CN116493061B - 一种血液检测微流控芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血液检测微流控芯片，该芯片包括芯片本体，该芯片本体包括一个以上的分离检测单元，各分离检测单元包括微量全血分离槽以及一个以上的反应测试单元，各反应测试单元包括第一加样腔、第一L型微流道、第二加样腔、第二L型微流道、Y型微流道以及反应检测腔；Y型微流道包括第一进样口、第二进样口以及流出口，分别流入第一进样口与第二进样口的流体混合后从流出口排出；第一L型微流道连通第一加样腔与Y型微流道的第一进样口；第二L型微流道连通第二加样腔与Y型微流道的第二进样口；Y型微流道的流出口与反应检测腔连通。该芯片可用于ABO血型反定型检测，有助于提高免疫凝集反应的灵敏度；也可用于HDN孕妇血型IgG抗体效价检测。
Description
技术领域
本发明涉及血液检测技术，具体涉及一种血液检测微流控芯片及其检测方法。
背景技术
ABO血型系统是人类血型系统中抗原免疫性最强的一个血型系统。红细胞ABO血型鉴定试验，血清学分为正定型试验和反定型试验。其中，反定型试验是用A、B试剂红细胞检查血清中抗A抗体、抗B抗体，与正定型试验相互补充，提高ABO血型鉴定的准确性。常用的方法有玻片法、试管法、微孔板法和微柱凝胶法。玻片法和试管法为手工法操作，操作过程复杂，结果的准确性受人为因素影响大，现已逐渐淘汰；微孔板法适用于大样本量分析，但需要配备大型自动加样仪，结果判断使用显微镜观察，准确性受人为因素影响大，临床输血科极少应用；微柱凝胶法是目前普遍采用的方法，但也存在以下局限性：①对ABO弱抗原抗体反应不敏感，发明人研究发现不敏感的原因是凝胶卡只能一次性离心看结果而不能通过反复离心的方法增强反应；②当红细胞抗原抗体结合强度弱，凝胶卡离心产生的切应力（Shear Force）超过亲合力时，抗体依赖的红细胞凝集就被分开，出现假阴性结果；③在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，气温对凝胶分子筛的大小也会产生影响，从而对最终检测结果的稳定性和可靠性产生影响。上述局限性会导致微柱凝胶法的正、反定型不符合，此时，需要对样本做特殊处理以提高免疫凝集反应的灵敏度，或者换手工方法来进一步明确鉴定。
新生儿溶血病，简称HDN，指的是母婴的血型不合，母体内有胎儿的红细胞循环，胎儿的红细胞循环促进母体内产生IgG型的抗体，该种IgG型抗体能通过母体胎盘作用于胎儿的红细胞，造成其不同程度的溶血现象。临床上ABO血型不合及RhD血型不合导致的HDN发生率较高，因此，在孕期对母体进行IgG抗体效价的动态监测，对早期干预和治疗疾病有重要的意义。
目前临床实验室产前IgG抗体检测均采用抗人球蛋白试验测定法，该测定法适用于试管法和微柱凝胶法。试管法为手工法操作，操作过程复杂，结果的准确性受人为因素影响大。微柱凝胶法是目前临床实验室普遍采用的方法。但是，存在与微柱凝胶法用于ABO血型反定型检测相同的一些局限性，这些局限性包括：①当红细胞抗原抗体结合强度弱，凝胶卡离心产生的切应力（Shear Force）超过亲合力时，抗体依赖的红细胞凝集就被分开，出现假阴性结果；②在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，气温对凝胶分子筛的大小也会产生影响，从而对最终检测结果的稳定性和可靠性产生影响。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种血液检测微流控芯片，适用于ABO血型反定型检测以及HDN孕妇血型IgG抗体效价检测，能够提高对免疫凝集反应检测的敏感性；同时，样本使用量小、自动化检测、微量全血分离兼顾红细胞压积测定，具有“微－全分析”功能，为小型化、全自动化、高通量的配套分析仪提供了实现条件。
为了解决上述技术问题，本发明的第一个目的公开了一种血液检测微流控芯片。该芯片包括芯片本体，所述芯片本体包括一个以上的分离检测单元，各分离检测单元包括用于接收并分离微量全血样本的微量全血分离槽以及一个以上的反应测试单元。当所述芯片本体转动时，从微量全血样本中分离出的红细胞沉降于所述微量全血分离槽远离所述芯片本体中心位置的一端，从微量全血样本中分离出的血浆位于所述微量全血分离槽的另一端。
各反应测试单元包括用于接收来自微量全血分离槽的血浆的第一加样腔、第一L型微流道、用于接收相应的红细胞试剂的第二加样腔、第二L型微流道、Y型微流道以及反应检测腔。所述Y型微流道包括第一进样口、第二进样口以及流出口，分别流入第一进样口与第二进样口的流体经Y型微流道混合后从流出口排出。所述第一L型微流道连通第一加样腔与Y型微流道的第一进样口。所述第二L型微流道连通第二加样腔与Y型微流道的第二进样口。所述Y型微流道的流出口与反应检测腔连通。
具体的，所述第一L型微流道和所述第二L型微流道均是由依次连通的下层微流道和垂直微流道构成，所述下层微流道与所述垂直微流道垂直设置。第一L型微流道中的下层微流道的入口与所述第一加样腔远离所述芯片本体中心位置的一侧的底部连通，所述第二L型微流道中的下层微流道的入口与所述第二加样腔远离所述芯片本体中心位置的一侧的底部连通。
Y型微流道的第一进样口、第二进样口以及流出口均位于所述芯片本体的上部。Y型微流道的第一进样口与第一L型微流道中的垂直微流道的出口连通，Y型微流道的第二进样口与第二L型微流道中的垂直微流道的出口连通。
Y型微流道包括两个上层入口微流道以及一个上层混合微流道。其中一个上层入口微流道的入口为Y型微流道的第一进样口，另一个上层入口微流道的入口为Y型微流道的第二进样口，两个上层入口微流道的出口交汇在上层混合微流道的入口，上层混合微流道的出口为Y型微流道的流出口。各上层入口微流道与对应的垂直微流道垂直设置。
