CN116459391A - 一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法 - Google Patents
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法，该生物医用凝胶包括：外层、中间层和内层；外层为力学强度小于10kPa的小分子凝胶；内层为紫外光交联水凝胶，其力学强度为200‑1000kPa；中间层为小分子凝胶溶液与紫外光交联水凝胶溶液混合后的紫外光交联产物，其力学强度为20‑100kPa。本发明生物医用凝胶包括三层结构，从外到内力学强度依次升高，低强度的凝胶可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，用于促进肿瘤消融抑制骨肿瘤原位复发，而高强度的水凝胶可为骨缺损部位提供机械稳定性的支撑，促进骨缺损部位的修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法。
背景技术
恶性骨肿瘤亦称“骨癌”，多见于10-25岁的青少年，严重威胁青少年生命。外科切除及随后的化疗(放疗)是肿瘤的常规治疗手段。在行手术切除后造成了负重骨骼的生物力学缺陷，同时病灶内残存的癌细胞给局部复发带来了隐患。此外，病人术后还需长期忍受放化疗带来的极大痛苦和副作用，术后5年内仍有40％癌症患者复发，90％患者因此死亡。此外，《自然》子刊上最新发布的研究表明化疗药物，如紫杉醇、阿霉素等，有加速癌细胞转移的风险。因此，为了提高肿瘤的治疗效果，抑制肿瘤复发的同时兼顾加速骨缺损部位的愈合等问题，探索开发新型兼具抗肿瘤及促进骨愈合植入材料有着重要的临床意义。
肿瘤细胞和正常细胞对力学微环境响应的差异性为解决上述问题提供了可能性。一，肿瘤细胞的粘附、铺展及骨架状态等都会为适应肿瘤微环境的力学性质而发生变化。研究者发现，基底材料力学强度的降低导致了骨肉瘤细胞内应力的减小，细胞的铺展受到限制，且片状伪足减少，自身的粘附力降低；除此之外，肿瘤细胞的增殖速率也与基底材料的力学强度密切相关。肿瘤细胞的增殖速率随着基底材料力学强度的降低而逐渐降低。研究发现，当基底凝胶的弹性模量为6kPa时，骨肉瘤细胞的活性受到明显的抑制；凝胶的弹性模量进一步降低至1.6kPa时，细胞的活性降至最低。二，骨细胞是一种力学敏感性细胞，将机械应力转化为细胞能够识别的生物信号继而影响骨形成过程。骨细胞的刺激导致hMSCs向成骨分化，成骨细胞向骨表面募集，随后形成了矿化骨基质。合适的机械应力对于骨细胞的正常生理功能和各种代谢活动的调节是至关重要的，机械力增强促进骨的形成并抑制骨吸收。有研究者在机械刺激诱导干细胞成骨的综述文章中报道称，机械刺激是BMSCs和ASCs成骨分化的基本生物学因素，是MSCs成骨分化的重要调节因素。在机械刺激中，循环应变通过典型Wnt通路、非典型Wnt途径等增加干细胞的成骨分化。
研究表明当水凝胶的机械强度大于30kPa，可促进干细胞向成骨分化。同时，骨肉瘤细胞活性随着材料力学强度的上升显著增强，但是当材料的弹性模量降低至5kPa以下，其活性则显著下降。值得注意的是，干细胞对基质刚度具有“趋向性”。基质刚度梯度可以作为MSC的“指引者”，精准的指引MSC迁移到缺损部位诱导骨的形成及矿化。有研究者分别模拟生理(1Pa/μm)、病理(10Pa/μm)和骨组织(>100Pa/μm)的刚度梯度，在三种梯度下MSC均会迁移至最硬的区域。肿瘤细胞则对基质刚度呈负敏感性。还有研究者研究凝胶边界力学强度变化对人纤维肉瘤细胞迁移的影响，发现人成纤维瘤细胞在100Pa区域的PEG水凝胶迁移时，遇到360Pa边界时，人成纤维瘤细胞在界面处有向反方向迁移或聚集的趋势。相比之下，当人成纤维瘤细胞从PEG水凝胶的硬区向软区迁移时，细胞迁移明显不受阻碍。结果表明细胞在某些力学强度下具有“逆转驱硬性”。在骨肉瘤细胞中也发现了同样的现象，对刚度梯度具有逆转性。因此，同一凝胶内部实现力学分区设计满足对不同细胞的生长速率的控制，即周围与骨肿瘤切除接触部位的机械强度较低，抑制癌细胞的活性；内部机械强度则能满足承载及诱导干细胞成骨分化的要求。
目前，制备力学分区水凝胶的常规手段有扩散法、交联度控制阀、微流/光聚合法、梯度模具/光聚合法、交联温度梯度法等等。然而，这些方法存在着以下问题：1)单体、光引发剂、交联剂等毒性问题；2)制备过程复杂；3)材料刚度梯度范围狭窄，通常在千帕范围。如，研究者通过温度梯度法制备了柱状PVA水凝胶用于调控干细胞的分化，其纵向刚度梯度只能在1kPa至24kPa范围调控。目前常规的水凝胶支架材料制备技术难以满足大范围力学强度的受控转换和分布设计。多层凝胶复合支架可以解决刚度梯度范围狭窄的问题，但是无法满足无缝连接的要求，只有无缝连接的界面支架才可以满足组织间连接处的力学要求。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法，以解决现有技术存在同一支架内部难以满足几千帕-数百千帕力学强度的受控转换和分布设计的问题，以及在使用过程中出现分层的问题，本发明提供的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶可实现在促进肿瘤消融抑制骨肿瘤原位复发并促进骨缺损愈合中的用途。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为力学强度小于10kPa的小分子凝胶；
内层为紫外光交联水凝胶，其力学强度为200-1000kPa；
中间层为小分子凝胶溶液与紫外光交联水凝胶溶液混合后的光交联产物，其力学强度为20-100kPa。
本发明的有益效果为：小分子凝胶可以由小分子通过非共价键相互作用(氢键、范德华力、π-π堆积等方式)自组装而成，优选氨基酸衍生物小分子凝胶，氨基酸衍生物小分子凝胶具有无免疫原性、良好的生物相容性、生物可降解等，本申请中将单一组分的氨基酸衍生物小分子凝胶作为兼具肿瘤消融及骨缺损修复的成分，将该外层凝胶的力学强度小于10kPa，低强度的凝胶可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，降低骨肉瘤细胞的粘附及细胞内应力，诱导骨肉瘤细胞凋亡，可用于促进肿瘤消融抑制骨肿瘤原位复发。
