CN116479043A - 一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗肿瘤药物研究技术领域,具体涉及一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统及其用途。该共递送系统是将参与细胞死亡方式相关的效应分子mRNA封装在细胞外囊泡膜中,将可诱导产生单线态氧的物质纳入细胞外囊泡膜,并将靶向肽或抗体负载在细胞外囊泡的表面后得到。本发明提供的细胞外囊泡共递送系统,效应分子mRNA在细胞外囊泡供体细胞中被优化的嘌呤霉素翻译抑制,促进了mRNA封装到细胞外囊泡;在供体细胞中,随着嘌呤霉素浓度的稀释和通过能够产生单线态氧的物质处理嘌呤霉素失活,效应分子蛋白被有效地表达,诱发肿瘤细胞死亡。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物研究技术领域,具体公开一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统及其用途。
背景技术
肿瘤是影响人类健康的重要疾病,现已成为全球第二大死亡原因。肿瘤治疗主要包括传统的手术治疗、放射治疗、化学治疗和近年来发展迅速的靶向治疗、免疫治疗等新型治疗方式。靶向药物一直是抗肿瘤药物研发的热点,大体可分为单克隆抗体和小分子化合物两大类。近年来随着研究深入,新靶点不断涌现,抗肿瘤药物研发取得了很多突破性进展。截止目前,美国食品药品监督管理局已批准了针对30余种靶点的肿瘤靶向治疗药物,其中很多都获批治疗多个适应症,这些药物的出现为肿瘤患者带来了新的希望,但其仍存在治疗剂量大、给药频率高等问题,给进一步转化带来不便。
细胞外囊泡(EVs)是一种天然纳米颗粒生物载体,在生物相容性、免疫原性、稳定性、药代动力学、生物分布和细胞摄取机制方面具有诸多优点。由于细胞外囊泡可“识别”特定细胞,因此与其他生物载体(如脂质体)相比,细胞外囊泡递送治疗药物具有更好的功效和更少的脱靶效应。近年来,越来越多的研究表明,细胞外囊泡在肿瘤治疗方面具有巨大的潜力。mRNA疫苗是核酸药物的一种,核酸药物从基因水平对患者进行治疗,只需针对目的基因开发合适的序列,即可开发相应药物,避免了研发过程的盲目性。核酸分子在体液循环系统中已被降解,具有免疫原性,易被富集于肝脏等器官。细胞外囊泡作为新型纳米药物递送系统,具有诸多优势,并且细胞外囊泡结合核酸疗法已成为新的热点。细胞凋亡、细胞焦亡及铁死亡等细胞死亡方式的效应分子,可直接杀伤肿瘤细胞,进而达到治疗效果。因此,从细胞死亡方式的效应分子mRNA着手寻求一种靶向递送mRNA药物的工程化细胞外囊泡对于有效治疗肿瘤且降低副作用迫在眉睫。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统,该细胞外囊泡共递送系统能够有效治疗肿瘤,而且具有副作用小、稳定性高、杀伤效率高的优势。
本发明第一个目的,提供一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统,是按照以下步骤制备得到:
S1、用肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体转染细胞,得到已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞;
S2、将含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体转染进入S1中已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞内,并加入嘌呤素以抑制转染后的效应分子质粒翻译,离心,得到表面修饰且含有效应分子mRNA的细胞外囊泡;
S3、将S2得到的细胞外囊泡与能够产生活性氧的物质共孵育,得到细胞外囊泡共递送系统。
优选地,所述肿瘤靶向蛋白或靶向肽为HER2单链抗体或GE11肽。
与细胞死亡相关效应分子为tbid、GSDMD-N、GSDME-N或GSDMB-N中的一种。
优选地,所述肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体是将肿瘤靶向蛋白或靶向肽装载至含Lamp2b基因的重组质粒pcDNA3.1-Lamp2b的BamHI和HindIII酶切位点之间得到;
所述含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体是将效应分子的质粒装载至pcDNA3.1(+)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间后得到。
优选地,S1中所述转染是将肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体与转染试剂按照1~2μg∶2~4μL混合,37℃静置20min~40min后加入不含双抗培养基的细胞培养体系中培养24h;
S2中所述转染是将所述含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体与转染试剂按照1~2μg∶2~4μL混合,37℃静置20min~40min后加入S1中已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞培养体系内。
优选地,抑制转染后的效应分子质粒翻译的具体操作过程为:
加入嘌呤素后,于37℃孵育4~6h,在无血清的完全培养基中继续孵育48h,收集细胞上清;
所述离心是将去除细胞碎片后的细胞上清采用100000×g超速离心10h~16h。
优选地,所述嘌呤素的抑制浓度为4μg/mL。
优选地,能够产生活性氧的物质为声敏剂或光敏剂。
优选地,所述声敏剂为二氢卟吩E6或Purpurin 18。
优选地,所述共孵育是将S2得到的细胞外囊泡与能够产生活性氧的物质按照质量比1∶10~50混合后共孵育12h~24h。
本发明第二个目的,是提供一种所述细胞外囊泡共递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
对比现有技术,本发明的有益效果为:
1、本发明将肿瘤靶向蛋白或靶向肽修饰在细胞外囊泡表面,与转染后的含效应分子质粒的重组表达载体混合,再利用合适浓度的嘌呤霉素抑制转染后的效应分子质粒翻译,收获较多含有效应分子mRNA的细胞外囊泡;再利用能够产生活性氧的物质(例如声敏剂、光敏剂等),使得嘌呤霉素在受体细胞中失活进而使得效应分子mRNA在受体细胞中正常翻译,从而主动发挥杀伤作用。本发明提供的细胞外囊泡共递送系统能够有效治疗肿瘤,而且具有副作用小、稳定性高、杀伤效率高的优势。