在一些实施例中，所述微量全血分离槽沿所述芯片的径向设置。微量全血分离槽包括血浆提取凹槽以及与血浆提取凹槽连通的直管凹槽。直管凹槽位于微量全血分离槽远离芯片中心位置的一端，血浆提取凹槽位于微量全血分离槽靠近芯片中心位置的另一端。在离心力的作用下，微量全血样本分离后得到的红细胞全部沉积于所述直管凹槽远离芯片中心位置的一端。
在一些实施例中，所述直管凹槽的表面设置有用于判读红细胞压积的刻度标识。所述微量全血分离槽的容积为50～100ul。
在一些实施例中，所述反应测试单元的数量为六个。该芯片还包括与各反应测试单元一一对应设置的血浆倍比稀释预处理槽。
在一些实施例中，所述反应检测腔包括圆柱形空腔以及直径逐渐缩小的锥形空腔，所述锥形空腔的大直径端与所述圆柱形空腔的底端连通。
本发明的第二个目的是提供一种血液检测微流控芯片的检测方法。该检测方法包括以下步骤：
所述第一加样腔的第一微流体经过所述第一L型微流道流入Y型微流道的第一进样口。所述第二加样腔的第二微流体经过所述第二L型微流道流入Y型微流道的第二进样口。所述第一微流体与所述第二微流体在Y型微流道内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经Y型微流道的流出口流出至所述反应检测腔。
微流控芯片中的微流道尺度小，微流道中的流体流动为层流，对应的雷诺数较小，因此不同微流体之间的混合主要依靠扩散。因此，为了增强混合，需要增加溶质之间的接触面积，增加接触面积的方式可以通过拉伸流体或剪切流体来实现。本申请利用管路几何交叉设计，通过设置自身具有管路交叉特性的L型微流道以及设置L型微流道的垂直微流道与Y型微流道在几何空间上相交叉，当不同的微流体分别依次流经对应的L型微流道以及Y型微流道的上层入口微流道时，对应的微流体先分裂成许多微团，再通过Y型微流道的上层混合微流道来促进不同的微流体微团之间的混合。
本发明的第三个目的是提供采用上述的一种血液检测微流控芯片进行ABO血型反定型检测的方法。所述反应测试单元的数量为三个。各反应测试单元的第二加样腔接收的红细胞试剂分别为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂和O型红细胞试剂。该检测方法包括以下步骤：
步骤一：所述微量全血分离槽接收待测的微量全血样本。
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向所述直管凹槽远离芯片中心位置的一端沉积，分离后得到的血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽内，分离后得到的血浆的第二部分容纳于直管凹槽靠近芯片中心的一侧。
步骤三：离心结束后，吸取血浆提取凹槽中的血浆并将其转移至各反应测试单元的第一加样腔；各反应测试单元的第二加样腔接收相应的红细胞试剂。
步骤四：在离心力作用下，所述第一加样腔的血浆经过所述第一L型微流道流入Y型微流道的第一进样口；所述第二加样腔的红细胞试剂经过所述第二L型微流道流入Y型微流道的第二进样口；所述血浆与所述红细胞试剂在Y型微流道内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经Y型微流道的流出口流出至所述反应检测腔并在反应检测腔内充分反应。
步骤五：静置，判读得到检测结果。
若待测的血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块，在离心力作用下，所述红细胞凝块向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，所述红细胞凝块在一定时间内保持黏附于反应检测腔内侧壁。
若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，未发生免疫凝集反应的红细胞由于重力作用发生自然坍塌沉降。
本发明的第三个目的是提供采用上述的一种血液检测微流控芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测的方法。所述反应测试单元的数量为六个。各反应测试单元还对应设置有一个独立的血浆倍比稀释预处理槽，用于形成系列倍比稀释。各反应测试单元的第二加样腔接收同一种红细胞试剂，所述同一种红细胞试剂为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂或者O型RhD阳性红细胞试剂。该检测方法包括以下步骤：
步骤一：所述微量全血分离槽接收待测的微量全血样本。
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向所述直管凹槽远离芯片中心位置的一端沉积，分离后得到的血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽内，分离后得到的血浆的第二部分容纳于直管凹槽靠近芯片中心的一侧。
步骤三：离心结束后，吸取血浆提取凹槽中的血浆并将其依次转移至各血浆倍比稀释预处理槽。
步骤四：用含有二硫苏糖醇或二巯基乙醇稀释液对各所述血浆倍比稀释预处理槽中的待测的血浆作预处理，静置反应15～30min，以便破坏IgM型抗体活性；静置反应结束后，加入样本稀释液完成倍比稀释，得到倍比稀释血浆。
步骤五：吸取各血浆倍比稀释预处理槽内的倍比稀释血浆并将其转移至对应的反应测试单元的第一加样腔内；各反应测试单元的第二加样腔接收红细胞试剂。