将生物相容性好，力学强度为200-1000kPa，可紫外交联的水凝胶作为内层，该水凝胶的力学强度高达数百千帕，可为骨缺损部位提供机械稳定性的支撑，并有效促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，促进成骨相关蛋白的表达以及骨细胞的生成，进而用于促进骨缺损部位的修复。
中间层为氨基酸衍生物小分子凝胶与可紫外交联水凝胶溶液混合后的光交联产物，即将外层氨基酸衍生物小分子凝胶与内层水凝胶溶液混合均匀后，在紫外光照下生成的复合凝胶层，该复合凝胶层兼具氨基酸衍生物小分子以及内层水凝胶分子特性的复合凝胶层，在非共价及共价交联的作用下形成双网络结构水凝胶，力学强度为数十千帕，实现了低力学强度的小分子凝胶与高力学强度的高分子凝胶的无缝连接。一方面，为骨肉瘤细胞迁移的“逆转驱硬性”提供了适宜的力学平台，有效的将骨肉瘤细胞限制于低力学强度的小分子凝胶层，促进骨肉瘤细胞的凋亡，实现肿瘤细胞消融以及抑制骨肿瘤的原位复发。另一方面，复合凝胶的力学强度高于小分子凝胶层，为骨髓间充质干细胞的“驱硬性”提供适宜的力学平台，有效将骨髓间充质干细胞诱导至高分子凝胶层，促进骨髓间充质干细胞向成骨分化，实现骨缺损部位的修复。
也就是说本发明提供的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，是通过调控各层的力学强度，外层、中间层和内层力学强度从低到高，使得每层之间力学强度无缝连接，进而能够实现扭转癌细胞迁移的作用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，氨基酸衍生物为可实现溶液-凝胶的转变，且成胶后力学强度小于10kPa的多肽分子即可，如谷氨酸衍生物，半胱氨酸衍生物，缬氨酸衍生物，苯丙氨酸衍生物、丙氨酸衍生物，亮氨酸衍生物等。
进一步，氨基酸衍生物小分子凝胶为多肽超分子水凝胶(Nap-GFFY)，多肽超分子水凝胶NDC-L-PhOMe，多肽超分子水凝胶Nap-GFFpY-OMe，多肽超分子水凝胶mPEG45-PLeu等，多肽超分子水凝胶(Nap-GFFY)，其结构式为：
进一步，内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶，甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶结构式为：
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括：向氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液中加入内层前驱液，调节溶液温度使氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液凝胶化形成外层，并在紫外灯光下照射，形成内层和中间层，具体包括以下步骤：
(1)将小分子凝胶溶解在溶剂中，获得浓度为5-50mg/ml的小分子凝胶前驱液；
(2)将紫外光交联水凝胶溶解，形成浓度为25-150mg/ml的内层前驱液；
(3)向小分子凝胶前驱液中加入内层前驱液，调节溶液温度使小分子凝胶前驱液凝胶化形成外层，并在紫外灯光下照射，形成内层和中间层。
进一步地，步骤(1)中小分子凝胶前驱液的浓度为20mg/ml；步骤(2)中内层前驱液的浓度为75mg/ml。
进一步地，步骤(3)中小分子凝胶前驱液和内层前驱液的体积比为3:1-1:3，优选体积比为1:1。
进一步地，步骤(3)紫外光照射时间为20-60s，优选紫外光照射时间为30s。
当小分子凝胶为氨基酸衍生物小分子凝胶时，具体制备过程如下：
(1)将氨基酸衍生物小分子凝胶溶解在溶剂中，获得浓度为5-50mg/ml的氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液；
(2)将甲基丙烯酰化海藻酸钠、钠盐、光引发剂溶解在水中，形成内层前驱液；其中，前驱液中甲基丙烯酰化海藻酸钠的浓度为25-150mg/ml，钠盐的浓度为5-20mg/ml，光引发剂的浓度为1-10mg/ml；
(3)向氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液中加入内层前驱液，调节溶液温度使氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液凝胶化形成外层，并在紫外光下照射，形成中间层和内层。
进一步，步骤(1)中溶解氨基酸衍生物小分子凝胶的溶剂为PEG-200，PEG-400与水的混合液，或PBS溶液。
进一步，步骤(1)中氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液的浓度为20mg/ml。
进一步，步骤(2)内层前驱液中甲基丙烯酰化海藻酸钠的浓度为75mg/ml，钠盐(可为氯化钠)的浓度为9mg/ml，光引发剂的浓度为5mg/ml。
进一步，光引发剂为I2959，I184，I1173，I500或I819。
进一步，步骤(3)中氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液和内层前驱液的体积比为3:1-1:3，优选体积比为1:1；放置于紫外光下照射时间为20-60s，优选照射时间为30s。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶包括三层结构，外层和内层均为单一组分形成的水凝胶，而中间层是由外层组分溶液渗透到内层小分子凝胶中而形成的凝胶，其为双网络结构，兼具共价交联和非共价交联的特性，通过调控不同凝胶因子的浓度、比例和紫外照射强度、时间来实现该生物医用凝胶的力学强度，以实现低力学强度的小分子凝胶与高力学强度的高分子凝胶的无缝连接。外层水凝胶的力学强度小于10kPa，中间层水凝胶的力学强度限制在20-100kPa，内层水凝胶的力学强度为200-1000kPa。三层复合凝胶实现了力学梯度大范围调控。外层(＜10kPa)及中间层(20-100kPa)水凝胶的力学强度限制了肿瘤细胞的迁移行为，阻隔肿瘤细胞从外层迁移进内层。此外，干细胞对基质刚度的“趋向性”诱导干细胞经中间层(20-100kPa)水凝胶迁移至内层(200-1000kPa)水凝胶。
