CN116490776A - 用于检测和治疗卵巢癌的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于检测早期卵巢癌和确定处于卵巢癌风险中的方法和相关试剂盒。

Description

用于检测和治疗卵巢癌的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月29日提交的美国临时专利申请号63/107,160的权益，其披露内容通过引用以其整体并入本文。
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。
背景技术
卵巢癌是一种特别隐匿的癌症，因为目前的方法无法充分检测早期卵巢癌。早期检测的卵巢癌(IA/IB/IC期)至少有85％的五年生存率；然而，随着疾病的进展，预后急剧恶化：IV期癌症的相对生存率为17％。目前，超过70％的卵巢癌患者出现晚期(III-IV)疾病，5年生存率低于30％。然而，当疾病局限于卵巢(I期)或骨盆(II期)时，通过常规手术和化学疗法可以实现高达70％-90％的生存率。
迄今为止，CA125是研究最多的卵巢癌早期检测标志物。然而，CA125的灵敏度仍然有限，20％的上皮卵巢癌不表达显著水平的CA125。单独使用CA125或经阴道超声(TVS)都不具备足够的灵敏度或特异性来进行早期检测。一个两阶段策略，即CA125升高提示筛选的有限部分妇女出现TVS，可以达到足够的特异性，但CA125的灵敏度有限。因此，需要额外的一个或多个标志物来检测早期疾病，以补充CA125的性能。
卵巢癌和三阴性乳腺癌(TNBC)具有共同的基因组特征，包括MYC拷贝数扩增。MYC是卵巢癌发病机制中的致癌驱动因素。三阴性乳腺癌中MYC对多胺代谢酶(PME)转录的调节，以及血浆多胺特征的存在与TNBC的发展和进展相关，已得到证实。本文展示了与卵巢癌相关的血浆多胺特征，以及与单独使用CA125相比，多胺与CA125组合使用可提高分类性能。
发明内容
本披露提供了用于检测和诊断卵巢癌的方法和试剂盒。这些方法和试剂盒使用对从受试者获得的生物样品内包含的生物标志物的多重测定法。至少三种生物标志物DAS、N3AP和CA125的组合分析提供卵巢癌的高精度检测。
鉴定了回归模型，该模型可基于从受试者获得的生物样品中发现的DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平，检测受试者中的卵巢癌。
因此，本文提供了检测受试者卵巢癌的方法，所述方法包括测量受试者样品中DAS、N3AP和CA125的水平。
还提供了检测受试者卵巢癌的方法，所述发发发包括测量受试者样品中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平。
还提供了在受试者中治疗或预防卵巢癌的方法，其中DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平将受试者分类为处于卵巢癌风险。
还提供了相应试剂盒，用于确定受试者样品中卵巢癌指标的存在、用于确定受试者卵巢癌风险、以及用于确定和/或定量受试者卵巢癌风险，所述试剂盒包括用于测量样品中DAS、N3AP和CA125或测量样品中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd水平的材料。
附图说明
图1描述了MYC对卵巢癌中多胺代谢的调节。TCGA卵巢癌数据集中的(i)正常卵巢组织(n＝8)和(ii)卵巢浆液性癌(n＝586)中多胺代谢酶(a)鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)(P＝0.04)(b)精胺合酶(SMS)(P<0.0001)和(c)多胺氧化酶(PAOX)(P＝0.01)的基因表达。纵轴＝log2中位数居中。统计学显著性通过单侧Wilcoxon秩和检验确定。
图2描述了MYC对卵巢癌中的多胺代谢。在浆液性癌细胞系SKOv3中siRNA介导的MYC敲低之后(a)MYC(P<0.001)、ODC1(P<0.001)、SRM(P<0.001)和SMS(P<0.001)的相对倍数变化(2-Δ/ΔCT)。(i)siCtrl(ii)siMYC-1(iii)siMYC-3。与siCtrl相比，统计学显著性通过双侧学生t检验确定。(b)在siRNA介导的MYC敲低后，SKOv3的条件培养基中DAS(P＝0.04)的水平(面积单位±StDev)。纵轴＝面积单位±stdev。统计学显著性通过双侧学生t检验确定。
图3描述了单个血浆多胺(i)DAS(ii)AcSpmd(iii)N3AP(iv)DiAcSpmd针对测试集#1的分类性能。DAS曲线下面积(AUC)用于描绘所有病例(n＝116)，(a)所有对照(n＝143)、(b)良性盆腔肿块患者(n＝72)和(c)健康对照(n＝71)。横轴＝特异性(％)；纵轴＝灵敏度(％)。
图4描述了针对测试集#1根据组织学分层的病例和对照的多胺血浆水平。(a)DAS(b)DiAcSpmd(c)AcSpmd(d)N3AP。(i)浆液性(n＝91)(ii)子宫内膜样(n＝12)(iii)粘液性(n＝4)(iv)透明细胞癌(n＝8)(v)其他(n＝1)(vi)良性卵巢囊肿(n＝72)(vii)健康对照(n＝71)。纵轴＝标准化值。
图5描述针对测试集#1时3标志物组和CA125的分类性能。(a)由(i)DAS+N3AP+CA125和(ii)仅CA125组成的3标志物组的曲线下面积。横轴＝特异性(％)；纵轴＝灵敏度(％)。(b)散点图说明(i)卵巢癌病例(ii)良性疾病对照(iii)健康对照的3标志物组得分(纵轴)和log10CA125值(横轴)的分布。虚线表示99％特异性截止值。
图6描述了(a)血浆多胺(i)DAS(ii)AcSpmd(iii)N3AP(iv)DiAcSpmd针对验证集#2的分类性能。单个多胺的曲线下面积(AUC)，用于区分所有病例(n＝61)和健康对照(n＝71)(b)散点图说明对于(i)卵巢癌病例(ii)健康对照的3标志物组得分(纵轴)和log10 CA125值(横轴)。虚线表示>99％特异性截止值。
图7描述了针对验证集#2根据组织学分层的病例和对照的多胺血浆水平。(a)DAS(b)DiAcSpmd(c)AcSpmd(d)N3AP。(i)浆液性(n＝28)(ii)子宫内膜样(n＝22)(iii)粘液性(n＝6)(iv)透明细胞癌(n＝4)(v)其他(n＝1)(vi)健康对照(n＝71)。纵轴＝标准化值。
如图8描绘的散点图描述了对于(i)卵巢癌病例(ii)健康对照针对验证集#2在CA125‘阴性’(定义为≤35U/mL)受试者中的3标志物组得分(纵轴)和CA125值(横轴，U/mL)。虚线表示100％特异性截止值。
图9描述了固定的3标志物组(3MP)用于区分所有OvCa病例(A)或早期OvCa病例(B)健康对照的预测性能。
具体实施方式
本文披露了用于早期检测卵巢癌的致癌MYC驱动的血浆多胺特征。重要的是，这种多胺特征可以与CA125组合以进一步提高分类器性能。具体来说，由DAS+N3AP+CA125组成的3标志物组，其使用来自初始测试集的早期卵巢癌病例和对照受试者开发。然后使用由61个新诊断的早期卵巢癌病例和71个健康对照(试验群组#2)组成的独立血浆样品组测试固定的3标志物组，其结果通过捕获30％的被单独CA125遗漏的病例，证明了相对于单独CA125的显著改善。因此，确定了与卵巢癌相关的MYC驱动的血浆多胺特征，该特征在检测早期卵巢癌时补充了CA125。此外，一组5个标志物(包括DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd)以及本文描述的3标记组的预测性能在独立数据集中使用固定系数进行了测试，该数据集由219例新诊断的卵巢癌病例(59例I+II期和160例III+IV期)、190名具有良性盆腔肿块(BPM)的个体，以及409名健康对照者组成。
在一些实施例中，测量从受试者抽取的血液样品中的生物标志物。在一些实施例中，可以确定生物样品中生物标志物的存在或不存在，或者可替代地生物标志物的量。在一些实施例中，可以量化生物样品中生物标志物的水平。
在另一个实施例中，使用这些测量浓度基于表12中所列截止值处的灵敏度和特异性值来计算生物标志物评分。在另一个实施例中，此类方法进一步包括将DAS+N3AP+CA125的量与表12中举例说明的截止值进行比较。在另一个实施例中，此类方法进一步包括将DAS+N3AP+CA125+AcSpmd+DiAcSpmd的量与表14中举例说明的截止值进行比较。在另一个实施例中，截止值包括至少为0.89(95％CI:0.82-0.95)的AUC(95％CI)。在另一个实施例中，截止值包括约0.52至约0.95的AUC(95％CI)。在其他实施例中，N3AP的截止值包括至少0.62的AUC(95％CI)，或AcSpmd的截止值包括至少0.75的AUC(95％CI)，或DiAcSpmd的截止值包括至少为0.73的AUC(95％CI)，或DAS的截止值包括至少0.92的AUC(95％CI)。在另一个实施例中，将受试者分类为患有卵巢癌具有93％和84％的灵敏度，特异性分别为78％和94％。
在一些实施例中，提供用以分析生物样品的表面。在一些实施例中，目的生物标志物非特异性地吸附到该表面上。在一些实施例中，对目的生物标志物具有特异性的受体被合并到该表面上。在一些实施例中，该表面与颗粒(例如珠粒)缔合。
