CN116490205A - 使用沙粒病毒载体的癌症治疗策略 - Google Patents
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Abstract
本申请整体涉及使用沙粒病毒颗粒的癌症治疗策略。本文所述的治疗策略用于使用编码人乳头瘤病毒(HPV)抗原的三区段沙粒病毒颗粒来治疗癌症，包括头颈部鳞状细胞癌。本文所述的治疗策略能够包括施用免疫检查点抑制剂。
Description
本申请要求2020年5月29日提交的美国序列号63/032,362、2021年4月9日提交的美国序列号63/173,155和2021年4月16日提交的美国序列号63/175,842的优先权权益，这些申请中的每一者全文以引用方式并入本文。
本申请整体涉及使用沙粒病毒颗粒的癌症治疗策略，并且更具体地涉及用于使用编码HPV抗原的三区段沙粒病毒颗粒治疗包括头颈部鳞状细胞癌的癌症的特定治疗策略，以及在某些方面涉及免疫检查点抑制剂的施用。
背景技术
人乳头瘤病毒16(HPV16)感染与世界范围内大量且不断上升的癌症比例相关，如宫颈癌、头颈癌、阴道癌和肛门癌(参见de Martel C等人，Int J Cancer.2017；141：664-670)。针对HPV16+复发性或转移性癌症患者的治疗选择有限，并且长期存活的可能性很低。HPV16+恶性状态的产生和维持需要HPV16特异性E7和E6致癌基因的稳定表达，这些致癌基因已被证明驱动细胞转化为癌细胞(参见Schmidt S等人.Oncoimmunology.2020；9(1)：1809960；Dong Z等人Front Immunol.2021；11：586796)。因此，HPV16特异性E7和E6可以作为免疫原性肿瘤相关抗原。本文描述的方法满足治疗HPV16感染的需求并提供相关优点。
发明内容
本文提供了用于治疗有需要的患者的癌症的方法。此类方法包括向患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。沙粒病毒颗粒的有效量可为约5x105、约5x106、约5x107、约1x108或约5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
在一些实施方案中，本文提供的用于治疗癌症的方法包括治疗HPV 16+癌症，无论起源如何。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为肛门癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为宫颈癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为阴道癌。在一些实施方案中，该HPV16+癌症已被诊断为外阴癌。
在一些实施方案中，该患者在该方法之前用至少一种标准护理疗法时具有肿瘤进展或复发。在一些具体实施方案中，该至少一种标准护理疗法包括帕博利珠单抗单一疗法。在其他实施方案中，该患者仅在淋巴结中具有靶病变。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用静脉内注射、瘤内注射或它们的组合施用工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，本文描述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括静脉内注射。在一些实施方案中，本文描述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括瘤内注射。在一些实施方案中，本文所述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括瘤内注射，接着是静脉内注射。
在一些实施方案中，静脉内注射以每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次或每8周一次的频率施用。
在一些实施方案中，静脉内注射是持续的或施用有限数量的周期。在具体实施方案中，该有限数量的周期为两个、三个、四个、五个或六个。在其他具体实施方案中，施用有限数量的周期的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的有效量比持续的静脉内注射中使用的有效量多一个对数级。在其他实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以较高的频率施用，接着以较低的频率施用。在具体实施方案中，静脉注射是持续的，并且首先以每3周一次的频率施用，接着以每6周一次的频率施用。在一个实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每3周一次的频率施用4个周期，接着以每6周一次的频率施用后续周期。在其他具体实施方案中，静脉注射是持续的，并且首先以每4周一次的频率施用，接着以每8周一次的频率施用。在一个实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每4周一次的频率施用4个周期，接着以每8周一次的频率施用后续周期。在另外的实施方案中，工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括瘤内注射。
在一些实施方案中，本文提供的方法还可以包括施用有效量的免疫检查点抑制剂。特别适用于本文所述方法的示例性免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)检查点抑制剂。此类抗PD-1检查点抑制剂可以是抗体，诸如纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)或西米普利单抗(cemiplimab)。
在一些实施方案中，本文提供的方法使用包含如本文所述的构建体1的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。在一些实施方案中，工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV，包括MP毒株、WE毒株、Armstrong毒株、Armstrong克隆13毒株、或表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。在一个实施方案中，构建体1的有效量为约5x106个RCV FFU，并且构建体1以每3周一次的频率施用。
在一些实施方案中，本文提供的方法使用包含如本文所述的构建体2的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。在一些实施方案中，工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自皮钦德病毒(Pichinde virus，PICV)，包括Munchique CoAn4763分离株P18、P2毒株、或Trapido及其同事描述的几种分离株中的任一种(Trapido等人，1971，Am J TropMed Hyg，20：631-641)。
在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中细胞因子或趋化因子水平的变化。在一些具体实施方案中，细胞因子和趋化因子包括IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα。
在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些具体实施方案中，HPV16 E7/E6特异性T细胞对CD8、IFN-γ、TNFα和/或CD107a呈阳性。在其他实施方案中，检测上述T细胞无需预先体外刺激和/或扩增。在其他实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，该方法导致更多的T细胞浸润到肿瘤组织中。
在一些实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，该方法使用实体瘤响应评价标准(RECIST)和/或实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)产生一个或多个改善的功效终点。在一些具体实施方案中，该一个或多个改善的功效终点包括较高百分比的客观响应率、较高百分比的疾病控制率、较高百分比的部分响应、较长的无进展生存期和/或较长的总生存期。
本文还提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括：(i)向该患者施用有效量的包含编码源自第一沙粒病毒种的HPV16E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，并且其有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)向该患者施用有效量的包含编码源自第二沙粒病毒种的HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，并且其有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个RCV FFU。
在一些实施方案中，本文提供的方法还包括重复(i)和/或(ii)。在一些实施方案中，(i)中的沙粒病毒种为LCMV，并且(ii)中的沙粒病毒种为PICV。在其他实施方案中，(i)中的沙粒病毒种为PICV，并且(ii)中的沙粒病毒种为LCMV。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的包含编码源自第一沙粒病毒种的人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的包含编码源自第二沙粒病毒种的HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个RCV FFU。在一些实施方案中，(i)中的第一沙粒病毒种为淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，并且(ii)中的第二沙粒病毒种为皮钦德病毒(PICV)。在其他实施方案中，(i)中的第一沙粒病毒种为PICV，并且(ii)中的第二沙粒病毒种为LCMV。
在一些实施方案中，本文提供了一种包括一个或多个疗程的方法，其中每个疗程包括：(i).向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCVFFU；以及(ii).在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，(i)和(ii)中的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括静脉内注射。在一些具体实施方案中，每个疗程持续4周、6周、8周、10周、12周、14周或16周。
在一些实施方案中，本文提供的用于治疗癌症的方法包括治疗HPV 16+癌症，无论起源如何。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为肛门癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为宫颈癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为阴道癌。
在一些实施方案中，该患者在该方法之前用至少一种标准护理疗法时具有肿瘤进展或复发。在一些具体实施方案中，该至少一种标准护理疗法包括帕博利珠单抗单一疗法。在其他实施方案中，该患者仅在淋巴结中具有靶病变。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用静脉内注射、瘤内注射或它们的组合施用工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，本文描述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括静脉内注射。在一些实施方案中，本文描述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括瘤内注射。在一些实施方案中，本文所述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的施用包括瘤内注射，接着是静脉内注射。
在一些实施方案中，疗程是持续的或重复有限数量的疗程。在一些具体实施方案中，有限数量的疗程为两个、三个、四个、五个或六个。在一些具体实施方案中，施用有限数量的疗程的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的有效量比持续的疗程中使用的有效量多一个对数级。在一些具体实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以较短的疗程施用，接着以较长的疗程施用。在一些具体实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续6周的疗程施用，接着以每次持续12周的疗程施用。在一个实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续6周的2个疗程施用，接着以每次持续12周的疗程施用。在一些具体实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续8周的疗程施用，接着以每次持续16周的疗程施用。在一个实施方案中，静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续8周的2个疗程施用，接着以每次持续16周的疗程施用。
在一些实施方案中，该方法还包括在静脉内注射之前的瘤内注射。在具体实施方案中，瘤内注射在静脉内注射前3周施用。在其他具体实施方案中，瘤内注射是施用构建体1。
在一些实施方案中，本文提供的方法还可以包括施用有效量的免疫检查点抑制剂。特别适用于本文所述方法的示例性免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)检查点抑制剂。此类抗PD-1检查点抑制剂可以是抗体，诸如纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗或西米普利单抗。
在一些实施方案中，本文提供的方法使用包含如本文所述的构建体1的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。在一些实施方案中，工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV，包括MP毒株、WE毒株、Armstrong毒株、Armstrong克隆13毒株、或表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。
在一些实施方案中，本文提供的方法使用包含如本文所述的构建体2的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。在一些实施方案中，工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自PICV，包括Munchique CoAn4763分离株P18、P2毒株、或Trapido及其同事描述的几种分离株中的任一种(Trapido等人，1971，Am J Trop Med Hyg，20：631-641)。
在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中细胞因子水平或趋化因子水平的变化。在一些具体实施方案中，细胞因子和趋化因子包括IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα。
在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些具体实施方案中，HPV16 E7/E6特异性T细胞对CD8、IFN-γ、TNFα和/或CD107a呈阳性。在其他实施方案中，检测上述T细胞无需预先体外刺激和/或扩增。在其他实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，该方法导致更多的T细胞浸润到肿瘤组织中。
在一些实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，该方法使用实体瘤响应评价标准(RECIST)和/或实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)产生一个或多个改善的功效终点。在一些具体实施方案中，该一个或多个改善的功效终点包括较高百分比的客观响应率、较高百分比的疾病控制率、较高百分比的部分响应、较长的无进展生存期和/或较长的总生存期。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中构建体1以每3周一次的频率静脉内施用4个周期，接着以每6周一次的频率施用持续的周期；以及向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个RCV FFU；以及ii在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中构建体1以每3周一次的频率静脉内施用3个周期，并且该方法在3个周期后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文提供了一种包含SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的核酸。
本文还提供了一种包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7或8的核苷酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本文提供的核酸为RNA。
本文提供了一种包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8的核苷酸序列的宿主细胞。
本文提供了一种包含SEQ ID NO：3、4和5的核苷酸序列的三区段LCMV颗粒。
本文还提供了一种包含SEQ ID NO：6、7和8的核苷酸序列的三区段皮钦德病毒颗粒。
本文提供了一种药物组合物，其包含含有SEQ ID NO：3、4和5的核苷酸序列的三区段LCMV颗粒或含有SEQ ID NO：6、7和8的核苷酸序列的三区段皮钦德病毒颗粒以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，包含二核苷酸优化的HPV16 E7E6核苷酸序列的三区段沙粒病毒颗粒在传代至少4、5、6、7、8、9或10代后可具有HPV抗原的稳定表达，可具有编码的HPV融合蛋白的一致表达或诱导针对编码的HPV融合蛋白的强免疫响应。
附图说明
图1示出了HPV癌症负荷和与HPV相关的癌症。
图2A至图2C示出了野生型沙粒病毒(例如，LCMV或PICV)、源自沙粒病毒LCMV或PICV的编码HPV16+E7/E6的非致瘤融合蛋白的有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒、以及复制型三区段沙粒病毒颗粒的减毒模式的示意图。图2A示出了沙粒病毒(LCMV和PICV)野生型颗粒(左)及其基因组(右)。反义RNA基因组编码4种病毒蛋白：GP(糖蛋白)、NP(核蛋白)、L(RNA指导的RNA聚合酶)和Z(RING指蛋白Z)。图2B示出了工程化的三区段沙粒病毒颗粒(构建体1；基于LCMV的载体，构建体2：基于PICV的载体)，其含有编码具有如星号(*)所示的5个氨基酸突变以消除E7和E6的致癌潜力的HPV16 E7/E6的融合蛋白和GP或NP的人工复制的S-区段，以及L-区段。图2C示出了分别与野生型LCMV和PICV相比，3个基因组区段的低效包装导致构建体1和构建体2的减毒。
图3A至图3C示出了图2B的工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒在小鼠中的临床前研究结果。此类颗粒靶向树突细胞和其他抗原呈递细胞，用于以抗原特异性方式刺激免疫系统。工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒诱导特异性针对HPV 16+肿瘤细胞的有效T细胞响应。图3A示出了工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒(构建体1)的免疫原性，其通过静脉内(IV)施用用增加剂量的颗粒免疫的健康小鼠中血液HPV16 E7特异性CD8(CD8+B220-)T细胞的百分比来说明。图3B示出了在IV施用后用增加剂量的工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒处理的携带HPV16+TC-1肿瘤的小鼠中肿瘤生长的动力学。图3C示出了在瘤内(IT)或IV施用后用工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒(构建体1)处理的携带HPV16+TC-1肿瘤的小鼠的生存曲线。
图4示出了治疗研究设计，其包括剂量递增和剂量扩展策略。构建体1＝图2B的工程化的基于LCMV的三区段沙粒病毒颗粒；RP2D＝推荐的II期剂量；HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌；HPV 16＝人乳头瘤病毒16；IV＝静脉内；IT＝瘤内；RCV FFU＝有复制能力的病毒病灶形成单位；抗PD-1＝PD-1免疫检查点抑制剂。
图5示出了1期剂量递增研究的治疗设计。
图6A至图6B示出了用构建体1治疗后不同血清细胞因子或趋化因子标记的结果。图6A示出了在八个时间点上十二名患者的30-plex细胞因子和趋化因子分析的结果。十二名患者中有十名患者的第4天数据可用。将分析物(pg/mL)转化为z评分。按访视日和每个分析物水平进行分级聚类。图6B示出了用构建体1治疗对治疗后4天选择关键细胞因子表达的影响。十二名患者中的九名患者具有来自基线和第4天的两个样品。
图7A至图7F示出了单次施用构建体1或构建体2后循环HPV E6/E7特异性多功能T细胞的结果。图7A示出了从基线到施用单一IV剂量的构建体1或构建体2后第15天斑点形成单位变化的直接IFN-γELISpot分析。图7B示出了用单一IV剂量的构建体1或构建体2治疗的患者中E6/E7特异性T细胞的增加。图7C示出了在针对来自接受一个剂量的构建体1的一名患者的CD8+T细胞设门后CD4+和CD8+在总外周T细胞群中的频率和IFN-γ+、TNF-α+和CD107a+的频率。图7D示出了在针对来自接受一个剂量的构建体1的另一患者的CD8+T细胞设门后CD4+和CD8+在总外周T细胞群中的频率和IFN-γ+、TNF-α+和CD107a+的频率。图7E示出了在针对来自接受一个剂量的构建体2的一名患者的CD8+T细胞设门后CD4+和CD8+在总外周T细胞群中的频率和IFN-γ+、TNF-α+和CD107a+的频率。图7F示出了来自三名患者的每一者的饼图，其表示在单次施用构建体1或构建体2后HPV16 E6/E7特异性CD8+T细胞与三种功能响应标志物(矽CD107a、IFN-γ、TNF-α)的组合的相对频率。
图8示出了根据图2B的构建体1的E7E6-NP-S-区段1(2648bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于LCMV cl13 S-区段(1-78bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；由人乳头瘤病毒16型(HPV 16)蛋白E6和E7(79-846bp)组成的合成融合蛋白以绿色显示；基于LCMV cl13 S-区段(847-910bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于LCMV cl13(911-2587bp)的核蛋白(NP)以灰色显示；基于LCMV cl13 S-区段(2588-2648bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图9示出了根据图2B的构建体1的E7E6-GP-S-区段2(2648bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于LCMV cl13 S-区段(1-78bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；由人乳头瘤病毒16型(HPV 16)蛋白E6和E7(79-846bp)组成的合成融合蛋白以绿色显示；基于LCMV cl13 S-区段(847-910bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于LCMV WE(911-2407bp)的糖蛋白(GP)以黄色显示；基于LCMV cl13 S-区段(2408-2468bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图10示出了根据图2B的构建体1的L-区段(7229bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于LCMV cl13 L-区段(1-89bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；基于LCMVcl13(90-362bp)的基质蛋白(Z)以绿色显示；基于LCMV cl13 L-区段(363-564bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于LCMV cl13(565-7197bp)的核糖核酸依赖性核糖核酸聚合酶蛋白(L)以灰色显示；基于LCMV cl13L-区段(7198-7229bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图11示出了根据图2B的构建体2的E7E6-NP-S-区段1(2663bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于PICV p18 S-区段(1-52bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；由人乳头瘤病毒16型(HPV 16)蛋白E6和E7(53-820bp)组成的合成融合蛋白以绿色显示；基于PICV p18 S-区段(821-894bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于PICV p18(895-2580bp)的核蛋白(NP)以灰色显示；基于PICV p18 S-区段(2581-2663bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图12示出了根据图2B的构建体2的E7E6-GP-S-区段2(2504bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于PICV p18 S-区段(1-52bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；由人乳头瘤病毒16型(HPV 16)蛋白E6和E7(53-820bp)组成的合成融合蛋白以绿色显示；基于PICV p18 S-区段(821-894bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于PICV p18(895-2421bp)的糖蛋白(GP)以黄色显示；基于PICV p18 S-区段(2422-2504bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图13示出了根据图2B的构建体2的L-区段(7058bp)。以下元件从所公开序列的5′至3′指示。基于PICV p18 L-区段(1-85bp)的5′非翻译区(UTR)未突出显示；基于PICV p18(86-373bp)的基质蛋白(Z)以红色显示；基于PICV p18 L-区段(374-443bp)的基因间区域(IGR)以蓝色显示；基于PICV p18(444-7028bp)的核糖核酸依赖性核糖核酸聚合酶蛋白(L)以灰色显示；基于PICV p18 L-区段(7029-7058bp)的3′非翻译区(UTR)未突出显示。