制备过程中，先将氨基酸衍生物小分子物质溶解，通过调控溶液温度使其凝胶化，且力学强度较低，作为外层，将内层前驱液加入外层水凝胶中，然后在紫外光照射下，内层部分内层前驱液形成内层水凝胶，该部分水凝胶力学强度大，另一部分内层前驱液进入到外层水凝胶分子中，形成双网络结构，该部分水凝胶力学强度高于外层水凝胶，而低于内层水凝胶的力学强度，本发明提供的生物医用凝胶从外到内，力学强度依次升高，低强度的凝胶可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，降低骨肉瘤细胞的粘附及细胞内应力，诱导骨肉瘤细胞凋亡，可用于促进肿瘤消融抑制骨肿瘤原位复发，而高强度的水凝胶可为骨缺损部位提供机械稳定性的支撑，促进骨缺损部位的修复。
本发明制备的具有大范围力学梯度变化的复合支架利用共价-非共价交联作用形成一体化结构，具有光滑的过渡层，可以解决同一支架内部力学强度范围窄的问题，并且可以在根本上接近防止分层的发生。
此外，本发明中的复合支架可以在单层或多层凝胶中包裹抗癌药物，如紫杉醇，阿霉素，吉非替尼、阿法替尼及中医药物等的一种，或它们的任意组合。
附图说明
图1为兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的示意图(氨基酸类小分子以Nap-GFFY为例)。
图2为Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA的力学性能测试结果；其中A图额外损耗模量结果，B图为储能模量结果。
图3为Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA的生物相容性测试结果。
图4为Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA的细胞粘附测试结果；其中A图为UMR-106细胞粘附结果，B图为MSC细胞粘附结果。
图5为UMR-106细胞在Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA表面培养48h后凋亡的流式细胞术结果图。
图6为MSC细胞在Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA表面培养14天、21天后的成骨分化表征结果图；其中A图为成骨细胞矿化结节染色及BCIP/NBT碱性磷酸酶染色结果，B图为细胞内钙离子浓度。
图7为Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、Nap-GFFY-Adriamycin植入皮下肿瘤动物模型后各项表征图；其中A图为小鼠28天体重记录；B图为术后28天后肿瘤体积大小示意图。
图8为用体式显微镜对股骨标本的缺损处进行拍照记录的结果。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为多肽超分子水凝胶Nap-GFFY；
内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；
中间层为多肽超分子水凝胶Nap-GFFY溶液和甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备Nap-GFFY氨基酸类衍生物小分子凝胶
S101、称取Nap-GFFY粉末溶解在溶剂PEG-200中，加热至Nap-GFFY粉末完全溶解，得到Nap-GFFY溶液；
S102、向Nap-GFFY溶液中加入加热至沸腾的超纯水，充分混匀，获得浓度为20mg/ml的Nap-GFFY氨基酸类衍生物小分子凝胶；其中，PEG-200与超纯水的体积比为1:1；
S2、制备甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶
S201、称取1g海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，制得浓度为10mg/ml的海藻酸钠溶液；
S202、称取氢氧化钠粉末溶解在超纯水中，制得浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液；
S203、向海藻酸钠溶液中缓慢加入15ml甲基丙烯酸酐，并滴加氢氧化钠溶液，调节反应溶液的pH值保持在8。整个反应在4℃下进行，且在反应过程中需调节溶液pH值稳定在8。反应时间为48h。反应结束后，向反应容器中加入提前预冷的乙醇500ml，甲基丙烯酰化海藻酸钠的粗产物析出。离心将粗产物分离出来，并加入100ml超纯水完全溶解。将重新溶解后的甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液转移至透析袋中，每日更换2次RO水，透析时间为5天。透析完成后，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液预冻12h，随后转移至真空冷冻干燥器中，冷冻干燥48h，即得甲基丙烯酰化海藻酸钠；
S204、将甲基丙烯酰化海藻酸钠、氯化钠、I2959溶解在超纯水中，其中氯化钠的浓度为9mg/ml、I2959的浓度为5mg/ml，获得浓度为75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液；
S3、制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
将S1制备所得的20mg/ml Nap-GFFY溶液加热至沸倒入培养皿，随即立刻加入S2制得的75mg/ml甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液；其中，20mg/ml的Nap-GFFY小分子凝胶前驱液与75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液的体积比为1:1，将培养皿中的溶液置于紫外灯下照射30s。外层Nap-GFFY溶液冷却形成凝胶，中间层和内层溶液在紫外光照后成胶。中间无分层，即得兼具肿瘤消融及骨缺损修复的一体化生物医用凝胶。
