CN116507911A - 用于检测缓冲液中聚乙烯基磺酸盐(pvs)的滴定方法 - Google Patents
用于检测缓冲液中聚乙烯基磺酸盐(pvs)的滴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了方法，包括自动方法，以通过基于络合测定或基于滴定的技术检测流体例如缓冲液中的聚阴离子例如聚乙烯基磺酸盐的水平。这样的聚阴离子化合物已显示抑制PCR中涉及的酶，这对监测从细胞培养物获得的蛋白质，例如生物制品和生物仿制药的纯度的努力造成挫折。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月16日提交的美国临时专利申请号63/093,124、2021年2月2日提交的美国临时专利申请号63/144,744和2021年10月1日提交的美国临时专利申请号63/251,465的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及化学领域，更具体地涉及确定或滴定流体中化合物的浓度的领域。
背景技术
生物制品和生物仿制药已成为治疗人类和其他动物疾病和病症的重要治疗剂类别。这些产品，包括重组蛋白，例如各种形式的抗体及其保留结合能力的片段，通常从细胞培养物中获得。因此，必须从细胞培养过程中固有的污染物质(例如不需要的和潜在有毒的蛋白质、脂质、碳水化合物和其他与培养中细胞生长相关的小分子)中纯化这些治疗剂。随着治疗性生物制品和生物仿制药通过从这些培养污染物中分离而逐渐纯化，治疗剂在缓冲溶液中稳定。此外，随着纯化的进行，必须监测纯度水平以确保治疗剂保持使用安全。从细胞培养物中纯化治疗剂时发现的一种重要污染物是宿主细胞DNA片段。残留量的宿主细胞DNA可以在严格的纯化过程中存在下来，作为纯化的治疗剂的有害污染物残留。施用给动物(例如人类患者)的蛋白质配制品(如生物制品或生物仿制药)中包含的残留宿主细胞DNA可能会引发不希望有的免疫反应或增加患癌症的风险。因此，政府对施用给人类的配制品中所含宿主细胞DNA的浓度进行了限制。世界卫生组织(WHO)和欧盟(EU)例如允许残留宿主细胞DNA的量高达10ng/剂量，而美国食品和药物管理局允许不超过100pg/剂量。
鉴于旨在用于人类的治疗配制品中允许的宿主细胞DNA水平较低，因此需要灵敏且准确的方法来确定这样的配制品中宿主细胞DNA的水平。定量样品中低水平核酸的一种方法是使用聚合酶链反应，例如通过使用qPCR实时监测核酸水平。PCR是一种基于酶的技术，它依赖酶促聚合酶来扩增低水平的核酸以促进其检测。
发明内容
本公开提供了用于确定或滴定样品(例如包含Good缓冲液(诸如MES)的样品)中聚阴离子水平的方法。样品包括Good缓冲液(例如Good缓冲液原料或生产批次)，还可以包括治疗性化合物，例如生物制品或小分子。示例性的聚阴离子是聚乙烯基磺酸盐(即PVS)，它通常以不同的量存在于Good的缓冲液或不同收获和纯化阶段的生物制品样品中。已发现这些聚阴离子，尤其是PVS，可抑制各种酶，包括RNA和/或DNA酶，例如聚合酶。本文公开了用于检测样品中PVS水平的方法。在生产、收获或纯化的不同阶段，样品可包含蛋白质，例如生物制品，或可包含其他治疗性化合物，例如小分子治疗剂，或两者。本领域已知的方法无法检测这样的样品中低水平的PVS，导致治疗性化合物例如生物制品的PVS污染。这样的污染可能会妨碍授权用于人类，并且PVS的抑制作用会对监测产品制剂中其他杂质(如宿主核酸)的努力造成挫折。PVS等聚阴离子会抑制标准核酸检测(如PCR，例如qPCR)中使用的酶，从而导致对污染性宿主核酸的测量不准确。本文公开了一种灵敏、准确和精确的方法，用于通过滴定测量包含Good缓冲液的样品(例如蛋白质样品)中PVS(一种已知的RNA酶抑制剂)的水平。根据本公开的滴定方法显示出1.5个数量级的动态检测范围，相对于MES对PVS具有高度选择性，导致具有拐点或当量点的简单读数，为正在考虑用于监测蛋白质样品(例如生物样品)的宿主细胞核酸污染的MES缓冲液批次提供直接的通过/未能通过输出。该方法还有助于以合理的成本的自动化电化学或光谱(例如，比色、光度、荧光、Raman或FTIR光谱)终点检测探头以及依赖于标准手动滴定装置的廉价实施例。