步骤六：在离心力作用下，在各反应测试单元中，所述第一加样腔的倍比稀释血浆经过所述第一L型微流道流入Y型微流道的第一进样口；第二加样腔的红细胞试剂经过所述第二L型微流道流入Y型微流道的第二进样口；所述倍比稀释血浆与所述红细胞试剂在Y型微流道内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经Y型微流道的流出口流出至所述反应检测腔并在反应检测腔内充分反应。
步骤七：静置，判读得到检测结果。
若待测的血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块，在离心力作用下，所述红细胞凝块向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，所述红细胞凝块在一定时间内保持黏附于反应检测腔内侧壁。
若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，未发生免疫凝集反应的红细胞由于重力作用发生自然坍塌沉降。
最终，以最高倍比稀释的血浆样本未发生免疫凝集反应的稀释倍数的倒数作为针对特定血型抗原的血型IgG抗体效价。
优选的，各反应测试单元的反应检测腔内预置有抗人球蛋白多抗冻干球。
有益效果：
（1）本发明提供一种血液检测微流控芯片，适用于ABO血型反定型检测以及HDN孕妇血型IgG抗体效价检测。本申请的血液检测微流控芯片具有“微－全分析”功能，不同于试管法和微住凝胶法需要多步骤、多器皿完成，本申请将混合、进入反应腔、离心加速反应、停止离心静置、反应结果呈现等过程都在一个血液检测微流控芯片的一个分离检测单元内完成，简化了操作过程，为小型化、全自动化、高通量的配套分析仪提供了实现条件。
（2）本发明通过微量全血样本即可完成检测。微量全血分离槽的容积设定为50～100ul，样品进样量为40～80ul，能够很好地解决采血困难者尤其是新生儿的适用性，同时有利于节约试剂成本。
（3）本发明的血液检测微流控芯片属于离心式微流控芯片，其设置有L型微流道和Y型微流道。在离心力的作用下，第一加样腔的第一微流体经过第一L型微流道流入Y型微流道的第一进样口。第二加样腔的第二微流体经过第二L型微流道流入Y型微流道的第二进样口。第一微流体与第二微流体在Y型微流道内混合后，形成第一混合物，第一混合物经Y型微流道的流出口流出至反应检测腔。本申请利用管路几何交叉设计，通过设置自身具有管路交叉特性的L型微流道以及设置L型微流道的垂直微流道与Y型微流道的上层入口微流道在几何空间上相交叉，当不同的微流体分别依次流经对应的L型微流道以及Y型微流道的上层入口微流道时，对应的微流体先分裂成许多微团，再通过Y型微流道的上层混合微流道来促进不同的微流体微团之间的混合。本申请将上述混合过程应用于红细胞悬液与其他流体例如血浆的混匀，利用微流控芯片内部的流体力学原理，使得红细胞悬液与血浆之间充分混合并反应，以满足免疫凝集反应的条件。相较于其他混匀方式例如磁力搅拌等，本申请的混匀方式具有无携带污染、不需要增添额外材料、无需如磁力搅拌模块等结构、利于简化配套分析仪的结构等优点。
（4）本发明的血液检测微流控芯片允许通过反复离心的方法来增强弱抗原抗体的免疫凝集反应，进而提高了对弱抗原抗体反应检测的敏感性，即提高了ABO血型系统反定型鉴定的灵敏度。在传统的微住凝胶法中，在离心力的作用下，凝胶卡内部的红细胞凝集会受到切应力，当该切应力大于红细胞抗原抗体结合的亲合力时，抗体依赖的红细胞凝集将被分开，导致假阴性的检测结果。为了避免假阴性的检测结果，微柱凝胶法限定只通过对凝胶卡采取一次性离心后判读检测结果。这种方式虽然保障了对弱抗原抗体反应检测的特异性，但是降低了对弱抗原抗体反应检测的敏感性。不同于传统的微住凝胶法，本申请的血液检测微流控芯片内若发生红细胞抗原抗体结合，在离心过程中，红细胞凝集未受到切应力的影响而相对稳定，不存在微柱凝胶法中的假阴性风险，因此，本申请的血液检测微流控芯片允许通过反复离心以增强弱抗原抗体的免疫凝集反应。若发生免疫凝集反应并且反应充分，在离心力作用下，红细胞凝集沉降粘附于反应腔内侧壁。红细胞凝集在静置一定时间内不会发生自然坍塌沉降，保持垂直贴附于反应腔壁。反应腔底部无可见的沉降红细胞扣，表示血浆中含有红细胞血型抗体，即结果为阳性。若未发生免疫凝集反应，撤去离心力并静置一段时间，未发生免疫凝集反应的红细胞自然坍塌沉降，并沿反应腔底部倒圆锥斜坡聚集于反应腔底部中心，形成红细胞扣，表示血浆中无红细胞血型抗体，即结果为阴性。
（5）当采用本发明的芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测时，由于离心过程中，该芯片的微流道以及反应腔内不存在凝胶微柱法中的切应力，所以利用本发明的芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测的方法避免了凝胶微柱法出现假阴性结果的风险。
（6）当采用本发明的芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测时，反应检测腔内可以预置有抗人球蛋白多抗冻干球。冻干球试剂在常温环境下的稳定性比液体试剂的稳定性更好，由此，运输过程及温度对芯片性能稳定性影响较小。
（7）本发明对是否发生免疫凝集反应的判读方式可以采用显微图像摄影加人工智能判断，减少人为因素对判读的影响，简化操作步骤；同时图像可永久性保存便于复核，提高检测结果的准确性。
（8）本申请的微量全血分离槽的结构包括血浆提取凹槽以及与血浆提取凹槽连通的直管凹槽。通过设置直管凹槽，在具有微量全血分离功能的同时还具有利用毛细管法测定红细胞压积的功能。通过在直管凹槽的表面设置有用于判读红细胞压积的刻度标识，便于人工读取红细胞压积的数值，以作为输血时的参考依据。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本申请的第一实施例的用于ABO血型反定型检测的一种血液检测微流控芯片的芯片本体的立体结构示意图；