2、本发明所用靶向蛋白或靶向肽能够识别疾病相关抗原,效应分子mRNA杀伤肿瘤细胞;在供体细胞中加入嘌呤霉素可抑制效应分子mRNA在供体细胞中的表达;在细胞外囊泡中加入能够产生活性氧的物质能够使嘌呤霉素在受体细胞中失活,进而使得效应分子mRNA在受体细胞中正常表达,从而杀伤肿瘤细胞。
附图说明
图1是嘌呤霉素浓度的筛选;
图2是Western blot检测细胞外囊泡P1h3表达情况;
图3是各组对SKBR3荷瘤移植小鼠中肿瘤的影响。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实施例仅是为了解释本发明,但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容,如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照试剂公司所推荐的条件;下述实施例中所用的试剂、耗材等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
细胞焦亡相关的效应分子GSDMD-N mRNA相关的靶向HER2阳性肿瘤的细胞外囊泡共递送系统的获得
具体操作过程如下:
S1、构建重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得P1h3基因序列
设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为P1h3,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-CTCGGATCCGCGCCACCATGACCTGCATGTTGGAACGCAT-3’,如SEQ ID NO:1所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CTCAAGCTTGGCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCCCCTCACTCCT CGCAGCACAGT-3’,如SEQ ID NO:2所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:11所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸7min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL,1.0μg/μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得P1h3片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b
同时对P1h3片段和含Lamp2b基因的重组质粒pcDNA3.1-Lamp2b(购买来源:南京金斯瑞科技公司)进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b,连接体系为pcDNA3.1-Lamp2b片段4μL,P1h3片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到预期的重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b。
S2、构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得GSDMD-N基因序列
根据GSDMD-N基因序列设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为GSDMD-N,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-GTGGGATCCGCCACCATGGGGTCGGCCTTTGAGCGGGT-3’,如SEQ ID NO:3所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CACAAGCTTTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGAAGTTGTGGAGG C-3’,如SEQ ID NO:4所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:12所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,45个循环;72℃延伸10min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL,1.0μg/μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得GSDMD-N片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N
同时对GSDMD-N片段和重组质粒载体pcDNA3.1进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N,连接体系为pcDNA3.1片段4μL,GSDMD-N片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N。
S3、嘌呤霉素浓度的筛选
(1)0.5μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N与1μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的96孔板,并加入0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL嘌呤霉素,每个浓度各设置6个孔;
(2)弃上清,加入CCK8试剂,450nm下检测OD值,使用GraphPad软件进行统计学差异分析,选择最佳嘌呤霉素浓度。
如图1所示,抑制重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N翻译的最佳嘌呤霉素浓度为4μg/mL。
S4、EVGSDMD-N的制备
(1)用肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)转染细胞,具体操作过程如下:
2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的293T培养皿中;
(2)将含细胞死亡相关效应分子GSDMD-N质粒的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N)转染进入已转染肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)的细胞内,具体操作过程如下:
24h后,将2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的已转染重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b的细胞培养皿中,并加入4μg/mL嘌呤霉素;
(3)放于37℃含5%CO2的细胞孵箱,6h后换为无血清的完全培养基(DMEM,Gibco公司,美国),48h后收集细胞上清;
(4)用0.22μm滤器过滤细胞上清,去除细胞碎片;
(5)细胞上清采用100000×g超速离心10h,所得沉淀即为含有较多效应分子mRNA的EVs,将该EVs与Ce6按质量比为1:10共孵育12h后,即得到EVGSDMD-N。
实施例2
细胞焦亡相关的效应分子GSDME-N mRNA相关的靶向EGFR阳性肿瘤细胞的细胞外囊泡共递送系统的获得
具体操作过程如下:
S1、构建重组表达载体pcDNA3.1-GE11:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得GE11基因序列
基于已有的GE11基因原始未注释序列(GenbankAccession:NC_000007.14)设计引物对,以GE11基因组为模板,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为GE11,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-GTGGGATCCGCCACCCTGGAGTCGACTTATGAGGGGAT-3’,如SEQ ID NO:5所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CACAAGCTTACACTCGTCGCCATCCTCTATGTAGTCTGGAGGC-3’,如SEQ ID NO:6所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸8min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL,1.0μg/μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得GE11片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-GE11
同时对GE11片段和含Lamp2b基因的重组质粒pcDNA3.1-Lamp2b(购买来源:南京金斯瑞科技公司)进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-GE11,连接体系为pcDNA3.1-Lamp2b 4μL,GE11片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到重组表达载体pcDNA3.1-GE11。
S2、构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得GSDME-N基因序列
设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为GSDME-N,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-GCGGGATCCCGCCACCATGTTTGCCAAAGCAACCAGGAA-3’,如SEQ ID NO:7所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CGCAAGCTTTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCATCTGGCATGTCTATGA ATGCA-3’,如SEQ ID NO:8所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:13所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸3min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL,1.0μg/μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得GSDME-N片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N
同时对GSDME-N片段和重组质粒载体pcDNA3.1进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N,连接体系为pcDNA3.1片段4μL,GSDMD-N片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N。
S3、嘌呤霉素浓度的筛选
(1)0.5μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N与1μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的96孔板,并加入0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL嘌呤霉素,每个浓度各设置6个孔;
(2)弃上清,加入CCK8试剂,450nm下检测OD值,使用GraphPad软件进行统计学差异分析,选择最佳嘌呤霉素浓度。
筛选得到的最佳嘌呤霉素抑制浓度为4μg/mL。
S4、EVGSDME-N的制备
(1)用肿瘤靶向肽GE11肽的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-GE11)转染细胞,具体操作过程如下:
2~4μ重组表达载体pcDNA3.1-GE11与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的293T培养皿中;