更详细地，本公开涉及用于检测流体中的聚阴离子酶抑制剂的滴定方法，所述方法包括：(a)使流体与已知量的聚阳离子化合物接触；(b)将(a)中的材料与指示剂化合物接触，其中所述指示剂化合物在游离形式下表现出跟当其与聚阳离子化合物络合时的形式相比改变的特性，并且其中添加足够的指示剂化合物以检测在没有络合物形成的情况下所述指示剂化合物的游离形式；(c)重复(a)；以及(d)在滴定点处检测所述指示剂化合物的游离形式，从而检测聚阴离子酶抑制剂。指示剂化合物可包含阴离子指示剂或由其组成，所述阴离子指示剂包括但不限于聚阴离子指示剂化合物。在一些实施例中，流体包括缓冲液、基本上由缓冲液组成或由缓冲液组成。预期可在(a)的第一迭代之前、同时或之后进行(b)将指示剂化合物添加到流体中，但应理解，在随后之后指示剂化合物的情况下，指示剂化合物将在重复(a)之前添加。在一些实施例中，制备缓冲液的多个样品，其中每个缓冲液样品具有不同浓度的缓冲化合物，从而产生缓冲液的稀释系列。在一些实施例中，聚乙烯基磺酸盐(PVS)的检测限为1.5/百万缓冲溶液、0.25/百万缓冲溶液或0.16μg/mL缓冲溶液。在一些实施例中，聚乙烯基磺酸盐(PVS)的检测限为1.5/百万缓冲化合物、或0.25/百万缓冲化合物。例如，如本文所述的自动化方法可以在0.25/百万缓冲化合物的检测限鉴定PVS。在一些实施例中，滴定终点是样品吸光度在初始样品吸光度和稳态吸光度之间的中间处的点，或者是样品吸光度曲线的一阶导数的局部最大值。在一些实施例中，以电化学或光谱法检测游离指示剂化合物。在一些实施例中，光谱法检测包括比色检测、光度检测、荧光检测、Raman或FTIR光谱。在一些实施例中，聚阴离子酶抑制剂是聚乙烯基磺酸盐(PVS)或其衍生物。在一些实施例中，聚阴离子酶抑制剂是聚乙烯基磺酸盐(PVS)。在一些实施例中，聚阳离子化合物是非pH依赖性聚阳离子化合物或pH依赖性聚阳离子化合物。在一些实施例中，非pH依赖性聚阳离子化合物是基于季铵的聚合物。在一些实施例中，pH依赖性聚阳离子化合物是聚胺。在一些实施例中，基于季铵的聚合物是海美溴铵(HDBr)、聚(二烯丙基)二甲基氯化铵(pDADMAC)或甲基二醇壳聚糖。在一些实施例中，基于季铵的聚合物是海美溴铵(HDBr)。在一些实施例中，将总计为总流体体积的至少0.1％的多个HDBr等分部份添加到流体中。在一些实施例中，基于季铵的聚合物是聚(二烯丙基)二甲基氯化铵(pDADMAC)。
许多合适的指示剂化合物，例如阴离子指示剂，可用于本文的实施例中。在一些实施例中，指示剂化合物是染料，例如偶氮染料。在一些实施例中，偶氮染料是铬黑T(ECBT)、铬蓝黑R(钙试剂(Calcon))或偶氮磺钠盐。在一些实施例中，偶氮染料是铬黑T(ECBT)。在一些实施例中，每mL的包含已知量聚阳离子化合物的流体添加0.8-1.7μg ECBT。在一些实施例中，缓冲液是Good缓冲液。在一些实施例中，Good缓冲液包含乙磺酸衍生物或丙磺酸衍生物。在一些实施例中，Good缓冲液是MES、双-三甲烷、ADA、双-三丙烷、PIPES、ACES、MOPSO、氯化胆胺、MOPS、BES、AMPB、HEPES、DIPSO、MOBS、乙酰氨基甘氨酸、TAPSO、TEA、POPSO、HEPPSO、EPS、HEPPS、Tricine、Tris、甘氨酰胺、甘氨酰甘氨酸、HEPBS、N,N-二羟乙基甘氨酸、TAPS、AMPB、CHES、CAPSO、AMP、CAPS或CABS。所述方法的一些实施例还包括根据滴定聚阴离子酶抑制剂所需的聚阳离子化合物的量来确定聚阴离子酶抑制剂的浓度。所述方法的一些实施例还包括将结果与用聚阴离子酶抑制剂的标准曲线获得的结果进行比较，从而确定流体中聚阴离子酶抑制剂的浓度。例如，可以针对一组多个聚阴离子(例如，PVS)校准标准品(例如，3至5个标准品)计算终点体积，并且可以生成标准曲线。标准曲线可用于基于样品的终点值计算样品中聚阴离子的浓度。所述方法的一些实施例还包括进行“限度测试”，其中计算空白(不含聚阴离子，例如PVS)和含有特定限度浓度的聚阴离子(例如，PVS)的样品的终点体积。可以确定样品的终点体积，并且基于样品中聚阴离子的浓度是否在指定限度内做出“通过/未能通过”分析确定。在一些实施例中，方法是自动化的。
本公开的另一方面涉及用于检测流体中的聚阴离子酶抑制剂的自动滴定方法，所述方法包括：(a)将流体和指示剂化合物组合，其中所述指示剂化合物在游离形式下表现出跟当其与聚阳离子化合物络合时的形式相比改变的特性，并且其中添加足够的指示剂化合物以在没有络合物形成的情况下检测游离形式的指示剂化合物；(b)将(a)中的材料与已知量的聚阳离子化合物接触；(c)使用滴定仪仪器测量包含所述指示剂化合物和聚阳离子化合物的流体的吸光度；以及(d)自动重复(b)和(c)，其中所述指示剂化合物的游离形式的检测对所述聚阴离子酶抑制剂进行检测。预期(a)将包含聚阳离子化合物的流体与指示剂化合物组合可以在(b)的第一迭代之前、同时或之后进行，但应理解，在之后组合指示剂化合物的情况下，指示剂化合物将在重复(b)之前添加。在一些实施例中，流体包括缓冲液、基本上由缓冲液组成或由缓冲液组成。在一些实施例中，缓冲液是Good缓冲液。在一些实施例中，方法在滴定仪仪器上进行。在一些实施例中，滴定仪仪器包括与聚阳离子化合物和流体处于流体连通的泵，例如注射泵或智能给料驱动器。可以基于所使用的指示剂化合物来选择用于本文描述的方法和系统的合适的吸收波长。例如，对于ECBT指示剂化合物，660-665nm的波长是合适的。