在一些实施例中，生物标志物与特定的受体分子结合，并且可以确定生物标志物-受体复合物的存在或不存在，或者可替代地生物标志物-受体复合物的量。在一些实施例中，可以量化生物标志物-受体复合物的量。在一些实施例中，将受体分子与酶连接，以促进检测和量化。
在一些实施例中，生物标志物与特定的中继分子结合，并且生物标志物-中继分子复合物又与受体分子结合。在一些实施例中，可以确定生物标志物-中继-受体复合物的存在或不存在，或者可替代地生物标志物-中继-受体复合物的量。在一些实施例中，可以量化生物标志物-中继-受体复合物的量。在一些实施例中，将受体分子与酶连接，以促进检测和量化。
在一些实施例中，顺序分析生物样品中的各种生物标志物。在一些实施例中，生物样品被分成多个单独的部分，以允许同时分析多种生物标志物。在一些实施例中，在单个过程中分析生物样品的多种生物标志物。
在一些实施例中，生物标志物的存在或不存在可以通过目视检查来确定。在一些实施例中，生物标志物的量可以通过使用光谱技术来确定。在一些实施例中，光谱技术是质谱。在一些实施例中，光谱技术是UV/Vis光谱。在一些实施例中，光谱技术是激发/发射技术，如荧光光谱。在一些实施例中，光谱技术是质谱。在一些实施例中，光谱技术与色谱技术相组合。在一些实施例中，色谱技术是液相色谱。在一些实施例中，色谱技术是高效液相色谱(“HPLC”)。在一些实施例中，色谱技术是气相色谱(“GC”)。在一些实施例中，组合的色谱/光谱技术是高效液相色谱/质谱(“HPLC-MS”)。在一些实施例中，组合的色谱/光谱技术是超高效液相色谱/质谱(“UPLC-MS”)。
在一些实施例中，生物标志物DAS、N3AP和CA125的分析，或生物标志物DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的分析，可以与额外的生物标志物的分析相组合。在一些实施例中，额外的生物标志物可以是蛋白质生物标志物。在一些实施例中，额外的生物标志物可以是非蛋白质的生物标志物。
在一些实施例中，提供了用于分析生物样品的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒可以包含执行分析所需的化学品和试剂。在一些实施例中，试剂盒包含用于操纵生物样品的装置，以便最小化所需的操作者干预。在一些实施例中，试剂盒可以数字记录分析的结果。在一些实施例中，试剂盒可以对由分析产生的数据执行任何需要的数学处理。
在另一个方面，本披露提供了一种利用生物标志物组和蛋白质标志物组确定受试者中的卵巢癌风险的方法，其中该生物标志物组包含DAS、N3AP和CA125，或包含DAS、N3AP、CA125、AcSpmd,和DiAcSpmd；其中该方法包括对从该受试者获得的生物样品执行以下步骤；测量该生物样品中的这些生物标志物和这些蛋白质生物标志物的水平；其中这些生物标志物和这些蛋白质生物标志物的量确定该受试者中的卵巢癌风险。
在另一方面，本披露提供了用于如本文所述的方法的试剂盒，其包含含有用于检测DAS的第一溶质的第一试剂溶液、含有用于检测N3AP的第二溶质的第二试剂溶液和含有用于检测CA125的第三溶质的第三试剂溶液。在其他实施例中，提供包含用于检测DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的溶质的试剂溶液。
在一个实施例中，这种试剂盒包括用于使试剂溶液与生物样品接触的设备。在另一个实施例中，这种试剂盒包括具有用于结合至少一种生物标志物的装置的至少一个表面。在另一个实施例中，至少一种生物标志物选自由DAS、N3AP和CA125组成的组，或选自由DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd组成的组。
在另一方面，本披露提供了一种治疗怀疑有卵巢癌风险的受试者的方法，该方法包括：用本文所述的方法分析受试者中的卵巢癌风险，并施用治疗有效量的卵巢癌治疗。在一个实施例中，该治疗是手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法或其组合。在另一个实施例中，这样的方法包括至少一个受体分子，其选择性地结合生物标志物，该生物标志物选自由DAS、N3AP和CA125组成的组，或选自由DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd组成的组。在另一个实施例中，DAS、N3AP和CA125的量或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的量的检测包括使用固体颗粒。在另一个实施例中，该固体颗粒是珠粒。在另一个实施例中，至少一种报道分子与酶连接。在另一个实施例中，至少一种蛋白质或代谢物标志物产生可检测信号。在另一个实施例中，该可检测信号可通过光谱法检测。在另一个实施例中，该光谱法是质谱。在另一个实施例中，这种方法包括将患者历史信息纳入到处于卵巢癌的风险或不处于卵巢癌的风险的分配中。在另一个实施例中，这种方法包括对被分配为处于卵巢癌的风险中的患者施用至少一种替代诊断测试。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗或预防受试者中的卵巢癌的方法，在该受试者中DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平鉴定了该受试者中的卵巢癌风险，该方法包括以下一个或多个步骤：向患有卵巢癌的受试者施用化学治疗药物；向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及部分或完全手术去除该患有卵巢癌的受试者中的癌组织的手术。在一个实施例中，DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平升高。在另一个实施例中，与在没有卵巢癌风险的参考受试者或组中的DAS、N3AP和CA125或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相比，DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平升高。在另一个实施例中，参考受试者或组是健康的。
在另一方面，本披露提供了治疗或预防受试者中的卵巢癌的方法，在该受试者中DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平将该受试者鉴定为患有卵巢癌或具有患卵巢癌的风险，该方法包括以下一项或多项：向患有卵巢癌的受试者施用化学治疗药物；向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及部分或完全手术去除该患有卵巢癌的受试者中的癌组织的手术。在一个实施例中，DAS、N3AP和CA125的水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平升高。在另一个实施例中，与在没有卵巢癌风险的参考受试者或组中的DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相比，DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平升高。在另一个实施例中，参考受试者或组是健康的。在另一个实施例中，受试者处于卵巢癌的高风险中。
在另一方面，本披露提供了一种治疗怀疑有卵巢癌风险的受试者的方法，该方法包括用本文所披露的方法分析受试者中的卵巢癌风险；施用治疗有效量的卵巢癌治疗。在一个实施例中，该治疗是手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法或其组合。
在一些实施例中，生物标志物的量用光谱来确定。在一些实施例中，所利用的光谱是UV-可见光谱。在一些实施例中，所利用的光谱是质谱。在其他实施例中，所利用的光谱是核磁共振(NMR)光谱，诸如包括但不限于质子NMR光谱、核磁共振(NMR)光谱、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、相关光谱(COSy)、核欧沃豪斯效应谱(NOESY)、旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱(ROESY)、LC-TOF-MS、LC-MS/MS和毛细管电泳-质谱。
在特定测定法中发现的一种或多种生物标志物的量可以直接报道给操作者，或者可替代地可以以数字方式存储，并易于使其可用于数学处理。可以提供一种用于执行数学分析的系统，并且可以进一步向操作者报道卵巢癌阳性或卵巢癌阴性的分类。
在一些实施例中，本领域普通技术人员已知的其他测定法可以与本文的披露内容一起发挥作用。其他测定法包括但不限于利用质谱、免疫亲和LC-MS/MS、表面等离子体共振、色谱、电化学、声波、免疫组织化学和阵列技术的测定法。
本文所讨论的各种系统组件可包括以下的一个或多个：包括用于处理数字数据的一个或多个处理器的计算机；短期或长期数字存储器；输入模数转换器，用于提供数字化数据；处理器可用来指导该处理器处理数字数据的应用程序；用于从受试者或操作者收集信息的输入设备，以及用于向受试者或操作者显示信息的输出设备。
本文还提供了用于被分类为卵巢癌阳性的受试者的治疗方法。对卵巢癌阳性患者的治疗可以包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法或其组合。
