CN116490612A - 大rna的脂质纳米颗粒包封 - Google Patents

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Abstract

一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，其包括使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；使包含脂质的乙醇溶液以相对于通过第一管的水溶液的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，所述脂质包含阳离子脂质；和将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；第一ID和第二ID以及通过第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以保持RNA完整性的剪切力；该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约乙醇中的RNA和脂质的湍流，该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。

Description

大RNA的脂质纳米颗粒包封
相关申请
根据35U.S.C.119(e)，本申请享有2020年9月13日提交的美国临时专利申请号63/077,648的优先权，该美国临时专利申请以其整体并入本文。
发明背景
脂质用作用于核糖核酸(RNA)递送的材料，因为它们能够形成脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包封RNA以在肠胃外施用后递送到靶细胞(Zimmermann,2006,Nature,doi:10.1038/nature04688)。
生产脂质包封的RNA纳米颗粒的不同方法是已知的。例如，WO 2001/005373公开了使用乙醇注射型工艺利用静态混合器制备脂质包封的RNA纳米颗粒的技术，该静态混合器提供在囊泡形成后与治疗分子组合的湍流环境。US 2004/0142025公开了使用非湍流混合和一系列依序逐步稀释形成脂质包封的RNA纳米颗粒的技术。US 6,843,942公开了一种形成颗粒的非湍流混合方法，该方法通过将有机溶液管道中的脂质通过孔口喷射到流过该孔口的水溶液中的核酸中来实现。US 9,005,654公开了使用湍流混合将siRNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中，由此脂质和RNA作为相反的流动以大约相等的速率从相对的臂进入T形混合室，以产生包含囊泡的45-60％乙醇溶液，该囊泡被收集并且被进一步稀释(直接稀释法)。US 9,404,127公开了通过直接稀释法生产的大多数LNP具有非层状形态，即非双层结构。
在尝试应用传统方法从大RNA形成脂质包封的RNA纳米颗粒时出现了挑战。例如，一个这样的问题是由LNP形成期间施加在RNA上的力导致RNA的结构完整性受损而引起的。因此，需要改进用于在大RNA序列的情形下配制脂质包封的RNA纳米颗粒的工艺和装置。此类方法在以期望的粒度和多分散性为目标的同时还应易于放大。本文的实施方案解决了这些问题中的一个或多个以及本领域技术人员认识到的其他挑战。
发明内容
在一些方面，本文的实施方案提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过内径(ID)为约0.01英寸至约0.08英寸的第一管；其中该水溶液的pH在约3.0至约4.5的范围内，任选的NaCl浓度高达约300mM；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过该第一管的水溶液流速的约0.2至约1倍的流速流过内径为约0.01英寸至约0.04英寸的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以及c)将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
在一些方面，本文的实施方案提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以及c)将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中第一ID和第二ID以及通过第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以保持RNA的完整性的剪切力；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％之间的乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
附图描述
图1示出了生产脂质纳米颗粒的工艺的一个实施方案的流程图。将脂质溶解在乙醇中，将RNA溶解在水性酸性缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)中，两者都经过过滤灭菌。通过本文所述的工艺混合该溶液以形成颗粒，分析该颗粒的PDI和粒度(PS)。通过切向流过滤(TFF)浓缩和纯化该颗粒以去除乙醇和未结合的RNA，并且再次监测PDI和PS。然后根据测得的总RNA浓度调整该颗粒的浓度。对该颗粒进行过滤杀菌、灌装、最后加工和冷冻。
图2示出了用于生产脂质包封的RNA纳米颗粒的装置。包含RNA的水溶液由HPLC泵通过管道运送，并且包含脂质的有机溶液由HPLC泵通过单独的管道运送。有机溶液可以在混合区中以90度角被泵送到水溶液中。出口管道将混合的脂质-RNA出口运送到聚丙烯管道，该聚丙烯管道以45度角与稀释区中的稀释缓冲液汇合。该以45度角与稀释区中的稀释缓冲液汇合的管道可以被串联稀释以包括1、2、3或4个管道稀释区，每个管道稀释区均以45度角用于稀释过程。稀释过程之后，可以将经稀释颗粒收集在维持在15-20℃的不锈钢夹套容器中。使用蠕动泵、隔膜泵或离心泵通过切向流过滤进一步处理该颗粒。
图3更详细地示出了混合模块。缓冲液中的核酸通过第一不锈钢管的输入臂运送。乙醇(或其他合适的有机溶剂/溶剂混合物)中的脂质通过垂直附接到第一管的第二不锈钢管运送。第一管的壁中的孔洞允许液体从第二管被运送到第一管的内部。由混合产生的脂质包封的RNA纳米颗粒通过第一管的输出臂排出。
图4示出了针对实施例13中描述的不同剂量水平的脂质纳米颗粒配制物的调整的平均荧光强度(MFI)，该平均荧光强度对应于响应于向小鼠施用脂质纳米颗粒而产生的抗-COVID19刺突蛋白抗体水平。
具体实施方式
应了解，本领域的技术人员将从本公开容易明白主题技术的其他构造，在本公开中通过图示示出且描述了主题技术的各种构造。如将认识到的，主题技术能够具有其他和不同的构造，并且主题技术的若干细节能够在各种其他方面进行修改，所有这些都不脱离主题技术的范围。因此，发明内容、附图和具体实施方式本质上应视为说明性的而不是限制性的。
本文的实施方案提供了用于将大RNA(例如，自复制RNA)包封在脂质纳米颗粒中的工艺。例如，大的mRNA的尺寸可能在6,000到大约15,000个核苷酸之间。如本文所公开，发现这些大核苷酸与典型的LNP形成工艺不相容。通常用于制作mRNA-LNP组合物的LNP工艺被用来尝试制作包封有自复制型RNA的LNP。以下程序对于含有约1,000至约5,000个核苷酸的RNA是典型的。大体积的配制物(Bulk formulation)是通过如下所概述将脂质的乙醇溶液与RNA药物物质或其他较小mRNA的水溶液混合来制造：
·将脂质赋形剂(阳离子脂质、磷脂、胆固醇(Chol)和PEG-脂质缀合物溶解在乙醇中，并通过0.2μm聚醚砜(PES)过滤器过滤。
·在柠檬酸盐pH 4.0缓冲液中制备mRNA水溶液，随后通过0.2μm PES过滤器过滤。
·然后经由不锈钢混合模块将mRNA溶液与脂质乙醇溶液混合。将如此形成的纳米颗粒通过用磷酸盐pH 6.0缓冲液随后用HEPES pH8.0缓冲液连续稀释来稳定化。
·然后使用改性的PES中空纤维膜(100kDa MWCO(截留分子量))和HEPES pH 8.0缓冲液通过切向流过滤(TFF)对纳米颗粒配制物进行超滤和渗滤(UF/DF)。UF/DF后，将配制物通过0.2μm PES过滤器过滤并且储存在2至8℃直至灌装。
·然后执行过程中mRNA浓度分析。将配制物的浓度调整到最终目标mRNA浓度(0.2mg/mL)，然后通过0.2μm PES除菌级过滤器过滤。
·无菌过滤后，将大体积的产品无菌地灌装到玻璃小瓶中，加塞、加盖，并且冷冻在-70±10℃下。
使用此工艺，所得到的具有较大RNA(超过约6,000个核苷酸)的LNP具有较差的尺寸、分散性和包封效率。此外，发现这些较大的RNA结构中有很大一部分在配制过程中被降解，这被假设是由于该方法中使用的某些过程压力和流速产生的剪切力。据推测，此类剪切力可以通过改变流速和管尺寸来调节。然而，单独的混合条件和操作压力并没有被认为是将必定提供必需的LNP包裹的RNA的唯一变量。通过降低剪切力和调整混合条件，有可能条件不足以形成LNP。因此，大RNA所带来的问题被认为是复杂的，因为其他参数被认为影响LNP包裹的大RNA的成功形成，包括但不限于缓冲液和盐浓度、RNA和脂质浓度、pH和系统中的总背压。
本文的实施方案提供了用于形成LNP包封的大RNA的工作解决方案。本文公开的方法的优点包括：(1)不同脂质组分所能耐受的组成的差异很大，诸如一系列磷脂/辅助脂质浓度、阳离子脂质浓度和胆固醇，以及RNA尺寸；(2)用于以小规模、中规模和大规模制造的不同可缩放模块之间的可转移性；(3)在维持减少的批量体积(batch volume)的同时放大生产的能力。
在实施方案中，提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过内径(ID)为约0.01英寸至约0.08英寸的第一管；其中该水溶液的pH在约3.0至约4.5的范围内，任选的NaCl浓度高达约300mM；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过该第一管的水溶液流速的约0.2至约1倍的流速流过具有约0.01英寸至约0.04英寸的ID的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以c)将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
在实施方案，提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以及c)将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中第一ID和第二ID以及通过第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以保持RNA的完整性的剪切力；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％之间的乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
在实施方案中，混合包括使乙醇溶液和水溶液流入由垂直联接到第一管的第二管组成的混合模块中。
在实施方案中，混合包括使乙醇溶液和水溶液流入多入口涡流混合器中。
在实施方案中，水溶液中的RNA浓度在约85微克/毫升至约2100微克/毫升的范围内。在实施方案中，该范围为约85至约200微克/毫升，或约200至约500微克/毫升，或约500至约800微克/毫升，或约800至约1000微克/毫升，或约1000至约1500微克/毫升，或约1500至约2100微克/毫升，包括它们之间的任何子范围及其分数。
在实施方案中，乙醇溶液中脂质的浓度在约5.0mg/mL至约125mg/mL的范围内。在实施方案中，该范围为约5.0至约30mg/mL，或约30至约60mg/mL，或约60至约90mg/mL，或约90至约125mg/mL，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，水溶液由具有不超过约200psi的背压的第一泵通过第一管泵送，并且乙醇溶液由第二泵通过第二管泵送。在一些实施方案中，该背压不超过约195psi，或不超过约190psi，或不超过约180psi。
在实施方案中，第一管具有在约0.01英寸至约0.08英寸的范围内的ID，并且第二管具有在约0.01英寸至约0.04英寸的范围内的ID。在实施方案中，第一管具有在约0.02英寸至约0.03英寸的范围内的ID，第二管具有在约0.01英寸至约0.02英寸的范围内的ID。在实施方案中，第一管具有约0.02英寸的ID并且第二管具有约0.01英寸的ID。在实施方案中，第一管具有约0.03英寸的ID并且第二管具有约0.01英寸的ID。此类测量值包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，水溶液以约40mL/min至约375mL/min范围内的流速被泵送。在实施方案中，该流速在约40至约80mL/min，或约80至约120mL/min，或约120至约160mL/min，或约160至约200mL/min，或约200至约240mL/min，或约240至约280mL/min，或约280至约320mL/min，或约320至约375mL/min的范围内，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，乙醇溶液以约10mL/min至约75mL/min范围内的流速被泵送。在一些实施方案中，该流速在约10至约30mL/min、或约30至约50mL/min，或约50至约75mL/min的范围内，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，水溶液、乙醇和输出溶液被维持在约10℃至约25℃的温度范围内。
在实施方案中，方法可进一步包括泵送第一稀释缓冲液并且通过将稀释缓冲液引入到输出溶液中来将稀释缓冲液与输出溶液混合以产生第一经稀释输出溶液。
在实施方案中，方法可进一步包括将第二稀释缓冲液泵送到第一经稀释输出溶液中，从而形成最终经稀释输出溶液，其中在泵送第一稀释缓冲液和第二稀释缓冲液之间存在延迟。
在实施方案中，该延迟为约0.1至约30秒，其中该延迟由一定长度的管道产生。在一些实施方案中，不存在延迟。在一些实施方案中，该延迟为0.1至约5秒，或约5至约10秒，或约10至约15秒，或约15至约20秒，或约20至约30秒，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，第一稀释缓冲液包含：具有约5.5至约7.0的pH的缓冲剂；和任选的高达约100mM的氯化钠浓度。例如，第一稀释缓冲液可包含高达约20mM的Tris缓冲液，或40mM至90mM磷酸盐缓冲液，或20mM至50mM HEPES缓冲液，或45mM pH 6.5磷酸盐缓冲液。