一些方面包括用于检测流体中的聚阴离子酶抑制剂的自动滴定系统。自动滴定系统可以包括流体输送系统，例如泵。自动滴定系统可以配置为自动执行如本文所述的方法。例如，自动滴定系统可以包括滴定仪。例如，适用于本文所述方法和系统的滴定仪可在万通的TITRANDO仪器系列下购买。任选地，滴定仪可以包括用于流体连通的泵(例如使聚阳离子化合物与流体处于流体连通)，例如注射泵或智能给料驱动泵。
根据包括附图的以下详细描述，本披露的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管示出了实施例，但是详细描述和特定实例仅提供用于说明，因为在本披露的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言从详细说明中将是显而易见的。
附图说明
图1.(a)2-(N-吗啉代)-乙磺酸(即，MES)的化学结构，显示为酸性形式，MES水合物，以及显示为碱性形式，MES钠盐。(b)化学反应，其产生能够抑制对核酸具有活性的酶(例如RNA酶)的化合物。图1(b)改编自Smith等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]278:20934-20938(2003)中的图。
图2.(a)在0-1.0ppm之间改变聚乙烯基磺酸盐(PVS)的浓度显示了从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得的两个不同批次PVS标准品的线性校准曲线，这些标准品以30wt％的水溶液提供。发现PVS的浓度在批次之间有显著差异。然而，预期可以通过稀释来调整特定批次的浓度以用作合适的标准。(b)使用海美溴铵(HDBr)滴定PVS的滴定曲线是在0-1.0ppm的PVS浓度范围内构建的。发现了大约1.5个数量级的线性范围。
图3.(a)使用HDBr滴定PVS并使用光谱终点检测进行定量的示意图。反应方案描述了PVS和HDBr之间由吸引性静电相互作用驱动的络合。在滴定终点，指示剂化合物(nD-)在与相邻HDBr电荷位点缔合后发生吸光度特性的变化。图3(a)中的蓝色圆形“加”和“减”符号表示溶液中的背景盐。(b)该图显示了在台式吸光度光谱仪上测量的空白样品(即，50mM硼酸盐缓冲液，pH 8.5，补充有EBT指示剂化合物)的溶液吸光度变化，因为HDBr是逐渐滴定到溶液中。随着HDBr浓度的增加，指示剂在665nm处的吸光度降低，同时吸光度最大值从约630nm移至593nm。
图4.滴定曲线，其绘制一系列PVS标准溶液在665nm处归一化的、体积校正的吸光度。
图5.(a)在MES基质空白中制备的三种不同PVS标准品在665nm处体积校正的溶液吸光度相比于HDBr(滴定剂)质量的图。(b)在50mM硼酸钠中制备的PVS标准品(绿色三角形)和与50mM硼酸钠混合的MES(黑色方块)之间的滴定曲线拐点比较。
图6.在MES基质空白制备的PVS标准品(黑色方块)、MES阴性对照批次(蓝色菱形)和导致qPCR无效测定的MES批次(批次#I；红色圆圈)的滴定曲线拐点的比较。
图7.空白标准品(100mM碳酸盐缓冲液，补充以1.25μg/mL EBT指示剂)用0.04mg/mL HDBr滴定的代表性谱(黑色迹线)，和相应的一阶导数(红色迹线)。
图8.(a)滴定终点体积相比于加标入溶解在100mM碳酸盐缓冲液中的50mM MES中的PVS浓度的图。(b)在100mM碳酸盐缓冲液中制备的标准样品的滴定终点体积相比于PVS浓度的图。
图9.以下的代表性滴定曲线：(A,B)在100mM碳酸盐缓冲液中以0(A)或0.75(B)μg/mL制备的PVS标准溶液；和(C,D)PVS以0(C)或0.70(D)μg/mL加标进入在100mM碳酸盐缓冲液中制备的50mM MES(表2中的样品H)。
图10.提供滴定终点体积相比于PVS浓度的图。A)是在100mM碳酸盐缓冲液中制备的标准样品的滴定终点体积相比于PVS浓度的图。B)是滴定终点体积相比于加标入溶解在100mM碳酸盐缓冲液中的50mM MES钠盐中的PVS浓度的图。
具体实施方式
等聚阴离子化合物，例如聚(乙烯基磺酸盐)(PVS)是Good缓冲液(例如MES缓冲液)中的聚合物杂质。这些聚阴离子化合物，例如PVS，相对于缓冲化合物，例如MES，以百万分率范围内的低水平存在于这样的缓冲液中。Good缓冲液中存在这些杂质是一个重要问题，因为这样的缓冲液用于制造治疗性蛋白质，而这些杂质，尤其是PVS，是可能干扰DNA的定量PCR(qPCR)检测的强效聚合酶抑制剂。通常需要对从培养物中纯化的治疗性蛋白质的配制品中或其他治疗性化合物的配制品中的宿主细胞核酸(例如DNA)进行测量，以评估旨在用于人类的治疗剂的安全性。使用基于PCR的技术检测和定量治疗性配制品中宿主细胞核酸的一个重大挑战是许多用于从细胞培养物中纯化蛋白质(例如生物制品和生物仿制药)的缓冲液(例如Good缓冲液)中都存在核酸酶抑制剂。检测和定量这些配制品中宿主细胞核酸水平的基于PCR的方法的速度、准确性和可重复性导致本领域非常需要鉴定和去除PCR中涉及的核酸酶(例如RNA酶)的抑制剂。因此，Good缓冲液(例如MES)中存在聚阴离子化合物(例如PVS)会通过干扰宿主细胞DNA的qPCR检测而导致一种或多种治疗性蛋白质或其他一种或多种治疗性化合物的批次不符合人类施用的验收标准。
