CN116530409A - 一种多抗玉米种质的创制方法 - Google Patents

一种多抗玉米种质的创制方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多抗玉米种质的创制方法，实施“稳定父本，放开母本”的杂交组合组配思路，基于黄淮海常用且成熟的杂种组配模式：瑞德×黄改和瑞德×兰卡，重点将父本固定在黄改和兰卡血缘的典型自交系昌7‑2、PH4CV等优良自交系，实施早代测配和杂交种组配，实现了自交系配合力和杂交组合双选择，既减少了工作量，也提高了选育效率，具有很强的实用性。本发明针对抗病性的改良全面，针对黄淮夏播区玉米生产上的茎腐病、小斑病、南方锈病、穗腐病等主要病害的一体化改良。本发明将“抗病+坚杆早熟优质+抗逆广适”等优良性状进行聚合，特别是打破了抗病和晚熟间的连锁，将抗病和早熟进行了融合，为机收玉米奠定了基础。

Description

一种多抗玉米种质的创制方法
技术领域
本发明涉及一种多抗玉米种质的创制方法，属于农作物育种领域。
背景技术
玉米是世界第一大粮食作物，总产量已超过10亿吨。中国是世界第二大玉米生产国和消费国，年种植面积6亿余亩，生产玉米2.7亿吨，为食品、畜牧养殖、化工、医药等行业提供重要的原料，对我国粮食安全和国民经济有重要作用。
玉米的高产稳产一直是育种家、种业企业、种植户共同追求的目标，但在玉米生长过程中，通常要应对多种生物和非生物逆境胁迫。像高温、干旱、阴雨寡照、大风等常见的非生物胁迫因素，如2022年8月黄淮夏玉米区持续25天的38℃以上高温无雨天气，正值玉米散粉吐丝期，造成部分品种雌穗畸形或雄穗无粉等现象，严重影响玉米的产量。病、虫等生物胁迫的危害，更是影响玉米产量和品质的关键因素，特别是在全球气候变化的大背景下，随着耕作制度变更、耕作栽培模式的推广，生产上连续多年的秸秆还田造成病残体积累、病原菌充足、病害压力增加，导致玉米茎腐病、穗腐病、叶斑病等重要病害易发频发，成为玉米生产最主要的限制因子之一，每年造成的产量损失占总产的10％以上。
应对上述逆境胁迫最经济有效的措施是选用多抗品种，况且具有优良的抗病抗逆特性本身就是优良品种的重要特征。特别是近些年，像黄淮海夏播区的玉米种植面对复杂多变的气候环境，除了要求品种抗高温、抗倒、耐阴雨寡照之外，也要求品种对茎腐病、穗腐病、小斑病、南方锈病等表现良好的抗性。
玉米作为杂交种，选育优良多抗品种的基础是培育多抗亲本或自交系。多抗自交系的培育有多种途径，比如引进国外杂交种直接选育二环系；利用抗病种质或热带种质改良创制新的种质，利用转基因或基因编辑等现代技术改变个别性状进行改良等。玉米自交系的培育目的是为了选育优良的杂交种，因此除了考虑改良抗逆性以外，还要考虑杂种优势群，方便父本或母本的选择，进行下一步的测交和杂交种的组配。从全球的范围划分种质类群，主要包括CIMMYT自交系、美国自交系以及部分中国来源的自交系。前人的多个研究结果显示，这些群体都表现出了较为丰富的遗传变异；在群体结构上，CIMMYT来源的自交系，大致可以划分为热带、亚热带等不同的类群，该类群抗病性突出，但对光照敏感。美国来源的自交系，则可以划分为坚秆类群(SS)和非坚秆类群(NSS)，通常把坚秆类群作为母本(如自交系B73、PH6WC)，非坚秆类群作为父本(如自交系Mo17、PH4CV)，通过向两边推来扩大遗传距离并提高杂种优势，其组配的杂交种通常表现抗倒、早熟、脱水快、品质优良、出籽率高等优点，但综合抗病性及抗高温干旱等逆境能力较差。中国玉米自交系通常划分为塘四平头(又称为黄改)、旅大红骨、兰卡斯特、瑞德(PB)、P群(PA)等五大类群，其中塘四平头(如自交系昌7-2)和旅大红骨(如自交系丹598)为中国特有种质，与其他类型均具有较强的杂种优势，其他三个类群多为外引系或国外公司杂交种的二环系。对扩大我国玉米种质遗传多样性和种质创新做出了重要贡献。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种多抗玉米种质的创制方法。针对黄淮海夏播玉米区的主要有害生物(茎腐病、小斑病、南方锈病、穗腐病)和重要非生物胁迫(高温、干旱、阴雨寡照)，基于中国亲本类群划分及黄淮常用的杂种优势模式(瑞德×黄改、瑞德×兰卡斯特)，利用抗病种质、国外种质、国内种质三结合的方法，将不同来源亲本/自交系/种质的优良性状进行聚合，通过复合杂交(如抗病种质/国外种质//国内种质或如抗病种质/国内种质//国外种质)确定后代遗传组成及所属类群，借助三亚南繁和黄淮夏播区田间自然逆境及抗病性的共同选择，来实施“多种质融合—多轮筛选鉴定—优良性状聚合”的多抗亲本培育技术体系，创制适应黄淮夏播复杂多样逆境胁迫且具有育种价值的抗病新种质，用于优良杂交种的选育。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种多抗玉米种质的创制方法，包括以下步骤：
(1)以抗病种质P1作母本，以抗逆广适种质P2作父本，组配P1×P2，收获的种子为F1；选择坚杆早熟种质P3，组配P3×F1或F1×P3，收获的种子为三交种F1’；
或，以抗病种质P1作母本，以坚杆早熟种质P3作父本，组配P1×P3，收获的种子为F1；选择抗逆广适种质P2，组配P2×F1或F1×P2，收获的种子为三交种F1’；
(2)种植三交种F1’，在散粉吐丝期，在三交种F1’中选择5-10株的花粉进行混合，对5-10株三交种F1’的花丝进行授粉，收获的种子脱粒后混合保存，形成基础群体S0；
(3)播种基础群体S0代种子，全部自交，田间收获时，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，收获同时满足抗南方锈病、茎腐病、穗腐病的单株，单穗脱粒保存，为S1世代；
(4)按穗行种植S1世代种子全部自交，收获时按玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择同时满足抗南方锈病、茎腐病、穗腐病、小斑病的单株，同时选择结实性和品质好的单株收获，单穗脱粒保存，得到S2世代；