实施例2：制备载有阿霉素钠的Nap-GFFY小分子凝胶
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为多肽超分子水凝胶NDC-L-PhOMe；
内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；
中间层为多肽超分子水凝胶NDC-L-PhOMe溶液和甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备NDC-L-PhOMe氨基酸类衍生物小分子凝胶
S101、称取NDC-L-PhOMe溶解在PEG-400：H2O体积比为1:1的混合溶剂中，加热至NDC-L-PhOMe粉末完全溶解，获得浓度为30mg/ml NDC-L-PhOMe氨基酸类衍生物小分子凝胶前驱液。
S2、制备甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶
S201、称取1g海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，制得浓度为10mg/ml的海藻酸钠溶液；
S202、称取氢氧化钠粉末溶解在超纯水中，制得浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液；
S203、向海藻酸钠溶液中缓慢加入15ml甲基丙烯酸酐，并滴加氢氧化钠溶液，调节反应溶液的pH值保持在8。整个反应在4℃下进行，且在反应过程中需调节溶液pH值稳定在8。反应时间为48h。反应结束后，向反应容器中加入提前预冷的乙醇500ml，甲基丙烯酰化海藻酸钠的粗产物析出。离心将粗产物分离出来，并加入100ml超纯水完全溶解。将重新溶解后的甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液转移至透析袋中，每日更换2次RO水，透析时间为5天。透析完成后，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液预冻12h，随后转移至真空冷冻干燥器中，冷冻干燥48h，即得甲基丙烯酰化海藻酸钠；
S204、将甲基丙烯酰化海藻酸钠、氯化钠、I2959溶解在超纯水中，其中氯化钠的浓度为9mg/ml、I2959的浓度为5mg/ml，获得浓度为75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液。
S3、制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
将S1制备所得的30mg/ml NDC-L-PhOMe小分子凝胶前驱液加热至沸倒入培养皿，随即立刻加入S2制备所得的75mg/ml甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液；其中，30mg/ml的NDC-L-PhOMe小分子凝胶前驱液体积与75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液的体积比为2:1，将培养皿中的溶液置于紫外灯下照射40s。外层NDC-L-PhOM溶液冷却形成凝胶，中间层和内层溶液在紫外光照后成胶。中间无分层，即得兼具肿瘤消融及骨缺损修复的一体化生物医用凝胶。
实施例3：制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为多肽超分子水凝胶Nap-GFFpY-OMe；
内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；
中间层为多肽超分子水凝胶Nap-GFFpY-OMe溶液和甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备Nap-GFFpY-OMe氨基酸类衍生物小分子凝胶
S101、称取Nap-GFFpY-OMe溶解在溶剂PEG-200中，加热至Nap-GFFpY-OMe粉末完全溶解，得到Nap-GFFpY-OMe溶液；
S102、向Nap-GFFpY-OMe溶液中加入加热至沸腾的超纯水，充分混匀，获得浓度为25mg/ml Nap-GFFpY-OMe氨基酸类衍生物小分子凝胶前驱液。其中，PEG-200与超纯水的体积比为1:1；
S2、制备甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶
S201、称取1g海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，制得浓度为10mg/ml的海藻酸钠溶液；
S202、称取氢氧化钠粉末溶解在超纯水中，制得浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液；
S203、向海藻酸钠溶液中缓慢加入15ml甲基丙烯酸酐，并滴加氢氧化钠溶液，调节反应溶液的pH值保持在8。整个反应在4℃下进行，且在反应过程中需调节溶液pH值稳定在8。反应时间为48h。反应结束后，向反应容器中加入提前预冷的乙醇500ml，甲基丙烯酰化海藻酸钠的粗产物析出。离心将粗产物分离出来，并加入100ml超纯水完全溶解。将重新溶解后的甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液转移至透析袋中，每日更换2次RO水，透析时间为5天。透析完成后，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液预冻12h，随后转移至真空冷冻干燥器中，冷冻干燥48h，即得甲基丙烯酰化海藻酸钠；
S204、将甲基丙烯酰化海藻酸钠、氯化钠、I2959溶解在超纯水中，其中氯化钠的浓度为9mg/ml、I2959的浓度为5mg/ml，获得浓度为75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液。