本文公开了涉及基于分析物(例如，PVS)与带相反电荷的高分子量滴定剂的络合进行滴定的方法。这种相互作用导致了极高的平衡缔合常数(Ka)，并且可以通过电化学或光谱法(例如，比色、光度、荧光、Raman或FTIR光谱)检测终点。图3提供了用于使用海美溴铵(HDBr)(示例性滴定剂)滴定PVS的检测方案总结。
获得九批商业MES缓冲液并使用本文公开的用于检测和测量PVS的滴定方法进行分析。使用所公开的检测和测量PVS的滴定方法并使用qPCR对这些批次的MES缓冲液进行比较评估。实验数据表明，该方法能够灵敏检测低水平的PVS，并准确且精确地检测PVS水平的批次间变化。这样的分析显示，商业批次MES缓冲液(批次#I)含有显著高水平的PVS，与使用PCR(例如qPCR)对生物样品的宿主细胞核酸污染的缓冲液相关抑制作用的批次间变异性的观察一致。
以下实施例中提供的数据表明，使用聚阳离子化合物如海美溴铵(即，HDBr)检测和测量样品中PVS的滴定方法对PVS比MES具有高度选择性，其中Ka,PVS>>Ka,MES，其中Ka代表滴定剂(HDBr)与PVS(Ka,MES)或MES(Ka,PVS)之间络合反应的平衡缔合常数。本文公开的结果表明所公开的滴定方法是可重复的(精确的)并且能够在Good缓冲液(如MES)中检测低水平的聚阴离子，例如PVS，其中定量限(即，LOQ)为约100-200ng/mL。
本文公开的方案描述了一种聚电解质滴定方法，用于在Good缓冲液(如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES))缓冲液中对聚阴离子(如聚(乙烯基磺酸盐)(PVS))进行定量。该方法可扩展到由乙烯基磺酸生产的其他Good缓冲液(例如HEPES)。PVS检测的基本机制基于与聚阳离子物质海美溴铵(HDBr)的结合。图3a提供了结合反应的示意图。这种方法利用PVS和HDBr之间的高平衡缔合常数(Ka)来实现相比于MES(单阴离子)的选择性。实际上，聚阳离子和聚阴离子之间的Ka随电荷位点的数量而急剧增加(与聚合物分子量正相关)。在滴定终点，过量的HDBr与阴离子指示剂化合物铬黑T(ECBT)缔合，导致指示剂的UV-Vis吸光度谱发生变化(图3b)。滴定的进程可以在单个波长(即，665nm)进行跟踪，并与样品中PVS的浓度相关，例如，通过计算所得S形曲线的拐点，如图2所示。
实例
实例1
材料和方法
从西格玛奥德里奇公司(#278424)和阿尔法化学公司(Alfa Chemistry)(#ACM25053274)购买约30wt％聚(乙烯基磺酸)(PVS)钠盐并稀释以制备已知浓度范围为0.1至20μg/mL的PVS标准品。使用常规技术制备50mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)。100mM碳酸盐缓冲液(pH 10.0)由碳酸钠(西格玛奥德里奇公司#223484)和碳酸氢钠(西格玛奥德里奇公司#S6014)制备。碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液补充有约0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA；MP生物医药公司(MP Biomedicals)#06133713)。1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一亚甲基聚甲溴化物(海美溴铵；HDBr)购自西格玛奥德里奇公司(107689)和卡博森斯公司(Carbosynth)(#FH165280)。铬黑T(EBT或ECBT)购自西格玛奥德里奇公司(#858390)。所有溶液均使用已纯化至最小电阻率为18MΩ-cm的水制备。通过在0.2μm过滤器(2.8cm2表面积)上过滤，将100mMMES水合物溶液中的PVS清除，并用作实例1的样品空白。
以与上述程序一致的方式制备的测定缓冲液产生包含50mM硼酸钠的缓冲液A，用盐酸将pH调节至8.5，以及包含100mM组合的碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液B，配制以产生pH10.0的溶液。指示剂化合物或染料溶液，例如铬黑T(ECBT；55wt％)，用作指示剂化合物。当指示剂化合物是ECBT时，将该材料的固体等分部份在室温下储存。为了制备示例性ECBT染料溶液，将125mg ECBT添加到25mL容量瓶中并记录实际质量。将ECBT溶解在25mL去离子(即DI)水中，并以1mL等分部份在2-8℃储存在1.6mL聚丙烯微量离心管中直至使用。所公开方法的聚阳离子化合物是滴定剂，并且示例性滴定剂溶液是使用HDBr制备的。该材料储存在2-8℃。为了制备该溶液，将18.7mg HDBr直接称重到玻璃瓶中并溶解在3.74mL水中，得到5mg/mL储备溶液。然后分别通过5mg/mL HDBr溶液在补充有0.1mM EDTA的50mM硼酸盐缓冲液中的1:20或1:100稀释来制备0.05μg/mL HDBr滴定剂。该溶液用作本文公开的测定方法的滴定溶液。HDBr滴定剂溶液在15mL聚丙烯离心管中制备为10mL溶液，并在2-8℃储存。