(2)将含细胞死亡相关效应分子GSDME-N质粒的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N)转染进入已转染肿瘤靶向肽GE11肽的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-GE11)的细胞内,具体操作过程如下:
24h后,将2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDME-N与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的已转染重组表达载体pcDNA3.1-GE11的细胞培养皿中,并加入4μg/mL嘌呤霉素;
(3)放于37℃含5%CO2的细胞孵箱,4~6h后换为无血清的完全培养基(DMEM,Gibco公司,美国),48h后收集细胞上清;
(4)用0.22μm滤器过滤细胞上清,去除细胞碎片;
(5)细胞上清采用100000×g超速离心10h,所得沉淀即为含有较多效应分子mRNA的EVs,将该EVs与Ce6按质量比为1:10共孵育12h后,即得到EVGSDME-N。
实施例3
细胞凋亡相关的效应分子tBid mRNA相关的靶向HER2阳性肿瘤的细胞外囊泡共递送系统的获得
具体操作过程如下:
S1、构建重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;同实施例1中重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b的构建过程;
S2、构建重组表达载体pcDNA3.1-tBid:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得tBid基因序列
根据tBid基因序列设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为tBid,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-GTGGGATCCCGCCACCATGTTCAGCGTATTTGAGGAAAT-3’,如SEQ ID NO:9所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-GTGAAGCTTTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCTCCATGTCCTCCAAC TTCTCCT-3’,如SEQ ID NO:10所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:14所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸8min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL,1.0μg/μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得tBid片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-tBid
同时对tBid片段和重组质粒载体pcDNA3.1进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-tBid,连接体系为pcDNA3.1片段4μL,tBid片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到重组表达载体pcDNA3.1-tBid。
S3、嘌呤霉素浓度的筛选
(1)0.5μg重组表达载体pcDNA3.1-tBid与1μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的96孔板,并加入0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL嘌呤霉素,每个浓度各设置6个孔;
(3)弃上清,加入CCK8试剂,450nm下检测OD值,使用GraphPad软件进行统计学差异分析,选择最佳嘌呤霉素浓度。
筛选得到的最佳嘌呤霉素抑制浓度为5μg/mL。
S4、EVtBid的制备
(1)用肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)转染细胞,具体操作过程如下:
2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的293T培养皿中;
(2)将含细胞死亡相关效应分子tBid质粒的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-tBid)转染进入已转染肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)的细胞内,具体操作过程如下:
24h后,将2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-tBid与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的已转染重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b的细胞培养皿中,并加入5μg/mL嘌呤霉素浓度;
(3)放于37℃含5%CO2的细胞孵箱,4~6h后换为无血清的完全培养基(DMEM,Gibco公司,美国),48h后收集细胞上清;
(4)用0.22μm滤器过滤细胞上清,去除细胞碎片;
(5)细胞上清采用100000×g超速离心10h,所得沉淀即为含有较多效应分子mRNA的EVs,将该EVs与Ce6按质量比为1:10共孵育12h后,即得到EVtBid。
实施例4
细胞焦亡相关的效应分子GSDMD-N mRNA相关的靶向HER2阳性肿瘤的细胞外囊泡共递送系统的获得
具体操作过程如下:
S1、构建重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得P1h3基因序列