在实施方案中，第一稀释缓冲液可任选地包含高达约50mM的氯化钠浓度。
在实施方案中，第二稀释缓冲液可包含具有在约7.4和8.0之间的pH的缓冲剂；和任选的高达约100mM的氯化钠浓度。
在实施方案中，第二稀释缓冲液可任选地包含高达约50mM的氯化钠溶液。
在实施方案中，第二缓冲液包含高达约15％w/v的蔗糖。在一些实施方案中，蔗糖的存在量高达约12％w/v，或高达约10％，或高达约8％，或高达约5％，或高达约1％。在一些实施方案中，蔗糖不存在。
在实施方案中，第二缓冲液包含高达约0.5％w/v的抗氧化剂。在一些实施方案中，抗氧化剂不存在。在一些实施方案中，抗氧化剂的存在量高达约0.4％w/v，或约0.3％，或约0.2％，或约0.1％w/v。
在实施方案中，第二缓冲液包含高达20mM的螯合剂。
在实施方案中，第一经稀释输出溶液包含约1.0％至约10.0％乙醇。在一些实施方案中，第一经稀释输出溶液约包含约2％至约8％乙醇，或约3％至约7％乙醇，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，第一稀释缓冲液以约80mL/min至约900mL/min的流速被泵送。在一些实施方案中，该流速为约80mL/min至约150mL/min，或约150mL/min至约200mL/min，或约200mL/min至约250mL/min，或约250mL/min至约300mL/min，或约300mL/min至约400mL/min，或约400mL/min至约500mL/min，或约500mL/min至约600mL/min，或约600mL/min至约700mL/min，或约700mL/min至约900mL/min，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，第二稀释缓冲液以约240mL/min至约5400mL/min的流速被泵送。在一些实施方案中该流速为约240mL/min至约500mL/min，或约500mL/min至约1000mL/min，或约1000mL/min至约1500mL/min，或约1500mL/min至约2000mL/min，或约2000mL/min至约2500mL/min，或约2500mL/min至约3000mL/min，或约3000mL/min至约3500mL/min，或约3500mL/min至约4000mL/min，或约4000mL/min至约4500mL/min，或约4500mL/min至约5000mL/min，或约5000mL/min至约5500mL/min，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，输出溶液的总流速在约120mL/min至约300mL/min的范围内。
在实施方案中，阳离子脂质具有式I的结构：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
R5和R6各自独立地选自由直链或支链C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和胆固醇基(cholesteryl)组成的组；
L5和L6各自独立地选自由直链C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
X5为-C(O)O-或-OC(O)-；
X6为-C(O)O-或-OC(O)-；
X7为S或O；
L7不存在或为低级烷基；
R4为直链或支链C1-C6烷基；以及
R7和R8各自独立地选自由氢和直链或支链C1-C6烷基组成的组。
在实施方案中，脂质包封的RNA纳米颗粒具有在约50nm至约120nm范围内的平均粒度。在一些实施方案中，该平均粒度为约60nm至约120nm、约70nm至约120nm或约70nm至90nmm，包括它们之间的任何子范围以及它们的分数。
在实施方案中，多分散性脂质包封的RNA纳米颗粒不超过约0.2。
在实施方案中，该脂质包封的RNA纳米颗粒的脂质部分进一步包含一种或多种选自由辅助脂质、胆固醇和PEG脂质缀合物组成的组的剂。
在实施方案中，RNA是自复制型RNA。
在实施方案中，方法可进一步包括冻干最终经稀释输出溶液。
前述实施方案以任何组合组合并且代表示例性实施方案。本文下文和随后的实施例中进一步提供了对这些实施方案的更全面的理解。
基于脂质的配制物
基于将核酸在细胞内递送至靶细胞的疗法面临细胞外和细胞内屏障。事实上，裸核酸材料不能容易地全身施用，这是由于它们的毒性、在血清中的稳定性低、肾脏清除速度快、靶细胞摄取减少、吞噬细胞摄取以及它们激活免疫反应的能力，所有这些特征阻碍了它们的临床开发。当外源性核酸物质(例如mRNA)进入人体生物系统时，它会被网状内皮系统(RES)识别为外来病原体，并在有机会遇到血管系统内或外的靶细胞之前从血液循环中被清除。据报告，裸核酸在血流中的半衰期约为几分钟(Kawabata K,Takakura Y,HashidaMPharm Res.1995年6月；12(6):825-30)。化学修饰和适当的递送方法可以减少RES的摄取并保护核酸免受无处不在的核酸酶的降解，从而提高基于核酸的疗法的稳定性和功效。此外，RNA或DNA是不利于细胞的摄取的阴离子亲水聚合物，细胞在表面处也是阴离子的。因此，基于核酸的疗法的成功在很大程度上取决于可以高效且有效地将遗传物质递送至靶细胞并且在体内获得足够水平的表达且毒性最小的媒介物或载体的开发。
此外，一旦内化到靶细胞中，核酸递送载体就会受到细胞内屏障的挑战，包括内体截留、溶酶体降解、核酸从载体解包、跨核膜易位(对于DNA)和在细胞质中释放(对于RNA)。因此，成功的基于核酸的疗法取决于载体将核酸递送至细胞内的靶位点以获得足够水平的所需活性(诸如基因表达)的能力。
虽然数种基因疗法已经能够成功地利用病毒递送载体(例如，AAV)，但基于脂质的配制物由于其生物相容性和易于大规模生产而越来越被认为是最有前途的RNA和其他核酸化合物递送系统之一。基于脂质的核酸疗法的最重要的进展之一发生在2018年8月，当时Patisiran(ALN-TTR02)成为第一个获得美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration,FDA)和欧盟委员会(European Commission,EC)批准的siRNA疗法。ALN-TTR02是一种基于所谓的稳定核酸脂质颗粒(SNALP)转染技术的siRNA配制物。尽管Patisiran取得了成功，但经由脂质配制物递送核酸疗法(包括mRNA)仍在开发中。
根据各种实施方案，一些本领域公认的用于核酸治疗剂的脂质配制的递送媒介物包括基于聚合物的载剂，诸如聚乙烯亚胺(PEI)，含类脂质的配制物，脂质纳米颗粒和脂质体，纳米脂质体，含神经酰胺的纳米脂质体，多泡脂质体，蛋白脂质体，天然和合成衍生的外泌体，天然、合成和半合成的层状体，纳米颗粒，胶束和乳液。
这些脂质配制物的结构和组成各不相同，并且正如在快速发展的领域中可预期的那样，本领域中已经使用了几种不同的术语来描述单一类型的递送媒介物。同时，在整个科学文献中，脂质配制物的术语经常被混淆，这种不一致的使用已导致对脂质配制物的几个术语的确切含义的混淆。在几种潜在的脂质配制物中，脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒在本文中被具体地详细描述和定义用于本公开的目的。
脂质体
常规脂质体是由至少一个双层和内部水性隔室组成的囊泡。脂质体的双层膜通常由两亲性分子，诸如包含空间上分离的亲水和疏水结构域的合成或天然来源的脂质形成(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合囊(polymerosome)、泡囊(niosome)等)形成。它们通常以球形囊泡的形式存在，并且可具有在从20nm到几微米的范围内的尺寸。脂质体配制物可被制备成胶体分散体，或者它们可被冻干以降低稳定性风险并且提高基于脂质体的药物的保质期。制备脂质体组合物的方法是本领域已知的并且在普通技术人员的技能范围内。
只具有一个双层的脂质体被称为单层脂质体，而具有多于一个双层的脂质体被称为多层脂质体。最常见的脂质体类型是小单层囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)和多层囊泡(MLV)。与脂质体相反，溶酶体、胶束和反胶束由单层脂质组成。通常，脂质体被认为具有单个内部隔室，但是一些配制物可以是多囊泡脂质体(MVL)，该多囊泡脂质体由许多不连续的内部水性隔室组成，这些不连续的内部水性隔室被几个非同心脂质双层隔开。
鉴于脂质体基本上是生物膜的类似物，并且可以由天然和合成磷脂制备，脂质体因其卓越的生物相容性而长期以来被视为药物递送媒介物(Int.J.Nanomedicine.2014；9:1833-1843)。在用作药物递送媒介物时，溶解在脂质体芯中的亲水性溶质不能容易穿过双层的疏水膜，并且疏水性化合物将与该双层缔合。因此，脂质体可以装载有疏水和/或亲水分子。当脂质体用于携带核酸诸如RNA时，核酸包含在水相的脂质体隔室内。
阳离子脂质体
脂质体可由阳离子脂质、阴离子脂质和/或中性脂质组成。作为脂质体的一个重要亚类，阳离子脂质体是全部或部分由带正电荷的脂质制成的脂质体，或者更具体地是包含阳离子基团和亲脂部分的脂质。除了上面针对脂质体概括的一般特征外，阳离子脂质体中使用的阳离子脂质的带正电部分提供了几个优点和一些独特的结构特征。例如，阳离子脂质的亲脂性部分是疏水性的，并且因此将引导其自身远离脂质体的水性内部并且与其他非极性和疏水性物质缔合。相反，阳离子部分将与水性介质缔合，更重要的是与极性分子和物质缔合，阳离子部分可以在阳离子脂质体的水性内部与该极性分子和物质复合。由于这些原因，阳离子脂质体越来越多地被研究用于基因疗法，因为它们具有经由静电相互作用对带负电荷的核酸的偏好性，导致产生提供生物相容性、低毒性和体内临床应用所需的大规模生产的可能性的复合物。适用于阳离子脂质体的阳离子脂质列于下文。
脂质纳米颗粒
与脂质体和阳离子脂质体相比，脂质纳米颗粒(LNP)具有包含将化合物包封在固相中的单个单层或双层脂质的结构。因此，与脂质体不同，脂质纳米颗粒在其内部没有水相或其他液相，而是来自双层或单层壳的脂质直接与内部化合物复合，从而将它包封在固体核中。脂质纳米颗粒通常是具有相对均匀的形状和尺寸分布的球形囊泡。虽然科学文献对于什么尺寸的脂质颗粒称得上是纳米颗粒的标准各不相同，但一致认为脂质纳米颗粒的直径可以在10nm至1000nm范围内。然而，更常见的是它们被认为小于120nm甚至100nm。
对于脂质纳米颗粒核酸递送系统，脂质壳可以被配制为包含可电离的阳离子脂质，该阳离子脂质可以与核酸核心的带负电荷的主链复合和缔合。表观pKa值低于约7的可电离阳离子脂质的益处是提供了这样的阳离子脂质，该阳离子脂质用于与核酸带负电荷的主链复合并且在低于该可电离脂质的pKa的pH(在该pH下该可电离脂质带正电荷)下装载到脂质纳米颗粒中。然后，在生理pH值下，该脂质纳米颗粒可以采用相对中性的外部，从而显著增加静脉内施用后该颗粒的循环半衰期。在核酸递送背景下，脂质纳米颗粒与其他基于脂质的核酸递送系统相比具有许多优势，包括高核酸包封效率、强效转染、改进的向组织中渗透以递送治疗剂，以及低水平的细胞毒性和免疫原性。
在开发用于核酸的脂质纳米颗粒递送系统之前，阳离子脂质被广泛研究为用于递送核酸药物的合成材料。在这些早期的努力中，在生理pH值下混合在一起后，核酸被阳离子脂质凝聚从而形成脂质-核酸复合物，其称为脂质复合物(lipoplexe)。然而，脂质复合物被证明是不稳定的，并且特征在于从亚微米级到几微米的广泛尺寸分布。脂质复合物，诸如试剂，已发现在体外转染方面具有相当大的实用性。然而，这些第一代脂质复合物尚未被证明在体内有用。大粒度和正电荷(由阳离子脂质赋予)导致快速血浆清除、溶血和其他毒性，以及免疫系统激活。
脂质-mRNA配制物
可以将如本文公开的mRNA或其药学上可接受的盐掺入到脂质配制物(即，基于脂质的递送媒介物)中。
在本公开的上下文中，基于脂质的递送媒介物通常用于将期望的mRNA运送至靶细胞或组织。该基于脂质的递送媒介物可以是本领域已知的任何合适的基于脂质的递送媒介物。在一些实施方案中，该基于脂质的递送媒介物是脂质体、阳离子脂质体或含有本公开的mRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，该基于脂质的递送媒介物包含纳米颗粒或脂质分子的双层和本公开的mRNA。在一些实施方案中，脂质双层优选进一步包含中性脂质或聚合物。在一些实施方案中，脂质配制物优选包含液体介质。在一些实施方案中，该配制物优选进一步包封核酸。在一些实施方案中，脂质配制物优选进一步包含核酸和中性脂质或聚合物。在一些实施方案中，该脂质配制物优选包封核酸。
说明书提供了脂质配制物，该脂质配制物包含一种或多种包封在该脂质配制物内的治疗性mRNA分子。在一些实施方案中，脂质配制物包含脂质体。在一些实施方案中，脂质配制物包含阳离子脂质体。在一些实施方案中，脂质配制物包含脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，mRNA被完全包封在脂质配制物的脂质部分内，使得脂质配制物中的mRNA在水溶液中对核酸酶降解具有抗性。在其他实施方案中，本文所述的脂质配制物对哺乳动物诸如人类基本上无毒。
本公开的脂质配制物通常还具有约1:1至约100:1、约1:1至约50:1、约2:1至约45:1、约3:1至约40:1、约5:1至约38:1、或约6:1至约40:1、或约7:1至约35:1、或约8:1至约30:1；或约10:1至约25:1；或约8:1至约12:1；或约13:1至约17:1；或约18:1至约24:1；或约20:1至约30:1的总脂质:RNA比率(质量/质量比率)。在一些优选的实施方案中，总脂质:RNA比率(质量/质量比率)为约10:1至约25:1。该比率可以是所列举范围内的任何值或子值，包括端点。
本公开的脂质配制物通常具有约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm，或约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm，或约150nm的平均直径，并且基本上无毒。该直径可以是所列举范围内的任何值或子值，包括端点。此外，当核酸存在于本公开的脂质纳米颗粒中时，该核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。