图2为本申请的第一实施例的用于ABO血型反定型检测的一种血液检测微流控芯片的芯片上层的俯视图；
图3为图1所示的芯片本体的俯视图；
图4为图3所示的芯片本体中的一个分离检测单元的局部放大图；
图5为图3所示的A向剖视立体示意图；
图6为本申请的第二实施例的用于HDN孕妇血型IgG抗体效价检测的一种血液检测微流控芯片的芯片本体的立体结构示意图；
图7为本申请的第二实施例的用于HDN孕妇血型IgG抗体效价检测的一种血液检测微流控芯片的芯片上层的俯视图；
图8为图6所示的芯片本体的俯视图；
图9为图8所示的芯片本体中的一个分离检测单元的局部放大图。
附图标记如下所示：
芯片本体1；第一分离检测单元101；第二分离检测单元102；微量全血分离槽110；血浆提取凹槽111；直管凹槽112；第一加样腔120；第一L型微流道130；第二加样腔140；第二L型微流道150；Y型微流道160；第一进样口161；第二进样口162；流出口163；反应检测腔170；倍比稀释预处理槽180a、180b、180c、180d、180e、180f；芯片上层2；微量全血分离槽注入孔201；第一加样腔注入孔202；第二加样腔注入孔203；血浆倍比稀释预处理槽注入孔204a、204b、204c、204d、204e、204f。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的技术方案进行详尽地描述。
实施例1
本实施例提供了一种血液检测微流控芯片，该血液检测微流控芯片用于对ABO血型进行反定型检测。该芯片包括芯片本体1以及芯片上层2。图1给出了本实施例的芯片本体1的立体结构示意图。
图2给出了本实施例的芯片上层2的俯视图。芯片上层2可以是透明贴膜，其覆盖于芯片本体1的顶面。
图3给出了图1所示的芯片本体1的俯视图。如图3所示，该芯片本体1包括六个分离检测单元。六个分离检测单元沿芯片本体1的旋转中心轴的圆周方向均匀分布。本实施例的分离检测单元相当于图3中的第一分离检测单元101。
图4给出了图3所示的芯片本体中的一个分离检测单元的局部放大图，其中虚线区域代表一个分离检测单元。如图4所示，每个第一分离检测单元101包括一个用于接收并分离微量全血样本的微量全血分离槽110以及三个反应测试单元。微量全血分离槽110的容积固定，可以设定为50～100ul，样品进样量为40～80ul，能够很好地解决采血困难者尤其是新生儿的适用性问题。当芯片本体1在2000～5000rpm的速度下转动时，从微量全血样本中分离出的红细胞沉降于微量全血分离槽110远离芯片本体1中心位置的一端，从微量全血样本中分离出的血浆位于微量全血分离槽110的另一端。
如图4所示，每个反应测试单元包括用于接收来自微量全血分离槽110的血浆的第一加样腔120、第一L型微流道130、用于接收相应的红细胞试剂的第二加样腔140、第二L型微流道150、Y型微流道160以及反应检测腔170。在本实施例中，三个反应测试单元的第二加样腔140所接收的红细胞试剂分别为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂和O型红细胞试剂。在同一反应测试单元内，第一加样腔120和第二加样腔140相邻设置并且位于芯片本体1的旋转中心轴的同一个同心圆上。第一加样腔120和第二加样腔140相对于反应检测腔170更靠近芯片中心位置的一侧。
如图4所示，Y型微流道160包括第一进样口161、第二进样口162以及流出口163。分别流入第一进样口161与第二进样口162的流体经Y型微流道160混合后从流出口163排出。第一L型微流道130连通第一加样腔120与Y型微流道160的第一进样口161。第二L型微流道150连通第二加样腔140与Y型微流道160的第二进样口162。Y型微流道160的流出口163与反应检测腔170连通。
检测时，在离心力的作用下，第一加样腔120的第一微流体经过第一L型微流道130流入Y型微流道160的第一进样口161。第二加样腔140的第二微流体经过第二L型微流道150流入Y型微流道160的第二进样口162。第一微流体与第二微流体在Y型微流道160内混合后，形成第一混合物，第一混合物经Y型微流道160的流出口163流出至反应检测腔170。第一微流体和第二微流体可以都是液体，或者，两者中的至少一种为多相混合物。在一个特定的实施例中，第一微流体为血浆，第二微流体为红细胞悬液。在300～2000rpm的离心力作用下，血浆与红细胞悬液分别通过相应的L型微流道汇入Y型微流道160。利用Y型微流道160的混合作用，使血浆与红细胞悬液混合、充分反应。混合反应后形成的多相混合物进入并充满反应检测腔170。
图5给出了图3所示的A向剖视立体示意图，图中箭头表示离心力作用下的流体流向。如图5所示，第一L型微流道130和第二L型微流道150均是由依次连通的下层微流道和垂直微流道构成，下层微流道与垂直微流道垂直设置。下层微流道和垂直微流道垂直连接形成了L型微流道的管道交叉特性。下层微流道设置有密封膜以防止样本漏出。第一L型微流道130中的下层微流道的入口与第一加样腔120远离芯片本体1中心位置的一侧的底部连通。第二L型微流道150中的下层微流道的入口与第二加样腔140远离芯片本体1中心位置的一侧的底部连通。
Y型微流道160的第一进样口161、第二进样口162以及流出口163均位于芯片本体1的上部。Y型微流道160的第一进样口161与第一L型微流道130中的垂直微流道的出口连通，Y型微流道160的第二进样口162与第二L型微流道150中的垂直微流道的出口连通。
