CN116519638A - 一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器及其检测方法。本发明中的多角度光散射检测器包括流通样品池、设置在不同角度的用于静态光散射采集的PD1‑PD5检测器、激光器、平凸透镜a、平凸透镜b、数据采集卡以及控制单元，其中激光器发射的激光通过透镜组照射到流通样品池中的样品上，PD1‑PD5光电二极管检测器同时接收样品的散射光，并通过数据采集卡将信号传输至控制单元；本发明实现对于高分子和蛋白样品分子量及其分布的准确和高分辨率的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种多角度光散射检测器，具体为一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器及其检测方法。
背景技术
高分子是一类具有较高分子量的物质，一般指分子质量高达几千至几百万的化合物。高分子的分子量和分子量分布与其性能具有密切相关性。当前有多种检测高分子物质分子量的测试技术，如端基滴定法(检测数均平均分子量Mn)，粘度法(检测粘均平均分子量Mv)，单管静态光散射(检测重均平均分子量Mw)，这些技术都只能检测平均分子量。
凝胶渗透色谱法GPC可以得到分子量分布。传统的凝胶渗透色谱法GPC使用一个示差折光检测器或者一个紫外检测器检测样品的流出时间和浓度信息，通过使用一系列不同分子量的窄分布标准样品绘制校正曲线，测试过程中色谱柱对于样品进行分离，由校正曲线得到每个组份样品的分子量，进而得到相对于标准样品的分子量分布和平均分子量(Mw，Mn，Mz)。传统的凝胶渗透色谱法检测得到的是相对分子量信息，而不是样品的绝对分子量信息，虽然得到广泛的应用，但是具有很大的局限性。首先相对分子量和样品的各种性质(如强度、韧性、粘度等)的相关性不好，其次当样品具有额外的结构信息(如支化、超支化高分子，或者蛋白样品)时，相对分子量和绝对分子量之间可能具有数倍的差异，而且相对分子量的测试结果很容易受到色谱泵精度、色谱柱牌号和组合、色谱柱老化，柱温箱温度波动等因素的影响。
发明内容
针对现有分子量检测技术仅能得到平均分子量或者相对分子量分布的问题，本发明提供一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器及其检测方法，可以得到样品的绝对分子量和分子量分布。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器，用于检测样品的分子量及其分布，适用于与完整的前端分离设备凝胶渗透色谱GPC、体积排阻色谱SEC和凝胶过滤色谱GFC连接使用，其中前端分离设备中至少包含一个示差折光检测器或者一个紫外检测器，可以利用色谱柱依赖于样品组份的大小将每个组份分离，并依次流出。本发明中的多角度光散射检测器包括流通样品池、设置在不同角度的用于静态光散射采集的PD1-PD5光电二极管检测器、激光器、平凸透镜a、平凸透镜b、数据采集卡以及控制单元，其中激光器发射的激光通过透镜组照射到流通样品池中的样品上，PD1-PD5检测器同时接收样品的散射光，并通过数据采集卡将信号传输至控制单元。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器，其优选方案为，可以在不同角度上配置1-5个PD检测器以应对于不同分子量范围的检测需求，其中PD1设置在与激光正交的90°，PD2设置在≤9°方向，PD3设置在≥170°方向，PD4设置在35°-55°方向，PD5设置在125°-145°方向。
一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，PD1-PD5检测器收集不同角度静态光散射信号，结合示差折光检测器或者紫外检测器的信号，通过瑞利散射方程，计算得到每个流出组份的绝对分子量信息，继而得到重均平均分子量Mw，数均平均分子量Mn，Z-均平均分子量Mz、分子量分布系数PD＝Mw/Mn，同时可以得到分子量实际分布曲线信息。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，当只配置一个设置在与激光正交的90°检测器PD1时，只能准确检测散射不依赖于角度的均匀散射样品。