标准品制备
通过在水中对储备溶液进行连续稀释，使用商业聚(乙烯基磺酸盐)(PVS)储备溶液来制备测定标准品(阿尔法化学公司，25wt％，钠盐，批#A19X05191)。然后将表1中的PVS溶液加标入50mM硼酸盐缓冲液(补充有0.1mg/mL EDTA)以制备已知PVS浓度的标准品。
表1.
储备溶液和标准溶液储存在2-8℃。
样品制备
如下制备100mM MES水合物溶液(批次#I和II)，pH调节至7.00±0.05。将2.132gMES水合物溶解在95mL水中，使用NaOH水溶液调节pH，然后用水将溶液调节至100mL的最终体积。使用常规的pH计测量pH。溶液储存在2-8℃。
测定程序
虽然滴定可行性实验是使用下面描述的简单方案进行的，但可以通过使用光度滴定仪仪器来自动化这里描述的步骤，从而使这样的实验自动化。光谱仪的紫外灯和可见光灯在使用前通过打开光谱仪加热至少20分钟。在每次测定之前使用标准溶液或样品溶液对光谱仪进行空白化。所公开的测定中使用的标准池是10mm、1.5mL的石英比色皿。标准品由在测定缓冲液中稀释的PVS组成。通过将100mM MES作为示例性Good缓冲液与测定缓冲液混合来制备样品。执行该步骤是因为示例性ECBT指示剂化合物在6-7的pH值范围内发生颜色变化，而大于7的pH值高于MES的缓冲区。因此，如上所述，MES与碱性缓冲液，即A或B混合，以确保ECBT指示剂去质子化。
初始实验以1:1的比例混合缓冲液A和MES。预计更多的碱性缓冲液(例如，B和C)与MES以不同体积比混合，将提高测定性能。
光谱仪空白化后，将少量ECBT溶液添加到标准品/样品中。最初，将995μL标准品/样品与5μL ECBT(5mg/mL)混合，最终ECBT浓度为25μg/mL。获得全波长吸光度扫描。通过将小体积(10-100μL)的0.050mg/mL HDBr溶液添加到比色皿中，测量每次添加HDBr之间的样品吸光度，来滴定标准品/样品溶液。用200μL移液管混合溶液，在测量吸光度前让溶液静置约1分钟。HDBr的体积在滴定过程中逐渐增加。例如，最初进行小体积(例如，10μL)添加，因为吸光度谱在滴定早期发生了剧烈变化。当吸光度变化受稀释影响更显著时，在滴定后期添加更大的体积。
在某些情况下(例如，对于具有较大PVS浓度的溶液)，使用浓度更高的0.25mg/mLHDBr溶液。然后对每个样品重复前面的空白化分光光度计和向标准品/样品中加入小体积染料溶液的步骤。
数据分析。
从UV-vis光谱中，将665nm处的吸光度针对添加的HDBr质量(以μg计)作图。吸光度应针对溶液体积的变化进行校正以说明稀释，这是通过将A665 nm乘以总溶液体积(即，溶液的原始体积[1.000mL]，加上添加的滴定剂溶液的累积体积)。
图4和5总结了评估结果。图4显示了相对于在三种不同PVS水平处加标的测定缓冲液的HDBr滴定剂的质量，在665nm处的经体积校正的溶液吸光度。
图5a显示了相对于在三种不同PVS水平处加标的MES基质空白的HDBr滴定剂的质量，在665nm处的经体积校正的溶液吸光度。对于0ppm PVS标准品和样品空白(即，MES空白)，添加滴定剂导致A665的初始下降，其在溶液中加入约5.00μgHDBr后稳定。通过将商业来源的PVS加标入溶液中制备的其余PVS标准品和样品需要更大量的滴定剂才能达到稳态吸光度。例如，7.5ppm样品(图5a)仅在添加超过40μg HDBr后才达到稳定的A665。综上所述，这些数据表明与样品溶液中PVS量相关的滴定曲线(图4和5a)存在明显差异。图5b通过以下总结了这种关系：在50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)(绿色三角形)或MES中制备的PVS标准品溶液的计算拐点进行作图，这些溶液已掺入PVS，随后与50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)混合以调节溶液pH(黑色方块)。两组数据的斜率相当，表明高浓度(100mM)的MES的存在不会干扰PVS定量。此外，这些数据支持在100mM MES溶液中检测低至1.5ppm(μg/mL)浓度的PVS，以及在测定缓冲液中检测低至0.3ppm的PVS。
