CN116514910A - 烯烃装订的两亲性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种烯烃装订的两亲性肽，通过将烯烃装订和芳香族氨基酸引入到模型肽Tat中，开发了更有效和选择性的肽。这些类似物具有阳离子基团、芳香疏水性基团、全烃交联和刚性α‑螺旋构象，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好的抑菌活性。特别是P3和P10具有一些优势，包括对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有优异的抗菌活性，对红细胞的溶血活性最低，与模型肽Tat相比，在小鼠血浆中更稳定，可产生强效广谱抗菌活性和对抗多药耐药细菌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种烯烃装订的两亲性肽及其制备方法和应用。
背景技术
在成功发现各种抗生素的一段时间内，常规抗生素被广泛应用于细菌感染的治疗。然而，由于其滥用，多药耐药(MDR)病原体感染迅速发展成为一个棘手的问题。根据美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)的报告，预估到2050年，全球每年将涌现出数千万例由抗生素耐药性引起的疾病。迄今为止，临床应用的常规抗生素多为小分子化合物，缺乏抵抗或延缓细菌耐药性的能力。因此，迫切需要发现新的抗菌药物，延缓或抑制细菌耐药的发展。
抗菌肽(AMPs)是一类小分子活性肽，由于其广谱抗菌特性，被认为是抑制多重耐药细菌病原体的理想候选药物。AMPs存在于昆虫、植物、动物和细菌等几乎所有种类的生物体中，并具有独特的非特异性细菌膜破裂机制，限制了细菌病原菌耐药性的产生。AMPs的抗菌机制不同于普通抗生素后者以特定的分子靶标来对抗细菌病原体。值得注意的是，一些AMPs穿透膜而不破坏膜，并与细菌内容物(如核酸或蛋白质)相互作用从而产生抑菌效果。AMPs通常包含这几种二级结构，α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、扩展构象和环。大多数AMPs是多阳离子序列，并且其阳离子和疏水侧链分布于多肽分子的不同区域或表面。AMPs的阳离子残基与细菌膜表面带负电荷的成分之间的相互作用起着至关重要的作用，疏水部分插入到磷脂双层中，导致膜损伤、去极化、裂解甚至导致细菌死亡。已有研究表明，AMPs的疏水性氨基酸，特别是带有芳香环侧链的色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)，它们与磷脂层的亲和力和对细菌膜的渗透性至关重要。因此，AMPs的这些特征是其生物活性的关键。尽管AMPs在替代抗生素治疗耐药细菌引起的感染方面具有巨大潜力，但AMPs的一些局限性，如易降解、全身毒性、高制造成本和抗菌活性不足等问题仍未得到有效的解决。
目前已采用多种化学修饰策略来改善AMPs的缺陷，包括肽的环化、生物等容/生物等电子取代、聚乙二醇化、糖基化、脂肪酸酰化、非天然氨基酸取代天然氨基酸等策略。一个主要的挑战是，天然抗菌肽通常缺乏二级结构，因此容易在体内降解，导致大多数天然抗菌肽抗菌活性一般。近年来，烯烃装订技术被认为是解决这些问题的一种很有前景的方法。通过这种装订方法形成稳定的α-螺旋构象可以干扰酶或其他多肽裂解剂的相互作用从而有效地提高其生物利用度。
Tat是一种来源于HIV转录反式激活蛋白的天然短链细胞穿膜肽，具有随机的螺旋结构，并被报道为分子转运体。CN201611036266.7公开了一种基于Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法，其公开的四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的已知晓了，且溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度未达到最低溶血浓度。暂时未见公开基于Tat的具有稳定二级结构的抗菌肽的报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种烯烃装订的两亲性肽，通过将烯烃装订和芳香族氨基酸引入到模型肽Tat中，开发了更有效和选择性的肽，制备的肽可产生强效广谱抗菌活性和对抗多药耐药细菌。