根据瑞利散射方程，样品的分子尺寸(均方旋转半径Rg)不超过激光波长的1/20，即可认为是均匀散射；以635nm入射光为例，均匀散射对应的样品尺寸上限为Rg不超过31.8nm，对应的球状蛋白的分子量理论计算值约为2000万Da，线性多糖分子理论计算值约为50万Da，超支化高分子聚合物依赖其结构理论计算值为1500万Da至25000万Da。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，当配置一个设置在≤9°方向的检测器PD5和PD1-PD4中任意一个检测器，均可以通过外推得到0°角的散射信息，根据瑞利散射方程可以检测到的样品分子量上限不受限制。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，当配置两个或者两个以上PD检测器时，可以通过绘制Zimm曲线，由Zimm曲线斜率得到样品的均方旋转半径Rg的信息。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，已知样品的折光指数增量dn/dc和紫外吸收增量dA/dc前提下，还可以通过为示差折光检测器或者紫外检测器信号设定基线和积分范围计算对应范围内样品的绝对浓度，其浓度单位为mg/mL。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，流通样品池具有极低的容积(小于30μL)，可以最大限度的防止样品在流通池中的扩散效应。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，采用静态光散射技术进行测试时具有极高的采样速率，最快一个数据点采样时间为0.2秒，即通过0.2秒测试可以得到一个流出组份的分子量结果。
所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其优选方案为，数据采集卡可以接收前端分离设备所发出的模拟或者数字信号的触发信号，由触发信号命令自动开始进行测试。其中软件收到触发信号时刻为测试起始时间，测试总时长由操作者根据实际样品流出时间决定。
本发明具有以下有益效果及优点：
1.本发明中设备和方法适用于与完整的前端分离设备凝胶渗透色谱GPC或者体积排阻色谱SEC或者凝胶过滤色谱GFC连接使用，其中前端分离设备中至少包含一个示差折光检测器或者一个紫外检测器，可以利用色谱柱依赖于样品组份的大小将每个组份分离，并依次流出。本发明中的多角度光散射检测器收集不同角度静态光散射信号，结合示差折光检测器或者紫外检测器的信号，通过瑞利散射方程，计算得到每个流出组份的绝对分子量信息，继而得到重均平均分子量Mw，数均平均分子量Mn，Z-均平均分子量Mz、分子量分布系数PD＝Mw/Mn，同时可以得到分子量实际分布曲线信息；
2.本发明中的多角度光散射检测器与前端色谱装置连用，在测试过程中不需要使用一系列不同分子量的窄分布标准样品绘制校正曲线，测试结果不依赖于样品信号的流出时间，测试得到的绝对分子量结果受到色谱泵精度、色谱柱牌号和组合、色谱柱老化，柱温箱温度波动等因素的影响很小。结果准确性高，重复性好，操作更加简便；
3.本发明广泛应用于生物制药、高分子聚合物材料、食品、农业科研、电子、环境等研究应用领域。该设备具有很好的推广和实用价值，广泛的推广应用后会产生良好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器电气原理框图；
图2为本发明和前端分离设备连用结构示意图；
图3为多角度检测器核心光路俯视示意图；
图4为流通样品池侧视结构示意图；
图5为光阑结构示意图；
图6为多角度光散射检测器通过设置在多个角度的PD检测器得到的散射光信号绘制的Zimm曲线；
图7为静态光散射结果示意图和计算得到的分子量结果示意图。
图中：1-激光，2-流通样品池，3-流通样品池入口端，4-流通池出口端，5-光阑a，6-光阑b，7-反射镜a，8-反射镜b，9-平凸透镜a，10-平凸透镜b，11-PD1方向散射光，12-PD1检测器，13-PD2方向散射光，14-PD2检测器，15-PD3方向散射光，16-PD3检测器，17-PD4方向散射光，18-PD4检测器，19-PD5方向散射光，20-PD5检测器，21-PD信号传输线，22-样品，30-流路，51-入射光通光孔，52-散射光通光孔。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步阐述。