为了进一步评估滴定程序的性能，与PVS标准品一起评估了两个不同批次的MES。将导致几种产品的qPCR结果无效的MES水合物批(样品I)与每个qPCR测定具有最小量的PVS的另一个MES样品相比较(即，用于生成图5中的样品空白的相同材料)。该评估的结果如图6所示，显示MES样品I中存在可测量的PVS量，但阴性对照MES材料中没有(这与PVS耗竭的基质空白无法区分)。这些结果表明，所公开的方法可以准确地鉴定具有不合适的PVS水平的MES水合物材料。此外，不含PVS或具有不会干扰qPCR的中等水平PVS的MES水合物材料与不合适的MES材料可区分。
实例2
自动滴定
PVS标准品溶液和MES样品溶液的自动滴定使用配备智能给料驱动器(#2.800.0010)和体积容量为20mL的给料装置(#6.303.2200)的Metrohm 907Titrando仪器进行。在紧接滴定前向100mL标准品溶液或样品溶液中补充0.8-1.7μg/mL EBT指示剂(例如，通过在0.5-1.0mg/mL EBT储备液中加标)。通过用HDBr以50-150μL的体积增量单调滴定样品来测定所得溶液，其中允许来自光度测定探头的信号在给料增量之间稳定。通过使用浸入式光度测定探头(光极(Optrode)，#6.1115.000)连续测量660nm处的样品溶液吸光度来监测滴定进程，其中使用滴定曲线一阶导数中的最大dU/dV确定滴定终点。
图7(黑色迹线)以及相应的一阶导数(红色迹线)显示了空白标准品的代表性滴定谱。一阶导数出现最大值时的体积(即，图7中约0.55mL的V滴定剂)对应于滴定剂终点并用于确定PVS浓度。
样品溶液的pH值在PVS的测量中起着重要作用，这是通过影响PVS分析物上的阴离子电荷密度或间接通过指示剂化合物质子化形成一价阴离子(H2In-)(其与HDBr络合后吸光度不发生变化)。上面在实例1中描述的实验表明，将制备的MES溶液与碱性缓冲液混合将是确保合适的样品pH的可行方法。这种方法在自动滴定实验中的使用(即，通过在100mM碳酸盐缓冲液中以50mM MES溶解MES样品)通过对MES样品溶液中PVS加标回收的评估进行了验证。对于该评估，将10ppm PVS储备溶液以不同浓度加标入MES水合物样品溶液(样品H；见表2)。这种材料，当在没有在样品中额外PVS加标的情况下通过滴定测定时，产生的终点体积与空白标准品无法区分，表明PVS水平低于方法检测限。
加标回收评估的结果显示在图8a中，该图绘制了滴定终点体积相比于四种不同PVS水平下的PVS浓度(每个以一式三份进行测定)。为了比较，单独在100mM碳酸盐缓冲液中制备的PVS标准品的结果显示在图8b中。对于两组数据，滴定终点体积和PVS浓度之间的线性回归产生了相似的斜率(0.99和0.95mL/(μg/mL))，其中具有适当的线性确定系数(R2＝0.99)。此外，目视检查图9中显示的PVS标准品(图9A和9B)的代表性滴定曲线并且加标回收样品(图9C和9D)显示较低pH或50mM MES的存在对滴定谱没有明显可察觉的影响。总的来说，这些结果表明较低样品pH或50mM MES的存在对测量的PVS水平没有可感知的影响。
在滴定程序的开发过程中，通过用0.10mg/mL HDBr滴定50mM MES(溶解在100mM碳酸盐缓冲液中)来评估几个MES水合物批次的PVS含量。将滴定终点与一系列PVS标准品溶液产生的结果进行比较。这些评估的结果在表2中给出。在这些样品中，有MES水合物批(样品I)，其导致几个治疗性蛋白质批次的qPCR测定失败。样品I的PVS水平(通过滴定测量)是71±4μg PVS/克MES水合物，该值显著高于任何其他测试样品的PVS水平，这支持滴定在筛选具有不合适PVS水平的MES材料中的效用。值得注意的是，对于一些MES水合物批次(即E.1和E.2、F.1和F.2、以及H.1和H.2)，显示了滴定程序的不同迭代。例如，E.1表示基于单次重复的迭代，而E.2表示基于一式三份的迭代。
表2.在滴定方法开发过程中评估MES水合物样品的PVS
a一式三份评估样品。b在没有重复测量的情况下评估样品。c样品低于0.16μg/mL(16μg/g)的LOD。
实例3
检测方法比较
评估了用于检测和测量蛋白质样品(例如，生物样品)中的聚阳离子(如PVS)的几种方法。涉及通过PVS诱导聚离子报告平衡离子聚集连同浊度检测的离子配位方法是一种简单的低复杂度方法，但该方法未能可靠地检测具有高水平PVS的MES缓冲液批。涉及通过荧光激发和检测直接检测水性PVS的基于荧光的方法是另一种简单的低复杂度方法，但该方法被证明对于检测PVS不可行，因为溶液中的PVS不发荧光，而与干燥PVS样品相关的荧光被确定为与干燥样品相关的PVS非特异性伪影。另一种基于荧光的方法涉及PVS诱导荧光报告分子的猝灭，但由于相对于MES选择性检测PVS的能力有限，因此没有显示出希望。一种基于Good缓冲液中聚阴离子物理特性的方法是带电荷气溶胶检测的尺寸排阻色谱法(即SEC-CAD)。该方法能够检测MES缓冲液中的PVS，但该方法比其他方法复杂得多。评估了另一种离子配位方法，发现该方法(其涉及聚电解质络合和使用紫外-可见波长吸光度检测的滴定)在提供Good缓冲液(包括但不仅限于表3中提供的Good缓冲液)中准确、精确和灵敏的PVS检测和定量方面产生出乎意料的优异结果。除了提供准确度、精密度和灵敏度的优点之外，本文中作为滴定方法公开的该方法是复杂性和成本低的直接方法。
