CN116531377A - 一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物医药材料技术领域，提供了一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法，包括以下步骤：将20mg的EGCG溶于2ml去离子水中，加入5mg甘氨酸和10μl甲醛溶液并搅拌，获得乳白色溶液并离心处理，弃上清并洗涤离心产物两次，得到直径为200nm的球形纳米粒子；测量球形纳米粒子含量并将浓度调为20mg/ml。将球形纳米粒子和缺氧模拟药FG‑4592以1.5/1的比例反应得到直径为60nm的核壳形状微球，这种载药纳米微球，不仅可以在牙周炎环境中响应释放精准用药，避免各种不良反应，提高纳米药物的治疗效率，其本身的抗氧化抗炎作用也对治疗牙周炎有积极的作用，在临床治疗中具有广阔的应用前景。

Description

一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域，尤其涉及一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用。

背景技术

牙周炎是一种高发口腔疾病，世界卫生组织统计结果显示，全球约有10％-15％的人口患有严重的牙周疾病，使患者的生活质量和全身健康都受到了极大的影响。目前认为牙周炎的发病机制是牙菌斑生物膜作为始动因子侵袭牙周组织后，机体会产生大量的炎症因子进行防御，有效地执行宿主防御反应。牙周炎是机体固有免疫和适应性免疫调节的结果，如未获得及时的治疗最终会导致结缔组织附着和牙槽骨等牙齿支持结构丧失，最终牙齿脱落影响人的生活质量。目前最常用的治疗方法包括龈上洁治和根面刮治等机械方法，并不能有效去除窄而深牙周袋中的菌斑。并且菌斑生物膜只是牙周炎的始动因子，控制细菌感染诱发的机体免疫防御反应，进而控制炎症，并促进牙周组织再生仍然是临床医生面临的问题。考虑到宿主免疫反应在牙周炎组织破坏中的突出作用，其中巨噬细胞向M1表型(促炎症)的极化与牙周炎症的破坏密切相关，而M2型巨噬细胞在炎症消退、组织修复中发挥作用，因此调节巨噬细胞极化可能是治疗牙周炎的靶点。

缺氧是炎症部位的常见特征。在正常发育和分化中以及在病理环境中，如癌症和缺血，细胞适应缺氧条件的能力是至关重要的。缺氧诱导因子(Hypoxia-induciblefactors,HIFs)的转录因子家族在很大程度上协调细胞对缺氧的应答，调控不同的靶基因表达来调节糖酵解、血管生成、能量代谢以及细胞增殖和生存。缺氧诱导因子1(HIF-1)在氧调控基因的表达中起核心作用，由α-亚基(HIF-1α)和β-亚基(HIF-1β)组成。HIF-1β在细胞中稳定表达，而HIF-1α在正常氧生物利用度条件下被脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylases,PHDs)羟基化两个脯氨酸残基，接着被包含von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)的蛋白质复合物识别，最终降解。在缺氧环境中可以迅速积累。大量研究表明HIFs是先天免疫和适应性免疫的关键调节因子，通过调节代谢等调控巨噬细胞极化调节炎症反应。因此，模拟缺氧效应，靶向HIFs通路可能是治疗炎症的一个关键的问题和重要的策略。本研究中我们使用一种PHD抑制剂FG-4592(Roxadustat)来模拟缺氧效应上调HIF-1α的表达来调控巨噬细胞极化调节炎症。FG-4592经FDA批准是一种用于临床治疗肾性贫血的口服药。口服用药会引起全身副作用，而直接局部用药会被口腔环境的溶解，达不到有效的药物浓度。因此，应用一种可以局部递送至牙周部位且能够在牙周炎碱性环境下响应释放的纳米载体是关键的。