设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为P1h3,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-CTCGGATCCGCGCCACCATGACCTGCATGTTGGAACGCAT-3’,如SEQ ID NO:1所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CTCAA GCTTGGCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCCCCTCACTCCT CGCAGCACAGT-3’,如SEQ ID NO:2所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:11所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸7min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收目的条带,经克隆测序获得P1h3片段。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b
同时对P1h3片段和含Lamp2b基因的重组质粒pcDNA3.1-Lamp2b进行BamH I和HindIII双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b,连接体系为pcDNA3.1-Lamp2b片段4μL,P1h3片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到预期的重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b。
S2、构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N:所述重组表达载体由南京金斯瑞生物科技公司完成;
(1)获得GSDMD-N基因序列
根据GSDMD-N基因序列设计引物对,通过聚合酶链式反应扩增出得到的产物即为GSDMD-N,其中,上游引物加入BamH I酶切位点后序列为F-BamH I:5’-GTGGGATCCGCCACCATGGGGTCGGCCTTTGAGCGGGT-3’,如SEQ IDNO:3所示;下游引物加入Hind III酶切位点后序列为R-Hind III:5’-CACAAGCTTTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGAAGTTGTGGAGG C-3’,如SEQ ID NO:4所示。
其中,扩增模板的序列如SEQ ID NO:12所示。
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃复性90s,72℃延伸30s,45个循环;72℃延伸10min,15℃保存。
PCR反应体系为:dH2O(14.2μL),10×KOD Buffer(2μL),KOD(0.2μL),dNTP(1.6μL),cDNA(1μL),F-BamH I(0.5μL),R-Hind III(0.5μL)。
(2)构建重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N
同时对GSDMD-N片段和重组质粒载体pcDNA3.1进行BamH I和Hind III双酶切,酶切产物切胶回收,Taq DNA连接酶连接两个片段,得到构建的重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N,连接体系为pcDNA3.1片段4μL,GSDMD-N片段1μL,DNA连接酶5μL。
反应物16℃反应过夜,然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,37℃过夜,挑取菌落,PCR验证。挑选阳性克隆株,BamH I和Hind III双酶切鉴定,得到重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N。
S3、嘌呤霉素浓度的筛选
(1)0.5μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N与1μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的96孔板,并加入0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL嘌呤霉素,每个浓度各设置6个孔;
(2)弃上清,加入CCK8试剂,450nm下检测OD值,使用GraphPad软件进行统计学差异分析,选择最佳嘌呤霉素浓度。
S4、EVGSDMD-N的制备
(1)用肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)转染细胞,具体操作过程如下:
2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置20min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的293T培养皿中;
(2)将含细胞死亡相关效应分子GSDMD-N质粒的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N)转染进入已转染肿瘤靶向蛋白HER2单链抗体的重组表达载体(即上述重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b)的细胞内,具体操作过程如下:
24h后,将2~4μg重组表达载体pcDNA3.1-GSDMD-N与4~8μL转染试剂混合后,37℃静置40min后缓慢加入不含双抗培养基(DMEM,Gibco公司,美国;胎牛血清,Gibco公司,美国)的已转染重组表达载体pcDNA3.1-P1h3-Lamp2b的细胞培养皿中,并加入4μg/mL嘌呤霉素;
(3)放于37℃含5%CO2的细胞孵箱,4h后换为无血清的完全培养基(DMEM,Gibco公司,美国),48h后收集细胞上清;
(4)用0.22μm滤器过滤细胞上清,去除细胞碎片;
(5)细胞上清采用100000×g超速离心16h,所得沉淀即为含有较多效应分子mRNA的EVs,将该EVs与Purpurin 18按质量比为1:50共孵育24h后,即得到EVGSDMD-N。
上述实施例1~4制备得到的细胞外囊泡共递送系统在抑制肿瘤效果方面基本相近,故以下仅以实施例1制备得到的细胞外囊泡共递送系统EVGSDMD-N为例进行效果说明。
按照实施例1中EVGSDMD-N的制备的方法同步收集正常293T来源的细胞外囊泡,即293T培养皿换为无血清的完全培养基(DMEM,Gibco公司,美国),48h后收集细胞上清;用0.22μm滤器过滤细胞上清,去除细胞碎片;细胞上清采用100000×g超速离心10h,所得沉淀即为对照细胞外囊泡。