S3、制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
将S1制备所得的25mg/ml Nap-GFFpY-OMe溶液加热至沸倒入培养皿，随即立刻加入S2制备所得的75mg/ml甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液；其中，25mg/ml的Nap-GFFpY-OMe小分子凝胶前驱液与75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液的体积比为1:2，将培养皿中的溶液置于紫外灯下照射40s。外层Nap-GFFpY-OMe小分子凝胶前驱液冷却形成凝胶，中间层和内层溶液在紫外光照后成胶。中间无分层，即得兼具肿瘤消融及骨缺损修复的一体化生物医用凝胶。
实施例4：制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为多肽超分子水凝胶mPEG45-PLeu；
内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；
中间层为多肽超分子水凝胶mPEG45-PLeu溶液和甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备mPEG45-PLeu氨基酸类衍生物小分子凝胶
S101、称取mPEG45-PLeu溶解在溶剂PBS中，在4℃下溶解过夜；获得浓度为50mg/mlmPEG45-PLeu氨基酸类衍生物小分子凝胶前驱液。
S2、制备甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶
S201、称取1g海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，制得浓度为10mg/ml的海藻酸钠溶液；
S202、称取氢氧化钠粉末溶解在超纯水中，制得浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液；
S203、向海藻酸钠溶液中缓慢加入15ml甲基丙烯酸酐，并滴加氢氧化钠溶液，调节反应溶液的pH值保持在8。整个反应在4℃下进行，且在反应过程中需调节溶液pH值稳定在8。反应时间为48h。反应结束后，向反应容器中加入提前预冷的乙醇500ml，甲基丙烯酰化海藻酸钠的粗产物析出。离心将粗产物分离出来，并加入100ml超纯水完全溶解。将重新溶解后的甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液转移至透析袋中，每日更换2次RO水，透析时间为5天。透析完成后，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液预冻12h，随后转移至真空冷冻干燥器中，冷冻干燥48h，即得甲基丙烯酰化海藻酸钠；
S204、将甲基丙烯酰化海藻酸钠、氯化钠、I2959溶解在超纯水中，其中氯化钠的浓度为9mg/ml、I2959的浓度为5mg/ml，获得浓度为75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液。
S3、制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
将S1制备所得的50mg/ml mPEG45-PLeu溶液转移至37℃水浴锅中，9min取出并倒入培养皿中。随即加入S2制备所得的75mg/ml甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液。其中，50mg/mlmPEG45-Pleu的小分子凝胶前驱液与75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液的体积比为1:1，将培养皿中的溶液置于紫外灯下照射30s。外层mPEG45-PLeu小分子凝胶前驱液在37℃下完成凝胶化，中间层和内层溶液在紫外光照后成胶。中间无分层，即得兼具肿瘤消融及骨缺损修复的一体化生物医用凝胶。
实施例5：制备外层载有阿霉素钠的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，包括：外层、中间层和内层；
外层为多肽超分子水凝胶Nap-GFFY，进一步装载阿霉素钠；
内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶；
中间层为装载于有阿霉素钠的多肽超分子水凝胶Nap-GFFY溶液和甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备装载阿霉素钠的Nap-GFFY氨基酸类衍生物小分子凝胶
S101、称取Nap-GFFY粉末、阿霉素钠粉末溶解在溶剂PEG-200中，加热至Nap-GFFY粉末及阿霉素钠粉末完全溶解。
S102、向Nap-GFFY-阿霉素钠溶液中加入加热至沸的超纯水，充分混合均匀，冷却至室温后即得载有阿霉素钠的Nap-GFFY小分子凝胶；其中，Nap-GFFY-阿霉素钠溶液中Nap-GFFY的浓度为20mg/ml，阿霉素钠浓度为5mg/ml，PEG-200和超纯水的体积比为2：5。
S2、制备甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶
S201、称取1g海藻酸钠粉末溶解在PBS缓冲液中，制得浓度为10mg/ml的海藻酸钠溶液；
S202、称取氢氧化钠粉末溶解在超纯水中，制得浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液；