表3.Good缓冲液
| 缓冲液 | PKA | 缓冲液 | PKA |
| MES | 6.15 | POPSO | 7.85 |
| 双-三甲烷 | 6.60 | HEPPSO | 7.9 |
| ADA | 6.62 | EPS | 8.0 |
| 双-三丙烷 | 6.80 | HEPPS | 8.1 |
| PIPES | 6.82 | TRICINE | 8.15 |
| ACES | 6.88 | TRIS | 8.2 |
| MOPSO | 6.95 | 甘氨酰胺 | 8.2 |
| 氯化胆胺 | 7.10 | 甘氨酰甘氨酸 | 8.2 |
| MOPS | 7.15 | HEPBS | 8.3 |
| BES | 7.17 | N,N-二羟乙基甘氨酸 | 8.35 |
| AMPB | 8.8 | TAPS | 8.55 |
| HEPES | 7.55 | AMPB | 8.8 |
| DIPSO | 7.6 | CHES | 9.3 |
| MOBS | 7.6 | CAPSO | 9.6 |
| 乙酰氨基甘氨酸 | 7.7 | AMP | 9.7 |
| TAPSO | 7.6 | CAPS | 10.4 |
| TEA | 7.8 | CABS | 10.7 |
实例4
制备的MES钠盐水溶液中PVS的定量
MES钠盐的水溶液(其比MES水合物共轭酸的溶液的碱性强得多(例如，对于在100mM碳酸盐缓冲液中的50mM MES钠盐和MES水合物溶液，pH分别为约10.0和约8.5))也适用于使用与实例2中提供的类似的滴定程序进行PVS测定。图10(B)绘制了在100mM碳酸盐缓冲液中制备并加标PVS标准品的50mM MES钠盐溶液在660nm光度计测定的滴定终点。为了进行比较，图10(A)绘制了单独的在100mM碳酸盐缓冲液中制备的标准品的作为PVS浓度函数的滴定终点体积。对于两组数据，滴定终点体积和PVS浓度之间的线性回归产生了相似的斜率(1.04和1.09mL/(μg/mL))，其中线性确定系数(R2)为1.00。重要的是，MES水合物和MES钠盐样品的加标回收斜率的幅度在该方法的典型实验误差范围内(即，两种样品类型之间的分析响应没有明显差异)。
每个引用的专利或其他出版物均通过引用以其整体或相关部分明确并入本文，这对于本领域普通技术人员从上下文中显而易见，该并入有效地描述和公开了例如在这样的出版物中描述的可能与本文披露的信息结合使用的方法。
Claims (31)
1.一种用于检测流体中的聚阴离子酶抑制剂的滴定方法，所述方法包括：
(a)使流体与已知量的聚阳离子化合物接触；
(b)将(a)中的材料与指示剂化合物接触，其中所述指示剂化合物以游离形式表现出与其和聚阳离子化合物络合时的形式相比改变的特性，并且其中添加足够的指示剂化合物以检测到没有形成络合物的所述指示剂化合物的游离形式；
(c)重复(a)；以及
(d)在滴定点处检测所述指示剂化合物的游离形式，从而检测所述聚阴离子酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体包括缓冲液或由缓冲液组成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中制备所述缓冲液的多个样品，其中每个缓冲液样品具有不同浓度的缓冲化合物，从而产生系列稀释的所述缓冲液。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中聚乙烯基磺酸盐(PVS)的检测限为百万分之1.5的缓冲溶液、百万分之0.25的缓冲溶液或0.16μg/mL的缓冲溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述滴定终点是样品吸光度在初始样品吸光度和稳态吸光度之间的中间点，或者是样品吸光度曲线的一阶导数的局部最大值。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中通过电化学或光谱法检测游离指示剂化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过光谱法检测包括比色检测、光度检测、荧光检测、Raman或FTIR光谱。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述聚阴离子酶抑制剂是聚乙烯基磺酸盐(PVS)或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚阴离子酶抑制剂是聚乙烯基磺酸盐(PVS)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述聚阳离子化合物是pH非依赖性聚阳离子化合物或pH依赖性聚阳离子化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述pH非依赖性聚阳离子化合物是基于季铵的聚合物。