关于本文详述的生物标志物的检测，本披露不限于本文报道的特定生物分子。在一些实施例中，可以选择其他生物分子来检测和分析所披露的生物标志物，包括但不限于基于蛋白质、抗体、核酸、适配体和合成有机化合物的生物分子。其他分子可能在灵敏度、效率、测定速度、成本、安全性或易于制造或储存方面表现出优势。在这方面，本领域普通技术人员将理解，本文披露的生物标志物的预测和诊断能力不仅可以扩展到对这些生物标志物的蛋白质形式的分析，还可以扩展到对生物标志物的其他表现形式(例如，核酸)的分析。此外，本领域普通技术人员将理解，本文披露的生物标志物的预测和诊断能力也可以与对与卵巢癌相关的其他生物标志物的分析组合使用。在一些实施例中，与卵巢癌相关的其他生物标志物可以是基于蛋白质的生物标志物。
本披露还提供以下实施例：
在一个方面，本披露提供了一种方法，该方法：
-确定受试者患卵巢癌的风险，
-在受试者中预测对卵巢癌的易感性，
-诊断受试者中的卵巢癌，
-将受试者分类为患有卵巢癌/处于患卵巢癌的风险中或
-预测受试者中卵巢癌进展的可能性，
-为患有卵巢癌的受试者提供预后，或
-选择患有卵巢癌的受试者用抗癌疗法治疗
该方法包括在获自该受试者的生物样品中，
a)测量二乙酰精胺(DAS)、N-(3-乙酰胺基丙基)吡咯烷-2-酮(N3AP)和癌症抗原125(CA125)的水平；以及
b)将所述样品中的DAS、N3AP和CA125水平与对应于健康受试者的参考值进行比较，
其中DAS、N3AP和CA125相对于所述参考的改变量提供选自由以下组成的组的指示：
-该受试者患有卵巢癌或处于患卵巢癌的风险中或没有卵巢癌或不处于患卵巢癌的风险中的指示，
-该受试者处于发展为卵巢癌的风险中或不处于发展为卵巢癌的风险中的指示，
-该受试者对卵巢癌的易感性的指示，
-在该受试者中该卵巢癌的进展可能性的指示，
-该受试者的无进展生存期的指示，
-对该卵巢癌的治疗的可能结果的指示，以及
-该受试者是用抗癌疗法治疗的候选者的指示。
在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括测量N3AP、AcSpmd和/或DiAcSpmd的水平。
在一些实施例中，DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于参考值升高。
在一些实施例中，DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于从没有卵巢癌的受试者获得的生物样品中的相应水平升高。
在一些实施例中，DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于从具有一个或多个良性盆腔肿块的受试者获得的生物样品中的相应水平升高。
在一些实施例中，生物样品源自受试者的血液。
在一些实施例中，生物样品是血清。
在一些实施例中，卵巢癌选自浆液性和非浆液性卵巢癌。
在一些实施例中，卵巢癌是浆液性卵巢癌。
在一些实施例中，卵巢癌是非浆液性卵巢癌。
在一些实施例中，非浆液性卵巢癌选自子宫内膜样癌、粘液癌和透明细胞癌。
在一些实施例中，卵巢癌是早期(例如，I期)卵巢癌。
在一些实施例中，卵巢癌是晚期(例如，II期)卵巢癌。
在一些实施例中，卵巢癌起源于上皮。
在一些实施例中，受试者具有c-myc的扩增。
在一些实施例中，CA125的浓度通过免疫测定来确定。
在一些实施例中，免疫测定使用抗CA125抗体或其结合片段。
在一些实施例中，DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd中至少一个的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
在一些实施例中，DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd中至少一个的浓度通过包括液相色谱在内的方法来确定。
在一些实施例中，DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
在一些实施例中，DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
在一些实施例中，DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括液相色谱和质谱在内的方法来确定。
在一些实施例中，与评估单独DAS的方法相比，该方法在给定的特异性下提供了改进的灵敏度。
在一些实施例中，与评估单独CA125的方法相比，该方法在给定的特异性下提供了改进的灵敏度。
在一些实施例中，该方法在约99％的特异性下提供改进的灵敏度。
在一些实施例中，该方法比评估单独DAS或CA125的方法正确鉴定更多的早期卵巢癌。
另一方面，本披露提供了包含DAS、N3AP和CA125的卵巢癌诊断组。
在一些实施例中，诊断组具有大于0.82的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组具有约0.84的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组对于将卵巢癌与健康对照区分开来而言具有约0.97的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组对于区分早期卵巢癌而言具有约0.95的AUC点估计。
另一方面，本披露提供了包含DAS、N3AP、AcSpmd、DiAcSpmd和CA125的卵巢癌诊断组。
在一些实施例中，诊断组具有大于0.82的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组具有约0.84的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组对于将卵巢癌与健康对照区分开来而言具有约0.97的AUC点估计。
在一些实施例中，诊断组对于区分早期卵巢癌而言具有约0.95的AUC点估计。
在一些实施例中，使用固定系数评估DAS、N3AP、AcSpmd、DiAcSpmd和CA125。
在一些实施例中，该方法进一步包括将DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的量与包含约0.52至约0.95的AUC(95％CI)的截止值进行比较。
在一些实施例中，N3AP的截止值包括至少0.62的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，AcSpmd的截止值包括至少0.75的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，DiAcSpmd的截止值包括至少0.73的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，DAS的截止值包括至少0.92的AUC(95％CI)。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗或预防受试者中的卵巢癌进展的方法，在该受试者中DAS、N3AP和CA125的水平相对于对应于无卵巢癌受试者中的水平的参考值升高，该方法包括以下一项或多项：
-向该患有卵巢癌的受试者施用抗癌药物；
-向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及
-部分或完全手术去除该患有卵巢癌的受试者中的癌组织的手术。
在另一个方面，本披露提供了一种治疗或预防受试者中的卵巢癌进展的方法，在该受试者中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于对应于无卵巢癌受试者中的水平的参考值升高，该方法包括以下一项或多项：
-向该患有卵巢癌的受试者施用抗癌药物；
-向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及
前述内容相当广泛地概述了本披露的特征和技术益处，以便更好地理解具体实施方式。本领域技术人员应该理解，所披露的特定实施例可以容易地用作修改或设计用于实现本披露的相同目的的其他结构或过程的基础。应当理解，本披露不限于所描述的特定实施例，因为可对特定实施例进行变化并且仍然落入所附权利要求书的范围内。
缩写和定义
如本文所用，以下术语具有所指出的含义。
当披露值范围以及使用符号“从n1…至n2”或“在n1…与n2之间”(其中n1和n2是数字)时，则除非另外说明，否则此符号旨在包括这些数字本身以及它们之间的范围。此范围可以是整的或在这些端值之间连续的并且包括这些端值。举例来说，“2至6个碳”的范围旨在包括两个、三个、四个、五个和六个碳，因为碳以整数单位出现。通过举例，将范围“从1至3μM(微摩尔)”(其旨在包括1μM、3μM和介于两者之间的所有数)与有效数字的任何数字(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)进行比较。
如本文所用，术语“约”旨在限定它所修饰的数值，表示此值在误差界限内可变。当未列举特定误差界限(如图表或数据表中给出的平均值的标准差)时，术语“约”应被理解为意指涵盖所列举值的范围、和考虑到有效数字通过四舍五入到该数字而被包括的范围。
本文的任何定义可以与任何其他定义结合使用以描述复合结构基团。按照惯例，任何此类定义的尾随元素是附接到母体部分上的元素。例如，复合基团烷基酰胺基表示通过酰胺基基团附接到母体分子上的烷基基团，并且术语烷氧基烷基表示通过烷基基团附接到母体分子上的烷氧基基团。