(5)按穗行种植S2世代种子，在散粉吐丝期，按照杂种优势群，选择1个常用自交系作为测验种，与每个穗行中随机选择一株做母本进行测交，收获的种子为F1”；
每个穗行中剩余株全部自交，收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择良好单株收获，单穗脱粒保存，得到S3世代；
(6)按穗行种植S3世代种子，全部自交；
将测交组合的种子F1”，分别种植在中低产田和高产田两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置一个杂交种作为对照，成熟期收获，并计算产量；
只有当某一测交组在两个试验点的产量均比对照增产5％以上时，才确定保留其母本所属穗行并收获其相应的S3世代的自交种；
收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择结实好、品质优的单株收获，单独脱粒保存，得到S4世代；
(7)按穗行种植S4世代种子，在散粉吐丝期，在每个穗行中随机选择2株做母本，按照杂种优势群，选择2个常用自交系分别作为父本，与母本分别进行测交，收获的种子为F1”’；
每个穗行中剩余株全部自交，收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择结实好、品质优的单株收获，单独脱粒保存，得到S5世代；
(8)按穗行种植S5世代种子，全部自交；
将测交组合的种子F1”’，分别种植在中低产田和高产田两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置一个杂交种作为对照；
收获前，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，田间调查每个测交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害均表现中抗以上的测交组合，并计算产量；
根据两个试验点的测交组合F1”’的抗病性和产量，确定两试验点相对于对照产量均增产5％以上的测交组合来源的穗行，收获相应穗行S5世代的自交种；
收获时，对S5世代的自交单株，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，在目标行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病的单株作为备选株，再选择结实好、品质优的单株进行收获，单穗脱粒保存，为S6世代，即为多抗玉米种质。
所述抗病种质P1为K22，抗逆广适种质P2为郑58，坚杆早熟种质P3为PH6WC或XL21。
以抗病种质K22作母本，以抗逆广适种质郑58作父本，组配K22×郑58，收获的种子为F1；选择坚杆早熟种质PH6WC，组配PH6WC×F1或F1×PH6WC，收获的种子为三交种F1’。
以抗病种质K22作母本，以坚杆早熟种质XL21作父本，组配K22×XL21，收获的种子为F1；选择抗逆广适种质郑58，组配郑58×F1或F1×郑58，收获的种子为三交种F1’。
所述收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级时，如在海南南繁种植，所调查的病害主要为南方锈病、茎腐病和穗腐病，收获的自交穗通常要求结籽率≥70％；
如在河南夏播区种植，所调查的病害主要为南方锈病、小斑病、茎腐病和穗腐病，收获的自交穗通常要求结籽率≥50％；针对南方锈病，要求病级≤3；针对茎腐病要求茎基部及气生根均为绿色，无干枯失绿症状；针对穗腐病要求镰孢菌引起的病籽粒率＜2％，针对小斑病要求病级≤3。
收获时，结实性的要求为穗行数在12行以上，穗长＞12cm，品质优良的穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄色或橙色；夏播时单穗结籽率≥50％；南繁时单穗结籽率≥70％。
测验种为兰卡斯特种质时，常用自交系为PH4CV或PHB1M；测验种为黄改种质时，常用自交系为昌7-2或798-1。
所述杂交种为先玉335或郑单958。
步骤(3)播种基础群体S0代种子500-1000株；步骤(4)按穗行种植S1世代300-400行，每行15-20株；步骤(5)播种S2世代穗行80-90行，每行10-15株；步骤(6)播种S3世代穗行80-90行，每行10-15株；步骤(7)播种S4世代15-20个穗行，每行10-15株；步骤(8)播种S5世代15-20个穗行，每行10-15株。
所述的创制方法获得的多抗玉米种质在杂交种选育中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明抗逆性自交系的培育方法，在选育多抗自交系的过程中采取实施“稳定父本，放开母本”的杂交组合组配思路。基于黄淮海常用且成熟的杂种组配模式：瑞德×黄改和瑞德×兰卡，重点将父本固定在黄改和兰卡血缘的典型自交系昌7-2、PH4CV等优良自交系，实施早代测配和杂交种组配，实现了自交系配合力和杂交组合双选择，既减少了工作量，也提高了选育效率，具有很强的实用性。
(2)本发明针对抗病性的改良全面，不单是对某一种病害的改良，而是针对黄淮夏播区玉米生产上的茎腐病、小斑病、南方锈病、穗腐病等主要病害的一体化改良。实现目标的前提是找到合适抗源，且该抗源本身具有抗多种病害的特性，即除了集多个抗病基因于一体外，还具育种价值。基于多年的种质收集及鉴定筛选工作，发现自交系K22具有这种特性，接种鉴定和自然发病鉴定均表明，K22抗大斑病、小斑病、茎腐病、镰孢穗腐病、南方锈病、灰斑病等病害，且具有较好的结实性等农艺性状，缺点是晚熟、出籽率低、品质较差、不耐高温干旱等缺点，但有较好的育种价值。这与多个抗病基因分布在不同种质材料上，把多个抗病基因聚合到一个自交系相比，能大大节省杂交或复交次数，自然节省了培育时间和后代选择的复杂性。