与其他大多数炎症酸性环境不同的是，牙周炎是一个碱性微环境，其龈沟液pH明显呈弱碱性反应，有研究表明PH值约在8.10±0.57。这可能是因为牙周袋加深造成厌氧环境使局部氧化还原电势降低使PH升高，另外大部分厌氧菌能产生组织胺等碱性还原物质，也会使局部pH值升高。然而目前大多数载体都是在酸性环境下释放药物。因此，选用一种能够在碱性环境下释放药物的纳米载体是一个关键问题。局部组织缺氧是感染和炎症的一个特征，HIF-1调控不同的靶基因来调节糖酵解、血管生成、能量代谢以及细胞增殖和生存，在氧调控基因的表达中起核心作用。HIFs是由α-亚基(HIF-αs)和β-亚基(HIF-1β)组成的一种转录激活因子复合体。HIF-1β在细胞中稳定表达，而HIF-αs在正常氧生物利用度条件下(>5％)，被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases,PHDs)结合并羟化脯氨酸残基，随后被多聚泛素化降解。在缺氧条件下，PHD活性被抑制，HIF-1α能稳定表达。据报道，HIF-1α可以调节巨噬细胞极化，降低M1/M2型细胞的比例，抑制炎症反应。因此，模拟缺氧效应，上调HIF-1α的表达是解决炎症的重要科学问题。增加HIF表达的药物被称为缺氧模拟剂。先前的研究报告的低氧模拟剂，包括二价铁离子拮抗剂如CoCl2和DFX，脯氨酸羟化酶的竞争性抑制剂如二甲氧丙烯甘氨酸(DMOG)，然而他们都有毒性较高、脱靶副作用等缺点。FG-4592是一种新型脯氨酰羟化酶抑制剂，采用基于结构的药物设计(SBDD)和高通量筛选(HTS)技术开发，已经通过FDA批准用于治疗的慢性肾性贫血。与传统的缺氧模拟剂相比，FG-4592具有更高的靶向特异性和更安全的临床应用。近年来，有研究表明，FG-4592稳定HIF-1α表达，增加对缺氧的耐受性，从而改善如肾性贫血、脊髓损伤、视网膜疾病，皮肤伤口的愈合，骨折愈合等许多疾病的预后。同时，FG-4592也被证明可以通过增加HIF-1α靶基因超氧化物歧化酶2(SOD2)、核因子红系2相关因子2(Nrf-2)和介导ROS解毒的血红素加氧酶-1(HO-1)的表达来平衡氧化应激。HIFs在先天免疫细胞中表现出特定的激活和独特的表达模式，因此，我们应用FG-4592来稳定HIF-1α的表达，来调控巨噬细胞极化，调节免疫反应，治疗炎症。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用，旨在解决FG-4592口服用药会引起全身副作用，而直接局部用药会被口腔环境的溶解，达不到有效的药物浓度的问题。

本发明是这样实现的，一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用，包括以下步骤：

步骤一、将20mg的EGCG溶于2ml去离子水中得到溶液A；

步骤二、向溶液A内加入5mg甘氨酸和10μl甲醛溶液并搅拌，获得乳白色溶液；

步骤三、对乳白色溶液离心处理，弃上清并用去离子水洗涤离心产物两次，得到直径为200nm的球形纳米粒子；

步骤四、测量球形纳米粒子含量，并将球形纳米粒子浓度调为20mg/ml；

步骤五、取100μl的浓度为20mg/ml的球形纳米粒子溶液，并加入20％的无水乙醇，乳白色溶液变为澄清溶液；

步骤六、称量1.3mg的FG-4592将其溶解在10μl的二甲基亚砜中得溶液B；

步骤七、将溶液B加入澄清溶液中，随后分两次共加入1600μl的去离子水，每次800μl；

步骤八、在摇床上反应10分钟后，离心处理5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到直径为60nm的载药核壳形状的微球。

进一步的技术方案，步骤二中搅拌在室温下进行，且以550转/分钟的速率搅拌20分钟。

进一步的技术方案，步骤三中离心处理具体以8500转/分钟的转速离心10分钟。

进一步的技术方案，所述步骤八中摇床转速为250转/分钟，所述步骤八中离心处理的转速为12000转/分钟。

一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球在炎症疾病中的应用，所述pH响应模拟缺氧效应纳米微球由上述的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法制备而得。

本发明实施例提供的一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用，多酚类药物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)也具有较强地抗氧化和抗炎作用，我们以EGCG、醛和氨基酸为原料，采用曼尼希缩合(Mannich反应)法合成了EGCG低聚物(EGCG CSs)，并将药物FG-4592加载其中，形成一种核壳状的纳米微球。这种纳米微球在牙周炎症的微碱环境中响应释放，模拟缺氧效应上调HIF-1α，调节巨噬细胞M1和M2型极化，调节固有免疫，抑制炎症反应，这为牙周炎的治疗提供了一种有前景的方法。我们选用的EGCG低聚物可以在碱性环境下拆解而释放药物，这样防止药物单独应用时在口腔复杂的环境中不稳定而溶解。另外构建纳米药物还可以克服药物水溶性差、生物利用度低、分布不特异等缺点。因此，利用具有治疗作用的纳米载体EGCG，不仅可以在牙周炎环境中响应释放精准用药，避免各种不良反应，提高纳米药物的治疗效率，其本身的抗氧化抗炎作用也对治疗牙周炎有积极的作用，在临床治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的直径为200nm的球形纳米粒子GCS的透射电镜图片；