图14A至图14E示出了构建体1和/或构建体2在携带HPV16+肿瘤的小鼠模型中的功效。图14A示出了构建体1的剂量与HPV16E7特异性CD8+B220-T细胞百分比之间的相关性。CD8＝分化簇8，E7＝来自人乳头瘤病毒16的抗原性E7融合蛋白。图14B示出了响应于用不同剂量的构建体1治疗的肿瘤体积随时间的变化；FFU＝病灶形成单位，HPV＝人乳头瘤病毒，RCV＝有复制能力的病毒。图14C示出了与仅用缓冲液处理的对照动物相比，响应于经由不同施用途径(i.v.＝静脉内；i.t.＝瘤内)用构建体1或表达非相关对照抗原GFP的沙粒病毒载体处理的肿瘤体积随时间的变化。E7E6＝来自人乳头瘤病毒16的抗原性E7和E6融合蛋白，G＝组，GFP＝绿色荧光蛋白，i.t.(IT)＝瘤内，i.v.(IV)＝静脉内，n＝每个实验组中的小鼠数量。图14D示出了在以21天间隔静脉内施用105个RCV FFU的每种载体后响应于构建体1和构建体2的指定给药方案小鼠中HPV16 E7特异性CD8+B220-T细胞的百分比随时间的变化。CD＝分化簇，E7E6＝来自人乳头瘤病毒16的抗原性E7和E6融合蛋白，G＝组，破折号指示载体施用的顺序(初免/第1剂量-加强/第2剂量)。图14E示出了在以4、7或10天的间隔静脉内施用105个RCV FFU的每种载体后响应于构建体1和构建体2的指定给药方案肿瘤体积随时间的变化。G＝组，d＝初免和加强施用之间的天数，破折号指示载体施用的顺序(初免/第1剂量-加强/第2剂量)。
图15示出了实施例III中的实验设计，其包括I期剂量递增和II期剂量扩展。Alt.＝交替，Approx＝约，HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌，HPV＝人乳头瘤病毒，IT＝瘤内，IV＝静脉内，n＝患者数量，RP2D＝推荐的II期剂量。
图16示出了实施例III中回填群组的实验设计。
图17A至图17I示出了构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法的功效数据。图17A示出了个体患者的治疗持续时间。治疗时间＝最后一次治疗/死亡日期-第一剂量日期+1；研究者将帕博利珠单抗添加到3名患者的沙粒病毒载体疗法中。由于截至数据传输日期TLF上数据输入缺失/不正确，一些患者使用EDC数据。DL，剂量水平；EDC，电子数据采集；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；IT，瘤内；IV，静脉内；PR，部分响应；Q2W，每2周一次；Q3W，每3周一次。图17B示出了每个个体患者的靶病变(TL)直径总和(SOD)相对于基线的变化。条纹区指示在疗法中添加帕博利珠单抗后靶病变变化减少。#具有非可评价扫描的进展，人为指定为2％。非口咽患者：A，肛门；C，宫颈；NP，鼻咽；V，阴道。IT，瘤内；IV，静脉内；SOD，直径总和；TL，靶病变。Q2W＝每两周一次；Q3W＝每三周一次；DL＝剂量水平。图17C示出了通过施用计划/途径得出的最佳靶病变(TL)直径总和(SOD)相对于基线的变化。Q2W＝每两周一次；Q3W＝每三周一次；DL＝剂量水平；IV＝静脉内；IT＝瘤内。图17D示出了蜘蛛图中每个个体患者的靶病变(TL)直径总和(SOD)相对于基线的变化。空心方块表示在添加帕博利珠单抗后进行的扫描。具有不可评价功效扫描的一名患者未在蜘蛛图上示出。所测量的淋巴结减少60％的靶病变＜10mm，因此未确认完全响应。由于截至数据传输日期TLF上数据输入缺失/不正确，一些患者使用EDC数据。EDC，电子数据采集；HNSCC，头颈部鳞状细胞癌；SOD，直径总和；TL，靶病变；uCR，未确认完全响应。图17E示出了受治疗患者的无进展生存期(PFS)。对于接受帕博利珠单抗的患者，PFS包括在RECIST进展前添加帕博利珠单抗后的时间。图17F示出了在仅具有淋巴结病变的患者中以及在仅具有非淋巴结病变或两者(淋巴结病变以及非淋巴结病变)的患者中靶病变相对于基线的变化。图17G示出了每三周一次接受构建体1剂量水平2的IV施用和构建体2/构建体1交替2-载体疗法的IV施用的患者中RECIST可评价病变的直径变化总和。图17H示出了直径变化的最佳总和与治疗时间之间的相关性。图17I示出了基线和治疗期间后续时间点的功效扫描。
图18A示出了在九个时间点上用构建体1治疗后30-plex细胞因子和趋化因子分析的结果。十二名患者中有十名患者的第4天数据可用。将分析物(pg/mL)转化为z评分。按访视日和每个分析物水平进行分级聚类。图18B示出了用构建体1单一疗法(DL 1(5x105个RCVFFU)或DL2(5x106个RCV))或构建体2/构建体1交替2-载体疗法(构建体2：1x106个RCV FFU，构建体1：5x106个RCV FFU)治疗对治疗后4天选择关键细胞因子表达的影响。
图19A至图191示出了由构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法诱导的强免疫原性。图19A示出了每3周一次以DL2(5x106个RCV FFU)IV接受构建体1的六名患者的ELISpot结果。将来自所有患者的解冻的外周血单核细胞(PBMC)用重叠的HPV16E6/E7肽刺激24h(±2h)，用于直接离体IFN-γELISpot测量。示出了斑点形成单位数/1×106个PBMC。图19B示出了每3周一次以DL2(5x106个RCV FFU)IV接受构建体1的六名患者的ICS结果。将PBMC用重叠的HPV16 E6/E7肽刺激6小时，洗涤用于后续的IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a的免疫染色，并通过多色流式细胞术分析。示出了CD8 T细胞中IFN-γ+细胞的百分比。图19C示出了每3周一次IV接受DL1(1x106个RCV FFU)的构建体2和DL2(5x106个RCV FFU)的构建体1的三名患者的ELISpot结果。将来自所有患者的解冻的外周血单核细胞(PBMC)用重叠的HPV16 E6/E7肽刺激24h(±2h)，用于直接离体IFN-γELISpot测量。示出了斑点形成单位数/1×106个PBMC。定量上限(ULOQ)由水平虚线指示。图19D示出了每3周一次IV接受DL1(1x106个RCV FFU)的构建体2和DL2(5x106个RCV FFU)的构建体1的三名患者的ICS结果。将PBMC用重叠的HPV16 E6/E7肽刺激6小时，洗涤用于后续的IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a的免疫染色，并通过多色流式细胞术分析。示出了CD8 T细胞中IFN-γ+细胞的百分比。图19E示出了在接受构建体2/构建体1交替2-载体疗法的一名患者中CD8+和CD4+T细胞随时间的流式细胞术结果。将PBMC用E6/E7肽刺激6小时，洗涤用于后续的免疫染色，并通过多色流式细胞术分析。将细胞针对CD3+细胞设门，并且CD8门以上的数字显示CD8+细胞在CD3+T细胞中的百分比。图19F示出了在接受构建体2/构建体1交替2-载体疗法的一名患者中表达IFN-γ、TNFα或CD107a的T细胞随时间的流式细胞术结果。将PBMC用重叠的E6/E7肽集合刺激6小时，洗涤用于后续的IFN-γ、TNF-α、IL-2和CD107a的免疫染色，并通过多色流式细胞术分析。将细胞针对CD3+CD8+T细胞设门。图19G至图19I示出了个体患者的PBMC从基线到最大响应(Max)的变化。Max是指对于每个个体患者通过IFN-γELISpot测量的最高E6/E7特异性T细胞响应。图19G示出了在＞2次沙粒病毒载体施用后白血细胞计数(WBC)从基线到Max的变化，表示为WBC 103/μl血液(左图)。右图示出了在血样的CD19、NK1.1、CD3、CD8和CD4染色后从流式细胞仪分析计算的CD8/CD4比率从基线到Max的变化。图19H示出了基线和Max的IFN-γELISpot结果，表示为斑点形成单位/106个PBMC。图19I是细胞内细胞因子染色后PBMC样品的代表性伪彩图(参见图19B、图19D和图19F)。左图来自基线，右图来自Max。上排来自用构建体1 DL2(5x106个RCV FFU)IV-IV治疗的患者，下排来自用构建体2 DL1(1x106个RCV FFU)和构建体1 DL2(5x106个RCV FFU)交替2-载体疗法治疗的患者。
具体实施方式
如本文所用，术语“周期”，当用于用一个种的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒治疗癌症的方法中时，旨在指施用天数和下一次施用前的天数。
如本文所用，术语“疗程”，当用于在交替2-载体治疗方法中用两个种的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒治疗癌症的方法中时，旨在指第一个种的施用天数、施用第二个种之前的天数、施用第二个种的天数和另外施用第一个种之前的天数。
本文提供了用于治疗有需要的患者的癌症的方法。此类方法包括向该患者施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。该颗粒的有效量可为约5x105、约5x106、约5x107个RCV FFU、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU。因此，在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x106个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的具有编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x107个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的具有编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约1x108个RCV FFU。
用于生成在本文所述方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的方法是本领域熟知的。示例性方法可见于2017年11月9日公开的美国专利申请公开US-2017-0319673-A1、2019年5月9日公开的美国专利申请公开US-2019-0135875-A1和2018年6月28日公开的美国专利申请公开US-2018-0179257-A1中，这些专利申请各自以引用方式并入本文。鉴于这些公开，本领域技术人员将理解如本文所述的具有复制(矽两个)S-区段的此类工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括这样的有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中编码NP蛋白的开放阅读框(ORF)存在于一个S-区段上，而编码GP蛋白的ORF存在于另一个S-区段上。在这些公开中还提供了可在本文所述的方法中使用的具有工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的药物组合物的描述。
在一些实施方案中，本文提供的用于治疗癌症的方法包括治疗任何HPV 16+癌症，无论起源如何。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为肛门癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为宫颈癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为阴道癌。在一些实施方案中，该HPV 16+癌症已被诊断为外阴癌。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法用于通过向有需要的患者施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒来治疗该患者的HPV 16+癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴道癌)，其中该有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCVFFU、约5x107个RCV FFU、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU。
患有HPV+癌症的患者通常在用标准护理疗法(例如，失败的放射、基于铂的疗法和/或抗PD-1/抗PD-L1疗法)时遭遇肿瘤进展或复发，包括经历多于一种全身疗法的患者。另一方面，一些患者禁忌标准护理疗法。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括在该方法之前用至少一种标准护理疗法时具有肿瘤进展或复发的患者。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗放射失败的患者。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗基于铂的疗法失败的患者。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗抗PD-1疗法失败的患者。在一些具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗抗PD-L1疗法失败的患者。在一个具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗帕博利珠单抗单一疗法失败的患者。在一个具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗纳武单抗单一疗法失败的患者。在一个具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗匹地利珠单抗单一疗法失败的患者。在一个具体实施方案中，本文提供的方法用于治疗西米普利单抗单一疗法失败的患者。在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗上文列出的疗法中的两种或更多种的组合失败的患者。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括治疗其病变涉及或不涉及淋巴结的患者。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括治疗仅在淋巴结中具有靶病变的患者。在一些实施方案中，本文提供的方法包括治疗仅在非淋巴结中具有靶病变的患者。在一些实施方案中，本文提供的方法包括治疗在淋巴结和非淋巴结两者中具有靶病变的患者。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用静脉内注射、瘤内注射或它们的组合施用工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法用于通过向有需要的患者静脉内注射有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒来治疗该患者中的HPV 16+癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴道癌)，其中该有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCV FFU、约5x107、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法用于通过向有需要的患者瘤内注射有效量的具有编码HPV16E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒来治疗该患者中的HPV 16+癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴道癌)，其中该有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCV FFU、约5x107、约1x108个RCV FFU、约5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法用于通过如下方式治疗有需要的患者的HPV 16+癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴道癌)：向该患者瘤内注射有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该瘤内注射的有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCV FFU、或约5x107、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU，接着向该患者静脉内注射有效量的具有编码HPV16E7/E6融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该静脉内注射的有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCV FFU、或约5x107、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括以一定频率(例如，每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、或每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、或每13周一次、每14周一次等)向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每2周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每4周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每5周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每6周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每7周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每8周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每9周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每10周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每11周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每12周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每13周一次、每14周一次、每15周一次、每16周一次、每17周一次、每18周一次、每19周一次、每20周一次、每21周一次、每22周一次、每23周一次、每24周一次、每25周一次或每26周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1。在一个优选的实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率向患者静脉内注射施用5x106个RCV FFU的构建体1。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括以一定频率(例如，每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、或每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、或每13周一次、每14周一次等)向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体2。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每2周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每4周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每5周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每6周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每7周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每8周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每9周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每10周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每11周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每12周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每13周一次、每14周一次、每15周一次、每16周一次、每17周一次、每18周一次、每19周一次、每20周一次、每21周一次、每22周一次、每23周一次、每24周一次、每25周一次或每26周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的治疗。在其他实施方案中，本文提供的方法包括施用有限次数的治疗。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括以一定频率和持续地向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以一定频率向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒(诸如构建体1或构建体2)有限次数。
具体地，对于仅施用有限数量的周期的方法，需要优化若干因素，诸如适当的周期数量、适当的剂量和给药频率，以实现与以持续方式施用的方法相同的治疗效果。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2，每2周一次进行仅2个周期、每3周一次进行仅2个周期、每4周一次进行仅2个周期、每5周一次进行仅2个周期、每6周一次进行仅2个周期、每7周一次进行仅2个周期、每8周一次进行仅2个周期、每9周一次进行仅2个周期、每10周一次进行仅2个周期、每11周一次进行仅2个周期、每12周一次进行仅2个周期。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(即两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2，每2周一次进行仅3个周期、每3周一次进行仅3个周期、每4周一次进行仅3个周期、每5周一次进行仅3个周期、每6周一次进行仅3个周期、每7周一次进行仅3个周期、每8周一次进行仅3个周期、每9周一次进行仅3个周期、每10周一次进行仅3个周期、每11周一次进行仅3个周期、每12周一次进行仅3个周期。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(即两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2，每2周一次进行仅4个周期、每3周一次进行仅4个周期、每4周一次进行仅4个周期、每5周一次进行仅4个周期、每6周一次进行仅4个周期、每7周一次进行仅4个周期、每8周一次进行仅4个周期、每9周一次进行仅4个周期、每10周一次进行仅4个周期、每11周一次进行仅4个周期、每12周一次进行仅4个周期。在一些实施方案中，本文提供的方法包括向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(即两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2，每2周一次进行仅5个周期、每3周一次进行仅5个周期、每4周一次进行仅5个周期、每5周一次进行仅5个周期、每6周一次进行仅5个周期、每7周一次进行仅5个周期、每8周一次进行仅5个周期、每9周一次进行仅5个周期、每10周一次进行仅5个周期、每11周一次进行仅5个周期、每12周一次进行仅5个周期。此外，本文提供的方法包括以有限数量的周期向患者静脉内注射施用有效量的构建体1，其中该有效量可为5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCVFFU。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用5x106个RCV FFU的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用5x107个RCV FFU的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用5x108个RCV FFU的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用1x109个RCV FFU的构建体1。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用5x109个RCV FFU的构建体1。此外，本文提供的方法包括以有限数量的周期向患者静脉内注射施用有效量的构建体2，其中该有效量可为1x107、1x108、1x109、或1x1010个RCV FFU。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用1x107个RCV FFU的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用1x108个RCV FFU的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用1x109个RCV FFU的构建体2。在一些实施方案中，本文提供的方法包括如上文相同段落中所述以有限数量的周期向患者静脉内注射施用1x1010个RCV FFU的构建体2。