具体地，本申请提出了两亲性肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12中的任意一种：
SEQ ID NO.1(P1)：WGRKS5RRQS5RR-NH2；
SEQ ID NO.2(P2)：FGRKS5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.3(P3)：XaaGRK S5RRQS S5RR-NH2；
SEQ ID NO.4(P4)：YWRK S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.5(P5)：YFRKS S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.6(P6)：YXaaRK S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.7(P7)：YGRW S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.8(P8)：YGRF S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.9(P9)：YGXaaF S5RRQ S5RR-NH2；
SEQ ID NO.10(P10)：YGRK S5RRW S5RR-NH2；
SEQ ID NO.11(P11)：YGRK S5RRF S5RR-NH2；
SEQ ID NO.12(P12)：YGRK S5RRXaa S5RR-NH2；
其中，Xaa为3-(2-萘基)-L-丙氨酸；S5为(2S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸，上述两亲性肽在第5位氨基酸和第9位氨基酸通过用丙氨酸衍生物S5形成烃桥。
其余氨基酸为常见氨基酸，如K为赖氨酸、Q为谷氨酰胺、R为精氨酸、F为苯丙氨酸、W为色氨酸、Y为酪氨酸。
优选地，所述两亲性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10所示。上述两种两亲性肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有优异的抗菌活性，对红细胞的溶血活性最低，与模型肽Tat相比，在小鼠血浆中更稳定。特别是，我们发现P3和P10对临床耐药菌株具有优异的抗菌能力。此外，与本研究中使用的抗生素相比，P3和P10没有产生细菌耐药性。
本发明进一步提出了上述烯烃装订的两亲性肽的制备方法，具体地，在RinkAmide MBHA树脂上通过固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护策略化学合成，并通过用Grubbs一代催化剂进行闭环烯烃复分解反应得到。
更具体地，在制备过程中，溶胀Rink Amide MBHA树脂，脱去Fmoc保护，偶联目标序列C-末端的氨基酸，偶联成功后，然后根据目标肽的序列，从C-端到N-端，依次偶联Fmoc保护氨基酸。最后一个氨基酸偶联成功后，去除Fmoc保护基，使用Grubbs一代催化剂进行闭环烯烃复分解反应环化装订目标多肽，反应持续时间为3-5h，然后裂解、纯化和制备目标多肽。
本发明进一步提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的任意一种或多种烯烃装订的两亲性肽。
优选地，所述药物组合物包括具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的两亲性肽。
本发明还提供了上述两亲性肽和药物组合物在制备抗菌药物中的应用。
其中，所述抗菌药物用于抑制革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌中的至少一种。