S203、向海藻酸钠溶液中缓慢加入15ml甲基丙烯酸酐，并滴加氢氧化钠溶液，调节反应溶液的pH值保持在8。整个反应在4℃下进行，且在反应过程中需调节溶液pH值稳定在8。反应时间为48h。反应结束后，向反应容器中加入提前预冷的乙醇500ml，甲基丙烯酰化海藻酸钠的粗产物析出。离心将粗产物分离出来，并加入100ml超纯水完全溶解。将重新溶解后的甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液转移至透析袋中，每日更换2次RO水，透析时间为5天。透析完成后，将甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液预冻12h，随后转移至真空冷冻干燥器中，冷冻干燥48h，即得甲基丙烯酰化海藻酸钠；
S204、将甲基丙烯酰化海藻酸钠、氯化钠、I2959溶解在超纯水中，其中氯化钠的浓度为9mg/ml、I2959的浓度为5mg/ml。获得浓度为75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液。
S3、制备兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶
将S1制备所得的20mg/ml装载有阿霉素钠的Nap-GFFY溶液加热至沸倒入培养皿，随即立刻加入S2制备所得的75mg/ml甲基丙烯酰化海藻酸钠溶液；其中，20mg/ml的阿霉素钠的Nap-GFFY小分子凝胶前驱液与75mg/ml的甲基丙烯酰化海藻酸钠凝胶前驱液的体积比为1:1，将培养皿中的溶液置于紫外灯下照射30s。外层的阿霉素钠的Nap-GFFY溶液冷却形成凝胶，中间层和内层溶液在紫外光照后成胶。中间无分层，即得兼具肿瘤消融及骨缺损修复的一体化生物医用凝胶。
试验例1：力学性能测试
将实施例1制得的Nap-GFFY氨基酸衍生物小分子凝胶(记为Nap-GFFY)、甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶即海藻酸钠高分子凝胶(记为AlgMA)、小分子-高分子杂化凝胶(记为AlgMA-Nap-GFFY)分别制成直径为14mm，厚度为2mm的凝胶材料，三组材料各做6个复孔，使用DMA测试各组凝胶材料的储能模量以及损耗模量，结果见图2。
如2图所示：各层水凝胶的储能模量均恒高于损耗模量，Nap-GFFY小分子凝胶层、小分子-高分子杂化凝胶层、海藻酸钠高分子凝胶层的储能模量分别约为6kPa、25kPa、500kPa。基质材料的力学范围跨度大，杂化凝胶实现了大范围的力学性能调控。
试验例2：细胞毒性检测测试
将实施例1制得的Nap-GFFY氨基酸衍生物小分子凝胶(记为Nap-GFFY)、甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶即海藻酸钠高分子凝胶(记为AlgMA)、小分子-高分子杂化凝胶(记为AlgMA-Nap-GFFY)置于96孔板中，三组材料各做6个复孔。将大鼠骨肉瘤细胞UMR-106、大鼠骨髓间充质干细胞MSC分别接种在各组凝胶表面。每孔加入100μL细胞完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。在培养时间为3、5、7天时，将各孔的完全培养基吸出，每孔加入1ml PBS洗涤。洗涤完成后，每孔加入100ul CCK-8试剂。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育4h。用酶标仪波长450nm检测各孔的吸光度OD值。
细胞毒性结果见图3，图3中每组柱形图从左到右分别为Control、Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA。由图3可知，随着细胞在各组材料上培养时间的延长，UMR-106及MSC细胞的存活率逐渐提高，由此得出，Nap-GFFY小分子凝胶、小分子-高分子杂化凝胶、海藻酸钠高分子凝胶均无明显细胞毒性。
试验例3：细胞粘附测试
将实施例1制得的Nap-GFFY氨基酸衍生物小分子凝胶(记为Nap-GFFY)、甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶即海藻酸钠高分子凝胶(记为AlgMA)、小分子-高分子杂化凝胶(记为AlgMA-Nap-GFFY)置于24孔板中，三组材料各做6个复孔。取第三代生长状态旺盛的大鼠骨肉瘤细胞UMR-106、大鼠骨髓间充质干细胞MSC制得2×104/ml的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养2天后取出后，PBS冲洗一次。用FDA染料对细胞进行染色，并在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态。结果见图4。
由图4可知，MSC及UMR-106细胞在三组材料上均有较好的粘附，且随着基质凝胶的力学强度逐渐提升，细胞的粘附数量也随之提升。但是相比在小分子-高分子杂化凝胶组以及Nap-GFFY组，MSC及UMR-106细胞在甲基丙烯酰海藻酸钠高分子层凝胶上的铺展得更好，尤其是MSC细胞，部分MSC细胞呈现出明显的梭形。表明了随着基质凝胶的力学强度逐渐提升，对细胞的粘附以及铺展有一定的促进作用。
试验例4：细胞凋亡测试
本试验例是利用流式细胞仪从定量的角度，检测癌细胞经本发明中所设计制备的Nap-GFFY小分子凝胶、小分子-高分子杂化凝胶、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶调控后，细胞的凋亡比例是否提升以及提升的比例，具体过程如下：
将实施例1制得的Nap-GFFY氨基酸衍生物小分子凝胶(记为Nap-GFFY)、甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶即海藻酸钠高分子凝胶(记为AlgMA)、小分子-高分子杂化凝胶(记为AlgMA-Nap-GFFY)置于6孔培养板中。取第三代生长状态旺盛的大鼠骨肉瘤细胞UMR-106制得3×106/ml细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后取出。PBS洗涤两次，并消化细胞，用上样缓冲液制得1×106/ml细胞悬液。取100μL细胞悬液置离心管中，加入5μLFITC染料及5μLPI染料，避光并在室温下染色15min，加入400μL上样缓冲液重悬细胞，并用流式细胞仪分别检测各组的细胞凋亡率，结果见图5。