(3)针对黄淮海夏玉米区多样化气候及复杂的逆境胁迫，本发明确立了抗病与高产、早熟、抗逆等多性状聚合的自交系及杂交种选育目标。本发明挑选抗病资源、选择国外经典早熟抗倒优质亲本及国内广适自交系，通过复合杂交，融合了三种不同来源种质资源的优点，将“抗病+坚杆早熟优质+抗逆广适”等优良性状进行聚合，特别是打破了抗病和晚熟间的连锁，将抗病和早熟进行了融合，为机收玉米奠定了基础。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
冬小麦-夏玉米连作是我国黄淮海区域主要种植模式，2020年该区域夏玉米种植面积约1.8亿亩，占全国的30％左右，但单产仅400kg/亩，低于全国平均水平(421kg/亩)，仅相当于美国玉米单产(730kg/亩)的55％，差距显著。多种逆境胁迫是影响产量的主要因素，通常夏玉米种植期间可能遭遇高温、干旱、大风、连阴雨、水淹等灾害天气，同时还要抵御茎腐病、穗腐病、小斑病、南方锈病等生物胁迫，前三种病害作为品种区域试验指定的一票否决病害(也就是抗病性鉴定高感即淘汰)，另外，由多堆柄锈菌引起玉米南方锈病已成为黄淮区域玉米生产上的重要病害，具有突发性、爆发性和难防治的特点，已纳入农业农村部新修订的《一类农作物病虫害名录》；另外考虑到南方锈病的危害，2021年新修订的玉米品种审定标准(国家级)特别强调了新审品种对南方锈病的抗性。
郑单958(郑58×昌7-2)和先玉335(PH6WC×PH4CV)作为过去20余年中国种植面积最大的两个品种，其杂种优势模式分别为瑞德×黄改和瑞德×兰卡斯特。两个品种各有优缺点，郑单958表现耐密、广适、耐高温干旱、前期抗倒等优点，但具有晚熟、籽粒脱水慢、后期抗倒性差、籽粒品质一般、出籽率低等缺点，对镰孢茎腐病抗性表现较差，不抗南方锈病；先玉335表现广适、早熟、籽粒脱水快、后期抗倒、品质好、出籽率高等优点，但有不耐高温干旱、前期不抗倒、不耐瘠薄等缺点，对镰孢茎腐病抗性较好，对小斑病抗性一般，不抗南方锈病。气候的变化和病害压力的增大使黄淮海区域种植面积最大的两个品种‘郑单958’和‘先玉335’的综合抗性下降。
针对黄淮海的生态特征，确立了多抗、早熟、广适、稳产的育种目标。基于‘郑单958’和‘先玉335’两个品种的优缺点和互补性，以及两个杂交种父本较强的一般配合力，实施“稳定父本，放开母本”的杂交组合组配思路，通过引进抗病资源，融合国内和国外种质的优点，改良提高母本的抗逆性，和现有父本组配实现杂交种的育种目标，既减少了工作量，又提高了选育效率。
实施例1改良瑞德自交系MD202的培育
基于前期的筛选鉴定工作，选择K22作为抗病种质，郑58为广适抗逆种质，PH6WC为坚杆早熟种质，来构建基础群体，培育多抗自交系。具体操作如下：
(1)2013年夏季，在河南省新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种抗病亲本K22和国内广适亲本郑58种子，以K22作母本，郑58作父本，组配K22×郑58，收获的种子为F1。
(2)2013年冬季，在海南三亚基地，播种自交系PH6WC和F1种子，根据吐丝散粉早晚，组配PH6WC×F1或F1×PH6WC，收获的种子为三交种F1’，其遗传构成为K22/郑58//PH6WC，其平均遗传组份中PH6WC占有约50％，K22和郑58各占约25％，后代选择尽可能保留原有的优点，改良缺点。
(3)2014年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，种植三交种F1’种子1行、每行20-30株，在散粉吐丝期，在三交种F1’中选择5-10株的花粉进行混合后，对5-10株三交种F1’的花丝进行授粉，收获的种子脱粒后混合保存，形成基础群体S0。
(4)2014年冬季，在海南三亚基地，播种S0代种子500-1000株，全部自交，田间收获时，依据海南气候导致的自然发病及结实情况，病害调查按照玉米抗病鉴定方法(王晓鸣，玉米病虫害田间手册-病虫害鉴别与抗性鉴定.北京：中国农业科学技术出版社，2010)，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级。针对南方锈病，要求病级≤3；针对茎腐病要求茎基部及气生根均为绿色，无干枯失绿症状；针对穗腐病要求镰孢菌引起的病籽粒率＜2％(表1)；结实性通常要求选择收获的自交穗结籽率≥70％。基于同时满足对上述三种病害表现抗病的单株及结籽率≥70％的自交穗进行收获，共收获360株，单穗脱粒保存，作为S1世代。
表1玉米主要病害抗性评价标准
病害类别 高抗(HR) 抗(R) 中抗(MR) 感(S) 高感(HS)
茎腐病(病株率％) 0～5.0 5.1～10.0 10.1～30.0 30.1～40.0 40.1～100.0
小斑病(病级) 1 3 5 7 9
镰孢穗腐病(病籽率％) 0～1.0 2～10 11～25 26～50 51～100
弯孢叶斑病(病级) 1 3 5 7 9
瘤黑粉病(病株率％) 0～5.0 5.1～10.0 10.1～20.0 20.1～40.0 40.1～100.0
南方锈病(病级) 1 3 5 7 9
(5)2015年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，按穗行种植S1世代360行，每行15-20株，全部自交。田间收获时，依据黄淮夏播区常发病害及结实情况，病害调查按照玉米抗病鉴定方法(王晓鸣，2010)，重点对南方锈病、茎腐病、穗腐病和小斑病等主要病害的抗性进行选择；结实性通常要求选择收获的自交穗结籽率≥50％。单株选择时，对南方锈病、茎腐病和穗腐病的抗性要求同上述步骤(4)的要求，对小斑病的抗性要求病级≤3，此外，在这些抗病单株中要选择结实性和品质较好的单株进行收获，结实性的要求为穗行数在12行以上，穗长＞12cm，穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙，单穗结籽率通常≥50％。按照上述目标共选择80个单株收获，单穗脱粒保存，为S2世代。
(6)2015年冬季，在海南三亚基地，播种S2代穗行80行，每行10-15株。散粉吐丝期，选择兰卡斯特血源代表性自交系PH4CV作为测验种，与每个穗行中随机选择一株做母本进行测交，获得80个测交组合，收获的种子为F1”；在收获时，先收获80个测交组合的种子。