有益效果：本申请通过将烯烃装订和芳香族氨基酸引入到模型肽Tat中，开发了更有效和选择性的肽。通过模拟AMPs的阳离子两亲性结构和功能，合成了一系列新型的烯烃装订肽作为潜在的抗菌药物。这些类似物具有阳离子基团、芳香疏水性基团、全烃交联和刚性α-螺旋构象，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好的抑菌活性。特别是P3和P10具有一些优势，包括对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有优异的抗菌活性，对红细胞的溶血活性最低，与模型肽Tat相比，在小鼠血浆中更稳定。特别是，我们发现P3和P10对临床耐药菌株具有优异的抗菌能力。此外，与本研究中使用的抗生素相比，P3和P10没有产生细菌耐药性。P3和P10是AMPs的潜在候选肽，它们在体外血浆的显著稳定性表明它们可以在血液或生物体中保留很长时间。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为系列烯烃装订的两亲性肽的结构和序列示意图；
图2为系列烯烃装订的两亲性肽的圆二色谱结果图；
图3为系列烯烃装订的两亲性肽的装订多肽的脂水分布系数；
图4为系列烯烃装订的两亲性肽溶血活性和细胞毒性图
图5为烯烃装订的两亲性肽稳定性测试结果；
图6为烯烃装订的两亲性肽杀菌动力学和耐药性评估；
图7为系列烯烃装订的两亲性肽的制备流程图；
图8.P3的质谱和色谱分析谱图，其中，色谱保留时间为：13.705min；计算分子量1557.96，检测为M+H+：1559.10；
图9.P10的质谱和色谱分析谱图，其中，色谱保留时间为：13.775min；计算分子量1581.96，检测为M+H+：1582.97。
具体实施方式
实施例1烯烃装订的两亲性肽的合成与纯化。
Tat肽源于HIV 1型(HIV-1)编码的核转录激活蛋白(Tat)，曾被报道为经典的细胞穿膜肽。在我们之前的研究中，以Tat(47-57)为模板，通过闭环烯烃复分解装订构建了具有α-螺旋构象(A4)的装订阳离子两亲性多肽(Chem Commun.2020；56(100):15655-15658.)，具有较高的内体逃逸效率和较低的细胞毒性。意外的是，我们发现A4具有广谱抗菌活性(表2)。为了优化和提高A4的抗菌活性，在设计新型的装订阳离子两亲性多肽时，我们引入了一种非天然芳香性氨基酸(2-Nal，即3-(2-萘基)-L-丙氨酸)和两种具有芳香疏水侧链的天然氨基酸(Trp和Phe)。为了研究不同芳香族疏水残基对抗菌活性的影响，我们合成了类似物P1-P3和P10-P12，分别用Trp、Phe和2-Nal取代A4中亲水的1位Tyr1和8位Gln8。为了测定芳香残基对抗菌活性的影响，将疏水残基Gly2替换为芳香疏水残基(Trp、Phe和2-Nal)，得到类似物P4-P6。与此同时，为了确定影响抗菌活性的正电荷数，还用Trp、Phe和2-Nal替换位于两亲性残基交界处的阳离子残基Lys4(图1)，以分别获得P7-P9。如前所述，通过Fmoc/tBu固相合成策略在树脂上合成所有装订肽。本文研究的所有肽均通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，纯度>95％。图1和表1列出了所有肽的序列和主要物理化学参数。
表1装订肽的设计及其物理化学参数
其中，本申请设计的所有烯烃装订肽都是在Rink Amide MBHA树脂上通过固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护策略化学合成的。具体流程如图7的制备流程所示。
具体来说，Rink Amide MBHA树脂使用二氯甲烷(DCM)溶胀30min。随后去除DCM。加入20％哌啶/DMF以去除Fmoc，反应10分钟，重复两次。然后Fmoc-AA-OH(4倍当量树脂负载量)、缩合剂(HBTU/HOBt，4倍当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，8倍当量)溶解在DMF中，然后在室温下反应60min。每次偶联后，通过20％哌啶/DMF去除Fmoc保护基。在1,2-二氯乙烷(DCE)中，使用Grubbs一代催化剂(0.2倍当量树脂负载量)进行闭环烯烃复分解反应，反应持续时间为4h。然后，用TFA/H2O/TIS混合物[95:2.5:2.5(v/v/v)]除去保护基。将裂解下来的粗肽溶解在乙腈和水(1:10)混合物中，使用制备RP-HPLC纯化，采用Waters C18柱，线性梯度为70-15％水/乙腈，最后通过分析RP-HPLC和ESI-TOF质谱进一步表征最终化合物。使用HeliQuest在线量化电荷和疏水力矩。(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParamsV2.py)。其中，图8和图9分别为P3和P5的质谱和色谱分析谱图。