在优选的实施方案中，脂质配制物包含mRNA、阳离子脂质(例如，本文所述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂和抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，一种或多种PEG-脂质结合物)。脂质配制物还可以包含胆固醇。
在核酸-脂质配制物中，mRNA可以完全包封在配制物的脂质部分内，从而保护核酸免于核酸酶降解。在优选的实施方案中，包含mRNA的脂质配制物被完全包封在脂质配制物的脂质部分内，从而保护核酸免于核酸酶降解。在某些情况下，在将该颗粒在37℃下暴露于核酸酶中至少20、30、45或60分钟后，脂质配制物中的mRNA基本上没有降解。在某些其他情况下，在将脂质配制物在37℃在血清中孵育至少30、45或60分钟或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时后该配制物中的mRNA基本上没有降解。在其他实施方案中，mRNA与该配制物的脂质部分复合。
在核酸的背景下，完全包封可以通过执行膜不可渗透的荧光染料排除测定来确定，该测定使用与核酸缔合时具有增强的荧光的染料。包封是通过将染料添加到脂质配制物中，测量产生的荧光，并将该荧光与添加少量非离子去污剂后观察到的荧光进行比较来确定的。去污剂介导的脂质层破坏释放了包封的核酸，使该核酸能够与膜不可渗透染料相互作用。核酸包封可计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和I0指的是添加去污剂前和后的荧光强度。
在其他实施方案中，本公开提供了包含多个核酸-脂质体、核酸-阳离子脂质体或核酸-脂质纳米颗粒的核酸-脂质组合物。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多个mRNA-脂质体。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多个mRNA-阳离子脂质体。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多个mRNA-脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，脂质配制物包含完全包封在配制物的脂质部分内的mRNA，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％，或至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％，或约99％(或它们的任何分数或其中的范围)的颗粒具有包封在其中的mRNA。该量可以是所列举的范围内的任何值或子值，包括端点。
根据脂质配制物的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用本领域已知的测定法测量特定配制物的递送效率。
根据一些实施方案，本文所述的可表达多核苷酸和mRNA构建体是脂质配制的。脂质配制物优选地选自但不限于脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，脂质配制物是阳离子脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)本公开的mRNA，
(b)阳离子脂质，
(c)聚集减少剂(诸如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)，
(d)任选的非阳离子脂质(诸如中性脂质)，和
(e)任选的固醇。
在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒配制物由以下组成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)辅助脂质；(iii)固醇(例如，胆固醇)；和(iv)PEG-脂质，摩尔比为约20％至约40％的可电离阳离子脂质:约25％至约45％的辅助脂质:约25％至约45％的固醇:约0.5％-5％的PEG脂质。示例阳离子脂质(包括可电离的阳离子脂质)、辅助脂质(例如，中性脂质)、固醇和含配体的脂质(例如，PEG-脂质)在下文有描述。
具体脂质及其相对％组成的选择取决于几个因素，包括所需的治疗效果、预期的体内递送靶标以及计划的给药方案和频率。通常，最优选对应于高效力(即治疗效果，诸如敲低活性或翻译效率)和导致快速组织清除的生物降解性二者的脂质。然而，生物降解性对于旨在仅用于受试者体内一次或两次施用的配制物可能不太重要。此外，脂质组合物可能需要仔细地工程改造，以便脂质配制物在体内施用和到达预期靶标的过程中保持它的形态，但随后能够在被摄取到靶细胞中后释放活性剂。因此，通常需要对几种配制物进行评估，以便找到最佳可能的脂质摩尔比以及总脂质与活性成分的比率中的脂质的最佳可能组合。
合适的脂质组分和制造脂质纳米颗粒的方法是本领域众所周知的，并且例如在PCT/US2020/023442、U.S.8,058,069、U.S.8,822,668、U.S.9,738,593、U.S.9,139,554、PCT/US2014/066242、PCT/US 2015/030218、PCT/2017/015886和PCT/US2017/067756中有描述，它们的内容通过引用并入。
阳离子脂质
脂质配制物优选包含适合于形成阳离子脂质体或脂质纳米颗粒的阳离子脂质。阳离子脂质被广泛研究用于核酸递送，因为它们可以结合至带负电荷的膜并且诱导摄取。通常，阳离子脂质是含有正亲水性头基、两个(或更多个)亲脂性尾部，或类固醇部分和介于这两个结构域之间的连接器的两亲物。优选地，阳离子脂质在大约生理pH下携带净正电荷。阳离子脂质体传统上是包括质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA/小发夹RNA shRNA在内的寡核苷酸的最常用的非病毒递送系统。阳离子脂质，诸如DOTAP、(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)和DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基-甲基硫酸铵)可以通过静电相互作用与带负电荷的核酸形成复合物或脂质复合物，从而提供高体外转染效率。
在目前公开的脂质配制物中，阳离子脂质可以是例如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)(也称为N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪子基)丙烷(DLin-MPZ)，或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯5-胺、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)，或其任何组合。其他阳离子脂质包括但不限于N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、3P-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)，和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(XTC)。另外，可以使用阳离子脂质的商业制备物，诸如例如LIPOFECTIN(包括可从GIBCO/BRL获得的DOTMA和DOPE)和Lipofectamine(包括可从GIBCO/BRL获得的DOSPA和DOPE)。
其他合适的阳离子脂质公开于国际公布号WO 09/086558、WO 09/127060、WO 10/048536、WO 10/054406、WO 10/088537、WO 10/129709和WO 2011/153493；美国专利公布号2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803；美国专利号8,158,601；和Love等人,PNAS,107(5),1864-69,2010，它们的内容通过引用并入本文。
其他合适的阳离子脂质包括具有可替代的脂肪酸基团和其他二烷基氨基基团的那些，包括其中烷基取代基不同的那些(例如N-乙基-N-甲基氨基-和N-丙基-N-乙基氨基-)。这些脂质是称为氨基脂质的阳离子脂质亚类的一部分。在本文所述的脂质配制物的一些实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质。通常，具有较少饱和酰基链的氨基脂质更容易针对过滤除菌的目的设定尺寸(特别是当复合物的尺寸必须设定为小于约0.3微米时)。可以使用含有碳链长度在C14至C22范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其他支架也可用于分离氨基和氨基脂质的脂肪酸或脂肪烷基部分。
在一些实施方案中，脂质配制物包含具有根据专利申请PCT/EP2017/064066的式I的阳离子脂质。在该背景下，PCT/EP2017/064066的公开内容也通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的氨基或阳离子脂质是可电离的并且具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得该脂质在等于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH下，优选在生理pH或高于生理pH下为中性。当然，应该理解，作为pH的函数的质子的添加或去除是平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指占优势物质的性质并且不要求所有脂质都以带电荷或中性形式存在。具有多于一个可质子化或可去质子化的基团或者作为两性离子的脂质不排除在本公开中的使用之外。在某些实施方案中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约11的范围内。在一些实施方案中，可电离阳离子脂质具有约5至约7的pKa。在一些实施方案中，可电离阳离子脂质的pKa为约6至约7。
在一些实施方案中，脂质配制物包含式I的可电离阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R5和R6各自独立地选自由直链或支链C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和胆固醇基组成的组；L5和L6各自独立地选自由直链C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；X5是借以形成-C(O)OR6的-C(O)O-，或借以形成-OC(O)-R6的-OC(O)-；X6是借以形成-C(O)OR5的-C(O)O-或借以形成-OC(O)-R5的-OC(O)-；X7为S或O；L7不存在或为低级烷基；R4为直链或支链C1-C6烷基；并且R7和R8各自独立地选自由氢和直链或支链C1-C6烷基组成的组。
在一些实施方案中，X7是S。
在一些实施方案中，X5是借以形成-C(O)OR6的-C(O)O-，并且X6是借以形成-C(O)OR5的-C(O)O-。
在一些实施方案中，R7和R8各自独立地选自由甲基、乙基和异丙基组成的组。
在一些实施方案中，L5和L6各自独立地为C1-C10烷基。在一些实施方案中，L5是C1-C3烷基，并且L6是C1-C5烷基。在一些实施方案中，L6是C1-C2烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C7烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C9烷基。
在一些实施方案中，R5和R6各自独立地为烯基。在一些实施方案中，R6是烯基。在一些实施方案中，L6是C2-C9烷基。在一些实施方案中，烯基包含单个双键。在一些实施方案中，R5和R6各自为烷基。在一些实施方案中，R5是支链烷基。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C9烷基、C9烯基和C9炔基组成的组。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C11烷基、C11烯基和C11炔基组成的组。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自由C7烷基、C7烯基和C7炔基组成的组。在一些实施方案中，R5是–CH((CH2)pCH 3)2或–CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)，其中p是4-8。在一些实施方案中，p是5并且L5是C1-C3烷基。在一些实施方案中，p是6并且L5是C3烷基。在一些实施方案中，p是7。在一些实施方案中，p是8并且L5是C1-C3烷基。在一些实施方案中，R5由-CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)组成，其中p为7或8。
在一些实施方案中，R4是亚乙基或亚丙基。在一些实施方案中，R4是正亚丙基或异亚丁基。
在一些实施方案中，L7不存在，R4是亚乙基，X7是S并且R7和R8各自是甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4是正亚丙基，X7是S并且R7和R8各自是甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4是亚乙基，X7是S并且R7和R8各自是乙基。
在一些实施方案中，X7是S，X5是-借以形成-C(O)OR6的C(O)O-，X6是-借以形成-C(O)OR5的C(O)O-，L5和L6各自独立为直链C3-C7烷基，L7不存在，R5为-CH((CH2)pCH3)2，并且R6为C7-C12烯基。在一些另外的实施方案中，p是6并且R6是C9烯基。
在一些实施方案中，脂质配制物包含选自由以下组成的组的可电离阳离子脂质：
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在一些实施方案中，本文所列举的任一种或多种脂质可被明确排除。
辅助脂质和固醇