在一些实施方案中，本文提供的方法还可以包括施用有效量的免疫检查点抑制剂。特别适用于本文所述方法的示例性免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)检查点抑制剂。此类抗PD-1检查点抑制剂可以是抗体，诸如纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗或西米普利单抗。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法用于通过向有需要的患者施用有效量的免疫检查点抑制剂和有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽，两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒来治疗该患者的HPV 16+癌症(例如，头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴道癌)，其中该颗粒的有效量为约5x105个RCV FFU、约5x106个RCV FFU、约5x107个RCV FFU、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU，并且其中该免疫检查点抑制剂为抗PD-1检查点抑制剂(例如，纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗或西米普利单抗)。在一些实施方案中，该抗PD-1检查点抑制剂为纳武单抗。在一些实施方案中，该抗PD-1检查点抑制剂为帕博利珠单抗。在一些实施方案中，该抗PD-1检查点抑制剂为匹地利珠单抗。在一些实施方案中，该抗PD-1检查点抑制剂为西米普利单抗。
具体地，对于以持续方式施用的方法，需要优化若干因素，诸如以较高频率开始并接着以较低频率进行的适当给药频率，以及具有初始较高频率的适当周期数(每次施用被定义为“周期”)。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括以较高频率接着以较低频率向患者静脉内注射施用有效量的具有编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，诸如构建体1或构建体2。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每2周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次或每12周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次或每13周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每4周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次或每14周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCVFFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每5周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次或每15周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每6周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次、每15周一次或每16周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCV FFU)。在一些优选的实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率进行4个周期接着以每6周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCV FFU)。在其他优选的实施方案中，本文提供的方法包括以每4周一次的频率进行4个周期接着以每8周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体1(例如，5x105、5x106、5x107、1x108、或5x108个RCVFFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每2周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次或每12周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2(例如，1x106、1x107、1x108、或1x109个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每3周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次或每13周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2(例如，1x106、1x107、1x108、或1x109个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每4周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次或每14周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2(例如，1x106、1x107、1x108、或1x109个RCVFFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每5周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次或每15周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2(例如，1x106、1x107、1x108、或1x109个RCV FFU)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括以每6周一次的频率进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个周期接着以每7周一次、每8周一次、每9周一次、每10周一次、每11周一次、每12周一次、每13周一次、每14周一次、每15周一次或每16周一次的频率向患者静脉内注射施用有效量的构建体2(例如，1x106、1x107、1x108、或1x109个RCV FFU)。
在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括如本文描述的构建体1(基于LCMV)的沙粒病毒颗粒(图2B和实施例I和II)。此外，在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV。LCMV的特定毒株包括MP毒株、WE毒株、Armstrong毒株、Armstrong克隆13毒株、或表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。因此，在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV MP毒株。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV WE毒株。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV Armstrong毒株。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自LCMV Armstrong克隆13毒株。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。
在其他实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自如本文所述的构建体2(基于PICV)(图2B和实施例II)。PICV的特定菌株包括Munchique CoAn4763分离株P18、P2毒株、或Trapido及其同事描述的几种分离株中的任一种(Trapido等人，1971，Am J Trop Med Hyg，20：631-641)。因此，在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自MunchiqueCoAn4763分离株P18。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自P2毒株。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自Trapido及其同事描述的几种分离株中的任一种(Trapido等人，1971，Am J Trop Med Hyg，20：631-641)
在施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒后测量某些细胞因子和趋化因子。待测量的细胞因子和趋化因子包括促炎和抗炎细胞因子和趋化因子。
因此，本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的包含编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、约5x106个RCV FFU、约5x107个RCVFFU、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU。其中与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中的细胞因子或趋化因子水平的改变(矽增加或降低)。
在一些具体实施方案中，本文所述的改变的细胞因子和趋化因子(矽增加或降低的细胞因子和趋化因子)包括但不限于GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12p40、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-22、IL-37、IL-38、TGF-β、IFN-α、INF-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IFN-诱导型蛋白(IP)-10、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、MCP-4、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、胸腺和激活调节趋化因子(TARC)、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)和血管内皮生长因子(VEGF)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞因子和趋化因子具有促炎和/或抗炎活性。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中细胞因子或趋化因子(例如，具有促炎和/或抗炎活性)水平的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍或30倍变化(例如，增加或降低)。在其他实施方案中，与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中细胞因子或趋化因子(例如，具有促炎和/或抗炎活性)水平的40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍变化(例如，增加或降低)。在其他实施方案中，与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中细胞因子或趋化因子(例如，具有促炎和/或抗炎活性)水平的300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍变化(例如，增加或降低)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞因子和趋化因子用作患者群体选择的生物标志物。因此，在一些实施方案中，在治疗前患者体内本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值高于某一阈值指示该患者适合于本文提供的方法。在一些实施方案中，在治疗前患者体内本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值低于某一阈值指示该患者适合于本文提供的方法。在具体实施方案中，在治疗前患者体内IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10、TNFα或它们的组合的测量值低于某一阈值指示该患者适合于本文提供的方法。
在一些实施方案中，本文所述的细胞因子和趋化因子用作治疗期间重新调节剂量和/或方案的生物标志物。因此，在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值高于某一阈值指示增加施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值高于某一阈值指示保持相同的施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值高于某一阈值指示降低施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值低于某一阈值指示增加施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值低于某一阈值指示保持相同的施用剂量和/或频率。在一些实施方案中，在治疗患者一段时间后，本文所述的细胞因子和趋化因子中的一者或多者的测量值低于某一阈值指示降低施用剂量和/或频率。在一些具体实施方案中，在治疗患者一段时间后，IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10、TNFα或它们的组合的测量值低于某一阈值指示增加施用剂量和/或频率。在一些具体实施方案中，在治疗患者一段时间后，IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10、TNFα或它们的组合的测量值高于某一阈值指示保持相同的施用剂量和/或频率。
细胞因子和趋化因子的水平可在施用包含编码HPV16 E7/E6融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒之前和之后的不同时间点测量。在一些实施方案中，在施用沙粒病毒颗粒之前测量细胞因子和趋化因子的水平。在一些实施方案中，在施用沙粒病毒颗粒后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时测量细胞因子和趋化因子的水平。在一些实施方案中，在施用沙粒病毒颗粒后2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、150天、300天、450天测量细胞因子和趋化因子的水平。
细胞因子和趋化因子的水平可用多种测定来测量，诸如生物测定(例如，趋化活性、增殖或细胞毒性的测试)、免疫测定(例如，ELISA并且尤其是多重ELISA)、流式细胞术和基于适体的检测方法，以及用放射性标记的细胞因子和趋化因子的分子成像。因此，在一些实施方案中，在施用编码HPV16 E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用生物测定(例如，趋化活性、增殖或细胞毒性的测试)测量细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，在施用编码HPV16E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用免疫测定测量细胞因子和趋化因子。在具体实施方案中，在施用编码HPV16 E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用ELISA测量细胞因子和趋化因子。在一些优选的实施方案中，在施用编码HPV16 E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用多重ELISA测量细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，在施用编码HPV16 E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用流式细胞术测量细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，在施用编码HPV16E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用基于适体的检测方法测量细胞因子和趋化因子。在一些实施方案中，在施用编码HPV16 E7/E6的沙粒病毒颗粒后，用放射性标记的细胞因子和趋化因子通过分子成像测量细胞因子和趋化因子。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、约5x106个RCV FFU、约5x107个RCV FFU、约1x108个RCV FFU、或约5x108个RCV FFU，其中与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中细胞因子或趋化因子水平的改变，并且其中与患者的治疗前水平相比，施用有效量的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒导致患者血清中HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。
本文所述的增加的HPV16E7/E6特异性T细胞可对指示T细胞的不同功能的单独或组合的不同细胞标志物(例如，CD4、CD8、IFN-γ、TNFα、CD107a)呈阳性。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中CD4阳性的HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中CD8阳性的HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中IFN-γ阳性的HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中TNFα阳性的HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。在一些实施方案中，与患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致患者血清中CD107a阳性的HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。
HPV16 E7/E6特异性T细胞可通过多种测定来检测和定量，诸如ELISpot和细胞内细胞因子染色(ICS)接着是流式细胞术。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法还包括通过ELISpot检测和定量HPV16 E7/E6特异性T细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括通过ICS接着通过流式细胞术检测和定量HPV16 E7/E6特异性T细胞。
具体地，本领域熟知的任何测定可用于测试HPV16 E7/E6特异性T细胞响应。例如，可使用ELISPOT测定(参见例如，Czerkinsky C.C.等人，J Immunol Methods.1983；65：109-121；和Hutchings P.R.等人，J Immunol Methods.1989；120：1-8)。细胞因子诸如但不限于IFN-γ可通过ELISPOT测定来测量。简而言之，该测定包括以下步骤：将免疫斑点板用抗细胞因子抗体包被。将细胞在免疫斑点板中与源自HPVE7/E6的肽一起温育。HPV16 E7/E6特异性细胞分泌细胞因子，这些细胞因子与包被的抗体结合。然后洗去细胞，并且向板中添加第二生物素化的抗细胞因子抗体，并用抗生物素蛋白-HRP系统或其他合适的方法显现。
类似地，本领域熟知的任何测定可用于测试对HPV16 E7/E6特异的CD8+和CD4+T细胞的功能。例如，可使用与流式细胞术组合的ICS(参见例如，Suni M.A.等人，J ImmunolMethods.1998；212：89-98；Nomura L.E.等人，Cytometry.2000；40：60-68；和GhanekarS.A.等人，Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001；8：628-63)。简而言之，该测定包括以下步骤：在经由HPV16 E7/E6激活细胞后，添加蛋白质转运抑制剂(例如布雷菲德菌素A)以将细胞因子保留在细胞内。在限定的温育期(通常为5小时)后，接着进行洗涤步骤，并且可向细胞中添加针对其他细胞标志物的抗体。然后将细胞固定并透化。添加荧光染料缀合的抗细胞因子抗体，并通过流式细胞术分析细胞。
本领域熟知，通过癌症免疫疗法在患者中诱导的靶抗原特异性T细胞的频率通常太低，以至于在没有预先体外扩增的情况下无法直接测量这些响应。因此，在检测前进行体外T细胞刺激和/或扩增是本领域的常规实践(参见例如，Trickett等人，J ImmunolMethods.2003Apr 1；275(1-2)：251-5.)。直接相反，对于在前述段落中描述的T细胞检测，在没有预先体外刺激和/或扩增的情况下，检测到本文所述的增加的T细胞频率。具体地，将来自受治疗患者的新鲜或冷冻保存但解冻的外周血单核细胞(PBMC)直接用于检测而无需预先体外扩增(参见例如实施例II和实施例V)。
除了如前述段落中所述检测诱导的T细胞的丰度和功能之外，T细胞迁移以浸润到肿瘤组织中也是本文提供的方法的功效的重要读出。在一些实施方案中，本文提供的方法导致更多的T细胞浸润到肿瘤组织中。在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更多的CD8+T细胞浸润到HPV16+肿瘤组织中(参见实施例III的第11部分)。
此外，可通过抗原特异性血清ELISA(酶联免疫吸附测定)进行用于确定接种后体液免疫响应的其他测定。简而言之，将板用抗原(例如重组蛋白)包被，封闭以避免抗体的非特异性结合，并与系列稀释的血清一起温育。温育后，例加使用酶偶联的抗物种(例如小鼠、豚鼠)特异性抗体(检测总IgG或IgG亚类)和随后的颜色反应，可检测结合的血清-抗体。抗体滴度可确定为例如终点几何平均滴度。
此外，使用GFP标记的病毒或表达HPV E7/E6的细胞系，可用以下细胞测定进行诸如确定血清中的中和抗体的其他测定。此外，使用补充的豚鼠血清作为外源补体的来源。在用于中和前一天或两天，以6.5x103个细胞/孔(50μl/孔)接种在384孔板中开始测定。中和在无细胞的96孔无菌组织培养板中在37℃下进行1小时。中和温育步骤后，将混合物添加到细胞中，再温育4天，用读板仪进行GFP检测。阳性中和人血清用作每个平板上的检测阳性对照，以检查所有结果的可靠性。使用4参数逻辑曲线拟合确定滴度(EC50)。作为附加测试，用荧光显微镜检查孔。类似地，可在临床环境中测量诱导抗体的中和活性。
在一些实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法使用实体瘤响应评价标准(RECIST)和/或实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)产生一个或多个改善的功效终点(例如客观响应率百分比、疾病控制率百分比、部分响应百分比、无进展生存期和/或总生存期)。因此，在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更高的客观响应率百分比。在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更高的疾病控制率百分比。在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更高的部分响应百分比。在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更长的无进展生存期。在一些具体实施方案中，与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，本文提供的方法导致更长的总生存期。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU；以及(ii)向该患者施用有效量的包含编码源自PICV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU。本文还提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的包含编码源自PICV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU；以及(ii)向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU；(ii)向该患者施用有效量的包含编码源自PICV的HPV16E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU，并且重复(i)和(ii)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。本文还提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的包含编码源自PICV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCVFFU；(ii)向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU，并且重复(i)和(ii)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。