如本文所用，“卵巢癌”是指在卵巢中形成的细胞恶性生长。卵巢癌最常见的起源是上皮细胞(约占卵巢癌的90％)，可分为多种类型，包括浆液性和非浆液性卵巢癌。浆液性卵巢癌是最常见的上皮细胞卵巢癌类型，约占所有卵巢癌的40％，而非浆液性卵巢癌可包括但不限于子宫内膜样癌、粘液癌和透明细胞癌。在一些实施例中，卵巢癌的严重程度可能不同，以I至IV期表示。在一些实施例中，卵巢癌可以处于早期阶段(例如，I期)，或者它可以是晚期的(例如，II期、III期或IV期)。
如本文所用，“c-MYC”是指c-MYC致癌基因，其表达被发现在高达70％的人类癌症中上调。c-MYC位于染色体8q24上，该染色体在癌症中经常易位或扩增。因此，在一些实施例中，患有卵巢癌的受试者可能在c-MYC基因中具有易位或扩增。在其他实施例中，患有卵巢癌的受试者具有c-MYC扩增。
当基团被定义为“无(null)”时，意指所述基团是不存在的。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物，优选是人，需要将其分类为卵巢癌阳性或卵巢癌阴性，并且可以为其提供进一步的治疗。
如本文所用，“参考患者”、“参考受试者”或“参考组”是指一组患者或受试者，可以将来自怀疑患有卵巢癌或处于患卵巢癌的风险中的患者或受试者的测试样品与之比较。在一些实施例中，这种比较可用于确定测试受试者是否患有卵巢癌。参考患者或组可以作为用于测试或诊断目的的对照。如本文所述，参考患者或组可以是从单个患者获得的样品，或者可以表示样品组，如汇集的样品组。
如本文所用，“健康”是指其中没有发现卵巢癌证据的个体，即，该个体未患卵巢癌。这样的个体可以被分类为“卵巢癌阴性”，或被分类为具有健康的卵巢或正常的未受损卵巢功能。健康的患者或受试者没有卵巢癌或其他卵巢疾病的症状，但可能有良性盆腔肿块，即腺瘤和囊肿的组合。在一些实施例中，健康患者或受试者可用作参考患者，用于与患病或疑似患病样品进行比较，以确定患者或患者组中的卵巢癌。
如本文所用，术语“治疗(“treatment”或“treating”)”是指针对受试者进行的药物施用或医疗程序执行，用于预防(prophylaxis/prevention)或治愈，或在受试者或患者遭受折磨的情况下降低病弱或紊乱或病症或事件的发生或复发的程度或可能性。与本披露相关，该术语也可以指施用药理学物质或配制品，或执行非药理学方法，这些方法包括但不限于放射疗法和手术。如本文所用的药理学物质可包括但不限于抗癌药物，包括化学疗法、激素疗法和靶向疗法。卵巢癌化疗药物的实例包括紫杉醇(例如白蛋白结合型紫杉醇或nab-紫杉醇，商品名)、六甲蜜胺/>卡培他滨/>环磷酰胺/>依托泊苷(VP-16)、吉西他滨/>异环磷酰胺/>伊立替康(CPT-11，/>)、脂质体伊立替康/>脂质体多柔比星美法仑、培美曲塞/>拓扑替康和长春瑞滨/>以及联合化疗方案，包括顺铂+紫杉醇、TIP(紫杉醇/紫杉酚、异环磷酰胺和顺铂/顺氯氨铂)、VeIP(长春碱、异环磷酰胺和顺铂/顺氯氨铂)、VIP(依托泊苷/VP-16、异环磷酰胺和顺铂/顺氯氨铂)、VAC(长春新碱、更生霉素和环磷酰胺)和PEB(顺铂/顺氯氨铂、依托泊苷和博来霉素)；激素疗法，包括促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂(例如戈舍瑞林/>和亮丙瑞林/>)、他莫昔芬、芳香酶抑制剂(例如来曲唑/>)、阿那曲唑())和依西美坦(/>))，以及靶向疗法，例如血管生成抑制剂，包括贝伐珠单抗(Avastin)以及(聚(ADP)-核糖聚合酶)(PARP)抑制剂，例如奥拉帕尼(Lynparza)、卢卡帕尼(Rubraca)和尼拉帕尼(Zejula)。术语“药理学物质”和“抗癌疗法”还可能包括免疫疗法中使用的物质，例如检查点抑制剂。治疗可包括多种药理学物质或多种治疗方法，这些方法包括但不限于手术和化学疗法。
如本文所用，“量”或“水平”是指本文描述的生物标志物的通常可定量的测量，其中该测量能够实现样品之间的标志物的比较和/或与对照样品的比较。在一些实施例中，量或水平是可定量的并且指生物样品(例如，血液、血清、尿等)中特定标志物的水平，如通过实验室方法或测试例如免疫测定(例如，抗体)、质谱或液相色谱而确定的。在一些实施例中，标志物可以增加的量或减少的量存在于样品中。标志物比较可基于本文所述生物标志物水平的直接测量(例如，通过蛋白质定量或基因表达分析)或可基于例如报告分子、生物标志物-受体复合物、生物标志物-中继-受体复合物的测量等。
如本文所用，术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定。该测定通常包括使荧光标记的蛋白质样品与对这些蛋白质具有特异性亲和力的抗体接触。对这些蛋白质的检测可以用多种方法完成，包括但不限于激光荧光测定法。
如本文所用，术语“回归”指的是一种统计学方法，其可以基于样品的可观察性状(或可观察性状集)为所述样品的潜在特征分配预测值。在一些实施例中，该特性不是直接可观察到的。例如，本文使用的回归方法可以将特定受试者的特定生物标志物测试或生物标志物测试集的定性或定量结果与所述受试者为卵巢癌阳性的概率联系起来。
如本文所用，术语“逻辑回归”指的是回归方法，其中对来自该模型的预测的分配可以具有几个允许的离散值中的一个。例如，本文使用的逻辑回归模型可以为某个受试者分配卵巢癌阳性或卵巢癌阴性的预测。
如本文所用，术语“生物标志物评分”是指通过将特定受试者的特定生物标志物水平输入到统计学方法而计算的所述受试者的数值评分。
如本文所用，术语“综合评分”是指在来自受试者的样品中测量的预定标志物的标准化值的总和。在一个实施例中，标准化值被报道为生物标志物评分，然后对这些生物标志物评分值求和，以提供所每个测试受试者的综合评分。当在风险类别表的背景下使用并与基于风险类别表中的综合评分范围的分层分组相关联时，“综合评分”用于确定每个测试受试者的“风险评分”，其中指示分层分组患有癌症的可能性增加的乘数变成“风险评分”。
如本文所用，术语“风险评分”是指与疾病队列中已知的卵巢癌患病率相比，指示无症状人受试者卵巢癌风险的单个数值。在某些实施例中，针对人受试者计算综合评分并将其与指示卵巢癌风险的乘数相关联，其中基于风险类别表中每个分层分组的综合评分范围来关联综合评分。以这种方式，基于指示分组患有癌症的可能性增加的乘数，将综合评分转换成与综合评分最佳匹配的风险评分。
如本文所用，术语“截止值”或“截止点”是指与特定统计学方法相关的数学值，该方法可用于基于所述受试者的生物标志物评分将卵巢癌阳性或卵巢癌阴性的分类分配给受试者。
如本文所用，当高于或低于截止值的数值“是卵巢癌所特有的”时，意味着对样品的分析产生该值的受试者患有前列腺癌或处于卵巢癌的风险中。
如本文所用，标志物用于诊断卵巢癌的“用途”是指对本文所述的一种或多种标志物在生物样品中的水平或量进行定量。可以使用本领域或本文所述的任何已知方法或技术进行定量。在一些实施例中，标志物可以被使用或组合在一起作为用于与其他样品进行统计比较的组。
在一些实施例中，将DAS、N3AP和CA125的量或水平，或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的量或水平与包括约0.52至约0.95，例如约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.60、约0.61、约0.62、约0.63、约0.64、约0.65、约0.66、约0.67、约0.68、约0.69、约0.70、约0.71、约0.72、约0.73、约0.74、约0.75、约0.76、约0.77、约0.78、约0.79、约0.80、约0.81、约0.82、约0.83、约0.84、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等的AUC(95％CI)的截止值进行比较。在一些实施例中，一起使用标志物DAS、N3AP和CA125作为一组，或一起使用标志物DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd作为一组可以具有0.90或更大的AUC(95％CI)，包括约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等。
在一些实施例中，使用固定系数将标志物DAS、N3AP和CA125作为组一起分析以诊断卵巢癌，或者使用固定系数将标志物DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd作为组一起分析以诊断卵巢癌对于区分卵巢癌病例和健康对照可产生约0.95至约0.99的AUC(95％CI)，例如约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等。在一些实施例中，使用固定系数分析这些标志物组对于区分卵巢癌病例与健康对照可产生0.97的AUC(95％CI)。在一些实施例中，使用固定系数分析本文所述的任何标志物组以诊断卵巢癌对于区分早期卵巢癌可产生约0.91至约0.98的AUC(95％CI)，例如约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等。在一些实施例中，使用固定系数分析这些标志物组对于区分早期卵巢癌可产生0.95的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，N3AP的截止值包括至少0.62，例如，约0.62、约0.63、约0.64、约0.65、约0.66、约0.67、约0.68、约0.69、约0.70、约0.71、约0.72、约0.73、约0.74、约0.75、约0.76、约0.77、约0.78、约0.79、约0.80、约0.81、约0.82、约0.83、约0.84、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，AcSpmd的截止值包括至少0.75，例如，约0.75、约0.76、约0.77、约0.78、约0.79、约0.80、约0.81、约0.82、约0.83、约0.84、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，DiAcSpmd的截止值包括至少0.73，例如，约0.73、约0.74、约0.75、约0.76、约0.77、约0.78、约0.79、约0.80、约0.81、约0.82、约0.83、约0.84、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等的AUC(95％CI)。