如图1所示，本发明提供一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器，包括流通样品池、PD1-PD5光电二极管检测器、激光器、平凸透镜a、平凸透镜b、数据采集卡，其中激光器发射的激光通过平凸透镜a照射到流通样品池中的样品上，PD1-PD5检测器同时接收样品的散射光信号，以及示差折光检测器或者紫外检测器的模拟信号均通过数据采集卡将信号传输至电脑。
如图2所示，与本发明中多角度光散射检测器适用于与完整的前端分离设备(凝胶渗透色谱GPC或者体积排阻色谱SEC或者凝胶过滤色谱GFC)连接使用，其中前端分离设备中至少包含一个示差折光检测器或者一个紫外检测器。前端分离设备可以进行进样，样品在流动过程中通过色谱柱以样品组份的尺寸进行分离，并依次流出，被分离的样品组份依次流经示差折光检测器或者紫外检测器和多角度光散射检测器。前端分离设备的触发信号和示差折光检测器或者一个紫外检测器的输出的模拟信号可以输入到本发明多角度光散射检测器中，通过数据采集卡进行收集，在传输给本发明软件系统，用于计算。前端的色谱泵和自动进样器直接与PC端软件通讯，用于控制色谱泵流速和进样。
如图3所示，为通过本发明多角度检测器核心光路俯视示意图，包括用于照射样品的激光1、流通样品池2、样品通过流通样品池入口端3进入流通样品池2，通过流通池出口端4流出流通样品池2，设置在激光入射端的光阑a5和出射端的光阑b6用于激光通过和限制特定角度散射光出射，设置在激光入射端的带通孔的反射镜a7和出射端的带通孔的反射镜b8用于激光通过和将PD2和PD3方向的散射光反射进入PD2和PD3检测器，在流通样品池两端的平凸透镜a9和平凸透镜b10用于激光汇聚和将检测点发散的散射光转为平行光，PD1检测器12设置在和激光成90°正交方向接收90°角PD1方向散射光11，并通过PD信号传输线21传输到信号采集卡，PD2检测器14设置在≤9°方向，接收前向角PD2方向散射光13，并通过PD信号传输线21传输到信号采集卡，PD3检测器16设置在≥170°方向，接收后向角PD3方向散射光15，并通过PD信号传输线21传输到信号采集卡，PD4检测器18设置在35°-55°方向，接收侧向角PD4方向散射光17，并通过PD信号传输线21传输到信号采集卡，PD5检测器20设置在125°-145°方向，接收侧向角PD5方向散射光19，并通过PD信号传输线21传输到信号采集卡。
如图4所示，为本发明中所使用的流通样品池侧视图，样品22经由流通样品池入口端3流入，经由流通样品池出口端4流出，样品22的流路30为通孔，通孔左右两端与平凸透镜a9和平凸透镜b10平面接触，并使用平凸透镜平面密封，激光从左向右入射。流通样品池2侧壁为透明石英材料，散射光可以通过侧壁和前后激光通光方向射出。流通池容积极低，不超过30μL，可以最大限度的防止扩散效应造成的对于检测分辨率的影响。
如图5所示，为本发明中所使用的光阑结构示意图，光阑中间为入射光通光孔51，用于激光通过，外侧为散射光通光孔52，用于样品散射光通过。
如图6所示，为本发明中所使用用于计算分子量和均方旋转半径Rg的Zimm曲线示意图。通过每个PD检测器得到的散射光信号和示差折光检测器(或者紫外检测器)信号，计算对应的Kc/R值，并以角度Sin2(θ/2)进行外推，其0°对应的截距为分子量倒数1/Mw，其斜率正比于均方旋转半径Rg2。
如图7所示，在测试过程中，使用PD检测器收集样品散射光强度信号，并同时收集示差折光检测器或者紫外检测器信号。静态光散射散射光收集频率为1-5Hz(最快0.2秒一个点)，示差折光检测器或者紫外检测器信号收集频率与静态光散射信号收集频率相同。测试结束后，对于静态光散射信号和示差折光检测器或者紫外检测器信号进行基线设置和积分设置，定义需要计算的区域。通过将实际检测到的响应信号值减去对应流出体积的基线值，得到信号的净响应值，结合样品的dn/dc(示差折光检测器)或者dA/dc(紫外检测器)，可以计算出对应粒径下样品的浓度信息Ci，将Ci带入瑞利散射方程，结合对应流出体积下的散射光强度LSi，得到对应流出体积的流出组份的分子量Mi。将一组份子量和其对应的浓度数据[Ci,Mi]以分子量为横坐标，浓度(或者相对浓度)为纵坐标进行绘图，就得到了样品的分子量分布曲线，还可以由以下公式
计算出数均平均分子量Mn，重均平均分子量Mw，Z-均平均分子量Mz以及分子量分布PD＝Mw/Mn。还可以通过粒度仪软件设置流出体积的积分范围，计算积分范围内分子量分布，以及通过浓度Ci加和得到积分范围内的样品总浓度。
Claims (10)