剩余株全部自交，对自交单株，按照上述步骤(4)的要求，每行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择穗长＞12cm、单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，单穗脱粒保存，为S3世代。
(7)2016年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种S3世代穗行80行，每行10-15株，全部自交，以备依据测交产量结果再确定穗行收获。
将2015年冬季在海南三亚基地组配的80测交组合的种子F1”，分别种植在豫南西华(通常病害多样且较重，属于中低产田)和豫北原阳(通常病害较轻，属于高产田)两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置杂交种先玉335(PH6WC×PH4CV)作为对照，成熟期收获，计算产量及相对于对照组的增产百分比。
只有当某一测交组在两个试验点的产量均比对照增产5％以上时，才确定保留其母本所属穗行，收获其相对应穗行的S3世代的自交种。
其中，共有15个S2世代穗行组配的测交组合产量超过对照组产量5％，在其传下来的15个S3世代穗行中进行选择收获。收获时，按照上述步骤(5)的要求，在目标行中首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病作为备选株，再选择结实较好(单穗结籽率≥50％)、品质较优(穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙)的单株进行收获，共收获15个单穗并单独脱粒保存，为S4世代。
(8)2016年冬季，在海南三亚基地，播种S4世代15个穗行，每行10-15株。散粉吐丝期，分别选择兰卡斯特血源代表性自交系PH4CV和PHB1M作为父本，与每个穗行中随机选择2株做母本进行测交，获得30个测交组合，收获的种子为F1”’。在收获时，先收获30个测交组合的种子用于夏播测试。
剩余株全部自交。对自交单株，按照上述步骤(4)的要求，每行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，单穗脱粒保存，为S5世代。
(9)2017年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种S5世代15个穗行，每行10-15株，全部自交，以备依据测交组合抗性及产量来确定其母本所属穗行再进行收获。
同步骤(7)的方法，将30个测交组合的种子F1”’在夏播区进行多点鉴定。2017年夏播将测交组合F1”’分别种植在豫南西华县和豫北原阳县两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置杂交种先玉335(PH6WC×PH4CV)作为对照。
收获前，按照步骤(5)的方法，田间调查每个测交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害表现中抗以上的测交组合，成熟期收获，计算产量及相对于对照组的增产百分比。
根据两个地点田间的抗病性和产量结果，确定两个试验地点相对于对照组产量均增产5％以上的测交组合来源的穗行，收获相对应穗行的S5世代的自交种。
其中，仅有1个穗行与两个测验种(PH4CV和PHB1M)的测交组合在两个地点的增产均在5％以上，且对四种病害的抗性均在中抗以上，命名该穗行为MD202。收获时，对自交单株，按照上述步骤(5)的要求，在目标行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病作为备选株，再选择结实较好(单穗结籽率≥50％)、品质较优(穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙)的单株进行收获，单穗脱粒保存，为S6世代，即为创制的多抗玉米种质，可用于杂交种的组配。
(10)2017年冬季，在海南三亚基地，播种MD202(S6世代)2行，每行10-15株，其中一行全部自交，该世代尽管已经基本纯合，但仍需要首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，混合脱粒保存，为S7世代，保存备用。
自交系的农艺性状和抗病性：2018年夏季，同时种植PH6WC和MD202(S7世代)进行性状调查和比较，分别种植在新乡市平原示范区河南农科院试验地和周口市西华县黄泛区农场(该地区病害通常较重)，前者主要调查农艺性状，后者主要调查抗病性。抗病性按照玉米抗病鉴定方法(王晓鸣，2010)(表1)，对主要病害进行了抗性鉴定。
农艺性状的调查表明MD202和PH6WC在雄穗特征和穗部特征间有明显的差别(表2)。与PH6WC的抗病性相比，MD202对小斑病、茎腐病和南方锈病的抗性显著提升(表3)。
表2改良系与近似亲本农艺性状的比较
表3改良系与近似亲本的抗病性比较
注：HR表示高抗，R表示抗，MR表示中抗，S表示感，HS表示高感。
实施例2改良瑞德自交系MR652的培育
针对黄淮海的生态特征和‘郑单958’的抗病性和后期抗倒性不足问题，确立了多抗、广适、稳产的育种目标，通过提高郑58的抗性，实现杂交种的改良。
基于前期的筛选鉴定工作，选择K22作为抗病种质，郑58为广适抗逆种质，XL21为坚杆种质，构建基础群体，培育多抗自交系。具体操作如下：
(1)2014年夏季，在河南省新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种抗病亲本K22和国外坚杆亲本XL21，选择以K22作母本，XL21作父本，组配K22×XL21，收获的种子为F1。