在一些实施例中，DAS的截止值包括至少0.92的的AUC(95％CI)，例如约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99或等等。
如本文所用，有“卵巢癌风险”的受试者是可能尚未证明卵巢癌的明显症状，但是正在产生指示受试者患有前列腺癌或可能在近期发展为卵巢癌的生物标志物水平的受试者。可以对患有卵巢癌或怀疑患有卵巢癌的受试者进行针对该癌症或被怀疑的癌症的治疗。
如本文所用，术语“分类”是指基于针对受试者获得的生物标志物评分的结果，将所述受试者分配为处于卵巢癌的风险中或不处于卵巢癌的风险中。
如本文所用，术语“Wilcoxon秩和检验”，也称为Mann-Whitney U检验、Mann-Whitney-Wilcoxon检验或Wilcoxon-Mann-Whitney检验，是指用于比较两个群体的特定统计学方法。例如，该检验可在本文中用于将可观察到的性状(特别是生物标志物水平)与特定群体的受试者中卵巢癌的不存在或风险联系起来。
如本文所用，术语“真阳性率”是指通过某种方法分类为阳性的给定受试者是真正阳性的概率。
如本文所用，术语“假阳性率”是指通过某种方法分类为阳性的给定受试者是真正阴性的概率。
如本文所用，术语“灵敏度”在各种生化测定法的背景下是指测定法正确鉴定有疾病者的能力(即，真阳性率)。通过比较，如本文所用，术语“特异性”在各种生化测定法的背景下指的是测定法正确鉴定无疾病者的能力(即，真阴性率)。灵敏度和特异性是二元分类检验(即分类函数)性能的统计学度量。灵敏度量化了对假阴性的规避，而特异性对假阳性也有同样的作用。
如本文所用，“固定系数”或“固定模型系数”是指标准化系数以便允许比较回归模型中每个系数的相对重要性的统计方法。在一些实施例中，固定系数涉及使用来自逻辑回归模型的相同β系数来为开发的组合规则产生综合得分，其最终用于基于一个或多个决策阈值做出临床决策。
如本文所用，“样品”是指待测试其中如本文所述的生物标志物的存在及其水平或浓度的测试物质。样品可以是根据本披露的任何合适的物质，包括但不限于血液、血清、血浆或其任何部分。
如本文所用，“代谢物”是指作为细胞代谢的中间体和/或产物的小分子。代谢物可以在细胞中执行多种功能，例如，对酶进行的结构性作用、信号传导作用、刺激作用和/或抑制作用。在一些实施例中，代谢物可以是非蛋白质、血浆来源的代谢物标志物，例如包括但不限于AcSpmd、DiAcSpmd、DAS和N3AP。在一些实施例中，如本文所述有用的代谢物可以是“多胺”，即具有多于两个氨基基团的有机化合物。在一些实施例中，本文所述的多胺是血浆多胺。在一些实施例中，可用于本组和方法的聚胺包括但不限于DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd。这些多胺可以与其他标志物(例如CA125)组合，以增强本文所述的卵巢癌检测。
如本文所用，术语“3标志物组”或“3MP”是指一组3个生物标志物，包括DAS、N3AP和CA125，可用于检测疑似患有卵巢癌的患者的卵巢癌。在一些实施例中，3标志物组可以与另外的标志物例如血浆多胺组合进行评估，以增强对来自疑似患有卵巢癌的患者的生物样品中的卵巢癌的检测。有用的血浆多胺包括但不限于N3AP、AcSpmd、DiAcSpmd和/或DAS。另外的多胺是本领域已知的并且在临床医生认为合适的情况下可以被包括。
如本文所用，术语“ROC”指的是接受者操作特征，其为本文所用的用于测量特定诊断方法在各个截止点的性能的图解绘图。ROC图可以由不同截止点处真阳性和假阳性的分数构建。
如本文所用，术语“AUC”指的是ROC图曲线下的面积。AUC可用于估计某种诊断测试的预测能力。通常，较大的AUC对应于增加的预测能力，预测误差频率越低。AUC的可能值范围是从0.5到1.0，后一个值是无误差预测方法所特有的。
如本文所述，标志物DAS、N3AP和CA125的水平可用作诊断卵巢癌的诊断组。在其他实施例中，标志物DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平可用作诊断卵巢癌的诊断组。在一些实施例中，这些组中的一个或两个可以使用固定系数来评估。在一些实施例中，分析DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平以诊断卵巢癌可产生大于约0.82，例如约0.82、约0.83、约0.84、约0.85、约0.86、约0.87、约0.88、约0.89、约0.90、约0.91、约0.92、约0.93、约0.94、约0.95、约0.96、约0.97、约0.98、约0.99等的AUC点估计。在一些实施例中，分析DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平以诊断卵巢癌可产生约0.84的AUC点估计。
在一些实施例中，分析DAS、N3AP和CA125的水平或DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平以诊断卵巢癌对于区分卵巢癌与健康对照可具有约0.97的AUC点估计。在一些实施例中，对于区分早期卵巢癌(例如，I期)可以获得约0.95的AUC点估计。
如本文所用，术语“p值”或“p”是指在Wilcoxon秩和检验的背景下卵巢癌阳性和卵巢癌阴性受试者的生物标志物评分分布相同的概率。通常，接近零的p值指示特定的统计学方法在对受试者进行分类时具有较高的预测能力。
如本文所用，术语“CI”指的是置信区间，即，可以取决于某个置信水平预测某个值的区间。如本文所用，术语“95％CI”指的是可以取决于95％置信水平预测某个值的区间。
如本文所用，术语“疾病进展”或“早期疾病进展”定义为在主动监测开始后18个月内在监测活检时Gleason评分升级和/或肿瘤体积增加。
缩写列表
AcSpmd＝乙酰亚精胺；AS＝主动监测；AUC＝曲线下面积；DAS＝N1,N12-二乙酰精胺；DiAcSpmd＝N1,N8-二乙酰亚精胺；FBS＝胎牛血清；HILIC＝亲水相互作用液相色谱；HPLC＝高效液相色谱；N3AP＝N-(3-乙酰胺基丙基)吡咯烷-2-酮；ODC1＝鸟氨酸脱羧酶；PAOX＝多胺氧化酶；ROC＝接受者操作特征；SEM＝平均值的标准误差：SFM＝无血清培养基；SMS＝精胺合酶；SRM＝亚精胺合酶；TCGA＝癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)；UPLC＝超高效液相色谱；UPLC/MS＝超高效液相色谱/质谱。
实例
包括以下实例来说明本披露的实施例。以下实例仅通过说明的方式呈现，并帮助普通技术人员使用本披露。这些实例不旨在以任何方式限制本披露的范围。本领域技术人员根据本披露内容应理解，可以对披露的特定实施例做出许多改变并且仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。
程序1：代谢物。
N-(3-乙酰胺基丙基)吡咯烷-2-酮(“N3AP”)
程序2：人队列
血浆样品取自MD安德森妇科癌症库(MD Anderson Gynecologic Cancer Bank)和正常风险卵巢癌筛查研究(Normal Risk Ovarian Cancer Screening Study，NROSS)。这些研究获得了MD安德森和合作机构的适当机构审查委员会/伦理委员会的伦理批准。所有参与者都同意在伦理批准的二级研究中使用样品。健康对照者的血浆来自未患卵巢癌的NROSS研究。在过去的二十年中，NROSS试验涉及超过50岁的6379名绝经后妇女，她们处于患卵巢癌的一般风险中并且接受年度CA125测量进行追踪，并且如果CA125值从每个个体的基线增加(由卵巢癌风险算法(ROCA)判断)，她们被推荐进行经阴道超声和妇科评估。对所有健康对照进行了至少7年的随访，以确保无癌状态。
测试集#1(表1)由41名早期(I-II)病例、75名晚期(III-IV)病例、71名健康对照者和72名良性盆腔肿块患者组成。
表1.测试集#1的患者特征。对照#1代表健康受试者；对照#2代表具有良性骨盆肿块的个体。
验证集#2(表2)由61个早期病例和71个健康对照组成。
表2.验证集#2的患者特征。
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程序3：代谢组学分析
