，所述一管法反应具体为：在试管底部加入8.8μL的A组分、1.2μL的10×RPA-Cas缓冲液、1μL的100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL，然后将6μL的B组分、4μL的所述核酸提取溶液和1μL的浓度为280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min，得检测试剂。
进一步的，所述显色试剂由8μL 10×RPA-Cas缓冲液、60μL水、10μL 60mMABTS盐、0.5μL 1M HCl和0.5μL 1M H2O2配置而成。
进一步的，所述读取吸光度为酶标仪测量吸光度。
进一步的，所述检测的检测下限为0.84copy/μL。
本发明提供的快速检测方法进行检测的工作原理为：采样后，通过酸处理快速获得了病毒基因组。
在没有纯化的情况下，进行一管法测定，其中，在恒定温度下同时进行RT-RPA、CRISPR-Cas12a激活和G4切割。将显色试剂添加到试管中，显示颜色变化。该法显著简化了分析程序和分析时间。由于方便、可靠和成本效益，所提出的检测方法在致病微生物的现场环境监测方面具有良好的前景。本发明提供的新冠病毒的检测下限为0.84copy/μL。
与现有技术相比，本发明提供的基于CRISPR-Cas技术的单管比色核酸检测法，具备一个实用且可大面积推广的致病微生物检测方法所需要的8个要素：精准、快速、高效、灵敏度高、易操作、成本低、不需要大型仪器及灵活性高。快速准确得到环境中新冠病毒的基因信息，通过信息关联，掌握新冠病毒的发展与蔓延趋势，将为重点区域与重要时间点的长期监控提供信息参考。
附图说明
图1为本发明中环境介质中新冠病毒可视化快速检测方法的工作流程示意图；
图2为本发明中一管法检测的工作机制示意图；
图3为酸处理快速提取核酸的凝胶电泳结果；
图4为一管法进行病毒核酸检测的实验结果；
图5为一管法中，不同反应时间对应的实验结果；
图6为一管法中，不同葡萄糖浓度对应的实验结果；
图7为检测含不同浓度新冠病毒的实验结果；
图8为本发明中特异性测试的实验结果；
图9为检测真实环境接种中的新冠病毒的显色结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
10×RPA-Cas缓冲液为NaCl(500mM)；Tris-HCl(100mM)；MgCl2(100mM)；BSA(100μg/mL)，pH值为7.9。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
本发明提供了一种环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法，工作机制示意图如图1所示，包括以下步骤：
S1.核酸提取：对环境采样进行处理，得到核酸提取溶液；
具体的，将采样棉签放于环境采样的采样液中，1M HCl溶液与所述采样液按比例1:10混合，处理2-7min后，加入与HCl等浓度等量的NaOH溶液，进行中和，中和后，得到核酸提取溶液。
S2.一管法反应：在试管底部加入A组分、10×RPA-Cas缓冲液、100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，然后将B组分、所述核酸提取溶液和280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，35-41℃孵育20min，得检测试剂；G4的序列如SEQ NO.1所示；
具体的，A组分的配置方法为：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。
B组分的配置方法为：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL 10μM的正引物，2.4μL 10μM的反引物，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
具体的，正引物和反应物为N区靶序列的正反引物。
一管法检测的工作机制如图2所示，具体为：在试管底部加入8.8μL的A组分、1.2μL的10×RPA-Cas缓冲液、1μL的100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL，然后将6μL的B组分、4μL的所述核酸提取溶液和1μL的浓度为280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，35-41℃孵育20min，得检测试剂。孵育温度优选39℃。
S3.向所述检测试剂中加入显色试剂，室温条件下2-7min后，读取吸光度，根据所述吸光度检测新冠病毒。
具体的，显色试剂由8μL 10×RPA-Cas缓冲液、60μL水、10μL 60mMABTS盐、0.5μL1M HCl和0.5μL1M H2O2配置而成。读取吸光度为酶标仪测量吸光度。
实施例1：核酸的快速提取
盐酸处理：环境采样后，将棉签放于采样液中，1M HCl溶液与采样液按比例1:10混合，处理5min后，加入与HCl等浓度等量的NaOH溶液，进行中和，中和后，得到核酸提取溶液。
图3所示为用该法提取的核酸与商品化试剂盒提取的核酸，扩增后，得到的凝胶电泳电泳两种方法均可获得较亮的靶基因条带，说明我们的提取核酸方法是可行的。
实施例2：一管法进行病毒核酸检测
(1)组分溶液配制：
A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。
B组分：在RPA干粉管中(含DNA聚合酶，dNTP)加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(2)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min。
(3)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
阳性样品中，靶基因被RT-RPA扩增，激活Cas酶并切割G4链，从而阻断了G4介导的颜色反应，如图4所示，阳性样品中不能发生颜色反应，吸光度特别低，而阴性样品中，无靶基因，不能激活Cas酶，G4不被切割，可发生颜色反应，吸光度特别高。
实施例3：不同反应时间对一管法检测效果的影响
(1)组分溶液配制：A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。B组分：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(2)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育不同时间：0，4，8，12,16，20，24min。
(3)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
以一管法反应时间为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，得到在不同一管法反应时间后，显色反应的吸光度柱状图。如图5，随着反应时间增加，吸光度逐渐下降。然而，在20min时，几乎不再发生显色反应，。因此，一管法最佳反应时间为20min。
实施例4：不同葡萄糖浓度对一管法检测效果的影响
(1)组分溶液配制：A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。B组分：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(2)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和葡萄糖(分别为2％，5％，10％，15％和20％)，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min。