图2为本发明实施例提供的直径为60nm的载药核壳形状的微球的透射电镜图片；

图3为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的紫外曲线；

图4为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的水合粒径分布；

图5为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的ZETA电位；

图6为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的傅里叶变换红外光谱图；

图7为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在PBS中的释放曲线图；

图8为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的生物安全性评价图；

图9为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在大鼠体内的生物安全性评价图；

图10为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞急性炎症期炎性基因和抗炎基因和HIF-1α基因的表达情况；

图11为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞慢性炎症期炎性基因和抗炎基因和HIF-1α基因的表达情况；

图12为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞慢性炎症期炎性和抗炎因子蛋白的免疫荧光图像；

图13为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞慢性炎症期巨噬细胞表面标志物表达的流式细胞术结果图；

图14为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞检测活性氧(ROS)清除能力的结果图；

图15为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球在体外细胞通过蛋白免疫印迹法检测HIF-1α蛋白的表达；

图16为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球动物实验示意图；

图17为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球用于大鼠牙周炎模型的牙龈组织H&E染色和Masson染色图；

图18为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球用于大鼠牙周炎模型牙龈组织的IL-1β和Arg-1的免疫组化染色图；

图19和图20分别为本发明实施例提供的pH响应模拟缺氧效应纳米微球用于大鼠牙周炎模型牙龈组织的TNF-α和IL-10免疫荧光染色图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例一，为本发明一个实施例提供的一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法及应用，包括以下步骤：

步骤一、将20mg的EGCG溶于2ml去离子水中得到溶液A；

步骤二、向溶液A内加入5mg甘氨酸和10μl甲醛溶液并搅拌，获得乳白色溶液；步骤二中搅拌在室温下进行，且以550转/分钟的速率搅拌20分钟；

步骤三、对乳白色溶液离心处理，弃上清并用去离子水洗涤离心产物两次，得到直径为200nm的球形纳米粒子(GCS)；步骤三中离心处理具体以8500转/分钟的转速离心10分钟；

步骤四、测量球形纳米粒子(GCS)含量，并将球形纳米粒子浓度调为20mg/ml；

步骤五、取100μl的浓度为20mg/ml的球形纳米粒子(GCS)溶液，并加入20％的无水乙醇，乳白色溶液变为澄清溶液；

步骤六、称量1.3mg的FG-4592将其溶解在10μl的二甲基亚砜中得溶液B；

步骤七、将溶液B加入澄清溶液中，随后分两次共加入1600μl的去离子水，每次800μl；所述步骤八中摇床转速为250转/分钟，所述步骤八中离心处理的转速为12000转/分钟；

步骤八、在摇床上反应10分钟后，离心处理5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到直径为60nm的载药核壳形状的微球。

根据图3可知，载药纳米粒子GCS@FG-4592已经成功载上药物FG-4592。

根据图7可知，本发明的纳米粒子在PH＝7.4的环境中2小时内释放药物达80％。

根据图8可知体外实验中FG4592药物浓度不高于20μM时对细胞有良好的生物安全性。

根据图9可知药物浓度在24mM时(GCS@FG-4592组)和48mM(GCS@FG-4592’组)时，对动物的心、肝、脾、肺、肾均有良好的生物安全性。

根据图10可知，本发明的载药纳米粒子，在急性炎症期炎性基因TNF-α、iNOS和IL-1β表达明显降低，且具有统计学意义，抗炎基因IL-10和TGF-β的表达显著增加。缺氧诱导因子1α表达也明显增加。由此可见，缺氧模拟纳米粒子对急性炎症有一定的抗炎作用，并且抑制M1型巨噬细胞相关的炎性因子，促进M2型巨噬细胞相关的抗炎因子表达。

根据图11可知，在炎性因子TNF-α、iNOS和IL-1β表达明显减少，抗炎因子IL-10，Arg-1表达显著增加，缺氧诱导因子1α表达明显增加。由此可见，本发明的缺氧模拟纳米粒子对慢性炎症有一定的抗炎作用。

根据图12可知炎性蛋白TNF-α，IL-1β缺氧模拟纳米粒子组表达都明显减少，抗炎蛋白IL-10,Arg-1缺氧模拟纳米粒子组表达增加。由此可见，从蛋白水平上证明本发明的缺氧模拟纳米粒子对慢性炎症有一定的抗炎作用。

根据图13可知，标志M1型巨噬细胞的CD86表达有减少，但是不很显著，标志M2型巨噬细胞的CD206表达明显增加，由此可见本发明的缺氧模拟纳米粒子可以显著地促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。