本公开的mRNA-脂质配制物可包含辅助脂质，该辅助脂质可称为中性脂质、中性辅助脂质、非阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、阴离子脂质、阴离子辅助脂质，或两性离子脂质。已经发现，如果脂质配制物(特别是阳离子脂质体和脂质纳米颗粒)中存在辅助脂质，则该配制物具有增加的细胞摄取。(Curr.Drug Metab.2014；15(9):882-92)。例如，一些研究已经指出中性和两性离子脂质，诸如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰-磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)，比阳离子脂质更易融合(即，促进融合)，可以影响脂质-核酸复合物的多态性特征，促进从层状向六角相的转变，从而诱导细胞膜的融合和破裂。(Nanomedicine(Lond).2014年1月；9(1):105-20)。此外，使用辅助脂质可以帮助减少使用许多常见阳离子脂质的任何潜在的有害影响，诸如毒性和免疫原性。
适用于本公开的脂质配制物的非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，诸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二乙酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱，以及其混合物。也可使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选是衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰。
非阳离子脂质的另外实例包括固醇，诸如胆固醇及其衍生物。一项研究得出结论，作为辅助脂质，胆固醇增加了与核酸接合的脂质层的电荷间距，使得电荷分布更紧密地匹配核酸的电荷分布。(JR Soc.Interface.2012年3月7日；9(68):548–561)。胆固醇衍生物的非限制性实例包括：极性类似物，诸如5α-胆甾烷醇、5α-粪固醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮和癸酸胆固醇酯；以及其混合物。在优选的实施方案中，胆固醇衍生物为极性类似物，诸如胆固醇基(4'-羟基)-丁基醚。
在一些实施方案中，存在于脂质配制物中的辅助脂质包含一种或多种磷脂和胆固醇或它们的衍生物的混合物，或者由一种或多种磷脂和胆固醇或它们的衍生物的混合物组成。在其他实施方案中，存在于脂质配制物中的中性脂质包含一种或多种磷脂，或者由一种或多种磷脂组成，例如不含胆固醇的脂质配制物。在又其他实施方案中，存在于脂质配制物中的中性脂质包含胆固醇或其衍生物，或者由胆固醇或其衍生物组成，例如不含磷脂的脂质配制物。
辅助脂质的其他实例包括不含磷的脂质，诸如例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸类聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基双甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。
在一些实施方案中，辅助脂质占存在于脂质配制物中的总脂质的约20mol％至约50mol％、约22mol％至约48mol％、约24mol％至约46mol％、约25mol％至约44mol％、约26mol％至约42mol％、约27mol％至约41mol％、约28mol％至约40mol％、或约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、或约39mol％(或它们的任何分数或其中的范围)。
在一些实施方案中，配制物中总的辅助脂质包含两种或更多种辅助脂质，并且该辅助脂质的总量占存在于脂质配制物中的总脂质的约20mol％至约50mol％、约22mol％至约48mol％、约24mol％至约46mol％、约25mol％至约44mol％、约26mol％至约42mol％、约27mol％至约41mol％、约28mol％至约40mol％，或约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、或约39mol％(或它们的任何分数或其中的范围)。在一些实施方案中，辅助脂质是DSPC和DOTAP的组合。在一些实施方案中，辅助脂质是DSPC和DOTMA的组合。
脂质配制物中的胆固醇或胆固醇衍生物可占脂质配制物中存在的总脂质的至多约40mol％、约45mol％、约50mol％、约55mol％或约60mol％。在一些实施方案中，胆固醇或胆固醇衍生物占脂质配制物中存在的总脂质的约15mol％至约45mol％、约20mol％至约40mol％、约30mol％至约40mol％、或约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％或约40mol％。
脂质配制物中存在的辅助脂质的百分比是目标量，并且配制物中存在的辅助脂质的实际量可以变化，例如以±5mol％变化。
含有阳离子脂质化合物或可电离阳离子脂质化合物的脂质配制物可以是以摩尔计的约20％-40％的阳离子脂质化合物、约25％-40％的胆固醇、约25％-50％的辅助脂质和约0.5％-5％的聚乙二醇(PEG)脂质，其中百分比是占配制物中存在的总脂质的百分比。在一些实施方案中，组合物是约22-30％的阳离子脂质化合物、约30-40％的胆固醇、约30-40％的辅助脂质和约0.5％-3％的PEG-脂质，其中百分比是占配制物中存在的总脂质的百分比。
脂质缀合物
本文所述的脂质配制物可进一步包含脂质缀合物。缀合的脂质可用于防止颗粒聚集。合适的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物，以及其混合物。此外，脂质递送媒介物可被用于通过将配体(例如抗体、肽和碳水化合物)附接到其表面或附接到附接PEG链的末端来进行特异性靶向(Front Pharmacol.2015年12月1日；6:286)。
在一个优选的实施方案中，脂质缀合物是PEG-脂质。在脂质配制物中纳入聚乙二醇(PEG)作为涂层或表面配体，这种技术被称为聚乙二醇化(PEGylation)，有助于保护纳米颗粒免受免疫系统的影响并且使该纳米颗粒逃避RES的摄取(Nanomedicine(Lond).2011年6月；6(4):715-28)。聚乙二醇化已被广泛用于通过物理、化学和生物机制稳定脂质配制物及其有效载荷。去污剂样PEG脂质(例如PEG-DSPE)可以进入脂质配制物以在表面上形成水合层和空间屏障。基于聚乙二醇化的程度，表面层通常可分为两种类型，刷样层和蘑菇样层。对于经PEG-DSPE稳定的配制物，PEG将在低程度的聚乙二醇化(通常小于5mol％)下呈现蘑菇构象，并且随着PEG-DSPE的含量增加超过一定水平时将转变为刷构象(J.Nanomaterials.2011；2011:12)。已经证明，聚乙二醇化的增加使得脂质配制物的循环半衰期显著提高(Annu.Rev.Biomed.Eng.2011年8月15日；13():507-30；J.ControlRelease.2010年8月3日；145(3):178-81)。
PEG-脂质的合适实例包括但不限于：偶联至二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)、偶联至二酰基甘油的PEG(PEG-DAG)、偶联至磷脂(如磷脂酰乙醇胺)的PEG(PEG-PE)、缀合至神经酰胺的PEG、缀合至胆固醇的PEG或其衍生物，以及其混合物。
PEG是具有两个末端羟基基团的乙烯PEG重复单元的直链水溶性聚合物。PEG按其分子量来分类，并且包括以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(tresylate)(MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)以及此类含有端部羟基而非端部甲氧基的化合物(例如，HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2)。
本文所描述的PEG-脂质缀合物的PEG部分可以包含范围约550道尔顿至约10,000道尔顿的平均分子量。在某些情况下，PEG部分具有约750道尔顿至约5,000道尔顿(例如，约1,000道尔顿至约5,000道尔顿、约1,500道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至3,000道尔顿、约750道尔顿至约2,000道尔顿)的平均分子量。在优选的实施方案中，PEG部分具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。平均分子量可以是在所列举范围内的任何值或子值，包括端点。
在某些情况下，PEG单体可任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基基团取代。PEG可以直接缀合至脂质，或者可以经由接头部分连接到脂质。可使用适于将PEG偶联至脂质的任何接头部分，包括例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在一个优选的实施方案中，接头部分为不含酯的接头部分。合适的不含酯的接头部分包括但不限于酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰氨基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚及其组合(诸如既含有氨基甲酸酯接头部分又含有酰氨基接头部分的接头)。在一个优选实施方案中，将PEG使用氨基甲酸酯接头偶联到脂质。
在其他实施方案中，使用含酯的接头部分以将PEG偶联到脂质。合适的含酯的接头部分包括：例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀酰基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其组合。
具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可缀合至PEG以形成脂质缀合物。此类磷脂酰乙醇胺是可商购获得的，或者可使用本领域技术人员已知的常规技术分离或合成。含有碳链长度在C10至C20范围内的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。也可以使用具有单不饱和脂肪酸或双不饱和脂肪酸以及饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物的磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰乙醇胺包括但不限于：二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一些实施方案中，PEG-DAA缀合物是PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂基氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈氧基丙基(C16)缀合物，或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)缀合物。在这些实施方案中，PEG优选具有约750至约2,000道尔顿的平均分子量。在具体实施方案中，PEG的末端羟基被甲基取代。
除了前述之外，其他亲水性聚合物也可以用来代替PEG。可用于代替PEG的合适聚合物的实例包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基、甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生化纤维素(诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素)。
在一些实施方案中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)占存在于脂质配制物中的总脂质的约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约0.6mol％至约1.9mol％、约0.7mol％至约1.8mol％、约0.8mol％至约1.7mol％、约0.9mol％至约1.6mol％、约0.9mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.7mol％、约1.2mol％至约1.8mol％、约1.2mol％至约1.7mol％、约1.3mol％至约1.6mol％，或约1.4mol％至约1.6mol％(或它们的任何分数或其中的范围)。在其他实施方案中，脂质缀合物(例如PEG-脂质)占存在于脂质配制物中的总脂质的约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5％(或它们的任何分数或其中的范围)。该量可以是所列举的范围内的任何值或子值，包括端点。
在一些优选实施方案中，PEG-脂质是PEG550-PE。在一些优选实施方案中，PEG-脂质是PEG750-PE。在一些优选实施方案中，PEG-脂质是PEG2000-DMG。
存在于本公开的脂质配制物中的脂质缀合物(例如PEG-脂质)的百分比是目标量，并且该配制物中存在的脂质缀合物的实际量可以变化，例如以±0.5mol％变化。本领域普通技术人员将理解，脂质缀合物的浓度可根据所用的脂质缀合物和脂质要发生融合的速率而变化。
细胞摄取脂质配制物的作用机制
用于核酸细胞内递送的脂质配制物，特别是脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒被设计用于通过利用靶细胞的内吞机制穿透靶细胞进行细胞摄取，其中脂质递送媒介物的内容物被递送至靶细胞的胞质溶胶。(Nucleic Acid Therapeutics,28(3):146-157,2018)。具体而言，就本文所述的靶向肝细胞的mRNA-脂质配制物而言，mRNA-脂质配制物通过受体介导的内吞作用进入肝细胞。在内吞作用之前，脂质递送媒介物表面处的功能化配体(诸如PEG脂质)从表面脱落，从而触发向靶细胞中的内化。在内吞作用过程中，细胞质膜的某些部分围绕载体并且将其吞入囊泡中，然后囊泡从细胞膜上夹断，进入胞质溶胶并且最终经历内溶酶体途径。对于可电离的含阳离子脂质的递送媒介物，酸度随着内体老化而增加，这导致媒介物的表面上带有强正电荷。然后，递送媒介物和内体膜之间的相互作用导致膜融合事件，从而导致有效载荷的胞质溶胶递送。对于mRNA有效载荷，细胞自身的内部翻译过程随后会将mRNA翻译成编码的蛋白质。编码的蛋白质可以进一步经受翻译后加工(包括向细胞内的靶细胞器或位置的运送)。