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述pH依赖性聚阳离子化合物是聚胺。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述基于季铵的聚合物是海美溴铵(HDBr)、聚(二烯丙基)二甲基氯化铵(pDADMAC)或甲基乙二醇壳聚糖。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述基于季铵的聚合物是海美溴铵(HDBr)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中将总计为总流体体积的至少0.1％的多个HDBr等份添加到所述流体中。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述基于季铵的聚合物是聚(二烯丙基)二甲基氯化铵(pDADMAC)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述指示剂化合物是染料。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述染料是偶氮染料。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述偶氮染料是铬黑T(ECBT)、铬蓝黑R(Calcon)或偶氮磺钠盐。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述偶氮染料是铬黑T(ECBT)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中对每mL包含已知量的所述聚阳离子化合物的流体添加0.8-1.7μg ECBT。
22.根据权利要求2-21中任一项所述的方法，其中所述缓冲液是Good缓冲液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述Good缓冲液包含乙磺酸衍生物或丙磺酸衍生物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述Good缓冲液是MES、Bis-tris甲烷、ADA、Bis-tris丙烷、PIPES、ACES、MOPSO、氯化胆胺、MOPS、BES、AMPB、HEPES、DIPSO、MOBS、乙酰胺基甘氨酸、TAPSO、TEA、POPSO、HEPPSO、EPS、HEPPS、Tricine、Tris、甘氨酰胺、甘氨酰甘氨酸、HEPBS、Bicine、TAPS、AMPB、CHES、CAPSO、AMP、CAPS或CABS。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法进一步包括由滴定所述聚阴离子酶抑制剂所需的聚阳离子化合物的量来确定所述聚阴离子酶抑制剂的浓度。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法进一步包括将结果与用所述聚阴离子酶抑制剂的标准曲线获得的结果进行比较，从而确定所述流体中所述聚阴离子酶抑制剂的浓度。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。
28.一种用于检测流体中的聚阴离子酶抑制剂的自动滴定方法，所述方法包括：
(a)将流体和指示剂化合物组合，其中所述指示剂化合物以游离形式表现出与其和聚阳离子化合物络合时的形式相比改变的特性，并且其中添加足够的指示剂化合物以检测到没有形成络合物的所述指示剂化合物的游离形式；
(b)将(a)中的材料与已知量的聚阳离子化合物接触；
(c)使用滴定仪器测量包含所述指示剂化合物和聚阳离子化合物的流体的吸光度；以及
(d)自动重复(b)和(c)，其中以检测所述指示剂化合物的游离形式对所述聚阴离子酶抑制剂进行检测。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述流体包括缓冲液或由缓冲液组成。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述缓冲液是Good缓冲液。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述滴定仪器包括与所述聚阳离子化合物和所述流体处于流体连通的泵，例如注射泵或智能给料驱动器。
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