在一些实施方案中，前述段落中的(i)与(ii)之间的间隔为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在其他实施方案中，前述段落中的(i)与(ii)之间的间隔为13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、22周、23周或24周。在其他实施方案中，前述段落中的(i)与(ii)之间的间隔为25周、26周、27周、28周、29周、30周、31周、32周、33周、34周、35周或36周。此外，在(i)和(ii)的重复期间，间隔可与(i)和(ii)的原始周期相同，或者可与(i)和(ii)的原始周期不同。因此，重复中(i)与(ii)之间的间隔可为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的与免疫检查点抑制剂组合的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该沙粒病毒颗粒的有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU；(ii)向该患者施用有效量的与免疫检查点抑制剂组合的包含编码源自PICV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU，而没有重复或重复(i)和(ii)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。本文还提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(i)向该患者施用有效量的与免疫检查点抑制剂组合的包含编码源自PICV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU；以及(ii)向该患者施用有效量的与免疫检查点抑制剂组合的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的复制(矽两个)S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107或5x108个RCV FFU，而没有重复或重复(i)和(ii)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的包含编码源自PICV的HPV16E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个RCVFFU。本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的编码源自PICV的人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的包含编码源自LCMV的HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中该有效量为约5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个RCV FFU。
在一些具体实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一个具体实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内施用1x106个RCV FFU的构建体2；以及(ii)向该患者静脉内施用5x106个RCV FFU的构建体1，并且每个疗程持续6周。在其他具体实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU。
疗程持续时间决定了前述段落中(i)的两个连续剂量的施用之间的间隔。因此，在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续4周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续6周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续8周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续10周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续12周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续14周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续16周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续18周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续20周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续22周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续24周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续26周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续28周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续30周。在一些实施方案中，本文提供的每个疗程持续32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52周。
在一些实施方案中，前述段落中(i)和(ii)的施用包括静脉内注射、瘤内注射、或静脉内注射和瘤内注射的组合。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内、肿瘤内、或静脉内注射和肿瘤内注射的组合施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内、肿瘤内、或静脉内注射和肿瘤内注射的组合施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内、肿瘤内、或静脉内注射和肿瘤内注射的组合施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内、肿瘤内、或静脉内注射和肿瘤内注射的组合施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的治疗。在其他实施方案中，本文提供的方法包括施用有限次数的治疗。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程或有限数量的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程或有限数量的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU。
具体地，对于仅施用有限次数的方法，需要优化若干因素，诸如适当的疗程数(例如，2、3、4或5个疗程)、适当的剂量和适当的疗程持续时间，以实现与以持续方式施用的方法相同的治疗效果。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括仅2个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括仅3个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括仅4个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括仅5个疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在其他实施方案中，本文提供的方法包括仅2个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在其他实施方案中，本文提供的方法包括仅3个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在其他实施方案中，本文提供的方法包括仅4个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。在其他实施方案中，本文提供的方法包括仅5个疗程，其中每个疗程包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107、1x108、1x109或1x1010个RCV FFU，并且其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周或12周。
具体地，对于以持续方式施用的方法，需要优化若干因素，诸如以适当的较短疗程开始接着是适当的较长疗程以及适当量的较短疗程的方案。
因此，在优化以适当的较短疗程开始接着是适当的较长疗程的方案之后，在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前2个疗程各自持续4周，并且其中第3个疗程和后续疗程各自持续6、8、10、12、14、16周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前2个疗程各自持续6周，并且其中第3个疗程和后续疗程各自持续8、10、12、14、16、18、20或24周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前2个疗程各自持续8周，并且其中第3个疗程和后续疗程各自持续10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前2个疗程各自持续10周，并且其中第3个疗程和后续疗程各自持续12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40周。类似地，这同样适用于包括施用(i)中的构建体1和(ii)中的构建体2的方法。
本文进一步提供了具有修改数量的较短疗程的方法。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCVFFU，其中前3个疗程各自持续4周，并且其中第4个疗程和后续疗程各自持续6、8、10、12、14、16周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前3个疗程各自持续6周，并且其中第4个疗程和后续疗程各自持续8、10、12、14、16、18、20或24周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前3个疗程各自持续8周，并且其中第4个疗程和后续疗程各自持续10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前3个疗程各自持续10周，并且其中第4个疗程和后续疗程各自持续12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCVFFU，其中前4个疗程各自持续4周，并且其中第5个疗程和后续疗程各自持续6、8、10、12、14、16周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前4个疗程各自持续6周，并且其中第5个疗程和后续疗程各自持续8、10、12、14、16、18、20或24周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前4个疗程各自持续8周，并且其中第5个疗程和后续疗程各自持续10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32周。在一些实施方案中，本文提供的方法包括持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU，其中前4个疗程各自持续10周，并且其中第5个疗程和后续疗程各自持续12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40周。类似地，这同样适用于包括施用(i)中的构建体1和(ii)中的构建体2的方法。
在静脉内注射之前进行肿瘤内注射可提供额外的功效。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括瘤内注射构建体1，接着是持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法包括瘤内注射构建体2，接着是持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法包括瘤内注射构建体1，接着是持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU。在一些实施方案中，本文提供的方法包括瘤内注射构建体2，接着是持续的疗程，其中每个疗程包括：(i)向患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个RCV FFU；以及(ii)在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106、1x107、1x108或1x109个RCV FFU。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中以每3周一次的频率进行4个周期接着以每6周一次的频率进行持续的周期，静脉内施用构建体1。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括：(i)向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x105、5x106、5x107、1x108或5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中以每3周一次的频率进行4个周期接着以每6周一次的频率进行持续的周期，静脉内施用构建体1；以及向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCVFFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周；以及(2)向该患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x106个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括(1)向该患者瘤内施用有效量的构建体1，其中该有效量的构建体1为约5x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及(2)3周后向该患者施用多个疗程，其中每个疗程包括i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个RCV FFU；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括向该患者施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x106、5x107、5x108、1x109或5x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中构建体1以每3周一次的频率静脉内施用3个周期，并且该方法在3个周期后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x107个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x108个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约1x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
本文进一步提供了一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，其包括3个疗程，其中每个疗程包括：i.向该患者静脉内施用有效量的构建体2，其中该有效量为约1x109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；ii.在约半个疗程的时间点向该患者静脉内施用有效量的构建体1，其中该有效量为约5x109个RCV FFU，并且其中每个疗程持续6周，并且该方法在3个疗程后结束。
应当理解，本文描述的用于施用源自单一沙粒病毒种的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的实施方案适用于重复施用源自不同沙粒病毒种的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。
用于治疗癌症的方法中的编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的二核苷酸优化融合蛋白的核酸
本文提供了编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)的E7/E6融合蛋白的优化核苷酸序列。这些优化的开放阅读框作为SEQ ID NO：1和2提供。序列在下面的“序列表”中提供。
在某些实施方案中，这些优化的开放阅读框被包括在沙粒病毒基因组区段中。SEQID NO：3给出了源自LCMV的第一S区段，该区段具有在5′UTR控制下的E7/E6融合蛋白的优化开放阅读框和在3′UTR控制下的NP蛋白的开放阅读框。SEQ ID NO：4给出了源自LCMV的第二S区段，该区段具有在5′UTR控制下的E7/E6融合蛋白的优化开放阅读框和在3′UTR控制下的GP蛋白的开放阅读框。SEQ ID NO：6给出了源自PICV的第一S区段，该区段具有在5′UTR控制下的E7/E6融合蛋白的优化开放阅读框和在3′UTR控制下的NP蛋白的开放阅读框。SEQ IDNO：7给出了源自PICV的第二S区段，该区段具有在5′UTR控制下的E7/E6融合蛋白的优化开放阅读框和在3′UTR控制下的GP蛋白的开放阅读框。这些基因组区段(例如，SEQ ID NO：3、4和5；或SEQ ID NO：6、7和8)可一起掺入病毒颗粒，诸如S区段1和2(分别为SEQ ID NO：3、4、6、7)，连同L区段(分别为SEQ ID NO：5和8)，从而产生编码E7/E6融合蛋白的复制型三区段病毒颗粒。
如SEQ ID NO：1至8所呈现的核苷酸序列可以是RNA或DNA序列。一旦存在于病毒颗粒中，这些核苷酸序列可作为RNA存在。如SEQ ID NO：1-8所示的DNA序列可通过用“U”(尿苷)替换“T”(胸苷)而转化为RNA序列。
如SEQ ID NO：1-8提供的核苷酸序列可用于本文公开的治疗方法中。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3-5可用于生成三区段有复制能力的病毒颗粒作为构建体1。在一些实施方案中，SEQ ID NO：6-8可用于生成三区段有复制能力的病毒颗粒作为构建体2。
本文提供了包含工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的药物组合物，该三区段沙粒病毒颗粒分别包含SEQ ID NO：3-5和SEQ ID NO：6-8。这些药物组合物可用于本文公开的任何方法中。
本文提供了包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8的核苷酸序列的表达载体。本文还提供了包含此类表达载体的宿主细胞。本领域技术人员已知的任何方法可用于生成具有SEQ ID NO：3至5的基因组区段的有复制能力的三区段病毒颗粒。本领域技术人员已知的任何方法可用于生成具有SEQ ID NO：6至8的基因组区段的有复制能力的三区段病毒颗粒。本文还提供了表达载体，从该表达载体中可转录SEQ ID NO：3至8的基因组区段中的任一者。
序列表
SEQ ID NO：1和2的核苷酸序列编码HPV16 E7E6融合蛋白。SEQ ID NO：1和2的HPV16 E7E6融合蛋白的核苷酸序列被修饰以减少CpG二核苷酸基序(二核苷酸优化)。包含SEQ ID NO：1或2的沙粒病毒颗粒在本文提供的方法中可展示出改善的遗传稳定性、改善的表达和改善的免疫原性。下面描述证明这些特性的测定。减毒的有复制能力的病毒载体可使用cDNA拯救系统从头生成，该系统包含编码两个短(S)基因组区段和长(L)基因组区段的质粒，该短(S)基因组区段分别包含二核苷酸优化的E7E6核苷酸序列以及沙粒病毒核蛋白(NP)或沙粒病毒糖蛋白(GP)的基因，该长(L)基因组区段包含RING指蛋白Z和RNA指导的RNA聚合酶L的基因。
证明二核苷酸优化序列的临床益处的测定
以下测定可用于证明SEQ ID NO：1或2的二核苷酸优化序列的改善。
遗传稳定性
编码二核苷酸优化的HPV16 E7E6核苷酸序列的三区段沙粒病毒颗粒在传代多代后可具有编码的HPV抗原的稳定表达，这对于大规模商业生产是必需的。在一些实施方案中，三区段沙粒病毒颗粒能够在传代至少4、5、6、7、8、9或10代后具有HPV抗原的稳定表达。
载体候选物在增殖细胞系中的连续传代。可用有复制能力的载体以MOI 0.001(RCV FFU/ml滴度)感染小规模HEK293细胞培养物。在感染后第4天，可通过离心从细胞和碎片中清除上清液。由此确定的RCV FFU滴度可用于通过如上所述感染新鲜细胞来生成下一次传代。载体原种材料可连续传代9次(至多传代p10)。
传代载体材料的分析。从头(P1)生成的以及源自其连续传代的载体材料可随后通过FFU和RCV FFU测定进行感染性分析。载体的转基因稳定性可通过以下方式来分析：从含有病毒的不同传代水平的上清液中分离基因组vRNA，转录成cDNA并随后用对相应转基因和S-区段特异的转基因侧翼引物进行PCR扩增。可通过使用转基因特异性抗体对不同传代水平的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析来确认载体原种的转基因表达。
抗原表达
编码二核苷酸优化的HPV16 E7E6核苷酸序列的三区段沙粒病毒颗粒可具有编码的HPV融合蛋白的一致表达。
编码的E7E6抗原的表达水平的分析。蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫沉淀、免疫细胞化学或免疫细胞化学结合FACS可用于定量沙粒病毒S区段或三区段沙粒病毒颗粒的基因产物。
蛋白质印迹。在组织培养瓶中或悬浮液中生长的感染细胞可在感染后的指定时间点用RIPA缓冲液(Thermo Scientific)裂解或不经细胞裂解直接使用。可用还原剂和NuPAGE LDS样品缓冲液(NOVEX)将样品加热至99℃持续10分钟，并冷却至室温，然后加载到NuPAGE4-12％Bis-Tris SDS-凝胶上进行电泳。可使用Invitrogen iBlot凝胶转移装置将蛋白质印迹到膜上。最后，可用针对目的蛋白质的一抗和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗探测膜，接着用ImmobiIon Western化学发光HRP底物(Merck/Millipore)染色
免疫原性
编码二核苷酸优化的HPV16 E7E6核苷酸序列的三区段沙粒病毒颗粒可诱导针对编码的HPV融合蛋白的强免疫响应。
用于检测抗原特异性CD8+T胞的MHC-肽多聚体染色测定。本领域熟知的任何测定可用于测量抗原特异性CD8+T细胞响应。例如，可使用MHC-肽四聚体染色测定(参见例如Altman J.D.等人，Science.1996；274：94-96；和Murali-Krishna K.等人，Immunity.1998；8：177-187)。简而言之，该测定可包括用于检测抗原特异性T细胞存在的四聚体测定。为了检测抗原特异性T细胞，它必须结合针对确定的抗原特异性和T细胞的MHC单倍型(通常是荧光标记的)定制的MHC分子的肽和四聚体两者。然后可通过流式细胞术经由荧光标记检测识别四聚体并因此对抗原特异的T细胞。
用于检测抗原特异性T细胞的ELISPOT测定。本领域熟知的任何测定可用于测试抗原特异性T细胞响应。例如，如表1中所例示可使用ELISPOT测定(参见例如，CzerkinskyC.C.等人，J Immunol Methods.1983；65：109-121；和Hutchings P.R.等人，J ImmunolMethods.1989；120：1-8)。用于中心实验室分析的样品收集总结，细胞因子诸如但不限于IFN-γ可通过ELISPOT测定进行测量。简而言之，该测定包括以下步骤：将免疫斑点板用抗细胞因子抗体包被。然后将细胞在免疫斑点板中与源自目的抗原的肽一起温育。抗原特异性细胞分泌细胞因子，这些细胞因子与包被的抗体结合。然后洗去细胞，并且向板中添加第二生物素化的抗细胞因子抗体，并用抗生物素蛋白-HRP系统或其他合适的方法显现。
表1.用于中心实验室分析的样品收集总结
缩写：bAb＝结合抗体测定，CD4＝分化簇4，CD8＝分化簇8，ctDNA＝循环肿瘤脱氧核糖核酸，ELISpot＝酶联免疫吸附斑点，ICS＝细胞内细胞因子染色，IFN-γ＝干扰素γ，IHC＝免疫组织化学，LCMV＝淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，NP＝核蛋白，PAP＝前列腺酸性磷酸酶，PBMC＝外周血单核细胞，PSA＝前列腺特异性抗原，PSMA＝前列腺特异性膜抗原，RCV＝有复制能力的病毒，RNA＝核糖核酸，TIL＝肿瘤浸润淋巴细胞，TNFα＝肿瘤坏死因子α，WES＝全外显子组测序。
用于检测CD8+和CD4+T细胞的功能性的细胞内细胞因子测定。本领域熟知的任何测定可用于测试CD8+和CD4+T细胞响应的功能性。例如，可使用与流式细胞术组合的细胞内细胞因子测定，例如但不限于表1。用于中心实验室分析的样品收集总结(参见，例如，SuniM.A.等人，J Immunol Methods.1998；212：89-98；Nomura L.E.等人，Cytometry.2000；40：60-68；和Ghanekar S.A.等人，Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2001；8：628-63)。简而言之，该测定包括以下步骤：在经由特异性肽或蛋白质激活细胞后，添加蛋白质转运抑制剂(例如布雷菲德菌素A)以将细胞因子保留在细胞内。在限定的温育期(通常为5小时)后，接着进行洗涤步骤，并且可向细胞中添加针对其他细胞标志物的抗体。然后将细胞固定并透化。添加荧光染料缀合的抗细胞因子抗体，并通过流式细胞术分析细胞。
血清ELISA。动物(例如小鼠、豚鼠)接种后体液免疫响应的测定可通过抗原特异性血清ELISA(酶联免疫吸附测定)进行。简而言之，可将板用抗原(例如重组蛋白)包被，封闭以避免抗体的非特异性结合，并与系列稀释的血清一起温育。温育后，例加使用酶偶联的抗物种(例加小鼠、豚鼠)特异性抗体(检测总IgG或IgG亚类)和随后的颜色反应，可检测结合的血清-抗体。抗体滴度可确定为例如终点几何平均滴度。
应当理解，在本文提供的公开内容的定义内还提供了基本上不影响本公开内容的各种实施方案的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制本公开。
实施例I
在患有HPV16+癌症的患者中单独或与免疫检查点抑制剂组合的基于沙粒病毒的癌症免疫疗法
该实施例描述了单独或与免疫检查点抑制剂组合使用基于沙粒病毒的颗粒的免疫疗法治疗策略。
可用于这种治疗策略中的沙粒病毒颗粒包括构建体1和构建体2，即图2B中描述的HPV抗原构建体。此外，可用于本文所述治疗策略中的HPV16 E7/E6抗原的抗原构建体包括2018年6月28日公开的美国专利申请公开US-2018-0179257-A1中描述的抗原，该专利申请以引用方式并入本文。具体地，在某些实施方案中，在所述治疗策略中使用的由沙粒病毒颗粒编码的HPV16 E7/E6抗原包括美国专利申请公开US-2018-0179257-A1的SEQ ID NO：10的氨基酸序列(构建体1和构建体2)。