通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质配制物中交换出来的速率，并且进而控制脂质配制物变得融合的速率。此外，包括例如pH、温度或离子强度在内的其他变量可被用于改变和/或控制脂质配制物变得融合的速率。阅读本公开后，可用于控制脂质配制物变得融合的速率的其他方法对本领域技术人员而言将变得显而易见。此外，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质体或脂质粒度。
脂质配制物制造
有许多不同的方法用于制备包含核酸的脂质配制物。(Curr.Drug Metabol.2014,15,882–892；Chem.Phys.Lipids 2014,177,8–18；Int.J.Pharm.Stud.Res.2012,3,14–20)。本文简要描述了薄膜水化、双乳化、反相蒸发、微流体制备、双不对称离心、乙醇注射、去污剂透析、由乙醇稀释引起的自发囊泡形成以及在预先形成脂质体中的包封的技术。
薄膜水化
在薄膜水化(TFH)或Bangham方法中，将脂质溶解在有机溶剂中，然后通过使用旋转蒸发仪进行蒸发，从而导致形成薄的脂质层。在用含有待装载化合物的水性缓冲溶液将该层水化后，形成多层囊泡(MLV)，该多层囊泡的尺寸可通过经由膜挤出或通过对起始MLV进行超声波处理来缩小从而产生小或大的单层囊泡(LUV和SUV)。
双乳化
脂质配制物也可以通过双乳化技术制备，该技术涉及将脂质溶解在水/有机溶剂混合物中。将含有水滴的有机溶液与过量的水性介质混合，从而导致形成水包油包水(W/O/W)双乳液。机械剧烈摇动后，部分水滴坍塌，形成大单层囊泡(LUV)。
反相蒸发
反相蒸发(REV)方法还允许人们获得装载有核酸的LUV。在这种技术中，通过将磷脂溶解在有机溶剂和水性缓冲液中形成两相系统。然后对所得悬浮液进行短暂超声处理，直到混合物变成透明的单相分散体。在减压下蒸发有机溶剂后获得脂质配制物。该技术已被用于包封包括核酸在内的不同大小的亲水性分子。
微流体制备
与其他大体积的技术不同，微流体方法提供了控制脂质水化过程的可能性。根据操纵流的方式，该方法可分为连续流微流体和基于液滴的微流体。在以连续流动模式运行的微流体流体动力学聚焦(MHF)方法中，脂质被溶解在异丙醇中，该异丙醇流体动力学地聚焦在介于两个水性缓冲液流之间的微通道交叉接合处。可以通过调节流速来控制囊泡尺寸，从而控制脂质溶液/缓冲液稀释过程。该方法可被用于通过使用由三个入口和一个出口端口组成的微流体设备来生产寡核苷酸(ON)脂质配制物。
双不对称离心
双不对称离心(DAC)不同于更常见的离心，因为它使用围绕其自身垂直轴的额外旋转。由于产生两个重叠运动，因此实现了有效的均质化：如同在常规的离心机中，该样本被向外推，然后由于额外的旋转，该样本被推向小瓶的中心。通过混合脂质和NaCl溶液可获得黏性囊泡磷脂凝胶(VPC)，然后将其稀释以获得脂质配制物分散体。该脂质配制物尺寸可通过优化DAC速度、脂质浓度和均质时间来调节。
乙醇注射
乙醇注射(EI)方法可被用于核酸包封。这种方法通过使用针头来将其中已溶解脂质的乙醇溶液快速注射到含有待包封核酸的水性介质中。当该磷脂被分散在整个介质中时，囊泡自发形成。
去污剂透析
去污剂透析法可被用于包封核酸。简单地说，将脂质和质粒溶解在具有适当离子强度的去污剂溶液中，在通过透析除去去污剂后，形成稳定的脂质配制物。然后通过离子交换色谱分析法除去未包封的核酸，并通过蔗糖密度梯度离心法去除空囊泡。该技术对阳离子性脂质含量和透析缓冲液的盐浓度高度敏感，且该方法亦难以缩放。
由乙醇稀释引起的自发囊泡形成
稳定的脂质配制物也可通过乙醇稀释法经由自发形成囊泡来产生，其中逐步或逐滴的乙醇稀释可提供装载有核酸的囊泡的瞬时形成，这可通过以经控制的方式在含有该核酸的快速混合的水性缓冲液中添加溶解在乙醇中的脂质来实现。
在预先形成的脂质体中的包封
核酸的截留也可通过两种不同的方法从预先形成的脂质体开始来达成：(1)将阳离子脂质体与核酸简单混合，产生称为“脂质复合”的静电复合物，在这种情况下核酸可成功地用来转染细胞培养，但特征是包封效率低并且体内性能较差；和(2)脂质体去稳定化，在阳离子囊泡的悬浮液中缓慢加入无水乙醇直至浓度为40％v/v，然后逐滴加入核酸以获得经装载的囊泡；然而，该二个决定该包封过程的特征的主要步骤过于敏感并且颗粒的尺寸必须缩小。
脂质包封的RNA纳米颗粒形成
图1提供了此处描述的生产脂质包封的RNA纳米颗粒的一般方法的代表性流程图的实例。
混合层的几何形状由以下组成：用于运送水溶液的第一管，该第一管具有如本文所述的内径；和用于运送乙醇(有机)溶液的第二管，该第二管由如本文所述的ID组成；当使用如本文所述的混合模块时，第二(有机)管以垂直角或接近垂直角与第一(水性)管相交。
本文所述的方法提供了RNA水溶液，该RNA水溶液包含溶解在包含缓冲液(例如柠檬酸盐)的水溶液中的例如在良好生产规范(GMP)下制备的治疗性大RNA。本方法还提供了包含一种或多种脂质，例如在GMP下合成的临床级脂质的有机溶液，该有机溶液通过将脂质溶解在水混溶性的有机溶剂中来生产。在本文所描述的方法中，水混溶性有机溶剂优选是低级烷醇，例如乙醇。优选地，将两种溶液过滤灭菌并调节它们的浓度。
将有机脂质溶液与包含核酸的水溶液混合以形成具有层状形态(即包含脂质双层)的脂质包封的RNA纳米颗粒。在一方面，核酸包封在脂质包封的RNA纳米颗粒中，形成了层状结构。
本文所述的方法涉及在混合环境中将脂质溶液连续引入水溶液中，优选地在混合模块中垂直地引入。该混合将脂质溶液用水溶液稀释至10％至75％v/v乙醇、12％至70％v/v乙醇、14％至65％v/v乙醇、16％至60％v/v乙醇、18％至50％v/v乙醇、20％至45％v/v乙醇或22％至30％v/v乙醇，并使得在湍流中形成脂质包封的RNA纳米颗粒。
在形成脂质包封的RNA纳米颗粒之后，用缓冲液将混合物连续稀释至约1％至约10％v/v乙醇，或7.5％、10％、12.5％或15％，优选地低于12.5％乙醇，这进一步稳定了脂质包封的RNA纳米颗粒并增加核酸的包封。
通过切向流过滤，优选通过中空纤维过滤器，浓缩脂质包封的RNA纳米颗粒。对浓缩的脂质包封的RNA纳米颗粒进行超滤步骤以除去烷醇并替换缓冲液。通过稀释调节核酸浓度。将所得的配制物过滤灭菌并且灌装到小瓶中。现在将使用如图1中提出的步骤在下文中更详细地讨论该过程。
脂质增溶和RNA溶解(Dissolution)
在一个实施方案中，通过本文所描述的方法生产的脂质包封的RNA纳米颗粒呈RNA和脂质的多分子组装体的形式，其中RNA至少部分通过与阳离子脂质的离子配对而被包封。
在某些方面，本文描述的脂质纳米颗粒包括四种脂质组分：辅助脂质、胆固醇、PEG-脂质，和阳离子脂质。优选地，辅助脂质为DSPC，PEG-脂质为PEG-DMG，并且阳离子脂质为可电离阳离子脂质。在某些实施方案中，溶解脂质的有机溶剂浓度为约45％v/v至约90％v/v。在某些优选的方面，该有机溶剂为低级烷醇。合适的低级烷醇包括，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、它们的异构体及组合。溶剂优选为浓度为约50％-90％v/v的乙醇。脂质可占约1mL/g至约5mL/g或者如在下面的实例中另外描述的体积。
使用例如顶置式搅拌器在合适的温度下溶解脂质。在某些优选的方面，RNA被包含在水溶液(例如缓冲液)中并且被稀释至终浓度。
脂质包封的RNA纳米颗粒形成步骤
在制备有机溶液和水溶液之后，可以使用下文详细描述的装置将它们混合在一起。简言之，该装置由用于运送RNA水溶液的第一管和用于运送有机脂质溶液的第二管组成，其中第二管在混合模块内与第一管垂直相交。该两种溶液由单独的HPLC泵通过各自的管泵送，并且在混合模块内在第一管的区域中被垂直地混合。以比有机脂质溶液大0.2倍至1倍的速率泵送RNA水溶液。在混合区中混合该两种溶液后，形成脂质包封的RNA纳米颗粒。
混合模块的区域中的第一管的泵速和尺寸提供了涉及湍流的混合过程。在流体动力学中，紊流(turbulence)或湍流(turbulent flow)是以压力和流速的混沌变化为特征的流体运动。这与层流形成对比，层流发生在流体在平行层中流动时，这些层之间没有中断。湍流总是高度不规则的，并且湍流中容易获得的能量供应倾向于加速流体混合物的均化(混合)。导致流动中混合增强以及质量、动量和能量运送的速率增加的特性称为“扩散性”。湍流的其他特征包括“旋转性”，因为湍流具有强大的三维涡旋生成机制(称为涡旋拉伸和“耗散”)，因为随着动能通过黏性剪切应力转换为内能，紊流迅速消散。湍流混合由流体内的包裹体(parcel)的小规模(与母流相比)随机运动主导，这些运动使包裹体之间的关系更近或更远，并且可能更精细地将它们划分和掺杂。本文所描述的用于混合脂质溶液和水溶液的工艺提供了RNA在脂质纳米颗粒中的包封(该包封是与该脂质纳米颗粒的形成同时形成的)，其中包封效率大于95％。
本文所述的连续工艺是完全可缩放的。在一个方面，形成了平均直径小于约90nm的脂质包封的RNA纳米颗粒，而无需机械能过程，诸如膜挤出、超声处理或微流化。
脂质包封的RNA纳米颗粒
本文公开的脂质包封的RNA纳米颗粒包含纳米颗粒或脂质分子的双层。除了阳离子脂质(例如可电离的阳离子脂质)之外，脂质包封的RNA纳米颗粒还包含中性脂质或聚合物。
在一些实施方案中，RNA完全包封在脂质纳米颗粒的脂质部分内，使得脂质包封的RNA纳米颗粒中的RNA在水溶液中可抵抗核酸酶降解。在其他实施方案中，本文所描述的脂质包封的RNA纳米颗粒对哺乳动物(诸如人)基本上是无毒的。脂质包封的RNA纳米颗粒的平均直径通常为30nm至150nm、40nm至150nm、50nm至150nm、60nm至130nm、70nm至110nm或70nm至90nm。本文所描述的脂质包封的RNA纳米颗粒通常还具有1:1至100:1、1:1至50:1、5:1至45:1、10:1至40:1、12:1至38:1，或15:1至45:1，或25:1至40:1、或30:1至40:1的脂质:RNA比(质量/质量比)。在一些实施方案中，组合物具有在约50:1与10:1之间的总脂质:RNA重量比。在一些实施方案中，组合物具有在约40:1与20:1之间的总脂质:RNA重量比。在一些实施方案中，组合物具有在约45:1与30:1之间的总脂质:RNA重量比。在一些实施方案中，组合物具有在约38:1与30:1之间的总脂质:RNA重量比。
在优选的实施方案中，脂质颗粒包含RNA、阳离子脂质(例如，本文所描述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂和抑制颗粒聚集的缀合的脂质(例如，一种或多种PEG-脂质缀合物)。脂质包封的RNA纳米颗粒还可以包含胆固醇。脂质包封的RNA纳米颗粒可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的RNA，该RNA表达一种或多种多肽。
在脂质包封的RNA纳米颗粒中，RNA可以完全包封在该颗粒的脂质部分内，从而保护该RNA免受核酸酶降解。在优选的实施方案中，脂质包封的RNA纳米颗粒包含这样的RNA，该RNA完全包封在该颗粒的脂质部分内从而保护该RNA免受核酸酶降解。在某些情况下，在将脂质颗粒在37℃下暴露于核酸酶中至少20、30、45或60分钟后，该脂质颗粒中的RNA基本上不降解。在某些其他情况下，在将脂质颗粒在37℃下在血清中培养至少30、45或60分钟或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时后，该脂质颗粒中的RNA基本上不降解。在其他实施方案中，RNA与脂质包封的RNA纳米颗粒的阳离子脂质络合。本公开的配制物的益处之一是脂质包封的RNA纳米颗粒对哺乳动物(诸如人)基本上是无毒的。
脂质颗粒包含完全包封在该颗粒的脂质部分内的RNA，使得从30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％、30％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％、85％至95％、90％至95％、30％至90％、40％至90％、50％至90％、60％至90％、70％至90％、80％至90％，或至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或它们的任何分数或其中的范围)的该颗粒具有包封在其中的RNA。
根据脂质包封的RNA纳米颗粒的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用本领域已知的测定来测量特定配制物的递送效率。
脂质包封的RNA纳米颗粒的稀释
在将有机脂质溶液混合到RNA水溶液中后，如果在去除游离RNA之前进一步稀释脂质包封的RNA纳米颗粒的悬浮液，则可以增强RNA包封的程度。这可以经由一个或多个缓冲液稀释来实现，例如，经由流入输出管线中的一个或多个Y连接器来实现。流入一个或多个Y形连接器中的缓冲液不必相同。
然后可任选地将经稀释的脂质包封的RNA纳米颗粒收集到维持在15℃-20℃的容器中，并且在进行进一步稀释步骤或浓缩步骤之前，允许该纳米颗粒温育几分钟至两小时。
样本浓度
可以将经稀释的脂质包封的RNA纳米颗粒浓缩，例如通过使用中空纤维膜(mPESKros膜，加利福尼亚州兰乔多明格兹的仕必纯公司(Spectrum Laboratories,Inc.))的切向流过滤(TFF)，任选地经由蠕动泵或4-活塞-隔膜泵或离心泵(基于磁悬浮原理)来浓缩。用于此类浓缩技术的方法是本领域已知的，并且对于普通技术人员是显而易见的。
去除游离RNA和缓冲液置换
浓缩后可以对7-10倍体积的10mM的Tris、50mM的NaCl、9％蔗糖(pH为7.5)进行渗滤，以去除有机溶剂和未结合的RNA。优选地，经由热交换器加入渗滤缓冲液，以使得产物温度维持在15℃-20℃。可以将该配制物进一步浓缩以达到>3mg/mL的总配制RNA浓度。
无菌过滤和灌装
然后可以通过IPRP-HPLC(离子对反相-高效液相色谱)测量脂质包封的RNA纳米颗粒配制物中的RNA浓度，并且通过用任选地含有甘油的如本文下文所述的缓冲液进行稀释将该RNA浓度调节至～2mg/mL(1.85至2.3mg/mL)，以使得配制物中甘油的终浓度为5％。将经渗滤的脂质包封的RNA纳米颗粒通过0.2μm灭菌级过滤器(PES)进行无菌过滤。然后可将经过滤的配制物无菌灌装到玻璃小瓶中，加塞、加盖并放置于-20或-70±5℃。
装置
本文的描述提供了用于执行上述工艺的装置。图2提供了根据本文说明书的一个实施方案的装置的代表性示意图的实例。