(3)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
以葡萄糖浓度为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，得到在不同的葡萄糖浓度下，一管法反应后，显色反应的吸光度柱状图。如图6，随着葡萄糖浓度增加，吸光度逐渐下降。然而，在浓度为15％时，几乎不再发生显色反应。因此，一管法中，葡萄糖的最佳浓度为15％。
实施例5：对不同浓度病毒的检测
(1)在采样液中，加入不同浓度的新冠假病毒(分别为0,1,2,5,10,20,50,100,200拷贝/μL)，按实施例1中的方法进行处理
(2)组分溶液配制：A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。B组分：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(3)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min。
(4)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
以病毒浓度为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，得到柱状图为图7A。
图7B病毒浓度与吸光度变化值之间的线性关系。线性方程为y＝0.1127+0.09939x(R2＝0.9741)。根据3σ法，计算出检测限为0.84copy/μL
实施例6：特异性评估
(1)在采样液中，加入不同种类假病毒(MERS-CoV，SARS-CoV，和SARS-CoV-2)，按实施例1中的方法进行处理
(2)组分溶液配制：A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。B组分：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(3)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min。
(4)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
以病毒种类为横坐标，以测得的吸光度为纵坐标，得到柱状图为图8。
实施例7：环境样品检测
(1)将SARS-CoV-2假病毒稀释到不同浓度(5、10、50copies/μL)，喷涂在玻璃、塑料、金属表面，模拟环境介质中物体表面，用一次性使用采样器蘸取，然后放入采样液，按实施例1中的方法进行处理
(2)组分溶液配制：A组分：4μL 1μM的Cas12a，4μL 1μM的crRNA以及0.8μL 10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。B组分：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL正反引物(各10μM)，1μL 200U/μL的逆转录酶和2μL 40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
(3)一管法反应：在试管底部加入8.8μL A组分，1.2μL 10×RPA-Cas缓冲液，1μL100μM的G4链，1μL 100μM的Hemin，无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL。将6μL B组分，4μL实施例1中的核酸提取溶液，1μL 280mM的MgOAc，混匀后，小心加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min。
(4)显色反应：向孵育后的溶液中加入8μL 10×RPA-Cas缓冲液，60μL水，10μL60mMABTS盐，0.5μL 1M HCl，0.5μL 1M H2O2即可肉眼观察颜色变化，并用酶标仪测量吸光度。
图9左侧图为采样后，检测含不同浓度假病毒的环境介质样品，显色反应后的照片。根据吸光度可以制作热图(右侧图)，能很明显地看出阳性样品。
本发明通过多种技术联用，包括核酸快速提取，一管法RT-RPA和CRISPR反应，G4介导的颜色反应。构建了一种方便、快捷、可靠和成本低的核酸检测新技术。大大提高了核酸检测的便捷性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于环境介质中新冠病毒的可视化快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.核酸提取：对环境采样进行处理，得到核酸提取溶液；
S2.一管法反应：在试管底部加入A组分、10×RPA-Cas缓冲液、100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，然后将B组分、所述核酸提取溶液和280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，35-41℃孵育20min，得检测试剂；
其中，A组分含有Cas12a和crRNA，B组分为RT-RPA混合物，G4链的序列如SEQNO.1所示；
S3.向所述检测试剂中加入显色试剂，室温条件下2-7min后，读取吸光度，根据所述吸光度检测新冠病毒。
2.根据权利要求1所述的可视化快速检测方法，其特征在于，所述对环境采样后进行处理，具体为：将采样棉签放于环境采样的采样液中，1MHCl溶液与所述采样液按比例1:10混合，处理2-7min后，加入与HCl等浓度等量的NaOH溶液，进行中和，中和后，得到核酸提取溶液。
3.根据权利要求1所述的可视化快速检测方法，其特征在于，RPA-Cas缓冲液为：NaCl的浓度为50mM，Tris-HCl的浓度为10mM，MgCl2的浓度为10mM，BSA的浓度为10μg/mL，pH为7.9。
4.根据权利要求3所述的可视化快速检测方法，其特征在于，A组分的配置方法为：4μL1μM的Cas12a，4μL1μM的crRNA以及0.8μL10×RPA-Cas混匀，37℃孵育10min，冷冻保存。
5.根据权利要求4所述的可视化快速检测方法，其特征在于，B组分的配置方法为：在RPA干粉管中加入29.4μL再水化缓冲液，2.4μL10μM的正引物，2.4μL10μM的反引物，1μL200U/μL的逆转录酶和2μL40U/μL的RNase抑制剂，混匀，配制好RT-RPA混合物。
6.根据权利要求5所述的可视化快速检测方法，其特征在于，所述一管法反应具体为：在试管底部加入8.8μL的A组分、1.2μL的10×RPA-Cas缓冲液、1μL的100μM的G4链、100μM的Hemin、无酶水和15％葡萄糖，总体积为20μL，然后将6μL的B组分、4μL的所述核酸提取溶液和1μL的浓度为280mM的MgOAc混匀后，加入试管底部溶液上方，不混合，39℃孵育20min，得检测试剂。
7.根据权利要求1所述的可视化快速检测方法，其特征在于，所述显色试剂由8μL10×RPA-Cas缓冲液、60μL水、10μL60mMABTS盐、0.5μL1MHCl和0.5μL1MH2O2配置而成。
8.根据权利要求1所述的可视化快速检测方法，其特征在于，所述读取吸光度为酶标仪测量吸光度。
9.根据权利要求1-8任一项所述的可视化快速检测方法，其特征在于，所述检测的检测下限为0.84copy/μL。
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