在这种治疗策略中使用的免疫检查点抑制剂包括抗PD-1免疫检查点抑制剂。可用于本文所述的治疗策略中的免疫检查点抑制剂，包括抗PD-1免疫检查点抑制剂，包括2018年12月6日公开的美国专利申请公开US-2018-0344830-A1中描述的那些，该专利申请以引用方式并入本文。
用于这种治疗策略中的沙粒病毒颗粒的瘤内施用包括2020年4月16日公开的美国专利申请公开US-2020-0113995-A1中描述的方法，该专利申请以引用方式并入本文。
构建体1是基于编码非致癌E7和E6融合蛋白的沙粒病毒LCMV的有复制能力的减毒活载体。在临床前模型中，静脉内(IV)和瘤内(IT)施用的构建体1均通过诱导HPV16特异性细胞毒性T细胞和相关的功效证明了有效的免疫原性(图3A至图3C)。
图4描述了在患有HPV16+癌症的患者中单独或与免疫检查点抑制剂组合使用基于沙粒病毒的癌症免疫疗法的治疗策略。这种治疗策略是构建体1单一疗法或与PD-1免疫检查点抑制剂(抗PD-1)组合在HPV16+确认的复发性/转移性癌症中的首次人体I/II期研究。I期由2个治疗组组成，每个治疗组采用3+3剂量递增设计进行。第1组招募患有HPV16+头颈部鳞状细胞癌的患者，这些患者将仅IV接受构建体1。第2组招募具有安全可触及肿瘤部位的HPV16+癌症患者，其将IT接受第一剂量的构建体1，接着IV接受后续剂量的构建体1(IT-IV)。构建体1可每21天施用一次。II期部分可用I期中定义的推荐II期剂量(RP2D)进行，并且可由3个组组成：A组(仅构建体1IV)、B组(构建体1IV加抗PD-1)和C组(构建体1 IT-IV)。
治疗策略的关键纳入和排除标准包括以下内容：
·所有患者-
·年龄≥18岁
·ECOG体能状态为0至1
·将根据RECIST 1.1标准评估肿瘤响应的至少一个可测量病变
·用标准护理疗法(包括至少一种全身疗法)时的肿瘤进展或复发，或标准护理的禁忌症
·没有未经治疗和/或有症状的转移性中枢神经系统疾病，除非经治疗并稳定至少4周
IV施用单独的基于沙粒病毒的颗粒-
·组织学确认的HPV 16+(基因型)头颈部鳞状细胞癌
·从最后一次治疗进展后收集的肿瘤组织，除非另行约定
IT或IV施用的基于沙粒病毒的颗粒-
·组织学确认的任何起源的HPV 16+(基因型)癌症
·安全且可触及的肿瘤部位，适合活检和IT施用，除非另行约定
·根据RECIST 1.1标准，除了适合活检和IT施用的肿瘤部位外，至少有一个附加的可测量病变
通过采用上述治疗策略，可评价以下研究目标和终点：
·主要
·仅I期：每组的II期推荐剂量
·仅II期：所有组的初步抗肿瘤活性(ORR)
·次要
·所有组的安全性和耐受性
·所有组的初步抗肿瘤活性(PFS、OS、反应持续时间、疾病控制率)
·探索性
·初步免疫原性(E7和E6抗原特异性测定，CD4+和CD8+T细胞测量)
·血液、组织、血清和血浆中与免疫和/或抗肿瘤响应相关的生物标志物
可进行的统计分析包括遵循传统3+3设计的I期剂量递增部分的每组，每个剂量水平至少有3名DLT可评价患者。对于这种基于病毒的疗法，最高剂量不一定是最有效的。因此，群组回填可用于更好地评估跨剂量的安全性和潜在功效。
对于安全性分析，治疗中出现的不良事件(TEAE)的数量和发生率可按CTCAE等级制表。治疗中出现的实验室异常、生命体征和ECG值的发生率也可使用描述性统计进行总结。
对于功效分析，可根据RECIST v1.1和iRECIST确定所有功效终点。对于I期，可呈现功效终点，而无需进行正式的统计测试。对于II期，ORR和疾病控制率可根据Clopper-Pearson方法使用精确的2侧95％CI进行总结。可使用卡普兰-迈耶曲线计算响应持续时间、PFS和OS。
实施例II
基于沙粒病毒的癌症免疫疗法在晚期HPV16+癌症患者中的免疫原性
本实施例描述了使用基于沙粒病毒的颗粒的免疫疗法的免疫原性，其导致晚期HPV16+癌症患者中细胞因子和趋化因子的改变，以及肿瘤抗原特异性T细胞的诱导。
携带非致癌HPV16特异性E7和E6融合蛋白的减毒复制型沙粒病毒载体在LCMV或PICV的基因组背景中表达(即分别为构建体1和构建体2；参见图2B)。
在先前的临床前研究中，单独施用基于LCMV的沙粒病毒和顺序施用基于PICV的沙粒病毒，接着施用基于LCMV的沙粒病毒(即交替的2-载体疗法)显示是安全且有效的。交替的2-载体疗法诱导E7和E6特异性CD8+T细胞响应，其占循环T细胞的高达50％(参见SchmidtS等人Oncoimmunology.2020；9(1)：1809960；Bonilla W等人Cell Rep Med.2021；2(3)：1-17。)。
在本实施例中，免疫原性结果获自在先前HPV16+癌症的抗PD-1/PD-L1和/或基于铂的化疗失败的重度预治疗患者中的开放标记的首次人体1/2期临床试验的1期部分。构建体1是包含基于LCMV毒株克隆13的各自编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的基因工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中病毒表面糖蛋白来自LCMV毒株WE。构建体2是包含基于PICV强毒株第18代的各自编码HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的基因工程化有复制能力的三区段PICV颗粒。分析了单独的构建体1或与构建体1交替的构建体2的单一疗法注射的不同剂量水平和计划。(参见图5，Bonilla W等人Cell Rep Med.2021；2(3)：1-17)。
已在1/2期研究中招募患者。群组剂量和招募的患者数量如下。对于使用构建体1单一疗法的群组1，剂量为5×105个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU；n＝13)；对于使用构建体1单一疗法的群组2，剂量为5×106个RCV FFU(n＝13)。对于队列构建体1和构建体2交替单一疗法的群组1，构建体1的剂量为5×106个RCV FFU，并且构建体2的剂量为1×106个RCV FFU(n＝5)；对于具有构建体1和构建体2交替单一疗法的群组2，构建体1的剂量为5×106个RCV FFU，并且构建体2的剂量为1×107个RCV FFU(n＝1)。78.2％的招募患者患有头颈部鳞状细胞癌，并且75％的患者为男性。中位年龄为62岁(年龄范围为30至86岁)。59.4％的招募患者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为1，并且既往疗法中位数为3(范围为1至8)。初始一轮治疗后的免疫原性的测量和分析呈现如下(矽实施例II)。具体地，用构建体1单一疗法治疗的患者接受5×106个RCV FFU的构建体1。用构建体2单一疗法治疗但到数据收集时仍未用构建体1治疗的患者接受1×106个RCV FFU的构建体2。
通过30-plex Meso Scale Discovery(MSD)面板评价来自66个样品(12名患者在至多13个时间点)的血清细胞因子和趋化因子模式。治疗后血清中的IFN-γ标记是免疫激活的早期征兆。血清30-plex分析的分级聚类显示在单次施用构建体1后90％的患者中IFN-γ水平增加(参见图6A)。在该分析中，在单剂量的构建体1治疗后的第4天，几乎所有9名患者中IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα的水平增加(参见图6B)。
上述免疫刺激细胞因子和趋化因子水平的变化是自然杀伤(NK)和T细胞激活的早期征兆。此外，全身细胞因子水平的平衡和生理学增加也表明病毒诱导的免疫激活。同时，细胞因子水平的变化通常与不良事件无关。
分别使用来自基线和施用单剂量的构建体1或构建体2后第15天的样品对五名患者进行直接IFN-γELISpot分析。具体地，将来自七名患者的冷冻保存和解冻的外周血单核细胞(PBMC)用重叠的HPV16 E6/E7肽刺激24h(±2h)，用于直接离体IFN-γELISpot测量。在数据截止时，从七名患者中的五名获得足够的细胞以通过ELISpot进行评价。在构建体1和构建体2治疗的患者中，循环功能性E6/E7特异性T细胞的数量达到允许在离体直接ELISpot(即没有T细胞的体外扩增)中检测的水平。
如图7A所示，从基线到第15天，所有患者(n＝5)对HPV16 E6/E7重叠肽具有强烈的抗原特异性T细胞响应的诱导。如图7B所示，在全身接受一个剂量的构建体1单一疗法(IV)的四名患者中观察到从基线到第15天抗原特异性IFN-γ分泌性T细胞增加了高达250倍。另外，在施用单剂量的构建体2单一疗法(IV)后，在一名患者中观察到150倍的增加。
对三名患者进行细胞内细胞因子染色(ICS)。具体地，在基线和第15天通过ICS评价来自三名患者的样品。将来自三名患者(两名患者用构建体1治疗，一名患者用构建体2治疗)的冷冻保存的PBMC用HPV16 E6/E7重叠肽刺激6小时，并洗涤用于后续的免疫染色。通过ICS确定IFN-γ+、TNF-α+、IL-2+、CD107a+、CD4+和CD8+T细胞的频率，接着进行多色流式细胞术分析。通过ICS评价的三名患者属于七名通过ELISpot检测细胞的患者。
图7C至7E示出了三名患者在基线和第15天时针对CD8+T细胞上设门的CD4+和CD8+T细胞的频率以及IFN-γ+、TNF-α+和CD107a+细胞的频率的代表性伪彩图。在基线时与第15天相比，两名患者在分别一个剂量的构建体1(8.3％对32.9％；参见图7C)和构建体2(48.2％对69.3％；参见图7E)后总外周T细胞群中的T细胞增加，主要是CD8+T细胞。在CD8+T细胞中，在施用单剂量的构建体1或构建体2后，E6/E7特异性IFN-γ+CD8+T细胞显著增加。例如，在单剂量的构建体1后，抗原特异性IFN-γ+CD8+T细胞从基线时的0％增加至第15天的2.8％(参见图7C)。在单剂量的构建体2后，抗原特异性IFN-γ+CD8+T细胞从基线时的0％增加至第15天的8.1％(参见图7E)。类似地，E6/E7特异性CD8+T细胞在第15天具有CD107a的较高表达。另一方面，用构建体1治疗的一个患者具有TNF-α+和CD107a+的轻微增加，但IFN-γ+或CD8+T细胞没有增加(参见图7D)。
此外，为了研究循环HPV16 E6/E7特异性CD8+T细胞的多功能性，在三名患者中进行脱粒标志物CD107a和/或细胞因子IFN-γ和TNF-α的共染色，并且相对频率描绘于图7F中。
如上所述，来自使用沙粒病毒载体的首次人体试验的数据首次证明，作为单一疗法用表达E7/E6的构建体1或构建体2全身注射的HPV16+癌症患者的关键全身细胞因子和趋化因子水平增加，这表明病毒诱导的免疫激活。此外，在第一次给药后，患者显示出高达8％的对循环HPV16 E6/E7特异性多功能CD8+T细胞的强烈诱导。
总之，该实施例表明表达E7/E6的沙粒病毒载体构成了对患有免疫疗法和/或化疗难治性HPV16+癌症的患者的新的潜在疗法。
实施例III
基于沙粒病毒的癌症免疫疗法在HPV16+癌症患者中的剂量递增和剂量扩展
本实施例描述了在HPV 16+确认的癌症患者中构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法的首次人体I/II期、多国、多中心、开放标记研究。该实施例包括两个部分：I期剂量递增和II期剂量扩展。在剂量扩展期间探索了患有HPV 16+头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和其他HPV 16+确认的癌症的患者中在使用或不使用帕博利珠单抗的情况下的构建体1单一疗法和/或构建体2/构建体1交替2-载体疗法。
1.所用试剂和先前体内实验
构建体1是基于LCMV毒株克隆13的遗传工程化的载体，其中病毒表面糖蛋白来自LCMV毒株WE(Kallert等人，2017，Nat Commun.2017；8：15327)。构建体1载体递送在三区段的、有复制能力的、减毒沙粒病毒载体中的基于HPV 16 E7和E6蛋白的非致癌合成融合蛋白(矽E7E6融合蛋白)。这种合成的E7E6融合蛋白已在五个关键位置特别突变(Cassetti等人，2004，Vaccine.2004；22(3-4)：520-27)，以消除其成视网膜细胞瘤蛋白和肿瘤蛋白p53结合能力，从而消除亲本E7和E6蛋白的致癌性，同时仍保留完全抗原性。
构建体1含有几个有助于免疫响应的载体颗粒部分。为了设计构建体1，将载体工程化以编码E7E6的突变形式，使得一个小区段(S-区段)携带来自LCMV毒株WE的LCMV病毒表面糖蛋白加上突变的E7E6融合蛋白，并且第二S区段携带LCMV病毒表面核蛋白加上第二、相同拷贝的突变E7E6融合蛋白。此外，构建体1含有LCMV克隆13的大区段(L-区段)。因此，构建体1含有三个基因组区段(即r3LCMV)，两个S区段和一个L区段。三个基因组区段的低效包装是构建体1与野生型LCMV相比减毒的基础。
非临床研究已经证明构建体1在小鼠TC-1模型中可触知HPV 16+肿瘤的肿瘤控制中的功效。构建体1的剂量与免疫原性强烈相关，如图14A所描绘的，并且更高剂量的构建体1也导致小鼠TC-1肿瘤模型中肿瘤生长控制的改善，如图14B所描绘的。具体地，含有少至100个RCV FFU的构建体1剂量显著抑制肿瘤生长。用最高三个剂量的构建体1给药，范围为每剂量10,000至1,000,000个RCV FFU，导致肿瘤生长几乎完全抑制并且在生存时间和总生存期(OS)方面的显著益处。这些数据表明，在这三个剂量中的最低剂量(10,000个RCV FFU)下达到最大有效剂量。构建体1的所有剂量在该模型中被良好耐受。在进一步的非临床研究中，当肿瘤为约100mm3时，向动物IV或IT施用构建体1。在两种情况下，如图14C所示，单剂量的构建体1导致所有治疗小鼠中肿瘤生长的显著抑制，并且IT施用导致约40％的长期生存。该非临床数据表明，当作为HPV 16+肿瘤的局部治疗(TC-1肿瘤的IT施用)施用时，构建体1是高度有效的，这支持作为整体临床开发计划的一部分的通过直接IT施用来施用构建体1。此外，当这些长期生存者在6个月后用相同的肿瘤再攻击时，没有检测到新的肿瘤生长。这种保护作用在仅接受单剂量构建体1来治疗原发性肿瘤的小鼠中是明显的。这些结果提示进一步研究构建体1在人中用于治疗原发性肿瘤、转移性肿瘤和复发性肿瘤的潜力。
构建体2是基于PICV的P18变体的基因工程化的、减毒的有复制能力的三区段PICV载体。构建体2递送与构建体1中相同的非致癌HPV 16 E7E6抗原。
使用与构建体1载体中相同的三区段原理，通过将必需的PICV病毒表面糖蛋白和核蛋白从原始的一个基因组区段分离到两个人工复制的基因组S-区段上，来设计构建体2载体。结果，构建体2载体含有三个基因组区段(矽r3PICV)，包括：携带PICV病毒表面糖蛋白加上突变E7E6融合蛋白的一个S区段，携带PICV病毒表面核蛋白加上第二相同拷贝的突变E7E6融合蛋白的第二S区段，以及PICV的P18变体的L-区段。与构建体1相同，构建体2中这些S区段的遗传设计绝对防止了区段间重组和回复为编码PICV糖蛋白和核蛋白的功能性野生型样单S区段。
在本实施例中，构建体2与构建体1按照顺序交替IV施用策略施用，其中构建体2作为初免剂量IV施用，下一剂量是构建体1IV加强剂量，并且后续的施用在构建体2与构建体1之间顺序交替。该治疗计划被命名为“构建体2/构建体1交替2-载体疗法”。在TC1模型中使用可触知HPV 16+肿瘤的非临床研究已证明，构建体2/构建体1交替治疗方案导致肿瘤生长的抑制和延长的总生存期(OS)，这优于单独的载体(同源构建体1&构建体1和构建体2&构建体2)或用构建体1初免然后用构建体2施用加强。此外，在所有可能的测试组合方案中，构建体2/构建体1交替2-载体疗法诱导最有效的HPV 16 E7特异性CD8 T细胞响应(免疫原性)。如图14D所描绘的，在所有合理设计的构建体1和构建体2的给药方案中，构建体2接着构建体1的顺序IV施用(用105个RCV FFU的构建体2初免并用105个RCV FFU的构建体1加强，一种命名为构建体2/构建体1交替2-载体施用的方案)被证明是最具免疫原性的方案，其触发显著高于由其他组合序列或单一载体方案诱导的响应的HPV 16、E7特异性CD8 T细胞响应。具体地，在接受构建体2/构建体1交替2-载体方案的组(G4)中，HPV E7特异性细胞的频率在构建体1的加强施用后5天达到总CD8 T细胞的约43％。此外，构建体2/构建体1交替2-载体疗法的优异免疫效果在观察期内是持续的(参见图14D)。在使用HPV 16+TC 1肿瘤模型的进一步功效研究中，如图14E所描绘的，与单独使用构建体1或构建体2的同源初免-加强方案(G1和G2)相比，其中每种载体均以105个RCV FFU的剂量IV施用的构建体2/构建体1交替2-载体疗法(G4)也赋予了优异的肿瘤抑制能力。总之，这些发现保证了构建体2/构建体1交替2-载体疗法在HPV 16+癌症患者中的进一步临床测试。
此外，在本实施例中使用帕博利珠单抗帕博利珠单抗最近已被FDA和欧洲委员会批准用于在单一疗法(对于肿瘤PD-L1阳性的患者[CPS≥1])或与化学疗法组合中一线治疗患有转移性或不可切除的复发性HNSCC的患者。
2.实验设计
在IV治疗组中招募HPV 16+HNSCC患者。患有HPV 16+HNSCC和其他HPV 16+确认的癌症的患者被包括在IT IV治疗组中。研究设计的示意图参见图15。
I期剂量递增有两种治疗方案：构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法。将构建体1的单一疗法给予3个不同的组(1、2和5，参见下表2)。研究第1组、第2组和第5组以确定用于静脉内(IV)和瘤内(IT)治疗的构建体1的安全推荐II期剂量(RP2D)。第5组探索了以3个剂量给予构建体1作为IV施用。将构建体2/构建体1交替2-载体疗法给予3个不同的组(3、4和6)。研究第3组、第4组和第6组以确定用于IV施用的构建体2的安全RP2D。第6组探索了施用3个剂量的构建体2/构建体1交替2-载体疗法，使得患者以交替方式接受首先施用的构建体2，接着是构建体1，直到每个患者各自已接受3个剂量的构建体2和构建体1，总共6个剂量。
II期剂量扩展具有至多六个治疗组，如下表2所示。基于来自剂量递增结果的安全性、功效和/或生物标志物数据，相应地开放特定的剂量扩展治疗组。II期剂量扩展A组和B组在I期剂量递增第1组完成后开始。II期剂量扩展D组和E组在I期剂量递增第3组完成时开始。II期剂量扩展C组在I期剂量递增第2组完成后开始。II期剂量扩展F组在I期剂量递增第4组完成时开始。
对于I期剂量递增第1组、第2组、第3组和第4组，每组招募约20名患者；第5组和第6组各自招募约3至6名患者。每组中招募的患者实际数量取决于何时达到RP2D。在已确定剂量水平是安全的之后，可在每组中添加另外的患者以确保获得足够的生物标志物数据。对于II期剂量扩展A组、B组、C组、D组、E组和F组，每组招募约20名患者。本研究共招募约200名患者，其中I期约100名并且II期约60至100名。
表2I期和II期治疗组的概述
IT＝瘤内，IV＝静脉内。
a构建体1作为IV施用。
b构建体1作为第一剂量的IT施用，接着是构建体1作为后续剂量的IV施用。
c构建体2和构建体1的顺序交替IV施用。
d第一剂量是构建体1的IT施用，接着是构建体2和构建体1的顺序交替IV施用。
e构建体1作为IV施用与帕博利珠单抗组合。
f构建体2IV和构建体1IV的顺序交替施用以及帕博利珠单抗。
对于第2组、第4组、C组和F组，其中第一剂量是构建体1的IT施用，如果不应当施用IT施用，则对于给定的剂量水平将第一剂量作为IV给予。在这种情况下，对于给定的剂量水平，该组限于HPV16+非HNSCC癌症。
2.1 I期剂量递增
I期剂量递增是安全性和耐受性阶段；没有主要的功效终点。监测在剂量限制性毒性(DLT)观察期期间施用的第一研究药物的DLT的发生率。记录安全性参数(例如，AE和SAE的类型、频率和严重程度)。还记录了耐受性参数(例如，剂量中断、减少和剂量强度，以及实验室值的评价)。I期的次要功效终点为实体瘤响应评价标准(RECIST)和实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)的客观响应率(ORR)和疾病控制率(DCR)。呈现了ORR和DCR。列出了到事件功效终点的时间(响应持续时间、无进展生存期[PFS]和总生存期[OS])。作为探索性读出，测试了E7和E6抗原特异性T细胞响应、CD4和CD8 T细胞测量结果、在基线和治疗后对CD8示踪剂PET扫描的基于SUV的定量测量的变化，以及肿瘤样本、血液和血清/血浆中的生物标志物。如下分配和治疗六个组的患者。
第1组(仅构建体1 IV)：在HPV 16+HNSCC的患者中构建体1作为持续IV施用。
第2组(构建体1 IT-IV)：在具有适合IT施用的安全且可触及的肿瘤部位的HPV 16+癌症患者中，构建体1作为第一剂量的IT施用，接着是持续的构建体1作为后续剂量的IV施用。
第3组(构建体2IV和构建体1IV)：构建体2作为IV施用(初始)然后接着是构建体1IV，在持续的基础上在HPV 16+HNSCC患者中交替治疗。
第4组(构建体1IT，接着是构建体2IV和构建体1IV)：构建体1作为第一剂量的IT施用。治疗接着是构建体2IV，然后接着是构建体1 IV，在持续的基础上在具有适合IT施用的安全且可触及的肿瘤部位的HPV 16+癌症患者中交替治疗。IT施用仅需要一个肿瘤部位。
第5组(3个剂量的构建体1 IV)：评估以所评价的最高剂量3次施用是否诱导与连续给药相似的E7/E6免疫原性。如果放射学进展，患者可选择IV接受另外3个剂量的构建体1。
第6组(各自3个剂量的构建体2 IV和构建体1 IV)：评估构建体1和构建体2的各自3次施用，总共施用6次，以测试构建体1和2的治疗疫苗的有限数量的施用是否允许达到与疾病控制相配的循环T细胞水平，并且在最后一次注射后持续。
来自第1组、第3组、第5组和第6组的患者是在用标准护理疗法(包括大于或等于1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发的HPV 16+HNSCC患者。来自第2组和第4组的患者是具有适合IT施用的安全且可触及的肿瘤部位的HPV 16+癌症患者，其在用标准护理疗法(包括大于或等于1个全身疗法)时中具有肿瘤进展或复发。
在I期剂量递增期间，探索了回填群组以招募附加的患者，在构建体1单一疗法和/或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的剂量水平下进行评价，该剂量水平被宣称是安全的以更好地评估安全性和潜在功效。
为了研究构建体1和/或2治疗对分子信号传导和肿瘤细胞响应的影响，鉴定可预测功效和响应的生物标志物，所选择的回填群组需要“新鲜的成对活检”。此外，肿瘤材料用于通过免疫组织化学染色定量肿瘤浸润淋巴细胞的水平。该分析提供了对肿瘤中免疫细胞并且特别是CD8+T细胞的肿瘤浸润的评估
回填群组的示意图在图16中呈现。回填群组保持与构建体1单一疗法剂量群组编号相同的编号，并通过添加每个回填群组的小写字母来进一步识别。作为实例，在剂量水平1探索构建体1的构建体1单一疗法剂量群组1宣称安全之后，回填群组被命名为群组1a、1b、1c、1d和1e。
回填群组可探索构建体1和/或构建体2治疗：
·在不同的施用计划中，
·探索帕博利珠单抗与构建体1和/或构建体2治疗的组合，
·招募HPV 16+肛门癌患者，仅IV施用构建体1和/或构建体2，和/或
在附加的时间点收集生物样品用于病毒脱落、淋巴细胞亚群(TruCount)、血清生物标志物和免疫原性的中心分析。
2.1.1附加生物标志物分析
对于回填群组-k，添加用于收集病毒脱落、淋巴细胞亚群(TraCo unt)、血清生物标志物和免疫原性的附加时间点，以提供在q3w、q6w剂量计划针对构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的附加翻译和生物标志物数据。
2.1.2探索用于构建体1和/或2研究治疗的替代给药计划
使用先前推荐的安全剂量的给药频率增加。例如，回填群组-b和-d探索了每2周一次剂量(q2w)施用计划中的构建体1单一疗法。回填群组-c和-e探索了构建体1单一疗法和/或构建体2/构建体1交替2-载体疗法，给药计划为从周期1至4每4周一次，以及从周期5开始每8周一次。该计划称为“q4w、q8w”。如果开放回填群组中的“q2w”或“q4w、q8w”给药计划，则使用与剂量递增群组相同的过程来评价DLT。在探索的替代给药计划中评价构建体1和/或2研究治疗的安全性、耐受性、抗肿瘤活性和免疫原性的表征。
2.1.3在进展后添加构建体1和/或2研究治疗的接受帕博利珠单抗治疗的患者
在研究的I期部分中，所选择的回填群组招募了用帕博利珠单抗单一疗法治疗的患者，这些患者自疾病进展以来继续用帕博利珠单抗治疗并添加构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2载体疗法。允许患者在疾病进展后继续他们的帕博利珠单抗单一疗法并添加构建体1和/或2治疗的基本原理是探索以下假设：一旦患者在使用帕博利珠单抗时进展，如果帕博利珠单抗与另一种治疗组合施用，则抗性或难治性的那些患者可再次开始响应。
回填群组-f和-h允许自疾病进展以来接受帕博利珠单抗治疗的患者继续使用其帕博利珠单抗并按照“q3w、q6w”计划添加构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法。类似地，回填群组-g和-i允许自疾病进展以来接受帕博利珠单抗治疗的患者继续使用其帕博利珠单抗并按照“q4w、q8w”添加构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法。
患者在接受帕博利珠单抗单一疗法时的疾病进展应相应地表征为具有难治性疾病或对帕博利珠单抗具有抗性。难治性和抗性疾病的定义为：根据实体瘤响应评价标准(RECIST)1.1版(v1.1)，将患有难治性疾病(原发抗性)的患者定义为在第一次剂量的帕博利珠单抗单一疗法的＜6个月内进展。疾病稳定(SD)并且然后在第一剂量的帕博利珠单抗的＜6个月内满足疾病进展标准的患者应被视为患有难治性疾病。对帕博利珠单抗具有抗性(继发抗性)的患者被定义为在第一剂量的帕博利珠单抗单一疗法后≥6个月进展。例外情况：由于AE而在中止后具有疾病进展的患者，以及没有接受至少6个月的帕博利珠单抗并且没有初始临床益处证据的患者，将最好被归类为具有原发抗性。
2.1.4仅接受IV施用的HPV 16+肛门癌患者
回填群组-j招募了五名仅接受IV施用的HPV 16+肛门癌患者，以评价构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法在q3w、q6w剂量计划下的功效。为了有资格参与该回填群组，患者必须满足所需的纳入和排除标准。
2.2 II期剂量扩展
II期剂量扩展评估了在I期剂量递增中定义的RP2D下的构建体1单一疗法和/或构建体2/构建体1交替2-载体疗法。
A组、B组、D组和E组中招募的患者是在用标准护理疗法(包括大于或等于1个全身疗法)时具有肿瘤发展或复发的HPV 16+HNSCC患者。C组和F组中招募的患者是具有适合IT施用的安全且可触及的肿瘤部位的HPV 16+癌症患者，其在用标准护理疗法(包括大于或等于1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发。