由图5可知，力学强度最低的Nap-GFFY小分子凝胶组细胞的凋亡率最高，细胞凋亡率约为47％，远高于空白对照(25.06％)及小分子-高分子杂化凝胶(29.25％)、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组(6.27％)，说明随着基底材料的力学强度降低，促进了骨肉瘤细胞的凋亡。流式细胞术检测结果直接说明了基质材料的低力学强度对骨肉瘤细胞的凋亡有明显的促进作用。
试验例5：细胞向成骨方向分化定性试验
将实施例1制得的Nap-GFFY氨基酸衍生物小分子凝胶(记为Nap-GFFY)、甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶即海藻酸钠高分子凝胶(记为AlgMA)、小分子-高分子杂化凝胶(记为AlgMA-Nap-GFFY)置于24孔板中，三组材料各做6个复孔。取第三代生长状态旺盛的大鼠骨髓间充质干细胞MSC制得5×103/ml的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养7天/14天后取出。取固定液固定各孔材料表面的细胞15min，固定完成后，PBS冲洗各孔三次。用成骨细胞矿化结节染色液试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对细胞进行染色，染色时间为1h，染色完成后观察各孔材料的颜色变化情况，定性观察细胞的成骨分化情况。用钙含量显色检测试剂盒检测细胞内Ca2+的含量，定量分析各组细胞的成骨分化情况。结果见图6，其中A图14天或21天中第一行为钙结节，第二行为ALP；B图每组柱形图中从左到右分别为Control、Nap-GFFY、AlgMA-Nap-GFFY、AlgMA。
由图6可知，成骨细胞矿化结节染色液试剂盒，MSC细胞在甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶表面培养14天后，Nap-GFFY小分子凝胶组未形成红色的矿化结节，而小分子-高分子杂化凝胶、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶均呈现出红色钙化结节，表现MSC细胞开始向成骨方向分化。培养时间为21天时，小分子凝胶组仍未呈现出红色，小分子-高分子杂化凝胶、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶形成了显著的红色矿化结节，尤其是甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组，甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶表面呈现出大面积红色，进一步揭示MSC细胞表现出向成骨方向分化。BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒的染色结果与成骨细胞矿化结节染色液试剂盒类似，均从定性的角度观察到MSC细胞能在甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶的作用下被诱导向成骨分化。
钙含量显色检测试剂盒进一步从定性的角度分析了MSC的成骨分化情况。MSC细胞在各组材料上培养14天后，小分子-高分子杂化凝胶、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组的细胞内钙离子含量表现出显著提高，尤其是甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组，胞内钙离子含量达到了6.41ug/well，较空白组的1.10ug/well提升了近六倍。随着培养时间延长至21天，甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组的细胞内钙离子含量进一步的提高，达到了6.85ug/well。钙离子检测试剂盒的结果进一步从定量的角度说明了力学增强型海藻酸钠水凝胶提供了足够的机械硬度能够诱导干细胞向成骨分化。
试验例6：体内肿瘤消融试验
将选取健康的6周龄的BALB/c雌鼠进行动物肿瘤建模实验。取第三代生长状态旺盛的小鼠乳腺癌细胞4T1制得1×107/ml的细胞悬液。按0.1ml/只的量将4T1细胞悬液注入BALB/c雌鼠的腹股沟处，注射完成后，将小鼠放回笼内继续饲养，大约两周后，观察到肿瘤出现。使用生理盐水配置10％(W/V)的水合氯醛溶液，超声溶解并过滤，按35mg/ml的剂量向BALB/c雌鼠腹腔内进行注射。当BALB/c雌鼠丧失自主行动能力后，用剃毛膏清理BALB/c雌鼠的肿瘤部位周围，并用75％(V/V)乙醇进行初步清理。将BALB/c雌鼠放置在无菌手术操作台上，使用洞巾暴露肿瘤处，擦拭碘伏进行消毒后，使用无菌手术剪在肿瘤侧边0.5cm处剪出长1cm左右的创口。
将实施例1、5制得的Nap-GFFY小分子凝胶、小分子/高分子复合凝胶支架(兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶)及小分子-阿霉素凝胶植入肿瘤部位处，随即缝合伤口，以假手术组作为对照组，每组BALB/c雌鼠设置6个平行样。术后持续每隔一天记录小鼠体重，并在术后第7天、14天、28天处死BALB/c雌鼠，取出肿瘤组织。观察肿瘤组织的体积，将肿瘤组织使用石蜡包埋，进行HE染色以及免疫荧光染色。结果见图7。
由图7可知，三组凝胶的植入，对于肿瘤的消融有一定的促进作用。小鼠的体重在术后没有出现大幅度的下降，说明了小分子/高分子复合凝胶支架在体内的安全性。术后28天的实验结果表明，植入三组凝胶后，各组BALB/c雌鼠的肿瘤体积均显著小于空白对照组，直接说明了Nap-GFFY凝胶对于肿瘤的消融作用。
试验例7：体内骨缺损修复试验