(2)2014年冬季，在海南三亚基地，播种自交系郑58和F1种子，根据实际的散粉吐丝情况，按照郑58×F1或F1×郑58组配，收获的种子为三交种F1’，其遗传构成为K22/XL21//郑58，其遗传组成中郑58平均约占50％，K22和XL21各约占25％。
(3)2015年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，种植三交种F1’种子1行，每行20-30株，在散粉吐丝期，在三交种F1’中选择5-10株的花粉进行混合后，对5-10株三交种F1’的花丝进行授粉，收获的种子脱粒后混合保存，形成基础群体S0。
(4)2015年冬季，在海南三亚基地，播种S0代种子500-1000株，全部自交，田间收获时，田间收获时，依据海南气候导致的自然发病情况，按照玉米抗病鉴定方法(王晓鸣，玉米病虫害田间手册-病虫害鉴别与抗性鉴定.北京：中国农业科学技术出版社,2010.)，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级(表1)。针对南方锈病，要求病级≤3；针对茎腐病要求茎基部及气生根均为绿色，无干枯失绿症状；针对穗腐病要求镰孢菌引起的病籽粒率＜2％。基于同时满足对上述三种病害表现抗病的单株进行收获，按照上述操作，共选择性收获310株，单穗脱粒保存，作为S1世代。
(5)2016年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，按穗行种植S1世代310行，每行15-20株，全部自交。田间选择单株收获时，依据黄淮夏播区自然发病情况，同样按照玉米抗病鉴定方法(王晓鸣，2010)，重点对南方锈病、茎腐病、穗腐病和小斑病等主要病害的抗性进行选择。单株选择时，对南方锈病、茎腐病和穗腐病的抗性要求同上述步骤(4)的要求，对小斑病的抗性要求病级≤3。首先要选择抗南方锈病单株，这些单株同时也要对茎腐病、穗腐病和小斑病表现抗病，此外，在这些抗病单株中要选择结实性和品质较好的单株进行收获，结实性的要求为穗行数在12行以上，穗长＞15cm，穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙，单穗结籽率通常在50％以上。按照上述目标共选择85个单株，单穗脱粒保存，为S2世代。
(6)2016年冬季，在海南三亚基地，播种S2代穗行85行，每行10-15株。散粉吐丝期，选择黄系种质代表性自交系昌7-2作为测验种，与每个穗行中随机选择一株做母本进行测交，获得85个测交组合，收获的种子为F1”；在收获时，先收获85个测交组合的种子。
剩余株全部自交。对自交单株，按照上述步骤(4)的要求，每行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择穗长12cm以上、单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，单穗脱粒保存，为S3世代。
(7)2017年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种S3世代穗行85行，每行10-15株，全部自交，以备依据测交产量结果确定其母本所属穗行再进行收获。
另外，将2016年冬季在海南三亚基地组配的85测交组合的种子F1”，分别种植在豫南的西华和豫北的原阳两个试验点，按间比法排列，每10个组合设置杂交种郑单958(郑58×昌7-2)作为对照，成熟期收获，计算产量及相对于对照组的增产百分比。
只有当某一测交组在两个试验点的产量均比对照增产5％以上时，才确定保留其母本所属穗行，收获相对应穗行的S3世代的自交种。
其中，共有18个S2世代穗行的测交组合产量超过对照组产量的5％，在其传下来的18个S3世代穗行中进行选择收获。收获时，按照上述步骤(5)的要求，在目标行中首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病作为备选株，再选择结实较好(单穗结籽率≥50％)、品质较优(穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙)的单株进行收获，共收获18个单穗并单独脱粒保存，为S4世代。
(8)2017年冬季，在海南三亚基地，播种S4世代18个穗行，每行10-15株。散粉吐丝期，分别选择昌7-2和798-1两个常用的黄改系作为测验种(父本)，与每个穗行中随机选择2株做母本进行测交，获得36个测交组合，收获的种子为F1”’。在收获时，先收获测交组合的种子用于夏播测试。
剩余株全部自交。对自交单株，按照上述步骤(4)的要求，每行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，单穗脱粒保存，为S5世代。
(9)2018年夏，在新乡市平原示范区河南农科院试验地，播种S5世代18个穗行，每行10-15株，全部自交，以备依据测交产量结果来确定穗行再进行收获。
同步骤(7)的方法，将36测交组合的种子F1”’，随机排列分别种植在豫南西华县和豫北原阳县两个试验点，按照间比法排列，设置杂交种郑单958作为对照。
收获前，按照上述步骤(5)的要求方法，田间调查每个测交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害表现中抗以上的测交组合，成熟期收获，计算产量及相对于对照组的增产百分比。
根据两个点的抗病性和测交产量结果，确定两个试验点相对于对照组产量均增产5％以上的测交组合来源的穗行，收获相对应穗行的S5世代的自交种。
其中，在收获的测交组合中，仅有1个穗行与两个测验种(昌7-2和798-1)组配的测交组合在两个地点的增产均在5％以上，命名该穗行为MR652。收获时，对自交单株，按照上述步骤(5)的要求，在目标行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病作为备选株，再选择结实较好(单穗结籽率≥50％)、品质较优(穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄或橙)的单株进行收获，单穗脱粒保存，为S6世代。