II期剂量扩展组的主要功效终点是基于RECIST和iRECIST的ORR和疾病控制率。使用点估计以及精确的两侧95％CI根据Clopper-Pearson方法来总结根据RECIST的ORR。II期的次要功效终点是响应持续时间、PFS和OS。记录安全性参数(例如，AE和SAE的类型、频率和严重程度)。还记录了耐受性参数(例如，剂量中断、减少和剂量强度，以及实验室值的评价)。使用描述性统计总结靶病变肿瘤大小相对于基线的百分比变化并在每个时间点呈现。还总结了肿瘤大小的最佳百分比变化。还使用瀑布图以图形方式呈现肿瘤大小。治疗组中具有客观响应的两名患者被视为支持进一步发展。作为探索性读出，测试了E7和E6抗原特异性T细胞响应、CD4和CD8 T细胞测量结果，以及肿瘤样本、血液和血清/血浆中的生物标志物。
3.患者群体
本实施例在患有以下疾病的成人患者中进行：任何来源的HPV 16+HNSCC和HPV 16+癌症(例如，宫颈癌、肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌)。只有满足所有纳入标准且不满足任何排除标准的患者才可招募到本研究中。以下标准适用于I期剂量递增和II期剂量扩展。
3.1纳入标准
只有当以下所有标准都适用时，患者才有资格纳入研究：
1.在签署知情同意书表格(ICF)时，男性或女性患者年龄为18岁或更大。
2.患者必须具有≥1个通过计算机断层摄影(CT)和/或磁共振成像(MRI)可测量的病变，以在研究进行期间按照RECIST和iRECIST评估肿瘤响应。
3.东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0至1。
4.在研究治疗施用前≥4周必须完成现有的治疗性放射疗法。在研究治疗施用前≥2周必须完成现有的局部姑息性放疗。
5.筛选实验室值必须满足以下标准，并且应当在研究治疗施用前28天内获得：
·嗜中性粒细胞绝对计数≥1,500/mm3(1.5×109/L)。
·血小板≥100×103/mm3(100×109/L)。
·血红蛋白≥9g/dL。
·血清肌酐≤2.0×正常上限(ULN)或肌酐清除率＞30mL/min(使用科克罗夫特-高尔特公式(Cockcroft-Gault formula))。
·肝转移受试者的天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶≤2.5×ULN或≤5×ULN。
·总胆红素≤1.5×ULN。总胆红素水平＞1.5×ULN的受试者直接胆红素≤ULN。
·除非受试者正在接受抗凝疗法，国际标准化比值(INR)或凝血酶原时间(PT)≤1.5×ULN，只要PT或部分凝血活酶时间(PTT)在抗凝剂预期使用的治疗范围内即可。
·除非受试者正在接受抗凝疗法，活化部分凝血活酶时间(aPTT)或部分凝血活酶时间(PTT)≤1.5×ULN，只要PT或PTT在抗凝剂预期用途的治疗范围内即可。
6.在研究者看来，能够理解并愿意遵守研究程序、限制和要求。
7.愿意并能够自愿地知情同意参与本研究。
对于治疗第1组、第3组、第5组、第6组、A组或D组中招募的患者
8.患者必须具有经由基因型测试确认的HPV 16+HNSCC的记录。
9.患者必须在用标准护理疗法(包括≥1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发(例如，基于铂的疗法和/或抗PD-1/抗PD-L1疗法失败)或为标准护理疗法禁忌的患者。
10.从最后一次治疗患者进展后收集肿瘤组织(存档[不长于2年]或在筛选期间能够提供新鲜活检样本)，除非申办者和研究者另行约定。
对于在回填群组中招募以在I期治疗第1组、第2组、第3组或第4组中将构建体1和/或2治疗添加到他们持续的帕博利珠单抗疗法中的患者(适用于回填群组-f、-g、-h和-i)
11.患者必须具有经由基因型测试确认的HPV 16+HNSCC的记录。
12.患者必须在用标准护理疗法(包括≥1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发(例如，基于铂的疗法和/或抗PD-1/抗PD-L1疗法失败)或为标准护理疗法禁忌的患者。
13.从最后一次治疗患者进展后收集肿瘤组织(存档[不长于2年]或在筛选期间能够提供新鲜活检样本)，除非申办者和研究者另行约定。
14.患者在招募之前必须接受持续的帕博利珠单抗单一疗法治疗，并且在初始响应后显示进展的证据。
必须满足以下所有标准。
患者必须：
·已接受至少2个周期的基于q3w计划的帕博利珠单抗单一疗法或更长的等效计划(例如，如果为q6w计划，则为1个周期)
·在帕博利珠单抗单一疗法期间，根据RECIST v1.1，表现出肿瘤响应(完全响应[CR]或部分响应[PR])或持续6个月或更长时间的延长SD的最佳响应
·然后通过iRECIST在用帕博利珠单抗单一疗法时进展(如果临床上可接受，在初始RECIST v1.1进展后至少4周通过第二次扫描确认进展)。
注：在开始本研究之前，患者不得中断帕博利珠单抗单一疗法。
对于I期回填群组-j中招募的患者(HPV 16+肛门癌)
患者必须具有：
15.组织学或细胞学确认的局部晚期或转移性肛管鳞状细胞癌。
注：不满足获得性免疫缺陷综合征(AIDS)标准的HIV阳性患者是合格的。注：在招募前超过90天接受HPV预防性疫苗的患者是合格的。
16.通过免疫组织化学记录的HPV 16+肿瘤。HPV 16+测试的样品必须在招募用于基因型测试之前提交。
17.在用标准护理治疗(包括≥1个全身疗法诸如基于铂的化疗)时肿瘤进展或复发，或不符合标准护理疗法。
18.适合活检的安全且可触及的肿瘤部位，除非申办者和研究者另行约定：
注：肿瘤组织可根据该机构对此类程序的自身指导和要求通过图像引导的活检诸如介入放射学获得。
19.除了适合活检的肿瘤部位之外，≥1个可测量病变，以在研究进行期间按照RECIST和iRECIST评估肿瘤响应。
对于在治疗第2组、第4组、C组或F组中招募的患者(第一剂量是作为瘤内施用给予的构建体1)
20.经由基因型测试确认的HPV 16+癌症(任何来源)的记录。
21.在用标准护理疗法(包括≥1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发的患者，或对于标准护理疗法禁忌的患者。
22.患者必须具有适合活检和IT施用的安全且可触及的肿瘤部位，除非申办者和研究者另行约定：
·肿瘤组织可根据该机构对此类程序的自身指导和要求通过图像引导的活检诸如介入放射学获得。
·然后将构建体1IT施用到肿瘤部位。
23.除了适合活检和IT施用的肿瘤部位之外，患者必须具有≥1个可测量病变，以在研究进行期间根据RECIST和iRECIST评估肿瘤响应。
对于在治疗第2组、第4组、C组或F组中招募的患者(如果瘤内施用改为IV施用给予)
24.经由基因型测试确认的HPV 16+非HNSCC癌症的记录。
25.在用标准护理疗法(包括≥1个全身疗法)时具有肿瘤进展或复发的患者，或对于标准护理疗法禁忌的患者。
26.从最后一次治疗患者进展后收集肿瘤组织(存档[不长于2年]或在筛选期间能够提供新鲜活检样本)，除非申办者和研究者另行约定。
对于在II期治疗B组或E组中招募的患者
27.经由基因型测试确认的HPV 16+HNSCC的记录。
28.根据包装说明书或产品特性总结(SmPC)，患者必须符合接受帕博利珠单抗的条件(即，未接受过抗PD-1/抗PD-L1疗法，并且在基于铂类的疗法中进展)。
29.从最后一次治疗患者进展后收集肿瘤组织(存档[不长于2年]或在筛选期间能够提供新鲜活检样本)，除非申办者和研究者另行约定。
3.2排除标准
如果患者满足或具有任何以下标准，则将患者排除在研究之外：
所有患者
1.患有未经治疗和/或有症状的转移性中枢神经系统(CNS)疾病和/或癌性脑膜炎的患者。
例外情况：脑/CNS转移患者符合条件，如果：
·他们已接受手术或放疗，并且他们的疾病是稳定的(对于每次评估使用相同的成像模式，MRI或CT扫描，没有通过成像获得的进展的证据)，并且任何神经病学症状均已恢复至基线，并且
·他们没有新的或扩大的脑转移的证据，并且
·在首次施用研究治疗之前，他们已服用稳定剂量的皮质类固醇(≤10mg泼尼松或等效物)持续≥4周是合格的。
注：该例外情况不包括无论临床稳定性如何均被排除的癌性脑膜炎。
2.可能增加与研究参与或研究治疗施用相关的风险、损害患者接受研究治疗的能力或干扰研究结果解释的任何严重或不受控制的医学病症。这包括临床上显著的(即，活动性)心血管疾病，包括招募前6个月以下的脑血管意外/中风和心肌梗塞、不稳定型心绞痛、充血性心力衰竭(纽约心脏协会分类II类)或严重的不受控制的心律失常。
3.在筛查时是临床上显著的或需要积极干预的并发恶性肿瘤(充分治疗的基底或鳞状细胞癌、非黑素瘤皮肤癌除外)，除非申办者和研究者另行约定。
4.需要免疫抑制疗法的活动性、已知或疑似自身免疫性或炎性疾病，低剂量泼尼松(≤10mg或等效物)除外。以下为本标准的例外情况：
·白癜风或脱发患者。
·激素替代稳定的甲状腺功能减退(例如，在桥本综合征之后)的患者。
·任何不需要全身治疗的慢性皮肤病症。
5.归因于在首次施用研究治疗前未痊愈至1级或基线的全身既往抗癌疗法(包括放疗和手术)的毒性，除脱发和疲劳外。允许招募具有归因于全身既往抗癌疗法的毒性的患者，该毒性预期不会消退并导致长期后遗症，例如基于铂的疗法后的神经病变或耳毒性。
6.在首次施用研究治疗的28天内用任何化疗、生物疗法或研究疗法治疗癌症，除非申办者和研究者基于抗癌疗法的半衰期在个案基础上另行约定。
例外情况：如果受试者招募到回填群组中，则允许用帕博利珠单抗进行持续治疗，继续帕博利珠单抗并且添加构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法。
7.用免疫抑制药物或替代药物的治疗：
·在首次施用研究治疗的14天内，全身药物诸如类固醇或吸收的局部类固醇的免疫抑制剂量(剂量＞10mg/天泼尼松或等效物)。
注：在没有活动性自身免疫疾病的情况下，允许吸入或局部使用剂量相当于＞10mg/天泼尼松的类固醇和肾上腺替代物。
·在首次施用研究治疗前6个月内的任何慢性免疫抑制药物(除非申办者和研究者在个案基础上另行约定)。
·在过去2年中需要全身治疗的活动性自身免疫疾病(即，使用疾病调节剂、皮质类固醇或免疫抑制药物)。替代疗法(例如甲状腺素、胰岛素或用于肾上腺或垂体功能不全的生理性皮质类固醇替代疗法等)不被认为是全身治疗的形式。
8.对人免疫球蛋白或抗体制剂施用的既往过敏性或其他严重反应。
9.在研究治疗首次剂量前28天内接受活疫苗，除非申办者和研究者另行约定。
10.在研究治疗首次剂量前28天内服用的具有免疫刺激特性或已知潜在干扰主要器官功能的草药疗法，除非申办者和研究者另行约定。
11.研究期间怀孕、哺乳或计划怀孕的女性患者。
12.需要全身疗法的活动性感染，除非申办者和研究者在个案基础上另行约定。
13.乙肝表面抗原(HBsAg)或丙肝病毒(HCV)抗体测试阳性，提示有急性或慢性感染。允许招募HCV抗体测试阳性但HCV核糖核酸(RNA)测试阴性的患者。
14.已知的AIDS史。对HIV的测试不是强制性的。
注：没有AIDS的CD4 T细胞＞200/mm3的HIV阳性患者是合格的。
15.研究者判断禁忌参与本研究的其他并发的严重和/或不受控制的医学病症(例如，胰腺炎、活动性肝炎、慢性阻塞性或限制性肺病，包括休息时呼吸困难或间质性肺病、肾上腺功能不全、不受控制的高血压)。
16.不允许进行医学随访和不符合研究方案的心理、家庭、社会或地理条件。
对于在研究中接受帕博利珠单抗的患者(第1组、第2组、第3组或第4组的I期回填群组-f、-g、-h和-i；II期B组或E组的所有患者)
17.帕博利珠单抗严重超敏反应史。
18.根据包装说明书或SmPC接收帕博利珠单抗的任何禁忌症
19.同种异体组织/实体器官移植。
20.需要类固醇的(非感染性)肺炎史或当前肺炎。
4.治疗方案
4.1 I期方案
第1组(静脉内施用构建体1)：从第1至第4周期，每3周一次施用构建体1。从第5周期开始及以后，每6周一次施用构建体1。该计划被称为“q3w、q6w”对于第1至4周期，治疗周期被定义为21天的时间段。在每个周期的第1天(±3天)IV施用构建体1剂量。对于第5周期和后续周期，治疗周期被定义为42天的时间段。在每个周期的第1天(±7天)IV施用构建体1剂量。
第2组(单次瘤内施用构建体1，接着静脉内施用构建体1)：从第1至第4周期，每3周一次施用构建体1。从第5周期开始及以后，每6周一次施用构建体1。该计划被称为“q3w、q6w”对于第1至4周期，治疗周期被定义为21天的时间段。治疗从第1周期的第1天以单次IT施用构建体1开始。在第2周期的第1天(±3天)和之后，IV施用后续构建体1剂量。对于第5周期和后续周期，治疗周期被定义为42天的时间段。在每个周期的第1天(±7天)IV施用构建体1剂量。
IT施用可由诸如介入放射学的图像引导程序来执行。IT施用的方法按照机构标准。如果通过直接IT施用递送总体积在技术上不可行，则剩余的构建体1体积应当通过瘤周和/或局部施用递送(第5节)。
患者具有一个选择用于活检和IT施用构建体1的病变。所选择的病变不根据RECIST和iRECIST评估肿瘤响应(例如，可单独地跟踪病变的直径变化，但不应包括在RECIST评估的直径总和内)。
第3组(静脉内施用构建体1和构建体2)：对于第1和第2周期，治疗周期被定义为42天的时间段。向患者首先施用构建体2，然后接着是构建体1，每3周(21天)一次交替治疗，并且窗口期为±3天，如下：在第1和第2周期的第1天IV施用构建体2。在第1和第2周期的第22天IV施用构建体1。对于第3周期和后续周期，治疗周期被定义为84天的时间段。第3周期第1天在第2周期第42天完成后开始。构建体2和构建体1剂量依次施用，每6周(42天)一次交替，窗口期为±7天，如下：在第3周期和后续周期的第1天IV施用构建体2。在第3周期和后续周期的第43天IV施用构建体1。该计划被称为“q3w、q6w”
第4组(单次IT施用构建体1，接着交替静脉内施用构建体2和构建体1)：治疗从第0周期第1天初始IT施用构建体1开始。21天(3周)后，治疗继续在第1周期的第1天IV施用构建体2并在第22天IV施用构建体1。对于第1和2周期，治疗周期被定义为42天的时间段。构建体2和构建体1剂量依次施用，每3周(21天)一次交替，窗口期为±3天，如下：在第1和第2周期的第1天IV施用构建体2。在第1和第2周期的第22天IV施用构建体1。对于第3周期和后续周期，治疗周期被定义为84天的时间段。第3周期的第1天在第2周期的第42天完成后开始。构建体2和构建体1剂量依次施用，每6周(42天)一次交替，窗口期为±7天，如下：在第3周期和后续周期的第1天IV施用构建体2。在第3周期和后续周期的第43天IV施用构建体1。该计划被称为“q3w、q6w”IT施用类似于上面第2组中所述的施用。
第5组(静脉内施用三个剂量的构建体1)：治疗第5组探索了施用3个剂量的构建体1单一疗法。患者每3周一次接受构建体1的IV施用，并在接受第三剂量后停止。该治疗计划被称为“3-剂量构建体1”。治疗周期被定义为21天(3周)的时间段。在第1、2和3周期的第1天(±3天)间隔3周给予3个剂量的构建体1。从施用第一剂量的构建体1开始，每42天(6周)一次进行肿瘤扫描以评估功效。使用RECIST测量肿瘤响应直至疾病进展。在根据RECIST的疾病进展后，使用iRECIST评估肿瘤响应。
在如RECIST或iRECIST所定义的放射学进展后，并且在患者接受完全3-剂量方案后，患者可接受间隔3周施用的另外3个剂量的构建体1。在3-剂量方案期间疾病进展的患者没有资格接受附加的3个剂量。将功效评估重新基线化至RECIST。每42天(6周)一次继续进行肿瘤扫描。在根据RECIST的疾病进展后，使用iRECIST评估肿瘤响应。根据iRECIST疾病进展后，患者继续进行研究EOT访视并完成所需的评估。
第6组(静脉内施用三个剂量的构建体2和构建体1)：治疗第6组探索了施用3个剂量的构建体2/构建体1交替2-载体疗法。患者各自接受3个剂量的构建体2和构建体1，其中他们总共接受6个剂量。治疗周期被定义为42天的时间段。在每个周期中，以交替的方式首先施用构建体2，接着是构建体1。每个剂量间隔3周给予，窗口期为±3天，如下：在第1、2和3周期的第1天IV施用构建体2。在第1、2和3周期的第22天IV施用构建体1。该治疗计划被称为“3-剂量构建体1和构建体2”。
从施用第一剂量的构建体2开始，每42天一次进行肿瘤扫描以评估功效。使用RECIST测量肿瘤响应直至疾病进展。在由RECIST或iRECIST定义的放射学进展后，患者接受完全3-剂量方案后，可给予另一“3-剂量构建体2和构建体1”治疗。在“3-剂量构建体2和构建体1”方案期间疾病进展的患者没有资格接受附加的3个剂量。将功效评估重新基线化至RECIST。每42天(6周)一次继续进行肿瘤扫描。在根据RECIST的疾病进展后，使用iRECIST评估肿瘤响应。根据iRECIST疾病进展后，患者继续进行研究EOT访视并完成所需的评估。
4.2 II期剂量扩展研究治疗计划
基于对来自剂量递增治疗组的安全性、功效和/或生物标志物结果的可用数据的回顾，类似地选择II期剂量扩展的给药计划。用于剂量扩展的研究治疗给药计划可以是以下之一：
·按照“q3w、q6w”计划施用构建体1和/或2研究治疗。
·每2周一次施用构建体1和/或2研究治疗。该计划被称为“q2w”。
·构建体1和/或2研究治疗从第1至第4周期每4周一次施用，并且在第5周期开始和之后每8周一次施用。该计划被称为“q4w，q8w”。
·构建体1和/或2治疗的三剂量方案，其中每个剂量间隔3周给予。该治疗计划被称为“3-剂量构建体1和/或2治疗”。
A组(静脉内施用构建体1)：构建体1单一疗法的II期剂量扩展A组可在I期剂量递增第1组完成后开始(确定在IV施用时构建体1的RP2D)。对于第1至第4周期，治疗周期被定义为21天的时间段：在每个周期的第1天(±3天)IV施用构建体1剂量。对于第5周期和后续周期，治疗周期被定义为42天的时间段：在每个周期的第1天(±7天)IV施用构建体1剂量。
B组(静脉内施用构建体1和帕博利珠单抗)：构建体1单一疗法和帕博利珠单抗的II期剂量扩展B组可在I期剂量递增第1组(确定在IV施用时构建体1的RP2D)完成后开始。患者正在接受构建体1单一疗法和帕博利珠单抗。对于第1至4周期，治疗周期被定义为21天的时间段。仅在每个周期的第1天(±3天)IV施用构建体1剂量。对于第5周期和后续周期，治疗周期被定义为42天的时间段。在每个周期的第1天(±7天)IV施用构建体1。帕博利珠单抗以q3w或q6w计划施用，与研究访视重叠。
C组(单次IT施用构建体1，接着静脉内施用构建体1)：构建体1单一疗法的II期剂量扩展C组可在I期剂量递增第2组(确定构建体1IV和IT的RP2D)完成后开始。对于第1至4周期，治疗周期被定义为21天的时间段。治疗从第1周期的第1天以单次IT施用构建体1开始。在每个周期的第1天(±3天)IV施用后续构建体1剂量。对于第5周期和后续周期，治疗周期被定义为42天的时间段。在每个周期的第1天(±7天)IV施用构建体1剂量。
IT施用可由诸如介入放射学的图像引导程序来执行。IT施用的方法按照机构标准。理想地，应当经由直接IT施用递送所有体积。如果通过直接IT施用递送总体积在技术上不可行，则剩余的构建体1体积应当瘤周递送和/或局部施用(参见第5节)。
患者具有一个选择用于活检和IT施用构建体1的病变。所选择的病变不根据RECIST和iRECIST评估肿瘤响应(例如，可单独地跟踪病变的直径变化，但不应包括在RECIST评估的直径总和内)。所有其他病变不接受构建体1或进行活检。
D组(顺序交替静脉内施用构建体2和构建体1)：构建体2/构建体1交替2-载体疗法的II期剂量扩展D组可在I期剂量递增第3组(确定在顺序交替计划中与构建体1一起IV施用时构建体2的RP2D)完成后开始。对于第1和2周期，治疗周期被定义为42天的时间段。治疗从第1周期的第1天IV施用构建体2开始，接着如以下指定的，每3周(21天)一次交替施用构建体1。构建体2和构建体1剂量施用具有±3天的窗口期。在第1和2周期的第1天IV施用构建体2。在第1和2周期的第22天IV施用构建体1。对于第3周期和后续周期，治疗周期被定义为84天的时间段。第3周期的第1天在第2周期的第42天结束后开始。构建体2和构建体1剂量施用在第3周期和后续周期中具有±7天的窗口期。如下每6周(42天)一次交替构建体2和构建体1剂量：在第3周期和后续周期的第1天IV施用构建体2。在第3周期和后续周期的第43天IV施用构建体1。
E组(顺序交替静脉内施用构建体2和构建体1以及帕博利珠单抗)：构建体2/构建体1交替2-载体疗法和帕博利珠单抗的II期剂量扩展E组可在I期剂量递增第3组(确定在顺序交替计划中与构建体1一起IV施用时构建体2的RP2D)完成后开始。对于第1至2周期，治疗周期被定义为42天的时间段。治疗从第1周期的第1天IV施用构建体2开始。构建体2和构建体1剂量施用在第1和第2周期中具有3天的窗口期。如下每3周(21天)一次交替向患者施用前两个剂量的构建体2和构建体1：在第1和第2周期的第1天IV施用构建体2。在第1和第2周期的第22天IV施用构建体1。对于第3周期和后续周期，治疗周期被定义为84天的时间段。第3周期的第1天在第2周期的第42天结束后开始。构建体2和构建体1剂量施用在第3周期和后续周期中具有±7天的窗口期。如下每6周(42天)一次交替构建体2和构建体1剂量：在第3周期和后续周期的第1天IV施用构建体2。在第3周期和后续周期的第43天IV施用构建体1。帕博利珠单抗以q3w或q6w计划施用，与研究访视重叠。
F组(瘤内施用构建体1，接着顺序交替静脉内施用构建体2和构建体1)：
II期剂量扩展F组可在I期剂量递增第4组(确定在IT施用时构建体1的RP2D，接着确定在IV施用时顺序交替计划的构建体2和构建体1的RP2D)完成后开始。
治疗从第0周期的第1天初始IT施用构建体1开始。IT施用可由诸如介入放射学的图像引导程序来引导。21天后，继续治疗，在第1周期的第1天IV施用构建体2并且在第22天IV施用构建体1。理想地，应当经由直接IT施用递送所有体积。如果通过直接IT施用递送总体积在技术上不可行，则剩余的构建体1体积应当瘤周递送和/或局部施用(参见第5节)。
对于第1和2周期，治疗周期被定义为42天的时间段。第2周期中的构建体2和构建体1剂量施用具有±3天的窗口期。如下每3周(21天)一次交替向患者施用构建体2和构建体1：在第1和第2周期的第1天IV施用构建体2。在第1和第2周期的第22天IV施用构建体1。对于第3周期和后续周期，治疗周期被定义为84天的时间段。第3周期的第1天在第2周期的第42天结束后开始。构建体2和构建体1剂量施用在第3周期和后续周期中具有±7天的窗口期。如下每6周(42天)一次交替构建体2和构建体1剂量：在第3周期和后续周期的第1天IV施用构建体2。在第3周期和后续周期的第43天IV施用构建体1。IT施用类似于上面C组中的施用。
4.3在疾病进展后添加帕博利珠单抗
对于仅在治疗第1组、第2组、第3组或第4组中招募并且如iRECIST所定义的后续放射学进展的患者，可将帕博利珠单抗添加到构建体1和/或2治疗中。应使用与帕博利珠单抗群组相关的纳入和排除标准来评估接受帕博利珠单抗的资格(参见第3节)。帕博利珠单抗的给药应与研究访视重叠，并遵循q3w或q6w计划，这取决于构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法指定的治疗计划。
当将帕博利珠单抗添加到构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法中时，使用RECIST v1.1对功效评估进行重新基线化。在根据RECIST的疾病进展后，使用iRECIST评估肿瘤响应。
5.治疗施用
用于IT施用的构建体1的总体积取决于暂定构建体1的处方剂量(参见表3)。选择一个病变和/或疾病部位用于构建体1IT施用。这应该是选择用于构建体1IT施用前和施用后活检的相同病变/疾病部位。理想地，应当经由直接IT施用递送所有体积。如果通过直接IT施用递送总体积在技术上不可行，则剩余的构建体1体积应当通过瘤周和/或局部施用递送，主要目的是治疗一种特定病变或疾病部位。为了确保施用构建体1处方剂量的全部体积，允许以下类型的施用：
·直接IT施用(肿瘤渗漏，如果其发生是可接受的)；
·瘤周施用(如果直接IT注射在技术上有困难)；
·肿瘤附近的局部施用(如果IT和瘤周注射在技术上有困难)。
总IT体积的递送可经由一次注射或经由多于一次注射、或经由一次注射和多次重新定位针而不撤回、或组合进行。
帕博利珠单抗应按照机构指南或按照护理标准诸如适当的SmPC或包装说明书进行施用。
6.给药
6.1针对构建体1探索的剂量水平
下表3描述了构建体1的起始剂量和在I期剂量递增期间可评价的剂量水平(第1组和第2组)。对于I期剂量递增第1组(仅构建体1IV)，构建体1的起始剂量从5×105个RCV FFU开始。将构建体1的后续剂量增加至如表3所列的下一个连续剂量水平。对于I期剂量递增第2组(构建体1IT-IV)，构建体1的IT施用的起始剂量从5×105个RCV FFU开始。IV施用的起始剂量也从5×105个RCV FFU开始。用于IT和IV施用的构建体1的后续剂量是相同的，并且两者都增加至如表3所列的下一个连续剂量水平。
对于I期剂量递增第5组(3-剂量构建体1方案)，剂量可从第1组中宣称安全的最高剂量水平开始增加一个对数级。作为实例，当第5组招募患者并且第1组中宣称安全的最高构建体1剂量为5×106个RCV FFU时，第5组可探索的构建体1剂量水平为5×107个RCVFFU。将构建体1的后续剂量水平增加至如表3所列的下一个连续剂量水平。
表3暂定构建体1剂量递增
FFU＝病灶形成单位，RCV＝有复制能力的病毒。
6.2针对构建体2/构建体1交替2-载体疗法探索的暂定剂量水平构建体2的拟定人体起始剂量为1×106个RCV FFU。构建体1的拟定人体起始剂量是第1组或第2组中宣称安全的最高剂量水平。如果RP2D被宣称用于来自单一疗法的构建体1，则构建体2/构建体1交替2-载体疗法中的构建体1剂量水平保持在RP2D，同时探索构建体2暂定水平。表4描述了构建体2/构建体1交替2-载体疗法的起始剂量和在I期剂量递增期间可评价的剂量水平(第3组和第4组)。
对于I期剂量递增第6组(3-剂量构建体2和构建体1 IV)，构建体2和构建体1的剂量可从第3组中宣称安全的最高剂量水平开始增加一个对数级。作为实例，在第6组招募患者并且第3组中宣称安全的最高构建体2和构建体1交替2-载体治疗剂量对于构建体1为5×106个RCV FFU并且对于构建体2为1×106个RCV FFU时，第6组的剂量对于构建体1可为5×107个RCV FFU并且对于构建体2可为1×107个RCV FFU。将构建体2和构建体1的后续剂量水平增加至如表4所列的下一个连续剂量水平。
表4暂定构建体2和构建体1剂量
FFU＝病灶形成单位，RCV＝有复制能力的病毒，RP2D＝推荐的II期剂量。
a群组中探索的构建体1或构建体2剂量可以是低于暂定剂量表中所示的剂量水平。
b群组1中构建体1的剂量是在第1组和第2组中确定的RP2D，或如果尚未达到RP2D则是确定为安全的最高剂量。
6.3帕博利珠单抗的给药
对于II期的B组和E组，帕博利珠单抗以200mg每3周一次或400mg每6周一次的计划施用。
7.功效评估
利用胸部/腹部/骨盆和涉及该疾病的所有可疑解剖区域的CT或MRI扫描来评估功效，并进行评估肿瘤响应。对于胸部扫描，CT模式是强制性的。不应使用超声来测量疾病部位。如果CT/MRI扫描计划在研究治疗施用的同一天，则CT/MRI应在给药前进行。
对于如iRECIST所定义的后续放射学进展的患者以及在继续构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的同时引入帕博利珠单抗的患者(第5.3.5节)，将功效评估重新基线化至RECIST。在根据RECIST的疾病进展后，使用iRECIST评估肿瘤响应。
应确认任何完全响应(CR)或部分响应(PR)，优选地以计划的时间间隔，但不得早于初始记录CR或PR后4周。CR或PR的确认可在初始记录CR或PR后的下一次可评价肿瘤评估时确认。