在96孔微孔板(Eppendorf)中，用30μL LCMS级甲醇(赛默飞世尔公司)从预等分的EDTA血浆(10μL)中萃取血浆代谢物。将板热封，以750rpm涡旋5min，并在室温下以2000×g离心10分钟。将上清液(10μL)小心地转移到96孔板上，留下沉淀的蛋白质。用10μL 100mM甲酸铵(pH 3)进一步稀释上清液。对于HILIC分析，将样品用60μL LCMS级乙腈(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))稀释，而对于C18分析，将样品用60μL水(GenPure超纯水系统，赛默飞世尔公司)稀释。将各样品溶液转移到384孔微孔板(Eppendorf)进行LCMS分析。
将冷冻培养基样品在冰上解冻，然后将30μl转移到含有30μL 100mM甲酸铵(pH3.0)的96孔微孔板(Eppendorf)中。将微孔板热封，以750rpm涡旋5min，并在室温下以2000xg离心10分钟。对于HILIC分析，将25μL样品转移到含有75μL乙腈的新96孔微孔板，而对于C18分析，将样品转移到含有75μL水的新96孔微孔板(GenPure超纯水系统，赛默飞世尔公司)。将各样品溶液转移到384孔微孔板(Eppendorf)进行LCMS分析。
对于每个批次，样品都是随机的，并且包括基质匹配的参考质量对照和特定于批次的合并质量对照。
在与Xevo G2-XS四极杆飞行时间(qTOF)质谱仪耦合的Waters AcquityTMUPLC系统上进行血浆多胺的半定量测量，该系统具有2D柱再生(I类和H类)。使用HILIC(AcquityTMUPLC BEH酰胺，1.7μm 2.1×100mm)和C18(AcquityTM UPLC HSS T3，/>1.8μm，2.1×100mm)柱在45℃下进行色谱分离。以灵敏、正和负电喷雾电离模式获取质谱数据。通过仪器自动增益控制进行采集，以优化样品采集过程中的灵敏度；数据处理如前所述进行(Fahrmann 2018，Fahrmann 2019)。
程序4：CA125水平的测量
用于确定CA125抗原浓度的自动免疫测定试剂盒购自美国罗氏诊断公司(RocheDiagnostics USA)(印第安纳州印第安纳波利斯)。
程序5：细胞培养和转染
SKOv3浆液性癌细胞系维持在补充有10％FBS的RPMI培养基中。在使用PromegaPowerPlex 1.2试剂盒制备mRNA和总蛋白裂解物时，通过短串联重复进行DNA指纹识别来确认该品系的身份。指纹识别结果根据原代来源维持的参考指纹进行了验证。
使用以下siRNA(赛默飞世尔公司)进行小干扰RNA(siRNA)转染实验：si对照(沉默子选择阴性对照#1)，siMYC#1和#3(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)Hs01_00222676和Hs01_00222678)。根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX以终浓度为20nM的siRNA转染细胞。转染后48小时收集细胞裂解物和条件培养基，分别用于RT-qPCR和代谢组学分析。
程序6：RT-qPCR分析
根据制造商的方案，使用RNeasy提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取RNA。通过将10μL RNA(100ng)与0.8μL 100mM dNTP、1μL 10X多转录逆转录酶、1μL 10X反应缓冲液、2μL随机引物、1μL RNA酶抑制剂和3.2μL超纯酶混合制备互补DNA样品水(所有试剂均来自应用生物科学公司(Applied Biosciences))。使用Eppendorf温度循环仪进行PCR cDNA制备。循环条件为25℃/10分钟、37℃/120分钟、85℃/5分钟，然后返回到4℃。使用通用TaqMan PCR预混液(赛默飞世尔公司)和针对MYC(Hs00153408_m1)、ODC1(Hs00159739_m1)、SRM(Hs01027696_g1)和SMS(Hs019224834_u1)的经FAMTM标记的探针和针对GUSB(Hs_00939627_m1)的经VICTM标记的探针进行TaqMan PCR。使用BioRad CFX Connect RT系统进行PCR反应。循环条件为50℃/2分钟、95℃/10分钟，然后在95℃/15秒至60℃/1分钟下进行40个循环。每个样品一式两份运行。计算每个基因的Ct值并归一化为GUSB的CT值(ΔCT)。然后通过归一化为对照的ΔCT值来计算ΔΔCT值。
程序7：基因表达数据
从Oncomine数据库[12](https://www.oncomine.org/resource/login.html)下载来自癌症基因组图谱(TCGA)卵巢癌数据集的多胺代谢酶(PME)鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)、腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)、鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)、亚精胺合酶(SRM)、精胺合酶(SMS)、精胺氧化酶(SMOX)、多胺氧化酶(PAOX)和亚精胺/精胺N1乙酰转移酶1(SAT1)在586例恶性肿瘤和8例正常卵巢组织中的基因表达。使用Affymet rix人基因组U133A阵列获得基因表达；将值进行log2中位数居中。
程序8：统计学分析
对于用2个以上的组进行比较，使用Kruskal Wallis检验进行单变量分析；使用Dunn多重比较检验确定组别差异，并报告调整后的p值。对于两类比较，使用Wilcoxon秩和检验确定统计显著性。在p值<0.05时确定统计显著性。使用R生成接受者操作特征曲线。每个生物标志物的个体性能呈现的95％置信区间是基于引导程序，其中对对照和患病的1000个引导样品分别进行替换的重新取样。为了确定CA125和其他4种多胺之间标志物的最佳组合，实施了套索回归。将使用AUC作为分类性能度量的训练数据集的十倍交叉验证并入以找到最佳调整参数(λ)。该参数产生了CA125、DAS和N3AP作为生物标志物的最佳组合；随后使用逻辑回归模型得出使用CA125、DAS和N3AP的生物标志物组。模型构建基于逻辑回归模型。所提出的代谢物组的估计AUC是通过使用与上述模型相对应的线性组合的经验ROC估计量得出的。McNemar精确检验用于比较两个不同模型在给定特异性下的性能。除非另有说明，否则所有统计测试都是双侧的。
混淆矩阵用于描述3标志物组或单独CA125在99％特异性截止值的分类模型。矩阵的行显示预测的类(病例或对照)，而列代表实际类(病例或对照)。为了测试3标志物组是否比CA125产生统计上显著的分类器改进，将McNemar精确检验应用于2x2列联表，其中第一个单元格代表两个标志物正确预测的患者数量(a)，第二个代表被CA125正确鉴定并被3标志物组错误分类的患者数量(b)，第三个表示被CA125错误分类但被3标志物组正确鉴定的患者数量(c)并且最后一个单元格表示被两种标志物错误分类的患者数量(d)。因此，无效假设和备择假设如下：
H0∶Pb＝Pc
Ha∶Pb<Pc
其中，Pi表示在单元格i中出现的概率。使用精确二项式检验来获得p值。
实例1.卵巢癌中MYC与多胺代谢之间的关联。
为了提供MYC在卵巢癌背景下调节多胺代谢的证据，使用TCGA-卵巢癌转录组数据集评估了卵巢浆液性癌和正常卵巢组织中多胺代谢酶(PME)的基因表达。在PME中，与正常卵巢组织相比，卵巢浆液性癌中鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)(其是多胺代谢限速酶)和精胺合酶(SMS)的基因表达水平在统计学上显著升高(单侧Wilcoxon秩和检验p：分别为0.04，<0.0001)；而催化乙酰化多胺氧化的多胺氧化酶(PAOX)在统计学上显著降低(单侧Wilcoxon秩和检验p：0.01)(图1)。这些发现表明卵巢癌中多胺代谢升高。
接下来，在浆液性癌细胞系SKOv3中执行siRNA介导的MYC敲低，并评估ODC1、SRM和SMS的基因表达。与之前的发现(Fahrmann 2019)一致，siRNA介导的MYC敲低导致ODC1、SRM和SMS的mRNA水平在统计学上显著降低(单侧学生t检验分别为p<0.001、<0.001、<0.001)(图2(a))。此外，在siRNA介导的MYC敲低后，SKOv3卵巢癌细胞的条件培养基中二乙酰精胺(DAS)的水平在统计学上显著降低(双侧学生t检验p：0.04)(图2(b))。这些发现证实了MYC调节卵巢癌中多胺代谢的假设。
实例2.卵巢癌患者血浆中的多胺水平和模型开发。
为确定多胺特征是否与卵巢癌相关，使用UPLC/MS筛选来自测试组#1(表1)的血浆中的多胺水平。对几种多胺进行了定量(表3)。
表3.测量的多胺
电喷雾电离正采集模式；HA：HLIC酸性；CA：C18酸性
用于区分卵巢癌与所有对照的单个多胺的AUC范围为0.61-0.83(表4(a)(i))。在测量的多胺中，DAS在以下方面表现出最高的分类性能：区分卵巢癌病例和良性盆腔肿块患者(AUC：0.78，表4(a)(ii)；图3(b))或健康对照(AUC：0.88，表4(a)(iii)；图3(c))。
表4.针对测试集#1血浆多胺在区分卵巢癌病例和对照方面的分类性能。