根据图14可知本发明的缺氧模拟纳米粒子活性氧染色明显减少，说明抗氧化能力较强。通过检测ROS的清除程度从而可以评价抗氧化能力。

根据图15可知本发明的缺氧模拟纳米粒子可以明显使HIF-1α蛋白稳定表达。

图16，选取6周的雄性Wistar大鼠，进行牙周局部注射P.gingivalis引发牙周炎，建立牙周炎动物模型。用10％水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉的大鼠，在下颌切牙唇侧龈沟内注射100μL P.gingivalis 3天，诱导炎症反应。为了消除炎症，用生理盐水，EGCG，GCS@FG-4592(24mM)，GCS@FG-4592(48mM)以0.2mL剂量注射入龈沟内，注射4天。由图可见，GCS@FG-4592组和GCS@FG-4592’组治疗组牙龈都无明显红肿。由此可见，本发明的缺氧模拟纳米粒子对牙周炎有一定的治疗效果。

根据图17可知，缺氧模拟纳米粒子GCS@FG-4592组和GCS@FG-4592’治疗组牙龈组织炎细胞明显减少，胶原纤维明显增加。由此可见，本发明的缺氧模拟纳米粒子对大鼠牙周炎有明显的治疗效果。

根据图18可知，缺氧模拟纳米粒子GCS@FG-4592组和GCS@FG-4592’治疗组牙龈组织炎性因子IL-1β蛋白表达显著减少，Arg-1蛋白表达显著增加。由此可见，本发明的缺氧模拟纳米粒子通过调节巨噬细胞极化，来治疗大鼠牙周炎并有良好的效果。

根据图18，19可知，缺氧模拟纳米粒子GCS@FG-4592组和GCS@FG-4592’治疗组牙龈组织炎性因子TNF-α蛋白表达减少，Arg-1蛋白表达显著增加。由此可见，本发明的缺氧模拟纳米粒子可以调节巨噬细胞分型调节免疫，对大鼠牙周炎有良好的效果。

本发明上述实施例中提供了一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球，EGCG采用曼尼希缩合(Mannich反应)法合成了微球EGCG低聚物(EGCG CSs)，EGCG CSs在有机溶剂中拆解，加入水后重新自组装成直径更加小的纳米微球。在重组的过程中加入FG4592药物，产物在电镜下可见呈核壳状微球，直径约为60nm。此核壳状微球具有pH响应特性，在pH约为7.4的环境中拆解，在微酸环境中也可以缓慢释放药物。释放的药物FG-4592是脯氨酰羟化酶(PHD)的强效小分子抑制剂，可以模拟缺氧环境而上调缺氧诱导因子HIF-1α，进而调控下游的信号来抑制炎症。本发明制备方法的反应条件温和，室温即可；可以通过改变加水的频率来调控纳米微球的尺寸；实验简单、重复性好，适合批量生产。本方法以EGCG为原料，EGCG作为一种抗氧化剂，在抗炎中也发挥着良好的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将20mg的EGCG溶于2ml去离子水中得到溶液A；

步骤二、向溶液A内加入5mg甘氨酸和10μl甲醛溶液并搅拌，获得乳白色溶液；

步骤三、对乳白色溶液离心处理，弃上清并用去离子水洗涤离心产物两次，得到直径为200nm的球形纳米粒子；

步骤四、测量球形纳米粒子含量，并将球形纳米粒子浓度调为20mg/ml；

步骤五、取100μl的浓度为20mg/ml的球形纳米粒子溶液，并加入20％的无水乙醇，乳白色溶液变为澄清溶液；

步骤六、称量1.3mg的FG-4592将其溶解在10μl的二甲基亚砜中得溶液B；

步骤七、将溶液B加入澄清溶液中，随后分两次共加入1600μl的去离子水，每次800μl；

步骤八、在摇床上反应10分钟后，离心处理5分钟，弃上清并用去离子水洗涤离心产物2次，得到直径为60nm的载药核壳形状的微球。

2.根据权利要求1所述的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤二中搅拌在室温下进行，且以550转/分钟的速率搅拌20分钟。

3.根据权利要求1所述的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤三中离心处理具体以8500转/分钟的转速离心10分钟。

4.根据权利要求1所述的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法，其特征在于，所述步骤八中摇床转速为250转/分钟，所述步骤八中离心处理的转速为12000转/分钟。

5.一种pH响应模拟缺氧效应纳米微球在炎症疾病中的应用，所述pH响应模拟缺氧效应纳米微球由权利要求1-4中任一项所述的pH响应模拟缺氧效应纳米微球的制备方法制备而得。