实施例2烯烃装订的两亲性肽的结构表征。
本申请通过使用CD光谱法研究了两种不同环境中新的装订肽的二级结构。
从图2A和表1可以看出，烯烃装订肽A4显示了典型的α-螺旋光谱，在190nm左右有正峰，在208nm和222nm处有双负峰。这一结果与我们之前的报道相同。A4类似物(P7和P9除外)在水中的CD光谱显示出无序构象的特征。P7用Trp取代A4的Lys4，呈轻微的α-螺旋结构。根据K2D2工具进行分析，2-Nal取代A4的Lys4的P9含有51.03％的α-螺旋含量。还测量了50％TFE中的CD光谱，以模拟细菌膜环境。在50％TFE中，细胞穿膜肽Tat的CD光谱仍然是无序构象的特征。然而，肽A4的α-螺旋含量显著降低。在50％的TFE中，装订肽A4的类似物表现出不同的α-螺旋含量。如表1所示，除P11和P12外，所有类似物的α-螺旋含量最高(77-88％)。P11和P12分别用Phe和2-Nal取代Gln8，显示出51-68％的α-螺旋。类似物在水中表现出无规则卷曲，而在细菌膜环境中，其结构趋向于形成α-螺旋构象，这可能有利于与细胞膜的相互作用。
实施例3烯烃装订的两亲性肽的抑菌活性研究。
MIC的测定：
使用稍作修改的用临床实验室标准化协会肉汤稀释法测试肽对革兰氏阳性、革兰氏阴性和多药耐药菌(Polymyxin B)的最低抑制浓度(MIC)。简而言之，在37℃的MuellerHinton肉汤(MH)培养基中培养单个菌落。16h～24h后，取对数期细菌培养物稀释至1×105CFU/mL。所有肽在MH培养基中从512到2mM经2倍稀释制备。将50μL不同浓度的每种肽溶液和50μL稀释细菌培养物添加到96孔板中，并在37℃下培养18h。MIC被确定为肽的最低有效浓度，无明显细菌生长。不含肽的MH培养基作为阳性对照。所有测试都进行了三次平行测试，并独立重复三次。
通过测定装订肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌活性，其最小抑菌浓度(MIC)见表2。MIC值的几何平均值(GM)表示抗菌效果的平均值，计算和总结结果如表3所示。母肽Tat活性较弱(GMall＝45.3μM)。我们的发现表明，我们之前报道的装订肽A4(GMall＝10.1μM)比Tat具有更好的广谱抗菌活性，这为进一步优化A4的治疗用途提供了潜力。如表2和表3所示，所有类似物的抗菌活性都有显著提高。有趣的是，我们发现所有类似物对革兰氏阳性菌的抗菌活性都优于革兰氏阴性菌。在这些类似物中，P3、P10和P12表现出更加优秀的对革兰氏阳性菌的抗菌活性，而P3、P4和P10表现出更加优秀的对革兰氏阴性菌的活性。综合对革兰氏阴性和阳性菌的抗菌活性我们发现P3和P10显示出最好的抗菌活性。从以上结果我们发现抗菌活性的改善与疏水性氨基酸的取代相关。随后，我们测定所有类似物的脂水分布系数(LogP)，其用于表征肽的疏水性。我们发现，对类似物疏水性的影响，Trp<Fhe<2-Nal；同时4位的取代>8位的取代>2位的取代>1位的取代。而疏水性对活性的影响，当类似物的LogP值在0附近，其抗菌效果最好(图3)。
表2装订肽的抗菌活性MIC值
实施例4烯烃装订的两亲性肽的溶血活性和细胞毒性测试。
生物相容性实验：
采用A549、NIH3T3和CHO-K1细胞系，通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物)法来确定装订肽是否具有细胞毒性。待细胞消化计数后，将细胞以5×103个细胞/孔的密度种到96孔板中，然后在培养箱中培养24h。用含2％的胎牛血清的培养基配制一系列浓度梯度的装订多肽，移去原来的培养基加入已配好的多肽。每个浓度对应三个平行孔。放置在培养箱中培养24h，然后向每孔中加入10μL MTT溶液(2mg/mL)，再将板子置于培养箱培养4h，随后洗涤并移去培养基和MTT混合物，最后每孔加150μL的DMSO，在培养箱孵育10min终止反应。使用多功能酶标仪测量板子中样品在490nm处的吸光值。其中以不加多肽处理的孔为阳性对照组，以没有种细胞的孔为空白组。最终的结果为三次独立重复实验的平均值。