表5肿瘤响应评估
iRECIST＝实体瘤免疫响应评价标准，ORR＝客观响应率，PFS＝无进展生存期，RECIST＝实体瘤响应评价标准
8.安全性评估
进行本领域熟知的某些安全测量，诸如身体检查、生命体征、身高、体重、心电图和临床实验室参数。
此外，收集来自唾液、粪便(例如粪便拭子)、血液和尿液的样品用于病毒脱落分析。通过定量逆转录PCR分析病毒脱落以定量核蛋白RNA的拷贝，并且可与感染性测定结合以表征脱落材料，从而确认不存在感染性病毒。对于病毒脱落收集，所收集的样品不应来自可能含有活癌细胞的区域。
9.生物标志物
9.1血液中的生物标志物评估
为了解决鉴定可能的构建体1、构建体2和帕博利珠单抗PD标志物的探索性目的，评价了一些探索性候选生物标志物(参见表6)。
在研究期间，收集血样(包括血清和血浆)用于表型分析、基因组分析、蛋白质组分析和转录分析。收集血样用于淋巴细胞亚群的表型表征。进行血液中信使RNA表达谱分析以评价与临床响应和/或抗性相关的基因标记。收集血浆用于循环肿瘤DNA评估。评估血清中针对研究治疗的中和抗体和结合抗体(主要是E7E6融合蛋白)和促炎性Th1/Th2细胞因子诸如IL 1、IL 12和IL-18、TNF以及IFN-γ。
表6生物标志物样品收集和分析总结
bAb＝抗药物抗体，ctDNA＝循环肿瘤脱氧核糖核酸，GEP＝基因表达谱，IHC＝免疫组织化学，MHC＝主要组织相容性复合体，RNA＝核糖核酸，TCR＝T细胞受体，TIL＝肿瘤浸润淋巴细胞，WES＝全外显子组测序。
9.2肿瘤组织中的生物标志物评估
收集肿瘤组织样品的目的是研究构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法对分子信号传导和肿瘤细胞响应的作用，鉴定可预测功效和响应的生物标志物。
通过诸如介入放射学的图像引导活检来获得肿瘤组织。所有患者将来自核心或切除活检(不接受细针抽吸)的组织送至中心实验室进行生物标志物评估。
新技术诸如下一代测序的应用提供了在肿瘤基因水平上进行评估的机会。在从患者获得的肿瘤组织中检查下一代生物标志物，诸如通过RNA测序的基因表达谱标记、微卫星不稳定性、肿瘤突变负荷和人白细胞抗原杂合性缺失，以了解临床响应和/或抗性的潜在生物标志物。
此外，肿瘤材料用于通过免疫组织化学染色定量肿瘤浸润淋巴细胞的水平。该分析提供了对肿瘤中免疫细胞并且特别是CD8+T细胞的肿瘤浸润的评估。
9.2.1肿瘤组织样品收集
肿瘤样品在筛选时或在首次研究药物施用当天和给药后收集。如果可触及，应提供新鲜的肿瘤活检。如果肿瘤活检和CT/MRI扫描在同一访视中进行，则应首先进行CT/MRI扫描，接着进行肿瘤活检。
对于接受构建体1IT作为第一剂量(构建体1单一疗法的第1周期第1天前剂量或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的第0周期第1天前剂量)的患者：
·在构建体1IT施用前选择一个病变进行活检。
·同一病变也接受构建体1 IT施用，除非申办者和研究者另行约定。
对于招募入图16中指定的回填群组的患者，在参与回填群组的首次疗效评估CT/MRI扫描之前的首次研究药物施用之前和给药后需要成对的新鲜肿瘤活检。
组织样品必须是新近从核心或切除活检(不接受细针抽吸)获得的，用于生物标志物评估。需要提交具有最大肿瘤病灶(至少两个核心)或最高肿瘤细胞性的肿瘤块。剥除/切除样本的肿瘤块优于载玻片。
9.3其他探索性生物标志物评估
除了第9.1节和第9.2节中规定的生物标志物外，可对实施例期间收集的任何肿瘤组织、血清/血浆和外周单核细胞(PBMC)样品进行探索性生物标志物研究。这些附加的研究可扩展对构建体1和/或构建体2功效和/或安全性的其他潜在相关生物标志物的搜索。附加的探索性生物标志物包括四聚体分选的抗原特异性T细胞谱、T细胞受体测序和抗原特异性T细胞上的染色质变化。
10.免疫原性
在所有患者中进行免疫原性测试以通过经由细胞内染色测量IFN-γ、TNF-α、IL-2、CD107a以监测患者的CD8+T细胞功能和抗原识别以及外周血单核细胞中分泌的IFN-γ特异性细胞，作为在具有和不具有帕博利珠单抗的情况下针对构建体1和/或构建体2的抗原特异性免疫响应(参见表7)。
表7免疫原性分析总结
CD4＝分化簇4，CD8＝分化簇8，E7E6＝来自人乳头瘤病毒16的抗原性E7和E6融合蛋白，ELISpot＝酶联免疫吸附斑点，ICS＝细胞内细胞因子染色，IFN-γ＝干扰素-γ，IL-2＝白介素-2，LMCV＝淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，NP＝核蛋白，PBMC＝外周血单核细胞；PICV＝皮钦德病毒，TNF-α＝肿瘤坏死因子α。
11.探索性成像子研究
该探索性免疫成像目标的目的是在用构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法治疗后捕获CD8+细胞向肿瘤组织中的分布和流入。具体地，通过使用CD8 PET示踪剂评估全身PET/CT图像来测量CD8+细胞的分布，以评价在用构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法治疗前后的变化。临床结果通过量化CD8 PET示踪剂信号相关。此外，评价治疗前后CD8 PET示踪剂信号的变化被用于预测治疗功效，并且还区分了构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法早期期间的真实放射学进展和伪进展。
在实施例的I期剂量递增部分期间，进行了一项子研究，包括用正电子发射断层摄影(PET)/CT扫描的探索性免疫成像，以评估在接受构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的HNSCC患者中的89Zr-Df-IAB22M2C(CD8 PET示踪剂，一种抗CD8微抗体(IAB22M2C)，其与去铁胺(Df)缀合并用锆-89(89Zr-Df-IAB22M2C)放射性标记)。在5-10分钟内IV施用剂量为1.0(±20％)mCi的CD8 PET示踪剂1.5mg的API。通过基于标准化摄取值(SUV)的定量测量(SUVmax、SUVpeak、SUVmean、CD8肿瘤体积)来确定肿瘤中的CD8PET示踪剂摄取。定量SUV＞20％SUVmax时CD8摄取增加的肿瘤组织的体积。
分别招募I期剂量递增治疗第1组和第3组的HPV 16+确认癌症患者的两个回填群组(参见实施例III第2.1节)用于CD8 PET示踪剂成像研究。对于来自第1组的患者，在第一剂量的构建体1 IV施用之前2周(14天)内(基线成像)以及在第二剂量的构建体1施用后8至12天内(治疗后成像)接受作为IV输注的CD8 PET示踪剂。在每次输注CD8 PET示踪剂后24±3小时获得PET/CT扫描(基线PET和治疗后PET)。对于来自第2组的患者，在第一剂量的构建体2IV施用之前2周(14天)内(基线成像)以及在第一剂量的构建体1施用后8至12天内(治疗后成像)接受作为IV输注的CD8 PET示踪剂。在每次输注CD8 PET示踪剂后24±3小时获得PET/CT扫描(基线PET和治疗后PET)。
实施例IV
HPV16+癌症患者中基于沙粒病毒的有效癌症免疫疗法
本实施例说明了实施例III的剂量递增部分的初步数据。
共招募38名患者，其中32名患者被诊断为患有HNSCC，并且6名患者被诊断为患有非HNSCC HPV16+癌症(参见表8)
在所评价的任何群组中均未观察到剂量限制性毒性，并且在剂量水平和方案中均未观察到显著变化。未报告相关严重或相关≥3级事件，且未出现剂量减少、剂量中断、中止或死亡。
在受治疗患者中观察到疾病控制和延长的生存期。如图17所示，相当一部分患者经历了疾病稳定或肿瘤缩小。图17A中的游泳图示出了治疗持续时间和个体患者对沙粒病毒载体疗法的响应，其中治疗时间计算为最后一次治疗或死亡减去第一剂量日期加一。图17B中的瀑布图示出了接受沙粒病毒载体疗法的患者中靶病变相对于基线的变化。大多数患者经历了疾病稳定。在部分响应和肿瘤减小的一些患者中观察到了沙粒病毒载体疗法的抗肿瘤活性。疾病控制率总体为62％。约34％的患者经历了肿瘤消退。为了评估不同施用模式、计划和剂量水平之间的差异，对于＞1名患者的群组分析了相对于基线的平均最佳靶病变变化(SOD)。图17C中的相应结果证明了静脉内(IV)施用优于瘤内(IT)施用。此外，载体施用之间的三周间隔似乎优于每两周一次施用的载体。数据进一步表明，与接受相同剂量的构建体1单一载体治疗的患者相比，用构建体2/构建体1交替2-载体疗法治疗的患者具有更好的抗肿瘤效果。如图17D和表9所示，在沙粒病毒载体疗法后相当一部分患者展示出疾病稳定。接受沙粒病毒载体疗法的患者的几个终点，诸如响应率、疾病控制率和无进展生存期，总结于下表9中。总体而言，客观响应率为6.9％，其中2名患者达到部分响应并且16名患者经历了疾病稳定。在具有稳定疾病的那些患者中，有4名患者维持这种响应至少16周。十一名患者疾病进展并且18名患者疾病得到控制。所有患者的中位无进展生存期为2.27个月。然而，用构建体1每3周一次以剂量水平1或2静脉内施用治疗的头颈部鳞状细胞癌患者具有18.2％的客观响应率，其中2名患者实现部分响应，并且6名患者(54.5％)经历了疾病稳定。中位PFS为3.45个月。在接受每3周一次IV施用DL1的构建体2和DL2的构建体1的构建体2/构建体1交替2-载体疗法的患者中，4名患者中有4名经历了疾病稳定，其中中位无进展生存期为3.58个月。图17E示出了所有HNSCC患者的无进展生存期。
有趣的是，以淋巴结病变作为唯一靶病变的患者比以非淋巴结器官作为靶病变的患者对沙粒病毒载体疗法的响应更好(参见图17F)。同样有趣的是，接受每三周一次构建体1 DL2的IV施用(G1DL2Q3W)和每三周一次构建体2/构建体1交替2-载体疗法的IV施用(G3DL1和DL2 Q3W)的患者在靶病变中显示出最佳响应(参见图17G)。当比较靶病变直径变化的最佳总和与治疗时间时，大多数具有较长治疗持续时间的患者经历了疾病稳定或肿瘤减小。直径变化的最佳总和与治疗时间之间的相关性在图17H中描绘。作为一项案例研究，在一名患有转移性头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和口咽原发病变部位的特定患者中，在用每三周一次构建体1 DL2单一疗法静脉内治疗后观察到快速的疾病稳定，接着是部分响应。在用构建体1治疗之前，相应患者已接受了以下在先治疗：(1)顺铂+XRT；(2)卡铂/紫杉醇/西妥昔单抗；和(3)帕博利珠单抗。图17G所示的CT扫描证明在第39和80天肿瘤减小(参见图17F)。当确认疾病进展时，患者继续接受构建体1沙粒病毒载体疗法127天。
总之，基于沙粒病毒的治疗性疫苗的安全性特征是特别可接受的。构建体1单一疗法和构建体2/构建体1交替2-载体疗法两者在晚期HPV16+肿瘤患者中通常是良好耐受的。作为没有任何组合的单一剂，该疗法在这些重度预治疗的HPV16+HNSCC患者中展示出初步的抗肿瘤活性(参见下表10)。
实施例V
基于沙粒病毒的癌症免疫疗法在HPV16+癌症患者中诱导的免疫原性
该实施例说明了由单独的构建体1以及构建体2/构建体1交替2-载体疗法诱导的强免疫原性。
图18A作为6A图的更新，展示了施用构建体1后不同的血清细胞因子或趋化因子标记。在第一次治疗后的第4天已经在90％的分析患者中观察到增加的IFN-γ水平。除了IFN-γ之外，其他免疫刺激细胞因子和趋化因子也在受治疗患者中上调，证明NK和T细胞激活的早期征兆。例如，单剂量的构建体1在治疗后第4天增加了患者中IFN-γ、IFN-诱导型蛋白(IP)-10、白介素(IL)-12p40、IL-15和肿瘤坏死因子TNF-α的水平。图18B作为图6B的更新，示出了在用DL 1(5x105个RCV FFU)或DL2(5x106个RCV)的构建体1单一疗法或构建体2/构建体1交替2-载体疗法(构建体2：1x106个RCV FFU，构建体1：5x106个RCV FFU)治疗后第4天患者中IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα的水平增加。
此外，通过ELISpot和细胞内细胞因子染色来测量抗原特异性T细胞响应的诱导。尽管本领域常见的是仅在体外刺激(IVS)4-14天以扩增T细胞并增加检测抗原特异性T细胞的可能性后，通过IFN-γELISpot来测量癌症治疗剂的免疫原性，但在用沙粒病毒载体疗法治疗后抗原特异性T细胞响应的诱导在没有预先体外扩增的情况下直接测量。具体地，通过IFN-γELISpot和细胞内细胞因子染色(ICS)选择来自具有可用样品的患者的PBMC用于T细胞分析。
如图19A和图19B所示，在首次给药剂量水平2(即5x106个RCV FFU)的构建体1后，检测到高达3.5％的IFN-γ+E6/E7特异性CD8T细胞。
令人惊讶的是，在静脉内构建体2/构建体1交替2-载体疗法后，在一名患者(患者106-0005)中观察到前所未有的E6/E7特异性CD8 T细胞水平。如图19C和图19D所示，在单剂量的构建体2后观察到约10％的抗原特异性CD8+T细胞，并且在构建体2/构建体1交替2-载体疗法的2个周期后可检测到高达约40％的IFN-γ+E6/E7特异性CD8 T细胞。对于所选择的患者(患者106-0005)，在构建体2/构建体1交替2-载体疗法的多个治疗周期中的不同时间点进行多色流式细胞术。图19E示出了循环的总CD8+T细胞的增加。图19F示出了在同一患者中表达IFN-γ、TNFα或CD107a的功能性和细胞毒性E6/E7特异性CD8 T细胞的增加。IFN-γ、TNFα或CD107a的产生证明了诱导的E6/E7特异性CD8 T细胞是多功能的且未耗尽。
图19G至图19I进一步示出了用构建体1单独治疗或构建体2/构建体1交替2-载体疗法治疗在患者中诱导显著的抗原特异性T细胞响应，其中高达40％的循环CD8+T细胞是E6/E7特异性的。IFN-γ和TNF-α的产生表明相应的T细胞未耗尽。此外，患者体内E6/E7特异性CD8+T细胞的扩增反映了在鼠模型中观察到的结果。
总之，构建体1和构建体2诱导血清中的1型细胞因子分泌。在没有预先体外扩增的情况下进行的直接IFN-γELISpot和ICS捕获了高量级的T细胞响应。单剂量的构建体1和构建体2分别能够驱动具有高达9.9％IFN-γ+CD8 T细胞的强E6/E7特异性CD8 T细胞。例如，三名患者在单剂量的构建体1后产生超过3％的抗原特异性CD8+T细胞。一名患者在单剂量的构建体2后产生了约10％抗原特异性CD8+T细胞的响应。83％接受单独构建体1或构建体2/构建体1交替2-载体疗法的IV给药患者展示出通过ELISpot和/或ICS测量的对HPV16E7/E6的肿瘤抗原特异性T细胞响应的诱导，以及向IFN-γ标记的转变。鉴于对HPV16+HNSCC患者观察到的初步功效测量，每3周一次施用构建体1单一载体导致18％的总响应率(ORR)(1个部分响应(PR)，1个未确认的完全响应(uCR))和73％的疾病控制率(DCR)，并且构建体2/构建体1交替2-载体疗法导致100％的DCR。
值得注意的是，构建体2/构建体1交替2-载体疗法实现了前所未有的40％的E6/E7特异性IFN-γ+CD8 T细胞，这是迄今为止对体内疗法(诸如癌症疫苗)大幅度地报道的最高响应。
贯穿本申请引用了各种出版物。这些出版物的公开内容据此全文以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本公开所属领域的现状。尽管已参考以上提供的实例描述了本公开，但应当理解，在不脱离本公开的精神的情况下可进行各种修改。
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序列表
<110> 霍欧奇帕生物科技有限公司(Hookipa Biotech GMBH)
<120> 使用沙粒病毒载体的癌症治疗策略
<130> 13194-071-228
<140> TBA
<141>
<150> US 63/175,842
<151> 2021-04-16
<150> US 63/173,155
<151> 2021-04-09
<150> US 63/032,362
<151> 2020-05-29
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HPV16 E7E6的核苷酸序列
<400> 1
atgcatggtg acacccccac cctgcatgag tacatgctgg acctgcagcc agagaccaca 60
gacctgtatg gctatggcca gctgaatgac agcagtgagg aagaggatga gattgatggg 120
ccagcaggcc aggcagaacc tgacagagcc cactacaaca ttgtcacctt ctgctgcaag 180
tgtgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccatg tggacatcag aaccctggaa 240
gacctgctga tgggcaccct gggcattgtg ggccccatct gctcccagaa gccccaccag 300
aaaagaactg ccatgttcca ggacccccag gagaggccca gaaagctgcc ccagctctgc 360
acagagctgc agaccaccat ccatgacatc atcctggaat gtgtctactg caagcagcag 420
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<223> HPV16 E7E6的核苷酸序列
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tacataatca catgggttta agtgcttaag agttaggttc tcactgttat tcttcccttt 2100
ggtcggttct gctaggaccc aaacacccaa ctcaaaagag ttgctcaatg aaatacaaat 2160
gtagtcccaa agaagaggcc ttaaaaggca tatatgatca cggtgggctt ctggatgaga 2220
ctgtttgtca caaatgtaca gcgttatacc atcccgattg caaactcttg tcacatgatc 2280
atctgtggtt agatcctcaa gcagcttttt gatatacaga ttttccctat ttttgtttct 2340
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<210> 6
<211> 2663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PICV HPV16 E7E6-NP-S-区段1的核苷酸序列
<400> 6
gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgcatgg 60
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aatcgcctag gatccactgt gcg 2663
<210> 7
<211> 2504
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PICV HPV16 E7E6-GP-S-区段2的核苷酸序列
<400> 7
gcgcaccggg gatcctaggc ataccttgga cgcgcatatt acttgatcaa agatgcatgg 60
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<210> 8
<211> 7058
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PICV L-区段的核苷酸序列
<400> 8
gcgcaccggg gatcctaggc atctttgggt cacgcttcaa atttgtccaa tttgaaccca 60
gctcaagtcc tggtcaaaac ttgggatggg actcagatat agcaaagagg tcaggaagag 120
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aactctttct cgttgttcag acaagtatac ctcatgtttt gcataaggga ttcagagtaa 3660
tcctcaatga gtctggttgt gagtttagta tttaaatcac cgacataaag ctccctgttg 3720
ccacccacct gttctttata agaaagacca aatttcaatc tccctacatt ggtggataca 3780
ccagacctct ctgtgggaga ctcatctgaa tagaaacaga gatttcgtaa ggatgagttg 3840
gtaaaaaagc tttgatccaa tcttttagct atcgattcag aattgctctc tcttgagctt 3900
atacgtgatg tctctctaat ttgtagtgct gcatctgtga acccaagtct gcttctactt 3960
ttgtgatcat atcttccgac tcgattatca taatcgcttg caatgagaat gtatttaaag 4020
cactcaaaat aatcagcttc tttgtacgcc ttcaatgtga ggttctttat taaaaactcc 4080
agaggacacg gattcattag tctgtctgca aagtacactg atctagcagt gacatcctca 4140
tagatcaagt ttacaagatc ctcatacact tctgctgaaa acaggctgta atcaaaatcc 4200
tttacatcat gaagtgaagt ctctcttttg atgacaacca ttgtcgattt gggccataat 4260
ctctctagtg gacatgaagt cttaaggttg gttttgacat tggtgtcaac cttagacaat 4320
acttttgcaa ctctggtctc aatttcttta agacagtcac cctgatcttc tgatagtaac 4380
tcttcaactc catcaggctc tattgactcc ttttttattt ggatcaatga tgacaacctc 4440
ttcagaatct tgaaatttac ctcctttgga tctaacttgt atttaccctt agttttgaaa 4500
tgttcaatca tttccacaac aacagcagac acaatggaag agtaatcata ttcagtgatg 4560
acctcaccaa cttcattgag ttttggaacc accacacttt tgttgctgga catatccaag 4620
gctgtacttg tgaaggaggg agtcataggg tcacaaggaa gcaggggttt cacttccaat 4680
gagctactgt taaatagtga tagacaaaca ctaagtacat ccttattcaa ccccggcctt 4740
ccctcacatt tggattccag ctttttacca agtagtctct ctatatcatg caccatcttc 4800
tcttcttcct cagtaggaag ttccatacta ttagaagggt tgaccaagac tgaatcaaac 4860
tttaactttg gttccaagaa cttctcaaaa catttgattt gatcagttaa tctatcaggg 4920
gtttctttgg ttataaaatg gcataaatag gagacattca aaacaaactt aaagatctta 4980
gccatatctt cctctctgga gttgctgagt accagaagta tcaaatcatc aataagcatt 5040
gctgtctgcc attctgaagg tgttagcata acgactttca atttctcaaa caattcttta 5100
aaatgaactt catttacaaa ggccataatg taatatctaa agccttgcaa gtaaacttga 5160
atacgcttgg aaggggtgca cagtatgcag agaataagtc gtctgagtaa atcagaaaca 5220
gaatccaaga ggggttggga cataaagtcc aaccaggata acatctccac acaagtcctt 5280
tgaatcacat ctgcactaaa gatcggtaag aaaaatctct tgggatcaca gtaaaaagac 5340
gcttttgttt catacaaacc cccacttttg gatctataag caacagcata acacctggac 5400
ctctcccctg tcttctggta cagtagtgtg agagaacctc cttctccaaa tcgctggaag 5460
aaaacttcgt cacagtaaac cttcccataa aactcatcag cattgttcac cttcatctta 5520
ggaactgctg ctgtcttcat gctattaatg agtgacaaac tcaaacttga caatgttttc 5580
agcaattcct caaactcact ttcgcccatg atggtataat caggctgccc tcttcctggc 5640
ctacccccac acatacactg tgactttgtc ttgtattgaa gacagggttt agcaccccat 5700
tcatctaaca ctgatgtttt cagattgaag taatattcaa catcaggttc ccgtagaaga 5760
gggagaatgt catcaagggg aagttcacca cagaccgagc tcagtctctt cttagccttc 5820
tctaaccagt tggggttttt aatgaatttt ttagtgattt gttccatcag gaagtcgaca 5880
ttaatcaacc tgtcatttac agacggtaac ccttgcatta ggagcacctc tctgaacaca 5940
gcacctggag aagacttgtc caagtcacac aaaatgttgt acatgataag gtccagaacc 6000
aacatggtgt tcctccttgt gttaaaaacc ttttgagact taattttgtt gcatattgaa 6060
agtactctaa aatattctct gctttcagtt gatgaatgct tgacctcaga ttgcctgagt 6120
tggcctatta tgcccaaaat gtgtactgag caaaactcac ataatctgat ttctgattta 6180
ggtacatctt tgacagaaca ttggataaat tcatggttct gaagtctaga aatcatatct 6240
tccctatctg tagcctgcag tttcctatcg agttgaccag caagttgcaa cattttaaat 6300