包含RNA的水溶液由HPLC泵通过管道运送。包含脂质的有机溶液由HPLC泵通过单独的管道运送。在混合模块中以90度角将有机溶液泵入到水溶液中。因此，将包含脂质的有机溶液以垂直于水溶液流动的流动引入到水溶液中。这种以直角流动方向的引入发生在诸如图3中所示的混合模块中，并且在被仔细调整成确保RNA的脂质纳米颗粒包封以对于粒度、分散性和包封效率而言可接受的方式形成的条件下产生湍流混合。然后，含有混合脂质-RNA的管道将脂质包封的RNA纳米颗粒例如经由与稀释区域中的稀释缓冲液以45度角汇合的聚丙烯管道运送至第二混合区域，并且经稀释的脂质包封的RNA纳米颗粒被收集在维持为15-20℃的不锈钢夹套容器中。例如通过使用隔膜泵或离心泵的切向流过滤进一步加工该颗粒。
在一个实施方案中，混合区域为混合模块，在混合模块中有机脂质溶液优选以约90°的角度被递送到RNA水溶液的流中。运送RNA水溶液的第一不锈钢管在其两端中间的管壁上有孔洞。第二管通过填充穿过第一管壁中的孔洞而垂直安装，以允许液体从第二管运送到第一管的内部(见图3)。在优选方面中，使用降低剪切力并允许保持大RNA完整性的RNA水溶液的流速制备脂质包封的RNA纳米颗粒的明确形状和可重复尺寸。也可通过改变流体管线的流速(例如，以在某些情况下确保充分混合)来制备具有明确形状和可重复尺寸的囊泡。
图3示出了根据一个实施方案的混合模块和关联的流体动力学。
本文的说明书提供了一种装置，该装置具有使用中空纤维膜(mPES Kros膜，加利福尼亚州兰乔多明格兹的仕必纯公司(Spectrum Laboratories,Inc.))和4-活塞-隔膜泵或离心泵的切向流过滤。
定义
术语“阴离子脂质”意指在生理pH下带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油，以及与中性脂质联接的其他阴离子修饰基团。
术语“阳离子脂质”意指具有正性亲水性头基；一个、两个、三个或更多个疏水性脂肪酸或脂肪烷基链；以及介于这两个域之间的连接器的两亲性脂质及其盐。可电离或可质子化的阳离子脂质通常在低于其pKa的pH下被质子化(即带正电荷)并且在高于pKa的pH下基本上是中性的。优选的可电离阳离子脂质是具有低于生理pH(其通常为约7.4)的pKa的那些。本公开的阳离子脂质也可称为可滴定的阳离子脂质。阳离子脂质可以是具有可质子化叔胺(例如，可pH滴定的)头基的“氨基脂质”。一些氨基示例性氨基脂质可包括C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3)个双键；以及介于头基与烷基链之间的醚、酯或缩酮连键。此类阳离子脂质包括但不限于DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(也称为MC2)、DLin-M-C3-DMA(也称为MC3)和(DLin-MP-DMA)(也称为1-Bl 1)。
术语“互补核苷酸碱基”意指彼此形成氢键的一对核苷酸碱基。腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或者与RNA中的尿嘧啶(U)配对，并且鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。相互杂交(即通过氢键合联接)的互补核酸区段或链。“互补”意指核酸可以通过传统的Watson-Crick或通过其他非传统的结合模式与另一个核酸序列形成一个获多个氢键。
术语“完全包封”意指核酸-脂质颗粒中的核酸(例如，mRNA)在暴露于将显著降解游离RNA的血清或核酸酶测定后没有被显著降解。当完全包封时，优选颗粒中少于25％的核酸在通常将降解100％游离核酸的处理中被降解，更优选颗粒中少于10％，最优选少于5％的核酸被降解。“完全包封”也意指核酸-脂质颗粒在体内施用后不会迅速分解成它们的组成部分。
术语“核酸”意指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连键的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效载荷的动作或方式。
术语“递送剂”是指至少部分促进多核苷酸体内递送至靶细胞的任何物质。
术语“工程化”是指被设计成具有某种特征或性质的分子，无论是结构上的还是化学上的，这些特征或性质与起始点、野生型或原生分子不同。
术语核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录本的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
术语“疏水脂质”意指具有非极性基团的化合物，该非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基以及此类任选地被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的基团。合适的实例包括但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
术语“脂质”意指包含脂肪酸酯的有机化合物，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。脂质通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生化脂质”，诸如类固醇。
术语“脂质递送媒介物”意是指可用于将治疗性核酸(例如，mRNA)递送至目标靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质配制物。脂质递送媒介物可以是核酸-脂质颗粒，其可以由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-脂质)和任选的胆固醇形成。通常，治疗性核酸(例如，mRNA)可以被包封在颗粒的脂质部分中，从而保护它免于酶促降解。
术语“脂质包封的”意指提供治疗性核酸(诸如具有完全包封、部分包封或两者的mRNA)的脂质颗粒。在一个优选的实施方案中，核酸(例如，mRNA)被完全包封在脂质颗粒中。
术语“脂质缀合物”意指抑制脂质颗粒聚集的缀合的脂质。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物，诸如例如与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，及与神经酰胺缀合的PEG、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺低聚物以及其混合物。PEG或POZ可以直接缀合至脂质，或者可以经由接头部分连接到脂质。可使用适于将PEG或POZ偶联至脂质的任何接头部分，包括例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施方案中，使用不含酯的接头部分，诸如酰胺或氨基甲酸酯。
术语“两亲脂质(amphipathic lipid)”或“两亲性脂质(amphiphilic lipid)”意指其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相的材料。亲水性特征源于极性或带电荷基团，诸如碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团的存在。疏水性可通过纳入非极性基团来赋予，该非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基以及此类被一个或多个芳族、脂环族或杂环基团取代的基团。两亲化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。
术语“信使RNA”(mRNA)是指编码目标蛋白质或多肽并且能够被翻译从而在体外、体内、原位或离体产生所编码的目标蛋白质或多肽的任何多核苷酸。
术语“修饰的”是指本公开的分子的经改变的状态或结构。分子可以通过多种方式(包括从化学上、从结构上和从功能上)进行修饰。在一个实施方案中，本公开的mRNA分子通过引入非天然核苷和/或核苷酸来加以修饰，例如当本公开的mRNA分子涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。非典型核苷酸诸如帽结构不被认为是“经修饰的”，尽管它们与A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构不同。
术语“核苷酸”意指本领域熟知的天然碱基(标准)和经修饰碱基。此类碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸根基团。核苷酸在糖、磷酸根和/或碱基部分处可以是未经修饰的或经修饰的，(也可互换地称为核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见例如，Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等人，国际PCT公布号WO 92/07065；Usman等人，国际PCT公布号WO 93/15187；Uhlman&Peyman，同上，所有这些专利都在此以引用的方式并入)。如Limbach等人，Nucleic Acids Res.22:2183,1994所总结，本领域已知有几个经修饰的核酸碱基的实例。可引入到核酸分子中的碱基修饰的一些非限制性实例包括：肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等人,Biochemistry 35:14090,1996；Uhlman&Peyman,同上)。在这个方面，“经修饰的碱基”意指除1'位置处的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸碱基或它们的等效物。
术语“开放阅读框”或“ORF”是指能够编码目标多肽的核酸序列(DNA或RNA)。ORF经常以起始密码子ATG开头，并且以无义密码子或终止密码子或信号结尾。
术语“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸材料，诸如向干扰RNA的一个或多个末端或者内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加非核苷酸材料。本公开的RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子，包括siRNA、反义RNA、单链RNA、微小RNA、mRNA、非编码RNA和多价RNA。
术语“靶细胞”是指任一种或多种目标细胞。该细胞可以在体外、体内、原位或生物体的组织或器官中发现。生物体可以是动物，优选哺乳动物，更优选人并且最优选患者。
术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用并且/或者引发期望的生物学和/或药理学作用的任何剂。
术语“单体”是指可以与相同或不同类型的另一分子联接从而形成寡聚体的单个单元，例如单个核酸。在一些实施方案中，单体可以是解锁核酸，即UNA单体。
术语“中性脂质”意指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的脂质种类。在生理pH下，此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”意指两亲脂质或中性脂质或阴离子脂质并且在本文中有描述。
术语“寡聚体”可与“多核苷酸”互换使用，并且是指包含至少两个单体的分子并且包括寡核苷酸诸如DNA和RNA。在寡聚体包含RNA单体和/或解锁核酸(UNA)单体的情况下，本公开的寡聚体可以含有除编码序列(CDS)之外的序列。这些额外的序列可以是非翻译序列，即不被宿主细胞转化为蛋白质的序列。这些非翻译序列可包括5'帽、5'非翻译区(5'UTR)、3'非翻译区(3'UTR)和尾区，例如聚-A尾(poly-A tail)区。如本文进一步详细描述的，这些非翻译序列中的任何一个都可以含有一个或多个UNA单体——这些UNA单体不能被宿主细胞的机制翻译。在本公开的上下文中，“mRNA序列”、“mRNA序列”、“可翻译的多核苷酸”或“可翻译的化合物”是指包含能够转化为蛋白质或其片段的区(例如RNA的编码区)的序列。
术语“可翻译”可与术语“可表达”互换使用，并且是指多核苷酸或其一部分被宿主细胞转化为多肽的能力。如本领域所理解的，翻译是其中细胞的细胞质中的核糖体产生多肽的过程。在翻译过程中，信使RNA(mRNA)被核糖体复合物中的tRNA解码以产生特定的氨基酸链或多肽。此外，当在本专利说明书中提及寡聚物时，术语“可翻译”意指寡聚物的至少一部分，例如寡聚物序列的编码区(也称为编码序列或CDS)能够转化为蛋白质或其片段。
术语“翻译效率”是指体外或体内mRNA序列翻译的蛋白质或多肽产生的量度。[0080]本公开提供了一系列mRNA序列分子，该mRNA序列分子可以含有一个或多个UNA单体，以及许多核酸单体，其中mRNA序列可以是可表达的以提供多肽或蛋白质。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者中足以治疗该感染、疾病、病症和/或疾患，改进该感染、疾病、病症和/或疾患的症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或疾患，以及/或者延迟该感染、疾病、病症和/或疾患的发作的结果。
实施例
在以下实施方案中进一步详细说明了本公开的另外实施方案，这些实施方案不以任何方式意在限制权利要求的范围。
实施例1：大RNA包封的脂质纳米颗粒制造
RNA和脂质赋形剂溶解
该实施例概述了用于LNP包封的大RNA产生的一些一般条件。将脂质赋形剂(可电离阳离子脂质/阳离子脂质:磷酸根脂质:胆固醇:PEG-脂质)称重并且在40℃下溶解在200标准烈度乙醇(proof ethanol)中(摩尔比为50：X：48.5-X：1.5，X＝7、10或13)中至完全溶解，溶解时间不超过4小时。可见溶解后，将溶液温度平衡至室温，然后将溶液通过0.2μm聚醚砜(PES)过滤器过滤到带夹套的玻璃或不锈钢容器中。该阶段的标称脂质浓度为5-125mg/mL。
将RNA在5mM含有0-300mM NaCl的柠檬酸盐pH 4.0缓冲液中稀释。然后通过0.2μmPES过滤溶液。该阶段大RNA的浓度为约0.096-0.765mg/mL。
通过T形不锈钢混合模块进行的纳米颗粒形成
通过经由T形不锈钢混合模块(“T模块”)以受控速率混合脂质的乙醇溶液和RNA水溶液来形成包封有大RNA的脂质纳米颗粒。该混合包括使乙醇溶液和水溶液流入由垂直联接到第一管的第二管组成的混合模块中。产生包含两种溶液混合物的输出溶液，该输出溶液在原始RNA流的方向上流动。