装订肽的溶血活性通过健康小鼠红细胞采用先前描述的方法进行评估。取雄性小鼠新鲜血液，保存在肝素钠抗凝管中，然后以800rpm离心10min，获得红细胞。随后，用PBS洗涤红细胞三次，并用PBS稀释至8％(v/v)，以进行溶血试验。将100μL8％红细胞悬液和100μLPBS中一定浓度的肽添加到96孔板中，并使用2％ Triton X-100作为阳性对照。在37℃孵育2h后，12000g下将平板离心15min。将血浆上清液(150μL)转移到新的96孔板中，并在490nm下测定吸光值。数据表示为三次独立实验的平均值±标准偏差。
溶血活性和细胞毒性是验证药物安全性和细胞选择性的关键指标。为了评估引入的芳香氨基酸和两亲性含量对细胞毒性的影响，我们计算并分析了所有合成肽的溶血活性。分析结果显示为肽的10％溶血浓度(MHC10)值(表3和图4)，表明所有含芳香族氨基酸的烯烃装订类肽在高达128μM的浓度下几乎没有红细胞毒性。对照肽多粘菌素B也显示没有溶血活性(MHC>128μM)。TI指标是用来评估抗菌肽的细胞选择性。它是以导致红细胞溶血达到10％的时候的最小浓度比MIC值的几何平均值而得到。TI值越高，说明选择性越好。如表所示，类似物P3和P10具有最高的TI值，这也说明它们具有最好的光谱抗菌活性和最低的溶血活性。正如预期的那样，处理24小时后，所有肽处理的细胞活力都以浓度依赖性的方式下降。其中2-Nal取代后的类似物的细胞毒性最强。Phe取代的类似物的细胞存活率最高，突出了最佳的安全性。SI是选择性指数，是细胞的IC50和GMall的比值。其SI值越高，说明抗菌活性越好，生物安全性越好。其中P2、P3和P8具有最高的SI值。
表3装订肽的MHC、GM和TI值
a MHC为导致小鼠红细胞10％溶血的最低溶血浓度；
b GM值为多肽MIC对被检测细菌的几何平均值。当在128μM下检测物抗菌活性时，使用256μM来计算GM值；
c TI通过MCH/GM计算得到，当MHC>128μM，使用值256μM来计算TI值；
d G+代表革兰氏阳性菌；
e G–代表革兰氏阴性菌；
f All代表革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；
g SI(选择指数)由IC50/GM all计算得到。
实施例5装订肽类似物对耐药细菌的抗菌活性
为了进一步研究烯烃装订肽类似物对耐药细菌的抗菌活性，我们选择了不同的耐药菌株，其中革兰氏阳性分离菌株为耐甲氧西林金黄色葡糖球菌(MRSA)，革兰氏阴性分离菌株为具有超广谱β内酰胺酶大肠杆菌(ESBLs E.coli-1)，多药耐药(MDR)铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。如表4所示，P3和P10对多耐药菌株的抑菌活性较高(2～4μM)。作为对照抗生素，多粘菌素B对ESBLs E.coli-1和MDR P.aeruginosa表现出较强的抑菌活性。在4～8μM范围内，对MRSA和MDR鲍曼氏菌的抗菌活性均低于P3和P10。A4的抗菌活性较低，对耐药菌的抗菌活性高达8～64μM。如表4所示，P3和P10对耐药菌具有广泛的抗菌潜力。
表4装订肽类似物对耐药细菌的抗菌活性
实施例6烯烃装订的两亲性肽的稳定性测试。
稳定性实验：
根据先前报道的方法进行体外稳定性研究。简单地说，将新鲜小鼠血清稀释成25％的血清，并通过离心(15000rpm，15min)进行制备。装订肽在37℃下用25％血清处理，最终浓度为50μM。在不同的培养时间后，提取200μL样品，用50μL 15％三氯乙酸终止降解，并在4℃下保存过夜。然后通过离心(15000rpm，20min)获得最终样品，并在Waters SunFireC18反相分析柱(5μm，4.6×250mm)上以1mL/min的流速进行分析，使用乙腈水溶液的线性梯度。通过记录220nm处的吸光度检测装订肽，并通过其EIC峰面积定量。计算不同时间点与0min峰面积的比值。所有试验独立重复三次。