具体的，如图5所示，Y型微流道160包括两个上层入口微流道以及一个上层混合微流道。其中一个上层入口微流道的入口为Y型微流道160的第一进样口161，另一个上层入口微流道的入口为Y型微流道160的第二进样口162。两个上层入口微流道的出口交汇在上层混合微流道的入口。上层混合微流道的出口为Y型微流道160的流出口163。Y型微流道160可以位于与垂直微流道垂直设置的平面内，以便各上层入口微流道与对应的垂直微流道垂直设置。
本申请利用管路几何交叉设计，通过设置自身具有管路交叉特性的L型微流道以及设置L型微流道的垂直微流道与Y型微流道在几何空间上相交叉，当不同的微流体分别依次流经对应的L型微流道以及Y型微流道的上层入口微流道时，对应的微流体先分裂成许多微团，再通过Y型微流道的上层混合微流道来促进不同的微流体微团之间的混合。
如图5所示，微量全血分离槽110沿芯片的径向设置。为了兼具检测红细胞压积的功能，如图5所示，微量全血分离槽110包括血浆提取凹槽111以及与血浆提取凹槽111连通的直管凹槽112。直管凹槽112位于微量全血分离槽110远离芯片中心位置的一端，血浆提取凹槽111位于微量全血分离槽110靠近芯片中心位置的另一端。具体地，微量全血分离槽110中的血浆提取凹槽111用于接收待测的微量全血样本。在离心力的作用下，微量全血样本分离后得到的红细胞全部沉积于直管凹槽112远离芯片中心位置的一端，血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽111内，血浆的第二部分容纳于直管凹槽112靠近芯片中心的一端。在一些示例中，当芯片本体1在2000～5000rpm的速度下转动时，微量全血分离槽110内的微量全血进行分离。
为了便于人工判读，直管凹槽112的表面可以设置有用于判读红细胞压积的刻度标识。刻度标识在图中未示出。
为了提高对反应检测腔判读的灵敏度和精准度，如图5所示，反应检测腔170包括圆柱形空腔以及直径逐渐缩小的锥形空腔。锥形空腔的大直径端与圆柱形空腔的底端连通。
如图2所示，微量全血分离槽110顶部靠近芯片本体2的中心位置的一端设置有用于加入微量全血样本的微量全血分离槽注入孔201。第一加样腔120顶部靠近芯片本体2的中心位置的一端设置有用于加入来自微量全血分离槽110的血浆的第一加样腔注入孔202。第二加样腔140顶部靠近芯片本体2的中心位置的一端设置有用于加入相应的红细胞试剂的第二加样腔注入孔203。微量全血分离槽注入孔201、第一加样腔注入孔202以及第二加样腔注入孔203均位于芯片上层2。
优选的，如图2所示，微量全血分离槽注入孔201、第一加样腔注入孔202以及第二加样腔注入孔203均设置有用于透气的缺口。其效果是，在加样时，缺口利于排出空气，从而避免样本溢出孔外。缺口的形状可以是U或者V型。
使用本实施例的血液检测微流控芯片对ABO血型进行反定型检测的检测方法包括以下步骤：
步骤一：微量全血分离槽110接收待测的微量全血样本。
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向直管凹槽112远离芯片中心位置的一端沉积，血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽111内，血浆的第二部分容纳于直管凹槽112靠近芯片中心的一侧。
步骤三：离心结束后，吸取血浆提取凹槽111中的血浆并将其转移至各反应测试单元的第一加样腔120。各反应测试单元的第二加样腔140接收相应的红细胞试剂。
步骤四：在离心力作用下，第一加样腔120的血浆经过第一L型微流道130流入Y型微流道160的第一进样口161；第二加样腔140的红细胞试剂经过第二L型微流道150流入Y型微流道160的第二进样口162。在离心力作用下，血浆与红细胞试剂在Y型微流道160内混合后，形成第一混合物，第一混合物经Y型微流道160的流出口163流出至反应检测腔170并在对应的反应检测腔170内充分反应1～5min。离心力的作用可缩短红细胞之间的距离，促进抗体与红细胞抗原的免疫凝集反应，增强免疫凝集反应强度。
步骤五：控制所述血液检测微流控芯片停止转动，静置，判读得到检测结果。
在本实施例中，各反应检测腔170内是否发生免疫凝集反应的判读原理如下：若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块。在离心力的作用下，红细胞凝块会因离心沉降垂直贴附于反应检测腔170内侧壁。控制所述血液检测微流控芯片停止转动后，在芯片本体静置状态下，红细胞凝块在一定时间内不会发生自然坍塌，即保持黏附于反应检测腔170内侧壁上一定时间。反应检测腔170腔底没有未凝集的红细胞，代表结果为阳性。
若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力的作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞也会由于离心沉降垂直贴附于反应检测腔170内侧壁。但是，不同于红细胞凝块，未发生免疫凝集反应的红细胞在静置一段时间后会由于重力作用发生自然坍塌沉降，即反应检测腔170腔底形成有大量未凝集的红细胞，代表结果为阴性。
对于ABO血型和Rh弱D抗原，在一次离心后的静置过程中，反应检测腔170腔底的红细胞沉降量或者沉降速度明显少于对照反应腔。该对照反应腔是指加有O型红细胞试剂的反应测试单元中的反应检测腔。此时，本申请的芯片可以通过重复2–3次离心，以直接增强免疫凝集反应。相较于凝胶法，本申请的芯片能够通过反复离心提高对免疫凝集反应检测的敏感性，以避免传统的微柱凝胶法因抗体较弱导致的正反定型不符合的情况。
在本实施例中，检测结果可以通过肉眼判读获得或者通过显微摄影并结合人工智能分析获得。相较于肉眼判断，显微摄影并结合人工智能分析的判断方式减少了人为因素的干扰，并因图像可永久保存而允许复核，进而有助于提高检测结果的准确性。