tgctgaaaga tttccatgat ttttgttcta cattgatctg ttgtcagttt attattaatg 6360
ccagacatta atgccttttc caacctcact ttgtaaggaa gtcccctttc ctttacagca 6420
agtagtgact ccagaccgag actctgattt tctaaggatg agagggaact tataaggcgt 6480
tcgtactcca actcctcaac ttcttcacca gatgtcctta atccatccat gagttttaaa 6540
agcaaccacc gaagtctctc taccacccaa tcaggaacaa attctacata ataactggat 6600
ctaccgtcaa taacaggtac taaggttatg ttctgtctct tgagatcaga actaagctgc 6660
aacagcttca aaaagtcctg gttgtatttc ttctcaaatg cttcttgact ggtcctcaca 6720
aacacttcca aaagaatgag gacatctcca accatacagt aaccatctgg tgtaacatcc 6780
ggcaatgtag gacatgttac tctcaactcc ctaaggatag cattgacagt catctttgtg 6840
ttgtgtttgc aggagtgttt cttgcatgaa tccacttcca ctagcatgga caaaagcttc 6900
aggccctcta tcgtgatggc cctatctttg acttgtgcaa gaacgttgtt tttctgttca 6960
gatagctctt cccattcggg aacccatttt ctgactatgt ctttaagttc gaaaacgtat 7020
tcctccatga tcaagaaatg cctaggatcc tcggtgcg 7058
Claims (119)
1.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 105个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
2.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
3.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
4.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
5.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含编码人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌症为HPV16+。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述HPV 16+癌症为头颈部鳞状细胞癌。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述HPV 16+癌症为肛门癌、宫颈癌、外阴癌或阴道癌。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述患者在所述方法之前用至少一种标准护理疗法时具有肿瘤进展或复发。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种标准护理疗法包括帕博利珠单抗单一疗法。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述患者仅在淋巴结中具有靶病变。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述施用包括静脉内注射。
13.如权利要求12所述的方法，所述静脉内注射以每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次或每8周一次的频率施用。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的或施用有限数量的周期。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述有限数量的周期为两个、三个、四个、五个或六个。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述有效量比持续的静脉内注射中使用的有效量多一个对数级。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以较高频率施用，接着以较低频率施用。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每3周一次的频率施用，接着以每6周一次的频率施用。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每3周一次的频率施用4个周期，接着以每6周一次的频率施用后续周期。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每4周一次的频率施用，接着以每8周一次的频率施用。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每4周一次的频率施用4个周期，接着以每8周一次的频率施用后续周期。
22.如权利要求12至21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述静脉内注射之前进行瘤内注射。
23.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述施用包括瘤内注射。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用有效量的免疫检查点抑制剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)检查点抑制剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗PD-1检查点抑制剂为抗体。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体为纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗或西米普利单抗。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述LCMV为MP毒株、WE毒株、Armstrong毒株、Armstrong克隆13毒株、或表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括构建体1。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述构建体1的有效量为约5x 106个RCV FFU，并且其中构建体1以每3周一次的频率施用。
32.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒源自皮钦德病毒(PICV)。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述PICV为Munchique CoAn4763分离株P18或P2毒株。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括构建体2。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中与所述患者的治疗前水平相比，所述方法导致所述患者血清中细胞因子或趋化因子水平的变化。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞因子和趋化因子包括IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中与所述患者的治疗前水平相比，所述方法导致所述患者血清中HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述HPV16 E7/E6特异性T细胞对CD8、IFN-γ、TNFα和/或CD107a呈阳性。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中在没有预先体外刺激和/或扩增的情况下检测所述T细胞。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，所述方法导致更多的T细胞浸润到肿瘤组织中。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，所述方法使用实体瘤响应评价标准(RECIST)和/或实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)产生一个或多个改善的功效终点。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述一个或多个改善的功效终点包括较高百分比的客观响应率、较高百分比的疾病控制率、较高百分比的部分响应、较长的无进展生存期和/或较长的总生存期。
43.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者施用有效量的包含编码源自第一沙粒病毒种的人乳头瘤病毒株16(HPV16)E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 105、1x106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、5x 108或1x 109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者施用有效量的包含编码源自第二沙粒病毒种的HPV16 E7/E6的融合蛋白的两个S-区段的工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述有效量为约5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、5x 108或1x 109个RCV FFU。
44.如权利要求43所述的方法，其中(i)中的所述第一沙粒病毒种为淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，并且(ii)中的所述第二沙粒病毒种为皮钦德病毒(PICV)。
45.如权利要求43所述的方法，其中(i)中的所述第一沙粒病毒种为PICV，并且(ii)中的第二沙粒病毒种为LCMV。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述LCMV为MP毒株、WE毒株、Armstrong毒株、Armstrong克隆13毒株、或表达LCMV毒株WE的糖蛋白而不是内源LCMV克隆13糖蛋白的LCMV克隆13毒株。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括构建体1。
48.如权利要求44或45所述的方法，其中所述PICV为Munchi que CoAn4763分离株P18或P2毒株。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒包括构建体2。
50.如权利要求45所述的方法，其中(i)中的所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒为构建体2，并且(ii)中的所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒为构建体1。
51.如权利要求50所述的方法，所述方法包括一个或多个疗程，其中每个疗程包括：
i.向所述患者施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x106、1x 107、1x 108或1x109个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x105、5x 106、5x 107、1x 108或5x 108个RCV FFU。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述构建体2的有效量为约1x 106个RCV FFU，并且所述构建体1的有效量为约5x 106个RCV FFU，其中构建体2和构建体1静脉内施用，并且每个疗程持续6周。
53.如权利要求43至52中任一项所述的方法，其中所述癌症为HPV 16+。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述HPV 16+癌症为头颈部鳞状细胞癌。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述HPV 16+癌症为肛门癌、宫颈癌、外阴癌或阴道癌。
56.如权利要求43至55中任一项所述的方法，其中所述患者在所述方法之前用至少一种标准护理疗法时具有肿瘤进展或复发。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述至少一种标准护理疗法包括帕博利珠单抗单一疗法。
58.如权利要求43至57中任一项所述的方法，其中所述患者仅在淋巴结中具有靶病变。
59.如权利要求43至58中任一项所述的方法，其中(i)和(ii)中的所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述施用包括静脉内注射。
60.如权利要求59所述的方法，其中每个疗程持续4周、6周、8周、10周、12周、14周或16周。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述疗程是持续的或重复有限数量的疗程。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述有限数量的疗程为两个、三个、四个、五个或六个。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述有效量比所述持续的疗程中使用的所述有效量多一个对数级。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以较短的疗程施用，接着以较长的疗程施用。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续6周的疗程施用，接着以每次持续12周的疗程施用。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续6周的2个疗程施用，接着以每次持续12周的疗程施用。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续8周的疗程施用，接着以每次持续16周的疗程施用。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述静脉内注射是持续的，并且首先以每次持续8周的2个疗程施用，接着以每次持续16周的疗程施用。
69.如权利要求59至68中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述静脉内注射之前进行瘤内注射。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述瘤内注射在所述静脉内注射前3周施用。
71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述瘤内注射是施用构建体1。
72.如权利要求43至58中任一项所述的方法，其中所述工程化有复制能力的三区段沙粒病毒颗粒的所述施用包括瘤内注射。
73.如权利要求43至72中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用有效量的免疫检查点抑制剂。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)检查点抑制剂。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述抗PD-1检查点抑制剂为抗体。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述抗体为纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗或西米普利单抗。
77.如权利要求43至76中任一项所述的方法，其中与所述患者的治疗前水平相比，所述方法导致所述患者血清中细胞因子或趋化因子水平的变化。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述细胞因子和趋化因子包括IFN-γ、IL-12p40、IL-15、IFN-诱导型蛋白(IP)-10和TNFα。
79.如权利要求43至78中任一项所述的方法，其中与所述患者的治疗前水平相比，所述方法导致所述患者血清中HPV16 E7/E6特异性T细胞的增加。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述HPV16 E7/E6特异性T细胞对CD8、IFN-γ、TNFα和/或CD107a呈阳性。
81.如权利要求79或80所述的方法，其中在没有预先体外刺激和/或扩增的情况下检测所述T细胞。
82.如权利要求43至81中任一项所述的方法，其中与接受安慰剂的患者或多个患者的治疗前水平相比，所述方法导致更多的T细胞浸润到肿瘤组织中。
83.如权利要求43至82中任一项所述的方法，其中所述方法使用实体瘤响应评价标准(RECIST)和/或实体瘤免疫响应评价标准(iRECIST)产生一个或多个改善的功效终点。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述一个或多个改善的功效终点包括较高百分比的客观响应率、较高百分比的疾病控制率、较高百分比的部分响应、较长的无进展生存期、较长的总生存期。
85.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 105、5x106、5x 107、1x 108或5x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中以每3周一次的频率进行4个周期接着以每6周一次的频率进行持续的周期静脉内施用构建体1。
86.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(i)向所述患者施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x105、5x 106、5x 107、1x108或5x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中以每3周一次的频率进行4个周期接着以每6周一次的频率进行持续的周期静脉内施用构建体1；以及
(ii)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
87.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
88.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
89.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
90.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
91.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
92.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 108个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
93.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
94.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
95.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
96.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
97.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
98.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)施用构建体2和构建体1的多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 108个RCV FFU，
并且其中所述前两个疗程各持续6周，随后进行的疗程各持续12周；以及
(2)向所述患者以每3周一次的频率静脉内施用200mg帕博利珠单抗或以每6周一次的频率静脉内施用400mg帕博利珠单抗。
99.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括
(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约5x 106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 106个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
100.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约5x 106个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
101.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约5x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
102.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约5x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
103.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
104.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括(1)向所述患者瘤内施用有效量的构建体1，其中所述构建体1的有效量为约5x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
(2)3周后向所述患者施用多个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个RCV FFU；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 108个RCV FFU，
并且其中前两个疗程各自持续6周，并且随后进行的疗程各自持续12周。
105.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 106、5x107、5x 108、1x 109或5x 109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)，并且其中构建体1以每3周一次的频率静脉内施用3个周期，并且所述方法在3个周期后结束。
106.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 107个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
107.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 107个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
108.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 108个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 108个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
109.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 108个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
110.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约1x 109个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
111.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括3个疗程，其中每个疗程包括
i.向所述患者静脉内施用有效量的构建体2，其中所述有效量为约1x 109个有复制能力的病毒病灶形成单位(RCV FFU)；以及
ii.在约半个疗程的时间点向所述患者静脉内施用有效量的构建体1，其中所述有效量为约5x 109个RCV FFU，
并且其中每个疗程持续6周，并且所述方法在3个疗程后结束。
112.一种核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列。
113.一种核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7或8的核苷酸序列。
114.如权利要求112或113所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列为RNA。
115.一种宿主细胞，其包含权利要求112至114中任一项所述的核苷酸序列。
116.一种三区段LCMV颗粒，其包含SEQ ID NO:3、4和5的核苷酸序列。
117.一种三区段PICV颗粒，其包含SEQ ID NO:6、7和8的核苷酸序列。
118.一种药物组合物，其包含权利要求116或117所述的三区段病毒颗粒和药学上可接受的载体。
119.如权利要求116或117所述的三区段沙粒病毒颗粒，其中所述二核苷酸优化的HPV16 E7E6核苷酸序列能够：
i.在传代至少4、5、6、7、8、9或10代后具有HPV抗原的稳定表达；
ii.具有编码的HPV融合蛋白的一致表达；或
iii.诱导针对编码的HPV融合蛋白的强免疫响应。
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