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用于区分所有浆液性病例与所有对照或具有良性盆腔肿块的受试者或健康对照的DAS的AUC分别为0.85、0.80和0.90(表5(a)(i)(ii)(iii))。仅考虑早期浆液性病例时，与所有对照、良性盆腔肿块受试者或健康对照相比，DAS产生的AUC分别为0.76、0.70和0.81(表5(b)(i)(ii)(iii))。
表5.针对测试集#1血浆多胺在区分浆液性病例与对照方面的分类性能。
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用于区分非浆液性卵巢癌病例与所有对照或具有良性盆腔肿块的受试者或健康对照的DAS的AUC分别为0.77、0.71和0.83(表6(i)(ii)(iii)；图4)。
表6.针对测试集#1血浆多胺在区分非浆液性病例与对照方面的分类性能。
/>
实例3.3标志物组的评估。
使用逻辑回归模型，与单独CA125相比，评估了多胺加CA125的组合在区分早期卵巢癌病例与对照(健康受试者+具有良性盆腔肿块的受试者)方面的相对性能。采用变量选择方法的逻辑回归(以AUC作为交叉验证的损失函数的Lasso L1罚分)将血浆DAS+N3AP+CA125的组合确定为最佳组，其中AUC点估计为0.84(95％C.I.：0.77-0.92)，相比之下，CA125的AUC点估计为0.81(95％C.I.：0.73-0.89)(图5(a))。
因此，接下来评估与单独CA125相比，3标志物组(DAS+N3AP+CA125)在99％、98.5％和97％的相应特异性下的灵敏度(表7)。与单独CA125相比，3标志物组在99％和98.5％的特异性下产生了统计学上显著提高的灵敏度。
表7.针对测试集#1时3标志物组和单独CA125在各种特异性截止值下的灵敏度。
描述对应于3标志物组和单独CA125的分类模型在99％特异性下的性能的混淆矩阵说明3标志物物组正确鉴定了41个早期卵巢癌病例中的19个(46.3％灵敏度)，而单独CA125正确鉴定了41个早期卵巢癌病例中的10个(24.3％灵敏度)(单侧McNemar精确检验p：0.006)(表8；图5(b))。
表8.混淆矩阵：测试集1
实例4.在早期卵巢癌患者的独立队列中进行模型验证
在验证集#2上对单个多胺代谢物和由DAS+N3AP+CA125组成的固定3标志物组进行进一步验证(表2.)。单个多胺代谢物的AUC范围为0.57-0.84，血浆DAS的AUC点最高(表9(a)；图6(a))。血浆DAS在区分浆液性(n＝28)和非浆液性病例(n＝33)与健康对照方面的分类性能分别为0.84和0.84(表9(b)(c)；图7)。
表9.针对验证集#2血浆多胺在区分浆液性或非浆液性病例与对照方面的分类性能
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使用来自测试集#1的固定协变系数在相应特异性>99％、98.5％和97％时对于验证集#2而言3标志物组的灵敏度分别为73.7、78.6和83.6(表10)。与单独CA125相比，3标志物组在>99％的特异性下产生了统计学上显著提高的灵敏度。
表10.针对验证集#2时3标志物组和单独CA125在各种特异性截止值下的灵敏度。
描述对应于3标志物组和单独CA125的分类模型在>99％特异性下的性能的混淆矩阵说明3标志物物组正确鉴定了61个早期卵巢癌病例中的45个，而单独CA125正确鉴定了61个早期卵巢癌病例中的38个，这相当于捕获了被单独CA125遗漏的病例的30.4％(表11；图6(b))。
表11.混淆矩阵：验证集#2
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35U/mL的CA125截止值被认为是“正常”的上限。在验证集#2中，35U/mL的截止值捕获了61个病例中的53个(86.9％灵敏度)和2个假阳性(97.2％特异性)。如果考虑CA125的“阴性”病例(定义为≤35U/mL)，固定的3标志物组鉴定8个早期病例中的另外2个(25.0％灵敏度)，没有任何额外的假阳性(图8)。值得注意的是，这2个由3标志物组鉴定的另外病例是I期高级别浆液性癌。
实例5：回归模型诊断得分范围内的特异性和灵敏度
在一个实例中，正在接受卵巢癌筛查的患者—基于本文披露的三生物标志物组—抽取血液样品(或其他流体或组织活检)并通过ELISA(或其他测定)进行测定以定量患者中DAS、N3AP和CA125的水平。考虑到所使用的特定测定的至少这些生物标志物的归一化值可以是，例如，DAS＝5.57ng/mL；N3AP＝1.35；和CA125＝86.7。对于DAS和N3AP，半定量值以相对于给定分析物的每个分析批次运行的历史质量对照参考样品中值的比率报告。对于CA125，原始值经过log10转换。使用以下回归模型进行分析时：
logit(p)＝-7.0619+1.8065×logCA125+2.3582×DAS+0.5139×N3AP
上述患者的综合得分为10.27。鉴于考虑特异性和灵敏度的首选截止值(表12)，具有此类综合得分的患者几乎可以肯定患有卵巢癌，因此将被指导使用本文讨论的和本领域技术人员已知的其他方式对卵巢癌进行后续测试和治疗。使用本文所述的回归模型，组合的卵巢癌预测得分越正，患者患卵巢癌的可能性越大。相反，组合的卵巢癌预测评分越负，患者没有卵巢癌的可能性就越大。
本领域普通技术人员将理解，生物标志物检测、定量和分析的不同方法或测定法可包括使用不同的试剂并且将产生可能需要修改回归模型的不同结果。特别地，不同的测定可以产生以例如不同单位表示的结果。此外，相同样品的重复测定中的重复反应也可能产生不同的原始结果。然而，正是对至少三个生物标志物DAS、N3AP和CA125的组合检测、定量和分析，当并入本文披露的回归模型时，产生卵巢癌的明确诊断。
用于检测、定量和分析四个生物标志物的每个特定测定报告的结果的范围将具有产生的卵巢癌预测得分的范围，这部分取决于灵敏度或特异性的程度。用于生成卵巢癌预测得分的回归模型可取决于用于测试标志物的特定测定。如本领域技术人员所理解的，不同的测定可以针对四个生物标志物的不同表位或具有不同的亲和力和灵敏度。因此，可以修改用于生成卵巢癌预测得分的回归模型算法，以将这些测定变化考虑在内。
测量的浓度用于基于逻辑回归模型计算生物标志物得分。表12说明了在测试集#2(验证集)中用于区分早期OvCa病例与健康对照的基于生物标志物组(N3AP、DAS和CA125)的得分的不同截止值点处的灵敏度、特异性和相应的约登指数。
表12.组合验证集中基于生物标志物组的得分的不同截止值处的灵敏度和特异性。
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讨论
与使用两个独立病例对照队列的对照相比，卵巢癌病例的血浆中的多胺水平在统计学上显著升高。在测量的多胺中，对于区分病例与呈现良性盆腔肿块的受试者或健康对照，DAS表现出最高的AUC。重要的是，与仅使用CA125相比，由DAS+N3AP+CA125组成的3标志物组产生了改进的分类性能，从而捕获了验证集#2中被单独CA125遗漏的早期病例。
先前的研究已经检查了尿液中的多胺水平，在一项研究中发现患有卵巢癌的受试者的尿多胺升高。与这一发现类似，DAS在从良性疾病个体中区分卵巢癌病例方面表现出最佳分类性能，并被发现与疾病进展有关(Niemi 2017)。
多胺生物合成受ODC1(其是多胺途径中的第一种酶，介导鸟氨酸脱羧生成腐胺)和腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AMD1)(其脱羧S-腺苷甲硫氨酸以提供氨丙基供体，用于转化为亚精胺和精胺)的调节。亚精胺和精胺的产生是通过经由SRM和SMS的两个连续的氨丙基转移反应介导的。细胞内多胺水平受酶亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(SAT1)(其促进介导细胞外排的亚精胺/精胺乙酰化)和氧化酶多胺氧化酶(PAOX)和精胺氧化酶(SMOX)调节。来自TCGA卵巢癌数据集的转录组数据分析表明，与正常卵巢组织相比，卵巢浆液性癌中ODC1和SMS在统计学上显著升高，而PAOX在统计学上显著降低，表明卵巢癌中多胺代谢升高。升高的多胺代谢表现为乙酰化多胺(包括DAS)的生物发生增加，以及它们随后在乳腺癌细胞系条件培养基中的积累。
ODC1、SRM和SMS受MYC在转录上调控。与siRNA介导的MYC敲低导致浆液性卵巢癌细胞系SKOv3中ODC1、SRM和SMS的mRNA水平统计学上显著降低的观察结果一致，从而将本发明的血浆多胺信号与致癌的MYC联系起来。
总之，已确定反映卵巢癌早期发病机制的MYC驱动的多胺特征。鉴于对开发癌症检测策略的浓厚兴趣以及CA125的有限性能，对补充CA125的早期卵巢癌多胺特征的验证为异常多胺代谢用于癌症检测提供了支持性证据。这些发现为在包含其他生物标志物候选物的验证研究中包含3标志物组提供了基础。
实例6：多胺的预测性能加上使用固定系数的3标志物组
目前，超过70％的卵巢癌(OvCa)患者出现晚期(III-IV)疾病，5年生存率低于30％。然而，当疾病局限于卵巢(I期)或骨盆(II期)时，通过常规手术和化学疗法可以实现高达70-90％的生存率。迄今为止，单独使用CA125或经阴道超声(TVS)都不具备足够的灵敏度或特异性来在早期检测中通用。需要一个或多个额外的标志物来检测早期卵巢癌，以补充CA125的性能缺点。
多胺以及3标志物多胺组的预测性能在独立数据集中使用固定系数进行了测试，该数据集由219例新诊断的卵巢癌病例(59例I+II期和160例III+IV期)、190名具有良性盆腔肿块(BPM)的个体，以及409名健康对照者组成(表13)。