(10)2017年冬季，在海南三亚基地，播种MR652(S6世代)2行，每行10-15株，其中一行全部自交，该世代尽管已经基本纯合，但仍需要首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病作为备选株，再选择单穗结籽率在70％以上的良好单株进行收获，混合脱粒保存，为S7世代，保存备用，用于杂交组合的选育。
自交系的农艺性状和抗病性：2018年夏季，同时种植郑58和MR652(S7世代)进行性状调查和比较，分别种植在新乡市平原示范区河南农科院试验地和周口市西华县黄泛区农场(该地区病害通常较重)，前者主要调查农艺性状，后者主要调查抗病性。抗病性按照玉米主要病害抗性评价标准(表1)，对主要病害进行抗性鉴定。
农艺性状的调查表明郑58和MR652在雄穗特征和穗部特征间差别不明显(表4)。但与郑58抗病性相比，MR652对小斑病、茎腐病和南方锈病的抗性显著提升(表5)。
表4改良系与近似亲本农艺性状的比较
表5改良系与近似亲本的抗病性比较
注：HR表示高抗，R表示抗，MR表示中抗，S表示感，HS表示高感。
从以上两实施例可看出，本发明多抗玉米种质的创制方法具有以下特点：(1)找到一个好的抗源，同时兼抗多种病害，且所属类群明确；(2)融合不同种质优点，但最后所属类群清晰；(3)培育的多抗种质可用于杂交种的选育。
培育抗性种质的目的是为了选育优良多抗玉米杂交种。下面就所培育的两个多抗种质(MD202和MR652)用于杂交种的选育及在品种试验中的表现进行说明。
应用例1自交系MD202的杂交组合筛选及品种试验
(1)杂交组合筛选鉴定：
基于MD202的遗传构成(K22/郑58//PH6WC)，可知其为瑞德种质，宜选用具有兰卡斯特血源的种质PH4CV、MD331等(表6)与其进行组配，用于杂交组合的筛选。
2018年夏季，将与MD202组配的杂交组合分别种植在豫南的西华和豫北的原阳，用于杂交组合的筛选和鉴定，两行区，行长4米，不设重复，间比法排列，每10个组合设置先玉335作为对照。9月中旬，玉米成熟前10天左右，田间调查每个杂交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害表现中抗以上的杂交组合，并计算产量。
表6 2018年部分杂交组合产量(公斤/亩)
经选择性收获计算产量，组合MD202×MD331的增产水平最高，两个地点的增产量均在9％以上(表6)，作为优良组合，参加品种审定试验。
(2)品种试验
2018年冬季在海南三亚基地，对亲本MD202和MD331进行扩繁。
2019年冬季，在海南三亚基地组配MD202×MD331杂交组合F1，将该组合命名为豫保202，参加2020年河南省玉米新品种比较试验(5000株/亩密度组)，河南省种子协会对11个试点的汇总结果表明，豫保202平均亩产670.0kg，比对照增产6.0％，增产点率81.8％，在50个参试品种中排名20，田间病害调查结果表明，豫保202抗小斑病、茎腐病、穗腐病，中抗南方锈病、弯孢叶斑病。因表现优异，升级进入河南省玉米新品种区域试验。
2020年冬季，在海南三亚新组配豫保202(MD202×MD331)F1种子。2021年参加河南省玉米品种区域试验5000株/亩密度组，当年对豫保202的试验结果总结如下：
1)产量表现：2021年区试产量平均亩产565.0kg，比郑单958(CK)平均亩产511.6kg增产10.4％，差异极显著，居试验第10位，试点9增1减，增产点比率为90.0％。
2)特征特性：2021年该品种生育期99.8天，比郑单958早熟1天；株高244cm，穗位高91cm；倒伏率4.1％(0.0％～33.8％)、倒折率1.4％(0.0％～6.1％)，倒伏倒折率之和5.5％，且倒伏倒折率≥15.0％的试点比率为10.0％；空杆率0.4％；双穗率0.4％；茎腐病14.6％(0.0％～80.0％)，穗腐病籽粒霉变比例0.3％(0.0％～1.0％)、且穗腐病籽粒霉变比例≥2.0％的试点比例0.0％，小斑病为1～5级，瘤黑粉病0.1％，弯孢菌叶斑病1～5级，南方锈病1～5级；穗长15.0cm，秃尖长0.7cm，穗粗4.6cm，轴粗2.7cm，穗行数16.2，穗行数变幅12-20行，行粒数31.1，出籽率87.7％，百粒重27.2g；株型紧凑；主茎叶片数18.8片，全生育期叶数变幅17-20片；叶片绿色；芽鞘紫色；第一叶形状匙型；雄穗分枝中等枝长中等，雄穗颖片浅紫色，花药浅紫色；花丝浅紫色，苞叶长度中；果穗短筒型；籽粒半马齿型，黄粒；红轴。
3)抗病性鉴定：据2021年河南农业大学植保学院人工接种鉴定报告显示：该品种抗镰孢菌穗腐病、小斑病；中抗镰孢菌茎腐病；感弯孢叶斑病、瘤黑粉病；中抗南方锈病。
4)品质分析：据2021年农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)对该品种多点套袋果穗的籽粒混合样品品质分析检验报告显示：粗蛋白质10.2％，粗脂肪3.6％，粗淀粉75.15％，赖氨酸0.32％，容重766g/L。
5)试验建议：按照《国家级玉米品种审定标准(2021年修订)》，晋级继续进行区域试验。
2021年冬季，在海南三亚重新组配豫保202(MD202×MD331)F1种子。2022年参加河南省玉米品种区域试验5000株/亩密度组，当年对豫保202的试验总结如下：
1)产量表现：2021年区试产量平均亩产565.0kg，比郑单958(CK)平均亩产511.6kg增产10.4％，差异极显著，居试验第10位，试点9增1减，增产点比率为90.0％。
2022年区试产量平均亩产644.6kg，比郑单958(CK)平均亩产617.3kg增产4.4％，差异不显著，居试验第8位，试点9增2减，增产点比率为81.8％。
综合两年21点次的区试结果：该品种平均亩产606.7kg，比郑单958(CK)平均亩产567.0kg增产7.0％；增产点数：减产点数＝18：3，增产点比率为85.7％。