在本实施例中，由于反应检测腔170的底部设有锥形空腔，未凝集的红细胞聚集于圆锥顶点处，形成沉降红细胞扣。沉降红细胞扣提供了更清晰易读、更灵敏精准的判读方式。
反定型血型鉴定结果判断如表1所示。
实施例2
本实施例提供了一种血液检测微流控芯片，该血液检测微流控芯片用于对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测。该芯片包括芯片本体1以及覆盖于芯片本体1的顶面的芯片上层2。图6给出了本实施例的血液检测微流控芯片中的芯片本体1的立体结构示意图。图7给出了本实施例的芯片上层2的俯视图。
图8给出了图6所示的芯片本体1的俯视图。如图8所示，本实施例的芯片本体1包括三个分离检测单元，三个分离检测单元沿芯片本体1的旋转中心轴的圆周方向均匀分布。本实施例的每个分离检测单元相当于图8中的第二分离检测单元102。
图9给出了图8所示的芯片本体1中的第二分离检测单元102的局部放大图，其中虚线区域代表一个分离检测单元。如图9所示，不同于实施例1，在本实施例的各第二分离检测单元102中，反应测试单元的数量为六个。并且，本实施例的芯片本体1还包括与各反应测试单元一一对应设置的血浆倍比稀释预处理槽180a、180b、180c、180d、180e、180f，用于制备一系列不同稀释倍数的血浆，以便使用者在使用本实施例的芯片时，无须另行准备血浆倍比稀释液制备试管，同时有助于节省耗材。通常，2、4、8、16、32、64等稀释倍数的血浆用于抗Rh血型IgG抗体效价测定，64、128、256、512、1024、2048等稀释倍数的血浆用于抗A、抗B血型IgG抗体效价测定。
在本实施例中，各反应测试单元的第二加样腔140接收同一种红细胞试剂，同一种红细胞试剂为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂或者O型RhD阳性红细胞试剂。A型红细胞试剂以及B型红细胞试剂适用于对ABO血型不符HDN血型IgG抗体效价检测。O型RhD阳性红细胞试剂适用于对Rh血型不符合HDN血型IgG抗体效价检测。
具体地，首先根据父母双方的血型预测胎儿可能的血型，再通过选择相应的已知血型红细胞试剂来测定母体血液中相应的抗体。例如，若孕妇为A型RhD阴性，父亲为B型RhD阳性血型，则胎儿的血型可以是A型RhD阳性、A型RhD阴性、B型RhD阳性、B型RhD阴性、AB型RhD阳性、AB型RhD阴性、O型RhD阳性或者O型RhD阴性，这种情况下，需要分别选择B型红细胞试剂和O型RhD阳性红细胞试剂检测孕妇抗B及抗RhD抗体，即需要使用两个分离检测单元；若父亲是B型RhD阴性血型，则胎儿的血型可以是A型RhD阴性、B型RhD阴性、AB型RhD阴性或者O型RhD阴性，则只需选择B型红细胞试剂检测孕妇抗B抗体即可，即仅需要一个分离检测单元。
如图7所示，在本实施例中，除了设置有微量全血分离槽注入孔201、第一加样腔注入孔202以及第二加样腔注入孔203，芯片上层2还设置有六个血浆倍比稀释预处理槽注入孔204a、204b、204c、204d、204e、204f。血浆倍比稀释预处理槽注入孔204a到204f依次布设于血浆倍比稀释预处理槽180a到180f的顶部，例如，血浆倍比稀释预处理槽注入孔204a位于血浆倍比稀释预处理槽180a的顶部，血浆倍比稀释预处理槽注入孔204b位于血浆倍比稀释预处理槽180b的顶部，其余类似对应。
采用本实施例的血液检测微流控芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测的检测方法包括以下步骤：
步骤一：微量全血分离槽110接收待测的微量全血样本。
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向直管凹槽112远离芯片中心位置的一端沉积，血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽111内，血浆的第二部分容纳于直管凹槽112靠近芯片中心的一侧。
步骤三：离心结束后，吸取血浆提取凹槽111中的血浆并将其依次转移至各血浆倍比稀释预处理槽。
步骤四：用含有二硫苏糖醇DTT或二巯基乙醇2-ME稀释液对血浆倍比稀释预处理槽内的血浆作预处理，静置反应15～30min，以便破坏IgM型抗体活性。静置反应结束后，加入样本稀释液完成倍比稀释，得到倍比稀释血浆。样本稀释液可以是PBS（磷酸盐缓冲液）或生理盐水。
步骤五：吸取各血浆倍比稀释预处理槽内的倍比稀释血浆并将其转移至对应的反应测试单元的第一加样腔120内；各反应测试单元的第二加样腔140接收红细胞试剂。
步骤六：在离心力作用下，在各反应测试单元中，第一加样腔120的倍比稀释血浆经过第一L型微流道130流入Y型微流道160的第一进样口161；第二加样腔140的红细胞试剂经过第二L型微流道150流入Y型微流道160的第二进样口162；在离心力作用下，倍比稀释血浆与红细胞试剂在Y型微流道160内混合后，形成第一混合物，第一混合物经Y型微流道160的流出口163流出至反应检测腔170并在反应检测腔170内充分反应1～5min。
步骤七：控制所述血液检测微流控芯片停止转动，静置，判读得到检测结果。
在本实施例中，各反应检测腔170内是否发生免疫凝集反应的判读原理与本申请的第一实施例中的判断原理相同。若倍比稀释血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块，在离心力的作用下，红细胞凝块会因离心沉降垂直贴附于反应检测腔170内侧壁。红细胞凝块在静置一定时间内不会发生自然坍塌，即保持黏附于反应检测腔170内侧壁。反应检测腔170腔底没有未凝集的红细胞，代表结果为阳性。