选取健康的7周龄的雌性SD大鼠(体重约200g)进行动物体内骨缺损修复实验。使用生理盐水配置10％(W/V)水合氯醛溶液，超声并过滤。按0.3ml/100g的剂量向SD大鼠的腹腔注射。大鼠双侧股骨头区域备皮，擦拭碘伏进行消毒后，在双侧股骨远心端关节处内侧皮肤作约1cm的切口，钝性分离SD大鼠的筋膜、肌肉，随后暴露出股骨头。使用直径为2mm的圆形钻头在生长板下方1mm处，垂直于骨面制备直径2mm，深度为3mm的非贯穿性股骨缺损。在备孔的过程中，使用生理盐水(无菌)对缺损处实现局部降温，同时冲洗残余的骨屑。将实施例1中制备得到的Nap-GFFY小分子凝胶、甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶、小分子/高分子复合凝胶支架植入股骨缺损处。肌肉、皮肤层依次缝合，封闭创口。术后连续给SD大鼠注射青霉素钠三日，预防术后感染。术后28天使用过量的麻醉处死SD大鼠，收集股骨标本。用体式显微镜对股骨标本的缺损处进行拍照记录，并对股骨标本进行脱钙、包埋、HE染色、免疫荧光染色处理，结果见图7。
由图7可知，术后28天，可以明显观察到空白组以及小分子凝胶组缺损区未完全愈合，仍有明显的圆形骨缺损；小分子/高分子杂化凝胶及甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组的骨缺损部位有明显的愈合现象，尤其是甲基丙烯酰海藻酸钠高分子凝胶组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，其特征在于，包括：外层、中间层和内层；
外层为力学强度小于10kPa的小分子凝胶；
内层为紫外光交联水凝胶，其力学强度为200-1000kPa；
中间层为小分子凝胶溶液与紫外光交联水凝胶溶液混合后的紫外光交联产物，其力学强度为20-100kPa。
2.根据权利要求1所述的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，其特征在于，外层为氨基酸衍生物小分子凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶，其特征在于，内层为甲基丙烯酰化海藻酸钠水凝胶。
4.权利要求1-3任一项所述的兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将小分子凝胶溶解在溶剂中，获得浓度为5-50mg/ml的小分子凝胶前驱液；
(2)将紫外光交联水凝胶溶解，形成浓度为25-150mg/ml的内层前驱液；
(3)向小分子凝胶前驱液中加入内层前驱液，调节溶液温度使小分子凝胶前驱液凝胶化形成外层，并在紫外灯光下照射，形成内层和中间层。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中小分子凝胶前驱液的浓度为20mg/ml。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中内层前驱液的浓度为75mg/ml。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中小分子凝胶前驱液和内层前驱液的体积比为3:1-1:3。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中小分子凝胶前驱液和内层前驱液的体积比为1:1。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)紫外光照射时间为20-60s。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中紫外光照射时间为30s。
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|---|---|---|---|
| CN202211634123.1A Active CN116459391B (zh) | 2022-12-19 | 2022-12-19 | 一种兼具肿瘤消融及骨缺损修复的生物医用凝胶及其制备方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116459391B (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2022
- 2022-12-19 CN CN202211634123.1A patent/CN116459391B/zh active Active
Patent Citations (11)
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Non-Patent Citations (4)
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| WANG YAO: "Controlled domain gels with a wide stiffness gradient simultaneously promote bone regeneration and suppress tumor recurrence through DAPK activity", CHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 482, 15 February 2024 (2024-02-15), pages 149018 * |
| 蒋童蒙: "细胞外基质粘附性和力学强度对骨肉瘤生长微环境影响及其机制研究", 中国博士学位论文全文数据库, 15 July 2019 (2019-07-15), pages 066 - 30 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116459391B (zh) | 2024-06-25 |
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Legal Events
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