1.一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器，其特征在于：检测器用于检测样品的分子量及其分布，适用于与完整的前端分离设备凝胶渗透色谱GPC或者体积排阻色谱SEC或者凝胶过滤色谱GFC连接使用，其中前端分离设备中至少包含一个示差折光检测器或者一个紫外检测器，可以利用色谱柱依赖于样品组份的大小将每个组份分离，并依次流出；多角度光散射检测器包括流通样品池、设置在不同角度的用于静态光散射采集的PD1-PD5光电二极管检测器、激光器、平凸透镜a、平凸透镜b、数据采集卡以及控制单元，其中激光器发射的激光通过透镜组照射到流通样品池中的样品上，PD1-PD5检测器同时接收样品的散射光，并通过数据采集卡将信号传输至控制单元。
2.根据权利要求1所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器，其特征在于：在不同角度上配置1-5个PD检测器，用于应对于不同分子量范围的检测需求，其中PD1设置在与激光正交的90°处，PD2设置在≤9°方向处，PD3设置在≥170°方向处，PD4设置在35°-55°方向处，PD5设置在125°-145°方向处。
3.根据权利要求2所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：PD1-PD5检测器收集不同角度静态光散射信号，结合示差折光检测器或者紫外检测器的信号，通过瑞利散射方程，计算得到每个流出组份的绝对分子量信息，继而得到重均平均分子量Mw，数均平均分子量Mn，Z-均平均分子量Mz、分子量分布系数PD＝Mw/Mn，同时得到分子量实际分布曲线信息；瑞利散射方程关系式如下：
其中K为与(dn/dc)2相关的常数，R为样品散射强度的瑞利比，
Mw为分子量，Rg为样品均方旋转半径，q为光学矢量因子，
其中n为流动相折光指数，λ为激光波长，θ为散射角度。
4.根据权利要求3所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：当只配置一个设置在与激光正交的90°检测器PD1时，只能准确检测散射不依赖于角度的均匀散射样品；根据瑞利散射方程，样品的分子尺寸-均方旋转半径Rg，不超过激光波长的1/20，即为均匀散射。
5.根据权利要求3所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：当配置一个设置在≤9°方向的检测器PD5和PD1-PD4中任意一个检测器时，均能够通过外推得到0°角的散射信息，根据瑞利散射方程检测到的样品分子量上限不受限制。
6.根据权利要求3所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：当配置两个或者两个以上PD检测器时，可通过绘制Zimm曲线，由Zimm曲线斜率得到样品的均方旋转半径Rg的信息。
7.根据权利要求3所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：在已知样品的折光指数增量dn/dc和紫外吸收增量dA/dc前提下，通过为示差折光检测器或者紫外检测器信号设定基线和积分范围计算对应范围内样品的绝对浓度，其浓度单位为mg/mL。
8.根据权利要求3所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：流通样品池的容积小于30μL，能够最大限度的防止样品在流通池中的扩散效应。
9.根据权利要求1所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：采用静态光散射技术进行测试时，采样速率,高，最快一个数据点采样时间为0.2秒，即通过0.2秒测试得到一个流出组份的分子量结果。
10.根据权利要求1所述的一种基于静态光散射技术的多角度光散射检测器的检测方法，其特征在于：数据采集卡接收前端分离设备所发出的模拟或者数字信号的触发信号，由触发信号命令自动开始进行测试；其中软件收到触发信号时刻为测试起始时间，测试总时长由操作者根据实际样品流出时间决定。
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2023
- 2023-02-14 CN CN202310109578.XA patent/CN116519638A/zh active Pending
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