若倍比稀释血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力的作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞也会由于离心沉降垂直贴附于反应检测腔170内侧壁，但是，不同于红细胞凝块，未发生免疫凝集反应的红细胞在静置一段时间后会由于重力作用发生自然坍塌沉降，即反应检测腔170腔底形成有未凝集的红细胞，代表结果为阴性。以最高倍比稀释的血浆样本未发生免疫凝集反应的稀释倍数的倒数作为特定血型抗原的血型IgG抗体效价。
在本实施例中，各反应测试单元的反应检测腔170内可以预置有抗人球蛋白多抗冻干球。冻干球试剂在常温环境下的稳定性比液体试剂的稳定性更好。抗人球蛋白抗体作为第二抗体达到桥梁的作用，链接与红细胞抗原结合的特异性抗体，使红细胞凝集。
在本实施例中，反应检测腔170的底部也可以设有锥形空腔。未凝集的红细胞聚集于圆锥顶点处，形成沉降红细胞扣。沉降红细胞扣提供了更清晰易读、更灵敏精准的判读方式。
本发明提供了一种血液检测微流控芯片及其检测方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (9)
1.一种血液检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片包括芯片本体(1)，所述芯片本体(1)包括一个以上的分离检测单元，各所述分离检测单元包括用于接收并分离微量全血样本的微量全血分离槽(110)以及一个以上的反应测试单元；当所述芯片本体(1)转动时，从所述微量全血样本中分离出的红细胞沉降于所述微量全血分离槽(110)远离所述芯片本体(1)中心位置的一端，从所述微量全血样本中分离出的血浆位于所述微量全血分离槽(110)的另一端；各所述反应测试单元包括用于接收来自所述微量全血分离槽(110)的血浆的第一加样腔(120)、第一L型微流道(130)、用于接收相应的红细胞试剂的第二加样腔(140)、第二L型微流道(150)、Y型微流道(160)以及反应检测腔(170)；所述Y型微流道(160)包括第一进样口(161)、第二进样口(162)以及流出口(163)，分别流入所述第一进样口(161)与所述第二进样口(162)的流体经Y型微流道(160)混合后从所述流出口(163)排出；所述第一L型微流道(130)连通所述第一加样腔(120)与所述Y型微流道(160)的第一进样口(161)；所述第二L型微流道(150)连通所述第二加样腔(140)与所述Y型微流道(160)的第二进样口(162)；所述Y型微流道(160)的流出口(163)与所述反应检测腔(170)连通；
所述第一L型微流道(130)和所述第二L型微流道(150)均是由依次连通的下层微流道和垂直微流道构成，所述下层微流道与所述垂直微流道垂直设置；第一L型微流道(130)中的下层微流道的入口与所述第一加样腔(120)远离所述芯片本体(1)中心位置的一侧的底部连通；所述第二L型微流道(150)中的下层微流道的入口与所述第二加样腔(140)远离所述芯片本体(1)中心位置的一侧的底部连通；
Y型微流道(160)的第一进样口(161)、第二进样口(162)以及流出口(163)均位于所述芯片本体(1)的上部；Y型微流道(160)的第一进样口(161)与第一L型微流道(130)中的垂直微流道的出口连通，Y型微流道(160)的第二进样口(162)与第二L型微流道(150)中的垂直微流道的出口连通；
Y型微流道(160)包括两个上层入口微流道以及一个上层混合微流道；其中一个上层入口微流道的入口为Y型微流道(160)的第一进样口(161)，另一个上层入口微流道的入口为Y型微流道(160)的第二进样口(162)，两个上层入口微流道的出口交汇在上层混合微流道的入口，上层混合微流道的出口为Y型微流道(160)的流出口(163)；各上层入口微流道与对应的垂直微流道垂直设置。
2.根据权利要求1所述的一种血液检测微流控芯片，其特征在于，所述微量全血分离槽(110)沿所述芯片的径向设置；所述微量全血分离槽(110)包括血浆提取凹槽(111)以及与所述血浆提取凹槽(111)连通的直管凹槽(112)；直管凹槽(112)位于微量全血分离槽(110)远离芯片中心位置的一端，血浆提取凹槽(111)位于微量全血分离槽(110)靠近芯片中心位置的另一端；在离心力的作用下，所述微量全血样本分离后得到的红细胞全部沉积于所述直管凹槽(112)远离芯片中心位置的一端。
3.根据权利要求2所述的一种血液检测微流控芯片，其特征在于，所述直管凹槽(112)的表面设置有用于判读红细胞压积的刻度标识；所述微量全血分离槽(110)的容积为50～100ul。
4.根据权利要求1所述的一种血液检测微流控芯片，其特征在于，所述反应测试单元的数量为六个；还包括与各所述反应测试单元一一对应设置的血浆倍比稀释预处理槽。
5.根据权利要求1至4中的任意一项权利要求所述的一种血液检测微流控芯片，其特征在于，所述反应检测腔(170)包括圆柱形空腔以及直径逐渐缩小的锥形空腔，所述锥形空腔的大直径端与所述圆柱形空腔的底端连通。
6.一种基于权利要求1所述的一种血液检测微流控芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
所述第一加样腔(120)的第一微流体经过所述第一L型微流道(130)流入所述Y型微流道(160)的第一进样口(161)；所述第二加样腔(140)的第二微流体经过所述第二L型微流道(150)流入所述Y型微流道(160)的第二进样口(162)；