将总脂质与mRNA的重量比设置为约35.88:1，但是该重量比可根据所使用的大RNA的确切尺寸和所需的脂质组成而变化。本领域技术人员将理解，本文描述的工艺适用于脂质组合物，该脂质组合物包含任何合适的摩尔比和重量比的脂质与RNA的任何合适的组合。使用高压活塞泵(Knauer)控制每种溶液的添加速率，其中脂质和mRNA溶液分别以30-75和90-225mL/min的流速添加。该两股流以120-300mL/min的总流速汇聚在不锈钢混合模块中。在高压活塞泵中使用Peek管道，对于RNA流，使用0.03-0.08英寸ID，而对于脂质流，使用0.01-0.03英寸ID。
纳米颗粒形成多入口涡旋混合器
通过经由多入口涡旋混合器(MIVM，荷兰)以受控速率混合脂质乙醇溶液与RNA水溶液来形成包封有大RNA的脂质纳米颗粒。
总脂质与mRNA的重量比为35.88:1。使用HPLC泵控制每种溶液的添加速率，其中脂质和mRNA溶液分别以每股流20-50mL/min的流速添加。该四股流以80-200mL/min的总流速汇聚在不锈钢混合模块中。在高压活塞泵中使用Peek管道，对于RNA流，使用0.02-0.8英寸ID，而对于脂质流，使用0.01-0.03英寸ID。
通过逐步稀释进行的纳米颗粒稳定化
将如此形成的纳米颗粒通过用缓冲液连续在线稀释来稳定化：首先用以80-600mL/min流速进料的45mM磷酸盐pH 6.5缓冲液稀释，然后用以240-2700mL/min流速进料的50mM HEPES或Tris、50mM NaCl、9％(w/v)蔗糖pH 8.0缓冲液稀释。
浓缩和缓冲液更换
通过使用具有100kDa MWCO的改性PES中空纤维膜的切向流过滤将如上所述获得的经稀释的纳米颗粒配制物浓缩并且针对50mM HEPES/20mM Tris，50mM NaCl，9％(w/v)蔗糖pH 8.0缓冲液进行渗滤。该工艺步骤确保了乙醇去除和缓冲液更换。将浓缩和渗滤期间配制物的温度维持在16至25℃。一旦通过Alco-Screen酒精测试条分析确认了乙醇去除，然后就将浓缩的溶液通过0.2μm PES过滤器过滤到玻璃瓶中，以去除潜在的较大颗粒和微生物污染物。收集这种经过滤的大体积产品的样本用于过程中RNA浓度分析。将该大体积产品储存在2℃至8℃下直至浓度调节。
浓度调节、灌装和冷冻
通过添加含有甘油的50mM HEPES/20mM Tris，50mM NaCl，9％(w/v)蔗糖pH 8.0缓冲液将配制物中的RNA浓度调节至0.2mg/mL的目标浓度，使得缓冲液中的甘油的最终浓度为6.3％(w/v)。
浓度调节后，将经调节的大体积产品通过0.2μm PES灭菌级(sterilizing-grade)过滤器过滤到无菌收集容器中。
将该产品无菌灌装到2mL I型硼硅酸盐玻璃小瓶中的1mL灌装容量(0.2mL溢出)中，塞好并且盖好。所有小瓶都使用冷冻干燥机以每分钟0.5℃的受控速率冷冻至≤-55℃，或直接冷冻在-70℃。将小瓶储存在维持在-70±10℃的冰箱中。
浓度调节、LYO辅料添加、灌装和冻干
通过添加含有适当LYO赋形剂的50mM HEPES/20mM Tris，50mM NaCl，9％(w/v)蔗糖pH 8.0缓冲液将配制物中的RNA浓度调节至0.1-0.2mg/mL的目标浓度，然后可在冻干过程之前或直接冻干之前储存在2-8℃、-20℃-70±10℃。
动态光散射
通过在Malvern Zetasizer Nano ZS(英国)上的动态光散射测量实施例中使用的脂质纳米颗粒配制物的平均粒度(z)和多分散指数(PDI)。
RiboGreen测定
使用RiboGreen荧光测定法表征脂质纳米颗粒配制物的包封效率。RiboGreen是一种用于检测和定量核酸(包括RNA和DNA两者)的专有荧光染料(Molecular Probes/Invitrogen，其是Life Technologies的一个部门，现在是美国俄勒冈州尤金的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)的一部分)。RiboGreen在其游离形式下表现出很少的荧光并且具有可忽略的吸光度特征。当与核酸结合时，该染料发出具有比未结合形式高几个数量级的强度的荧光。然后可以通过传感器(荧光计)检测荧光，并可对核酸进行定量。
可接受的LNP理化特性
如以下实施例中所述的那样进行了进一步的实验，以评价各种试剂、工艺参数和仪器配置对LNP包封的大RNA配制物的质量的影响。这些配制物的质量是通过分析配制物的可接受粒度(Z或Z平均值)、多分散性(PDI)和包封效率(包封％)来评估的。筛选测试的各种组合物是否满足特性阈值，该特性阈值包括可接受的粒度(小于150nm，但最优选小于120nm)、PDI(<0.2)和高包封效率(>85％)。
实施例2：包含大RNA的LNP-初始研究
在初始运行中，使用Precision Nano Assembler(台式配制物系统，PrecisionNanosystems,Inc.,Vancouver,BC,Canada)生成LNP。该组合物包含摩尔比为50:7:41.5:1.5的阳离子脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质。将mRNA在5mM pH 4.0柠檬酸盐缓冲液中稀释。总脂质:RNA重量比为35.2，并且该两个流的总流速为12mL/min，其中EtOH与水的比率为1:3。稀释、纯化和浓缩步骤如实施例1所述，第一次稀释比率为1:2，并且第二次稀释比率为1:3。比较典型的小核苷酸序列和大核苷酸序列的初步结果如下表1所示。
表1
如从表1可看出，使用相同的过程，包封较大的RNA会导致较大的粒度，以及较高的多分散性(PDI)和较低的包封效率百分比(包封％)。
实施例3：添加盐的效果
在该实施例中，使用在柠檬酸盐缓冲液中的NaCl时观察到包封有大RNA的脂质纳米颗粒的质量提高。组合物、配制物模块和mRNA与实施例2中描述的相同。结果总结于下表2中。
在下表中，“[脂质IP]mM”是在不稀释的情况下混合两个流后总脂质的过程中浓度。
表2
通过这些工艺改进，选择含有10mM NaCl的pH 4.0柠檬酸盐缓冲液进行进一步开发，因为pH 4.0缓冲液还维持了更好的mRNA纯度和完整性。
在柠檬酸盐缓冲液中添加盐的效果在所有的配制物组成和不同的大自复制型RNA中都适用。还发现这种缓冲组合物易于转移到中等规模的配制系统，包括使用多入口涡流混合器。然而，缓冲液组合物尚不适合大规模配制系统，诸如那些使用T形混合模块的系统。这些进一步的结果总结在下表3-5中。
对于本实施例中使用多入口涡旋混合器的配制物，该四股流如实施例1所述以120mL/min的总流速汇聚在不锈钢混合模块中，其中脂质:RNA的流速比为1:3。对于高压活塞泵，使用Peek管道，其中对于RNA流，使用0.03英寸的ID，而对于脂质流，使用0.01英寸的ID。稀释比率为1:2和1:3，并且纯化和浓缩步骤如实施例1中所述。
对于使用本实施例中的可缩放T模块的配制物，该两股流如实施例1所述以300mL/min的总流速汇聚在不锈钢混合模块中，其中脂质:RNA的流速比为1:3。在高压活塞泵中使用Peek管道，其中对于RNA流，使用0.03英寸的ID，而对于脂质流，使用0.01英寸的ID。如实施例1中所述进行纯化和浓缩步骤。
表3
表4
表5
实施例4：第一稀释缓冲液的盐添加和pH的效果
为改进工艺，对第一次稀释缓冲液(45mM磷酸盐缓冲液)的盐添加和pH进行了评价。使用Precision Nano Assembler时，配制物组成和工艺如实施例2中所述。
如表6所示，在磷酸盐缓冲液中添加NaCl并没有进一步提高LNP质量，导致大粒度，以及较高的多分散性(PDI)和较低的包封效率百分比(包封％)。
表6
进行了进一步的评价，包括磷酸盐缓冲液的pH变化。基于该配制物中可电离阳离子脂质的pKa(～6.4)选择6.5的pH。这种变化显著提高了脂质纳米颗粒的包封效率，如表7所示。在该配制物中使用了可电离阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEG-DMG2000＝50:13:35.5:1.5摩尔比的组合物。
表7
实施例5：流速在MIVM和T-模块系统中的影响
在该实施例中使用总脂质:RNA重量比率为约35.78:1的可电离阳离子脂质:DSPC:CHOL:PEG-DMG2000＝50:10:38.5:1.5摩尔比的组合物。使用荧光素自复制型RNA(构建体编号pARM2807，9693nt)。MIVM系统和T-模块系统的配制过程分别如实施例3所述。
令人惊讶的是，对于MIVM系统和配制模块系统两者来说，较低的流速对于包封有大RNA的配制物的效果更好。流速越低，粒度(Z-平均值)和PDI越小，并且包封％越高。(如表8和表9所示)。为了努力获得可接受的制造速度和可接受的LNP质量两者，为MIVM系统选择100ml/min并且为T-模块系统选择160ml/min进行进一步开发。
表8
表9
本实施例中的发现与对如表10中所示的包封有小RNA的脂质纳米颗粒配制物观察到的结果相反。更高的流速为包封有小RNA的脂质纳米颗粒提供了更小的粒度和更低的PDI。对于具有表10中包封有小RNA的LNP的结果的工艺，使用具有23nt长度的siRNA。
表10
实施例6：在可缩放的MIVM和配制模块系统中进行的包封有大RNA的脂质纳米颗粒制造
通过实施例2-5中提到的所有改进，开发了LNP包封的大RNA(荧光素自复制型RNA，pARM2807，9693nt；和另一种自复制型RNA，11,665nt)在整个可缩放的配制系统(MIVM和T-模块)中的配制工艺，并且其适用于不同的组合物(表11)。除非另外指出，否则本实施例中的配制条件和工艺如前面的实施例所述。
表11
为了满足制造要求，测试了用于连续制造的全在线设置的可能性。在第1次和第2次稀释之间使用长管道来延长两次稀释之间的保持时间。这是基于从前面的实施例中学到的知识。如表12所示，包封有大RNA的LNP的质量不受全在线设置的影响。
表12
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实施例7：通过MIVM和T-模块配制系统进行的包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺放大
实施例6中描述的配制工艺被证明非常适用于包封有大RNA的脂质纳米颗粒制造，但批量体积和制造速率表明需要进一步改进。在本实施例的实施方案中，采用了多种方法来实现该目标。
除非另外指出，否则本实施例中所有配制物组成、条件和工艺均与实施例6相同。
过程中浓度随着柠檬酸盐缓冲液中的NaCl添加的增加
在这个实施方案中，为了放大目的增加了过程中浓度，并且发现了过程中浓度与柠檬酸盐缓冲液中的NaCl浓度之间的关系(如表13和表14所示)，该发现跨越了不同的制造模块。柠檬酸盐缓冲液中较高的NaCl浓度对于较高的过程中浓度配制物是必要的，并且它提供小粒度、PDI和高包封％。但是一旦达到阈值，就不需要进一步增加较高的NaCl浓度。在柠檬酸盐缓冲液中的适当的NaCl浓度对于包封有大RNA的脂质纳米颗粒制造是需要的，并且这与全线设置兼容，提供了连续大规模制造的可能性。
表13
表14
稀释比率降低以放大
为了进一步减少批量体积，对稀释比率的降低进行了评价。如实施例1中所述，包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺需要两步稀释。在所有前面的实施例中，使用45mM磷酸盐缓冲液进行1:2稀释，并且使用pH 8.0的含50mM NaCl和9％蔗糖的50mM HEPES缓冲液进行1:3稀释。在该实施方案中，在维持经稀释的配制物中适当的乙醇浓度和pH的范围内测试了较低的稀释比率。还测试了纯化过程前8小时的保持时间(TFF)，以确保大规模制造纯化过程期间配制物的稳定性(表15)。
如表15所示，配制物的物理化学性质不受降低工艺稀释比率的影响。保持8小时后，配制物的理化性质也得以维持。在该实施例中，还通过片段分析仪测试了mRNA的纯度和完整性，以确保在制造期间可以维持mRNA的效力。相对于包封前mRNA的纯度和完整性报告了mRNA纯度和完整性。
在12mM脂质[IP]下，在利用含有50mM NaCl的5mM pH 4.0柠檬酸盐缓冲液的情况下，进行1:1.5磷酸盐稀释，然后进行1:2.5HEPES缓冲液稀释，LNP具有良好的质量并且在开始纯化过程(TFF)之前的至少8小时内在物理化学性质和mRNA纯度方面是稳定的，这确保了LNP在制造过程期间的稳定性。
表15
实施例8：用于包封有大RNA的脂质纳米颗粒制造的管道构造和背压
对于包封有较小RNA的脂质纳米颗粒制造，为了提高模块中使用的高压活塞泵的背压，常常使用较小的管道(0.01英寸ID、0.02英寸ID)。为了避免RNA流的脉动，经常在连接peek管道和混合模块的管道上使用夹钳。该实施例显示了使用实施例7中开发的制造工艺，但为RNA流使用0.02英寸ID peek管道并且在peek管道和T-模块之间的管道上使用夹钳时的故障点。之后，对管道构造和背压的影响进行了评价(表16)在本实施例中，除非另外提到，否则所有配制物组成、条件和工艺都与实施例7相同。
表16
如表16所示，当在制造期间为RNA流使用0.02英寸的peek管道并且为脂质流使用0.01英寸的管道时，粒度和PDI出人意料地较高，而包封％出人意料地低。为了了解哪条管线造成了该差异，探究设置：RNA0.03(50cm)；脂质：0.01(30cm)被使用并且产生良好质量的LNP。比较这3种设置，结果清楚地表明RNA流管道对LNP质量有重要影响。但是，不知道是管道ID、高压还是两者都是原因。
因此，进行了一组具有不同RNA流管道长度和尺寸的测试(表17)。结果表明，使用0.02英寸管道时，LNP质量会受到影响，即使对于极短长度也是如此。
表17
进行了进一步探究，结果如表18所示。移除夹钳对配制物有利。然而，当对这两条管线都使用0.03英寸ID管道并且在RNA管线中使用长管道(90cm)以避免脉动时，结果并不理想。当使用中等长度的管(48cm)时，在通过混合模块的RNA管线中使用夹钳来维持背压，同时与用于脂质流的较小管道(0.01英寸ID)组合地混合对配制物有利。约70psi的压力对于配制是安全的。
表18
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实施例9：实施例1-8的发现的可能机制
根据以上所有发现，在本实施例中讨论了一种可能的机制。由于所有这些发现仅适用于大RNA(～6000-13000nt)，并且包封有大RNA的脂质纳米颗粒的质量受柠檬酸盐缓冲液中的RNA浓度、柠檬酸盐缓冲液中的NaCl浓度、RNA+柠檬酸盐流的管道尺寸和RNA流的流速的影响。一个假设是大RNA(～6000-13000nt)对剪切应力和剪切速率更敏感。
这些发现可以使用下面的公式来解释：
剪切速率：