2)特征特性：2021年该品种生育期99.8天，比郑单958早熟1天；株高244cm，穗位高91cm；倒伏率4.1％(0.0％～33.8％)、倒折率1.4％(0.0％～6.1％)，倒伏倒折率之和5.5％，且倒伏倒折率≥15.0％的试点比率为10.0％；空杆率0.4％；双穗率0.4％；茎腐病14.6％(0.0％～80.0％)，穗腐病籽粒霉变比例0.3％(0.0％～1.0％)、且穗腐病籽粒霉变比例≥2.0％的试点比例0.0％，小斑病为1～5级，瘤黑粉病0.1％，弯孢菌叶斑病1～5级，南方锈病1～5级；穗长15.0cm，秃尖长0.7cm，穗粗4.6cm，轴粗2.7cm，穗行数16.2，穗行数变幅12-20行，行粒数31.1，出籽率87.7％，百粒重27.2g；株型紧凑；主茎叶片数18.8片，全生育期叶数变幅17-20片；叶片绿色；芽鞘紫色；第一叶形状匙型；雄穗分枝中等枝长中等，雄穗颖片浅紫色，花药浅紫色；花丝浅紫色，苞叶长度中；果穗短筒型；籽粒半马齿型，黄粒；红轴。
2022年该品种生育期103.3天，比郑单958早熟2.0天；株高261cm，穗位高94cm；倒伏率0.2％(0.0％～1.0％)、倒折率0.1％(0.0％～0.4％)，倒伏倒折率之和0.3％，且倒伏倒折率≥15.0％的试点比率为0.0％；空杆率1.5％；双穗率0.4％；茎腐病2.8％(0.0％～28.8％)，穗腐病籽粒霉变比例0.1％(0.0％～0.4％)、且穗腐病籽粒霉变比例≥2.0％的试点比例0.0％，小斑病为1～5级，瘤黑粉病0.0％，弯孢菌叶斑病1～3级，南方锈病1～1级；穗长15.9cm，秃尖长0.7cm，穗粗4.5cm，轴粗2.6cm，穗行数15.8，穗行数变幅12-18行，行粒数33.2，出籽率89.5％，百粒重28.1g；株型紧凑；主茎叶片数19.4片，全生育期叶数变幅18-21片；叶片绿色；芽鞘紫色；第一叶形状圆到匙型；雄穗分枝中等枝长中等，雄穗颖片绿色，花药绿色；花丝浅紫色，苞叶长度中；果穗短筒型；籽粒半马齿型，黄粒；红轴。
3)抗病性鉴定：据2021年河南农业大学植保学院人工接种鉴定报告：该品种抗镰孢菌穗腐病、小斑病；中抗镰孢菌茎腐病；感弯孢叶斑病、瘤黑粉病；中考南方锈病。
据2022年河南农业大学植保学院人工接种鉴定报告：该品种高抗瘤黑粉病；抗茎腐病、小斑病、镰孢穗腐病、弯孢霉叶斑病、南方锈病。
4)品质分析：据2021年农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)对该品种多点套袋果穗的籽粒混合样品品质分析检验报告：粗蛋白质10.2％，粗脂肪3.6％，粗淀粉75.15％，赖氨酸0.32％，容重766g/L。
据2022年农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)对该品种多点套袋果穗的籽粒混合样品品质分析检验报告：粗蛋白质10.8％，粗脂肪3.4％，粗淀粉73.61％，赖氨酸0.33％，容重787g/L。
5)试验建议：按照《国家级玉米品种审定标准(2021年修订)》，区域试验各项指标达标，推荐参加生产试验。
豫保202经2020-2022年连续3年的品种试验，均表现优异，推荐参加2023年生产试验，若达标即可审定。
以上结果表明，用该发明创制的多抗种质MD202可用于优良杂交种的选育。应用例2自交系MR652的杂交组合筛选及品种试验
(1)杂交组合筛选鉴定：
选用自选系昌7-2、MR953等(表7)具有黄改血源的自交系做父本，与改良的瑞德种质MR652(K22/XL21//郑58)做母本进行组配，用于夏播区田间杂交组合的筛选鉴定。
2018年夏季，将与MR652组配的杂交组合分别种植在豫南的西华和豫北的原阳，用于杂交组合的筛选和鉴定，两行区，行长4米，不设重复，间比法排列，每10个组合设置郑单958作为对照。9月中旬，玉米成熟前10天左右，田间调查每个杂交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害表现中抗以上的杂交组合，并计算产量(表7)。
表72018年部分杂交组合产量(公斤/亩)
经选择性收获计算产量，组合MR652×MR953的增产水平最高，两地点的增产量均在6％以上，可考虑作为优良组合，参加品种审定试验。
(2)品种试验
2020年冬季在海南三亚基地，对亲本MR652和MR953进行扩繁。
2021年冬季在海南三亚基地，组配MR652×MR953杂交组合F1种子。将该组合命名为豫保692，参加河南华科农作物联合体组织的2022年新品种区域试验(5000株/亩密度)，对豫保692的试验结果总结如下：
黄淮海夏播区37个试点汇总，平均亩产645.3千克，比对照郑单958增产5.8％，位次3，增产点比例86.5％。特征特性：生育期102.9天，比对照郑单958早熟0.5天。幼苗叶鞘紫色，株型半紧凑，株高257厘米，穗位高108厘米，全生育期叶片数21片，雄穗分枝中等枝长中等，花药绿色，花丝绿色。穗型短筒型，果穗茎秆角度小，穗长17.8厘米，苞叶中等，穗行数14-20行，秃尖长0.6厘米，穗轴白色，籽粒黄色，马齿型，百粒重30.9克。倒伏率0.5％，倒折率1.0％，空秆率1.2％。田间抗性：小斑病5级，茎腐病10.9％，穗腐病1.8％，弯孢叶斑病5级，瘤黑粉病0.0％，南方锈病5级。
2022年在山东农业大学植物保护学院进行抗性评价，结果如下：抗小斑病，高抗瘤黑粉病，中抗穗腐病，高感弯孢叶斑病，高抗茎腐病，中抗南方锈病。
试验建议：按照《国家级玉米品种审定标准(2021年修订)》晋级标准，2023年继续进行区域试验。
以上结果初步表明，用该发明创制的多抗种质MR652也可用于优良杂交种的选育。

Claims (10)

1.一种多抗玉米种质的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以抗病种质P1作母本，以抗逆广适种质P2作父本，组配P1×P2，收获的种子为F1；选择坚杆早熟种质P3，组配P3×F1或F1×P3，收获的种子为三交种F1’；
或，以抗病种质P1作母本，以坚杆早熟种质P3作父本，组配P1×P3，收获的种子为F1；选择抗逆广适种质P2，组配P2×F1或F1×P2，收获的种子为三交种F1’；