表13.独立测试集的患者和肿瘤特征。
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用于区分OvCa病例和健康对照的血浆多胺的单个性能范围为0.62-0.92；DAS产生了最高的预测性能，AUC为0.92(95％CI：0.90-0.95)(表14)。
表14.单个多胺的预测性能。
*BPM：良性盆腔肿块；(95％置信区间)；缩写：N3AP-N-(3-乙酰胺基丙基)吡咯烷-2-酮；AcSpmd-乙酰亚精胺；DiAcSpmd-二乙酰亚精胺；DAS-二乙酰精胺
使用固定系数的3MP的结果AUC对于区分OvCa病例和健康对照时为0.97(95％CI：0.95-0.99)，在考虑早期OvCa病例时，AUC为0.95(95％I：0.91-0.98)(图9)。重要的是，在预先指定的95％特异性截止值下，3标志物组捕获了另外11.8％的OvCa病例，否则使用单独CA125会错过这些病例。因此，本研究验证了多胺在卵巢癌早期检测中的效用。
其他实施例
提供以上列出的详细说明以帮助本领域技术人员实践本披露。然而，本文描述和要求保护的披露不限于本文披露的特定实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本披露几个方面的说明。任何等效实施例都旨在处于本披露的范围内。事实上，除了本文示出并且描述的那些，本披露的各种修改从前述说明书对于本领域技术人员来说也将变得清楚，这不偏离本发明的精神或范围。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (44)

1.一种如下的方法：
-确定受试者患卵巢癌的风险，
-在受试者中预测对卵巢癌的易感性，
-诊断受试者中的卵巢癌，
-将受试者分类为患有卵巢癌/处于患卵巢癌的风险中或
-预测受试者中卵巢癌进展的可能性，
-为患有卵巢癌的受试者提供预后，或
-选择患有卵巢癌的受试者用抗癌疗法治疗
该方法包括在获自该受试者的生物样品中，
c)测量二乙酰精胺(DAS)、N-(3-乙酰胺基丙基)吡咯烷-2-酮(N3AP)和癌症抗原125(CA125)的水平；以及
d)将所述样品中的DAS、N3AP和CA125水平与对应于健康受试者的参考值进行比较，
其中DAS、N3AP和CA125相对于所述参考的改变量提供选自由以下组成的组的指示：
-该受试者患有卵巢癌或处于患卵巢癌的风险中或没有卵巢癌或不处于患卵巢癌的风险中的指示，
-该受试者处于发展为卵巢癌的风险中或不处于发展为卵巢癌的风险中的指示，
-该受试者对卵巢癌的易感性的指示，
-在该受试者中该卵巢癌的进展可能性的指示，
-该受试者的无进展生存期的指示，
-对该卵巢癌的治疗的可能结果的指示，以及
-该受试者是用抗癌疗法治疗的候选者的指示。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量N3AP、AcSpmd和/或DiAcSpmd的水平。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于该参考值升高。
4.如权利要求3所述的方法，其中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于从没有卵巢癌的受试者获得的生物样品中的相应水平升高。
5.如权利要求4所述的方法，其中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于从具有一个或多个良性盆腔肿块的受试者获得的生物样品中的相应水平升高。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该生物样品源自该受试者的血液。
7.如权利要求6所述的方法，其中该生物样品是血清。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该卵巢癌选自浆液性和非浆液性卵巢癌。
9.如权利要求8所述的方法，其中该卵巢癌是浆液性卵巢癌。
10.如权利要求8所述的方法，其中该卵巢癌是非浆液性卵巢癌。
11.如权利要求10所述的方法，其中该非浆液性卵巢癌选自子宫内膜样癌、粘液癌和透明细胞癌。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该卵巢癌是早期(例如，I期)卵巢癌。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该卵巢癌是晚期(例如，II期)卵巢癌。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该卵巢癌起源于上皮。
15.如权利要求1-1314中任一项所述的方法，其中该受试者具有c-myc的扩增。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中CA125的浓度通过免疫测定来确定。
17.如权利要求16所述的方法，其中该免疫测定使用抗CA125抗体或其结合片段。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd中至少一个的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd中至少一个的浓度通过包括液相色谱在内的方法来确定。
20.如权利要求18和19中任一项所述的方法，其中DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
21.如权利要求18所述的方法，其中DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括质谱在内的方法来确定。
22.如权利要求18所述的方法，其中DAS、N3AP、AcSpmd和DiAcSpmd的浓度通过包括液相色谱和质谱在内的方法来确定。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中与评估单独DAS的方法相比，该方法在给定的特异性下提供了改进的灵敏度。
24.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中与评估单独CA125的方法相比，该方法在给定的特异性下提供了改进的灵敏度。
25.如权利要求23或24中任一项所述的方法，其中该方法在约99％的特异性下提供改进的灵敏度。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中该方法比评估单独DAS或CA125的方法正确鉴定更多的早期卵巢癌。
27.一种用于卵巢癌的诊断组，该诊断组包含DAS、N3AP和CA125。
28.如权利要求27所述的诊断组，其具有大于0.82的AUC点估计。
29.如权利要求27所述的诊断组，其具有约0.84的AUC点估计。
30.如权利要求26所述的诊断组，其对于区分卵巢癌与健康对照而言具有约0.97的AUC点估计。
31.如权利要求26所述的诊断组，其对于区分早期卵巢癌而言具有约0.95的AUC点估计。
32.一种用于卵巢癌的诊断组，该诊断组包含DAS、N3AP、AcSpmd、DiAcSpmd和CA125。
33.如权利要求32所述的诊断组，其具有大于0.82的AUC点估计。
34.如权利要求32所述的诊断组，其具有约0.84的AUC点估计。
35.如权利要求32所述的诊断组，其对于区分卵巢癌与健康对照而言具有约0.97的AUC点估计。
36.如权利要求32所述的诊断组，其对于区分早期卵巢癌而言具有约0.95的AUC点估计。
37.如权利要求32所述的方法，其中使用固定系数评估DAS、N3AP、AcSpmd、DiAcSpmd和CA125。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括将DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的量与包含约0.52至约0.95的AUC(95％CI)的截止值进行比较。
39.如权利要求38所述的方法，其中N3AP的截止值包括至少0.62的AUC(95％CI)。
40.如权利要求38所述的方法，其中AcSpmd的截止值包括至少0.75的AUC(95％CI)。
41.如权利要求38所述的方法，其中DiAcSpmd的截止值包括至少0.73的AUC(95％CI)。
42.如权利要求38所述的方法，其中DAS的截止值包括至少0.92的AUC(95％CI)。
43.一种治疗或预防受试者中的卵巢癌进展的方法，在该受试者中DAS、N3AP和CA125的水平相对于对应于无卵巢癌受试者中的水平的参考值升高，该方法包括以下一项或多项：
-向该患有卵巢癌的受试者施用抗癌药物；
-向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及
-部分或完全手术去除该患有卵巢癌的受试者中的癌组织的手术。
44.一种治疗或预防受试者中的卵巢癌进展的方法，在该受试者中DAS、N3AP、CA125、AcSpmd和DiAcSpmd的水平相对于对应于无卵巢癌受试者中的水平的参考值升高，该方法包括以下一项或多项：
-向该患有卵巢癌的受试者施用抗癌药物；
-向该患有卵巢癌的受试者施用治疗性辐射；以及
-部分或完全手术去除该患有卵巢癌的受试者中的癌组织的手术。
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