体积流速Q；内管半径r。
剪切应力：对于牛顿流体壁，剪切应力(τw)可以通过τW＝γXμ与剪切速率相关，其中μ是流体的动态粘度。因此，剪切应力将随着剪切速率或动态粘度的增加而增加。反过来，剪切速率与内管半径成反比，而动态粘度将受到缓冲液和流体条件以及RNA尺寸的影响。
如本领域技术人员将理解的，可以评价流体的进一步动态粘度和计算。
实施例10：包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺的进一步改进和放大
在本实施例中，除非特别指出，否则所有配制条件和工艺与实施例7相同，RNA流的peek管道尺寸的ID在本实施例中为0.04英寸。
利用来自实施例1-9的知识，通过设计实现了进一步的改进。在这一成果中，批量体积大大减小，并且制造率大大提高，包封有大RNA的脂质纳米颗粒的质量得到提高。当总流速足够高(300ml/min)时，可以仅在RNA流上应用夹钳以避免脉动。RNA流上的压力为～80psi被证明是一个安全条件，但高于100psi将会对脂质纳米颗粒的质量产生不利影响。
表19和表20示出了基于通过实施例1-9得到的知识的设计对包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺的显著改进。LNP质量保持良好，批量体积因增加的流速、柠檬酸盐缓冲液中的NaCl浓度和RNA流管道ID的组合而显著减小。在总流速为300ml/min时，不需要RNA流的夹钳。
表19
表20
实施例11：在另一个缓冲体系中的包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺的进一步改进和放大
包封有冻干RNA的LNP的生产对于提供在某些环境中具有稳定性的药物产品很重要。冻干过程的一部分涉及制备LNP在适当基质中的悬浮液。美国申请号17/402,077描述了冻干脂质纳米颗粒包封的RNA的方法，并且通过引用并入本文。为了开发包封有冻干大RNA的脂质纳米颗粒药物产品，基于来自实施例1-10的学识开发了在Tris缓冲体系中的包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺。配制条件和工艺设置与实施例10相同，全在线设置在15秒至25秒的保持时间内。唯一的差异是第二稀释缓冲液是pH为8.0的含有50mM NaCl和9％蔗糖的50mM Tris，而渗滤缓冲液是pH为8.0的含有50mM NaCl和9％蔗糖的20mM Tris。(表21)
来自实施例1-10的所有知识都适用于Tris缓冲体系配制。
表21
实施例12：包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺的稀释和最终确认期间的EDTA添加
在本实施例中，除非另有说明，否则所有配制条件和工艺设置均与实施例11相同。本实施例中测试了在第二次稀释期间添加EDTA和在渗滤期间去除EDTA的效果，并且最终高度放大的制造工艺被确认为：脂质IP浓度为28mM，第一次和第二次稀释之间的保持时间为20秒，稀释比率为1:1.5、1:2，添加或不添加EDTA以生产高质量的包封有大RNA的脂质纳米颗粒。(表22)
表22
实施例13：包封有大RNA的脂质纳米颗粒的制造工艺改进对体内功效的影响
在这个实施方案中，图4显示不仅包封有大RNA的脂质纳米颗粒物理化学特性通过使用本文所述的放大工艺得到很好的维持和改进，而且体内功效也得到维持和改进。表23示出了这两种工艺的制造差异，除了表23中所述的以外，所有配制条件和其他工艺设置与实施例7相同。
在这个实施方案中，将50μl含有编码COVID刺突蛋白的RNA的包封有大RNA的脂质纳米颗粒肌肉内注射到Balb/c小鼠的双腿上，以给予如图4所述的剂量。每组五只小鼠。40天后，采集血清，并使用Luminex测定法(一种基于珠粒的多重免疫测定系统)以微板格式进行测试，以检查COVID刺突蛋白抗体的表达水平。
表23
进一步的考虑
提供前述描述是为了使本领域技术人员能够实践本文描述的各种构造。可能有许多其他方式来实现主题技术。在不脱离本主题技术的范围的情况下，本文描述的各种功能和元件可以与所示的那些不同地划分。对这些构造的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且本文定义的一般原理可以应用于其他构造。因此，本领域的普通技术人员可以在不脱离主题技术的范围的情况下对主题技术进行许多改变和修改。
尽管具体实施方式含有许多细节，但这些不应被解读为限制主题技术的范围，而仅仅是说明主题技术的不同实例和方面。应当理解，主题技术的范围包括上面未详细讨论的其他实施方案。可以在不脱离本公开的范围的情况下对本文公开的主题技术的方法和装置的布置、操作和细节进行各种其他修改、改变和变化。此外，设备或方法不必解决本公开的不同实施方案可解决的每一个问题(或具有可实现的每一个优点)以便被涵盖在本公开的范围内。“可以”及其派生词在本文的使用应在“可能”或“任选地”的意义上理解，而不是肯定的能力。

Claims (34)

1.一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使包含RNA的水溶液流过具有约0.01英寸至约0.08英寸的内径(ID)的第一管；其中所述水溶液的pH在约3.0至约4.5的范围内，任选的NaCl浓度高达约300mM；
其中所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；
b)使包含脂质的乙醇溶液以通过所述第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有约0.01英寸至约0.04英寸的ID的第二管，其中所述脂质包括阳离子脂质；和
c)将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；
其中所述混合产生在所述第一管中流动的输出溶液，所述输出溶液包含在约10％至75％乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；和
其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
2.一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；
其中所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；
b)使包含脂质的乙醇溶液以通过第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，其中所述脂质包括阳离子脂质；和
c)将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；
其中所述第一ID和第二ID以及通过所述第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以产生保持所述RNA的完整性的剪切力；
其中所述混合产生在所述第一管中流动的输出溶液，所述输出溶液包含在约10％至75％之间的乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；和
其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合包括使所述乙醇溶液和所述水溶液流入由垂直联接到所述第一管的第二管组成的混合模块中。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合包括使所述乙醇溶液和所述水溶液流入多入口涡流混合器中。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水溶液中的RNA浓度在约85微克/mL至约2100微克/mL的范围内。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述乙醇溶液中脂质的浓度在约5.0mg/mL至约125mg/mL的范围内。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述水溶液由具有不超过约200psi的背压的第一泵通过所述第一管泵送，并且所述乙醇溶液由第二泵通过所述第二管泵送。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有在约0.02英寸至约0.03英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.02英寸的范围内的ID。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有约0.02英寸的ID并且所述第二管具有约0.01英寸的ID。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有约0.03英寸的ID并且所述第二管具有约0.01英寸的ID。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述第一管具有在约0.01英寸至约0.08英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.04英寸的范围内的ID。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述第一管具有在约0.02英寸至约0.03英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.02英寸的范围内的ID。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中以约40mL/min至约375mL/min范围内的流速泵送所述水溶液。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中以约10mL/min至约75mL/min范围内的流速泵送所述乙醇溶液。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述输出溶液的总流速在约120mL/min至约300mL/min的范围内。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述水溶液、乙醇和输出溶液维持在约10℃至约25℃的温度范围内。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法进一步包括泵送第一稀释缓冲液并且通过将所述稀释缓冲液引入到所述输出溶液中来将所述稀释缓冲液与所述输出溶液混合以产生第一经稀释输出溶液。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括将第二稀释缓冲液泵送到所述第一经稀释输出溶液中，从而形成最终经稀释输出溶液，其中在泵送所述第一稀释缓冲液和第二稀释缓冲液之间存在延迟。
19.权利要求18所述的方法，其中所述延迟为约0.1至约30秒，并且所述延迟由一定长度的管道产生。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述第一稀释缓冲液包含：
a)具有约5.5至约7.0的pH的缓冲剂；和
b)任选的高达约100mM的氯化钠浓度。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述第二稀释缓冲液包含
a)pH介于约7.4和8.0之间的缓冲剂；和
b)任选的高达约100mM的氯化钠浓度。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲液包含至多约15％w/v的蔗糖。
23.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲液包含至多约0.5％w/v的抗氧化剂。
24.如权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲液包含至多20mM的螯合剂。
25.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述第一经稀释输出溶液包含约1.0％至约10.0％乙醇。
26.如权利要求17至25中任一项所述的方法，其中以约80mL/min至约900mL/min的流速泵送所述第一稀释缓冲液。
27.如权利要求18至26中任一项所述的方法，其中以约240mL/min至约5400mL/min的流速泵送所述第二稀释缓冲液。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述阳离子脂质具有式I的结构：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
R5和R6各自独立地选自由直链或支链C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和胆固醇基组成的组；
L5和L6各自独立地选自由直链C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
X5为-C(O)O-或-OC(O)-；
X6为-C(O)O-或-OC(O)-；
X7为S或O；
L7不存在或为低级烷基；
R4为直链或支链C1-C6烷基；以及
R7和R8各自独立地选自由氢和直链或支链C1-C6烷基组成的组。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有在约50nm至约120nm范围内的平均粒度。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有在约70nm至约90nm范围内的平均粒度。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述多分散性脂质包封的RNA纳米颗粒不超过约0.2。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒的脂质部分进一步包含一种或多种选自由辅助脂质、胆固醇和PEG脂质缀合物组成的组的剂。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述RNA是自复制型RNA。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其进一步包括冻干所述最终经稀释输出溶液。
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