对提取得到的细胞外囊泡进行Westernblot检测P1h3表达情况,并以上述对照细胞外囊泡为对比。
根据实施例1中细胞外囊泡的提取方法,收集含有较多效应分子mRNA的细胞外囊泡EVGSDMD-N,真空泵吸除残余液体,加入50μL RIPA裂解液(碧云天,中国),用移液器吹打至细胞外囊泡完全溶解,冰上放置30min,使细胞外囊泡蛋白充分裂解。通过倍比稀释法进行蛋白定量(Thermo,美国)并进行蛋白样品制备。自行配制12%的凝胶(碧云天,中国),后加入细胞外囊泡蛋白样品进行电泳。设置电泳电压90V,30min,开始电泳。当蛋白样品进入下层分离胶后,调节电泳电压至120V,90min。观察蛋白样品位置,当到达预计位置后即可停止电泳,转而进行转膜,设置电流为200mA,时间120min。之后进行抗体孵育。根据抗体说明书,按比例稀释适量抗体,一抗选择Lamp2b抗体(Abcam,美国),摇床上缓慢摇晃30min后,置于4℃冰箱,过夜孵育。二抗选择山羊抗兔IgG HRP(BBI生工,中国),置于暗盒中,室温下在摇床上缓慢摇晃1h。最后进行发光(ECL发光液,GE,美国),以GAPDH为内参。
如图2所示,293T来源细胞外囊泡携带P1h3模序。
上述细胞外囊泡共递送系统EVGSDMD-N在SKBR3荷瘤移植小鼠模型中抑制肿瘤生长的应用
将SKBR3荷瘤移植小鼠模型(集萃药康公司)随机分为3组进行瘤内注射治疗,分组情况为PBS组(PBS购自于凯基生物,KGB5001,作对照),对照细胞外囊泡组(实施例1提取的对照细胞外囊泡),EVGSDMD-N组(实施例1提取的修饰细胞外囊泡EVGSDMD-N)。
PBS组:以每只100μg/200μL的剂量将PBS注射到SKBR3荷瘤移植小鼠体内,每两天1次,共四次,之后取瘤观察;
对照细胞外囊泡组(记为EVCtrl):以每只100μg/200μL的剂量将对照细胞外囊泡注射到SKBR3荷瘤移植小鼠体内,每两天1次,共四次,之后取瘤观察;
EVGSDMD-N组(记为EVTx):以每只100μg/200μL的剂量将EVGSDMD-N注射到SKBR3荷瘤移植小鼠体内,并伴随超声,每两天1次,共四次,之后取瘤观察。
结果如图3所示,EVGSDMD-N组SKBR3荷瘤移植小鼠肿瘤相对于PBS组和对照细胞外囊泡组明显减小,表明本发明提供的细胞外囊泡共递送系统能够有效抑制肿瘤生长。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种用于肿瘤治疗的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,是按照以下步骤制备得到:
S1、用肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体转染细胞,得到已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞;
S2、将含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体转染进入S1中已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞内,并加入嘌呤素以抑制转染后的效应分子质粒翻译,离心,得到表面修饰且含有效应分子mRNA的细胞外囊泡;
S3、将S2得到的细胞外囊泡与能够产生活性氧的物质共孵育,得到细胞外囊泡共递送系统。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,所述肿瘤靶向蛋白或靶向肽为HER2单链抗体或GE11肽。
与细胞死亡相关效应分子为tbid、GSDMD-N、GSDME-N或GSDMB-N中的一种。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,
所述肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体是将肿瘤靶向蛋白或靶向肽装载至含Lamp2b基因的重组质粒pcDNA3.1-Lamp2b的BamHI和HindIII酶切位点之间得到;
所述含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体是将效应分子的质粒装载至pcDNA3.1(+)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间得到。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,
S1中所述转染是将肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体与转染试剂按照1~2μg∶2~4μL混合,37℃静置20min~40min后加入不含双抗培养基的细胞培养体系中培养24h;
S2中所述转染是将所述含细胞死亡相关效应分子质粒的重组表达载体与转染试剂按照1~2μg∶2~4μL混合,37℃静置20min~40min后加入S1中已转染肿瘤靶向蛋白或靶向肽的重组表达载体的细胞培养体系内。
5.根据权利要求4所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,
抑制转染后的效应分子质粒翻译的具体操作过程为:
加入嘌呤素后,于37℃孵育4~6h,在无血清的完全培养基中继续孵育48h,收集细胞上清;
所述离心是将去除细胞碎片的细胞上清采用100000×g超速离心10h~16h。
6.根据权利要求5所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,所述嘌呤素的抑制浓度为4μg/mL。
7.根据权利要求1所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,能够产生活性氧的物质为声敏剂或光敏剂。
8.根据权利要求7所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,所述声敏剂为二氢卟吩E6或Purpurin18。
9.根据权利要求1所述的细胞外囊泡共递送系统,其特征在于,所述共孵育是将S2得到的细胞外囊泡与能够产生活性氧的物质按照质量比1∶10~50混合后共孵育12h~24h。
10.一种权利要求1~9任一项所述的细胞外囊泡共递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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