(2)种植三交种F1’，在散粉吐丝期，在三交种F1’中选择5-10株的花粉进行混合，对5-10株三交种F1’的花丝进行授粉，收获的种子脱粒后混合保存，形成基础群体S0；
(3)播种基础群体S0代种子，全部自交，田间收获时，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，收获同时满足抗南方锈病、茎腐病、穗腐病的单株，单穗脱粒保存，为S1世代；
(4)按穗行种植S1世代种子全部自交，收获时按玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择同时满足抗南方锈病、茎腐病、穗腐病、小斑病的单株，同时选择结实性和品质好的单株收获，单穗脱粒保存，得到S2世代；
(5)按穗行种植S2世代种子，在散粉吐丝期，按照杂种优势群，选择1个常用自交系作为测验种，与每个穗行中随机选择一株做母本进行测交，收获的种子为F1”；
每个穗行中剩余株全部自交，收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择良好单株收获，单穗脱粒保存，得到S3世代；
(6)按穗行种植S3世代种子，全部自交；
将测交组合的种子F1”，分别种植在中低产田和高产田两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置一个杂交种作为对照，成熟期收获，并计算产量；
只有当某一测交组在两个试验点的产量均比对照增产5％以上时，才确定保留其母本所属穗行并收获其相应的S3世代的自交种；
收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择结实好、品质优的单株收获，单独脱粒保存，得到S4世代；
(7)按穗行种植S4世代种子，在散粉吐丝期，在每个穗行中随机选择2株做母本，按照杂种优势群，选择2个常用自交系分别作为父本，与母本分别进行测交，收获的种子为F1”’；
每个穗行中剩余株全部自交，收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，选择结实好、品质优的单株收获，单独脱粒保存，得到S5世代；
(8)按穗行种植S5世代种子，全部自交；
将测交组合的种子F1”’，分别种植在中低产田和高产田两个试验点，按照间比法排列，每10个组合设置一个杂交种作为对照；
收获前，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，田间调查每个测交组合对茎腐病、南方锈病、小斑病和穗腐病的抗性水平，只收获对上述4种病害均表现中抗以上的测交组合，并计算产量；
根据两个试验点的测交组合F1”’的抗病性和产量，确定两试验点相对于对照产量均增产5％以上的测交组合来源的穗行，收获相应穗行S5世代的自交种；
收获时，对S5世代的自交单株，按照玉米抗病鉴定方法，对主要病害抗性进行鉴定和调查分级，在目标行中，首先选择兼抗南方锈病、穗腐病、茎腐病、小斑病的单株作为备选株，再选择结实好、品质优的单株进行收获，单穗脱粒保存，为S6世代，即为多抗玉米种质。
2.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，所述抗病种质P1为K22，抗逆广适种质P2为郑58，坚杆早熟种质P3为PH6WC或XL21。
3.如权利要求2所述的创制方法，其特征在于，以抗病种质K22作母本，以抗逆广适种质郑58作父本，组配K22×郑58，收获的种子为F1；选择坚杆早熟种质PH6WC，组配PH6WC×F1或F1×PH6WC，收获的种子为三交种F1’。
4.如权利要求2所述的创制方法，其特征在于，以抗病种质K22作母本，以坚杆早熟种质XL21作父本，组配K22×XL21，收获的种子为F1；选择抗逆广适种质郑58，组配郑58×F1或F1×郑58，收获的种子为三交种F1’。
5.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，所述收获时对主要病害抗性进行鉴定和调查分级时，如在海南南繁种植，所调查的病害主要为南方锈病、茎腐病和穗腐病，收获的自交穗通常要求结籽率≥70％；
如在河南夏播区种植，所调查的病害主要为南方锈病、小斑病、茎腐病和穗腐病，收获的自交穗通常要求结籽率≥50％；针对南方锈病，要求病级≤3；针对茎腐病要求茎基部及气生根均为绿色，无干枯失绿症状；针对穗腐病要求镰孢菌引起的病籽粒率＜2％，针对小斑病要求病级≤3。
6.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，收获时，结实性的要求为穗行数在12行以上，穗长＞12cm，品质优良的穗中部籽粒顶端颜色通常为橘黄色或橙色；夏播时单穗结籽率≥50％；南繁时单穗结籽率≥70％。
7.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，测验种为兰卡斯特种质时，常用自交系为PH4CV或PHB1M；测验种为黄改种质时，常用自交系为昌7-2或798-1。
8.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，所述杂交种为先玉335或郑单958。
9.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于，步骤(3)播种基础群体S0代种子500-1000株；步骤(4)按穗行种植S1世代300-400行，每行15-20株；步骤(5)播种S2世代穗行80-90行，每行10-15株；步骤(6)播种S3世代穗行80-90行，每行10-15株；步骤(7)播种S4世代15-20个穗行，每行10-15株；步骤(8)播种S5世代15-20个穗行，每行10-15株。
10.如权利要求1所述的创制方法获得的多抗玉米种质在杂交种选育中的应用。
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