所述第一微流体与所述第二微流体在所述Y型微流道(160)内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经所述Y型微流道(160)的流出口(163)流出至所述反应检测腔(170)。
7.一种利用权利要求2所述的一种血液检测微流控芯片进行ABO血型反定型检测的方法，其特征在于，所述反应测试单元的数量为三个；各所述反应测试单元的第二加样腔(140)接收的红细胞试剂分别为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂和O型红细胞试剂；该检测方法包括以下步骤：
步骤一：所述微量全血分离槽(110)接收待测的微量全血样本；
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向所述直管凹槽(112)远离芯片中心位置的一端沉积，分离后得到的血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽(111)内，分离后得到的血浆的第二部分容纳于直管凹槽(112)靠近芯片中心的一侧；
步骤三：离心结束后，吸取所述血浆提取凹槽(111)中的血浆并将其转移至各所述反应测试单元的第一加样腔(120)；各所述反应测试单元的第二加样腔(140)接收相应的红细胞试剂；
步骤四：在离心力作用下，所述第一加样腔(120)的血浆经过所述第一L型微流道(130)流入所述Y型微流道(160)的第一进样口(161)；所述第二加样腔(140)的红细胞试剂经过所述第二L型微流道(150)流入所述Y型微流道(160)的第二进样口(162)；所述血浆与所述红细胞试剂在所述Y型微流道(160)内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经所述Y型微流道(160)的流出口(163)流出至所述反应检测腔(170)并在所述反应检测腔(170)内充分反应；
步骤五：静置，判读得到检测结果；
若待测的血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块；在离心力作用下，所述红细胞凝块向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，所述红细胞凝块在一定时间内保持黏附于反应检测腔(170)内侧壁；若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，未发生免疫凝集反应的红细胞由于重力作用发生自然坍塌沉降。
8.一种利用权利要求2所述的一种血液检测微流控芯片对HDN孕妇血型IgG抗体效价进行检测的方法，其特征在于，所述反应测试单元的数量为六个；各反应测试单元还对应设置有一个独立的血浆倍比稀释预处理槽，用于形成系列倍比稀释；各所述反应测试单元的第二加样腔(140)接收同一种红细胞试剂，所述同一种红细胞试剂为A型红细胞试剂、B型红细胞试剂或者O型RhD阳性红细胞试剂；该检测方法包括以下步骤：
步骤一：所述微量全血分离槽(110)接收待测的所述微量全血样本；
步骤二：在离心力作用下，待测的微量全血样本中的红细胞与血浆分离，分离后得到的红细胞向所述直管凹槽(112)远离芯片中心位置的一端沉积，分离后得到的血浆的第一部分容纳于血浆提取凹槽(111)内，分离后得到的血浆的第二部分容纳于直管凹槽(112)靠近芯片中心的一侧；
步骤三：离心结束后，吸取所述血浆提取凹槽(111)中的血浆并将其依次转移至各所述血浆倍比稀释预处理槽；
步骤四：用含有二硫苏糖醇(DTT)或二巯基乙醇(2-ME)稀释液对各所述血浆倍比稀释预处理槽中的血浆作预处理，静置反应15～30min，以便破坏IgM型抗体活性；静置反应结束后，加入样本稀释液完成倍比稀释，得到倍比稀释血浆；
步骤五：吸取各所述血浆倍比稀释预处理槽内的倍比稀释血浆并将其转移至对应的反应测试单元的所述第一加样腔(120)内；各所述反应测试单元的第二加样腔(140)接收红细胞试剂；
步骤六：在离心力作用下，在各所述反应测试单元中，所述第一加样腔(120)的倍比稀释血浆经过所述第一L型微流道(130)流入所述Y型微流道(160)的第一进样口(161)；所述第二加样腔(140)的红细胞试剂经过所述第二L型微流道(150)流入所述Y型微流道(160)的第二进样口(162)；所述倍比稀释血浆与所述红细胞试剂在所述Y型微流道(160)内混合后，形成第一混合物，所述第一混合物经所述Y型微流道(160)的流出口(163)流出至所述反应检测腔(170)并在所述反应检测腔(170)内充分反应；
步骤七：静置，判读得到检测结果；
若待测的血浆中的血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原发生免疫凝集反应，形成红细胞凝块，在离心力作用下，所述红细胞凝块向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，所述红细胞凝块在一定时间内保持黏附于反应检测腔(170)内侧壁；若待测的血浆中血型抗体与红细胞试剂中的血型抗原未发生免疫凝集反应，在离心力作用下，未发生免疫凝集反应的红细胞向远离芯片中心位置的方向沉降；当所述芯片静止时，未发生免疫凝集反应的红细胞由于重力作用发生自然坍塌沉降；以最高倍比稀释的血浆样本未发生免疫凝集反应的稀释倍数的倒数作为针对特定血型抗原的血型IgG抗体效价。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，各所述反应测试单元的反应检测腔(170)内预置有抗人球蛋白多抗冻干球。
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