稳定性差是AMPs临床应用的主要限制之一。由此，使用RP-HPLC在小鼠血浆中分析Tat、A4、P3和P10的蛋白水解稳定性。孵育30分钟后，只有约9％的Tat仍然完好无损(图5)。有趣的是，孵育30分钟后，测得的装订肽仅轻微降解，孵养2小时后，A4和P3分别约为69％和68％完好。总的来说，线性肽Tat对酶具有更高的敏感性，半衰期约为8分钟。相比之下，烯烃装订肽对血清蛋白酶的抗性非常稳定。A4和P3的半衰期分别为215min和200min。然而，含有色氨酸的肽P10比A4和P3更容易降解，半衰期约为90min。与我们之前的研究一致，血浆稳定性结果清楚地表明，烯烃装订赋予了它们额外的血浆稳定性。
实施例7烯烃装订的两亲性肽的的杀菌动力学研究和耐药性分析。
在Muller-Hinton培养基中，通过将隔夜培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别在0.5×MIC、1×MIC和2×MIC下暴露于A4、P4和P9，研究细菌杀伤的时间进程。然后，在不同的时间点(0、10、30、60、120、240min)，将肽处理过的细菌悬液涂布在MH琼脂平板上。在37℃下培养24h后，对菌落进行计数。如图6A和图6B所示，在4倍MIC的条件下，3小时内几乎能消除所有大肠杆菌，但A4未能杀死所有金黄色葡萄球菌。另一方面，作为A4修饰的类似物，P10能够在6小时和3小时内杀死所有金黄色葡萄球菌细胞和大肠杆菌，而P3能够在3小时和2小时内消除几乎所有金黄色链球菌和结肠杆菌(图6A和6B)。
为了评估新设计肽的耐药趋势，使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为模型细菌，在96孔板中进行了连续传代和MIC值测定。在连续21天使用低于MIC水平的肽和抗生素诱导耐药，监测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对A4、类似物P3、P10和阿莫西林的潜在耐药性发展(图6C和6D)。连续21天处理后，A4、P3和P10的对金黄色葡萄球菌的MIC只有轻微改变，这表明以烯烃装订的AMPs不易产生耐药性。与金黄色葡萄球菌一致，A4、P3和P10对大肠杆菌没有诱导耐药性。正如预期的那样，阿莫西林和大肠杆菌的MIC值增加了16倍，而金黄色葡萄球菌的MIC在连续21天治疗后增加了250倍。结果表明，与本研究中使用的抗生素相比，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌不会对A4、P3和P10产生耐药性。
本发明提供了一种烯烃装订的两亲性肽的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (6)
1.一种烯烃装订的两亲性肽，其特征在于，所述两亲性肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.1- SEQ ID NO.12中的任意一种，其中，上述两亲性肽在第5位氨基酸和第9位氨基酸通过用丙氨酸衍生物S5形成烃桥，所述S5为 (2S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸。
2.一种烯烃装订的两亲性肽，其特征在于，所述两亲性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10所示，其中，上述两亲性肽在第5位氨基酸和第9位氨基酸通过用丙氨酸衍生物S5形成烃桥，所述S5为(2S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸。
3.权利要求2所述的烯烃装订的两亲性肽的制备方法，其特征在于，在Rink AmideMBHA树脂上通过固相9-芴甲氧羰基保护策略化学合成，并通过用Grubbs一代催化剂进行闭环烯烃复分解反应得到。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的任意一个或多个两亲性肽。
5.权利要求1所述的两亲性肽或权利要求5所述的药物组合物在制备抗菌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物用于抑制革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌中的至少一种。
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