CN116457366A - 疫苗组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文尤其提供了包含与病毒蛋白或编码所述病毒蛋白的核酸连接的纳米粒子的复合物。提供了制备和使用所述复合物的方法。包括复合物的组合物预期可用于治疗和/或预防病毒感染。

Description

疫苗组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月31日提交的美国临时申请No.63/059,845的优先权，其据此出于所有目的全文以引用方式并入。
背景技术
世界卫生组织(World Health Organization)在2020年3月11日宣布，COVID-19是一种由称为SARS-CoV-2的新型冠状病毒株引起的大流行病。该病毒主要通过感染表达较高水平的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体的细胞而引起人的呼吸道疾病和肺炎，病毒利用该受体获得细胞内进入1-2。
简而言之，机体的适应性免疫系统可学习识别新的入侵病原体。SARS-CoV-2使用其表面刺突糖蛋白(S)锁定到人细胞表面上的ACE2受体上2-3。一旦处于内部，病毒就与其周围的囊泡融合以释放其核糖核酸(RNA)，病毒RNA被翻译成蛋白质，发生病毒装配，并释放更多的病毒以感染其它宿主细胞4。受感染的患者然后可启动免疫反应，由此特化的“抗原呈递细胞”吞噬病毒并展示其部分以激活辅助性T细胞。辅助性T细胞则允许其它免疫反应：B细胞产生可阻断病毒感染细胞的抗体，并且也标记病毒进行破坏；并且细胞毒性T细胞识别并破坏病毒感染的细胞。识别病毒的长寿“记忆”B和T细胞可以在后续数月或数年内巡逻机体，提供免疫力5。
抗COVID-19治疗和预防是当务之急：目前的大流行性SARS-CoV-2毒株是新的，并且有限的临床和免疫学信息可用来帮助开发能够治疗和保护COVID-19患者的药物或疫苗。开发出提供SARS-CoV-2防护的安全有效的疫苗是至关重要且是迫切重要的。
所有疫苗的目标均是使机体暴露于不会引起疾病的抗原，但是将激发能够在人被感染时阻断或杀伤病毒的免疫反应。截至2020年4月30日，世界各地已开发出八大类型90多种针对SARS-CoV-2的疫苗：(1)病毒疫苗(弱化或灭活病毒)。(2)核酸疫苗(基于DNA或RNA)。(3)病毒载体疫苗(复制型和非复制型病毒载体)。(4)基于蛋白质的疫苗(蛋白质亚单位和病毒样颗粒)。这些策略存在许多相对的优缺点6。常规的疫苗方法(如活减毒、灭活和亚单位的病原体疫苗)通过直接模拟天然病原体而不引起疾病来提供针对多种危险疾病的持久防护。然而，由于SARS-CoV-2是一种极迅速且全球性传播的新病毒株，传统的疫苗开发渠道不能提供及时的解决方案。那些传统方法需要迅速开发和大规模的部署策略。
SARS-CoV-2在其生物学特征和临床表现方面与SARS-CoV和MERS-CoV病毒相似7。在所有这些病毒中，S蛋白是中和抗体的主要诱导物8-11。当经鼻内(IN)向BALB/c小鼠中施用时，表达MERS-CoV的S蛋白的基于重组腺病毒的疫苗诱导全身性IgG、分泌性IgG以及肺常驻型记忆T细胞反应，从而提供针对刺突假型MERS病毒的持久中和免疫，由此表明该IN疫苗可赋予针对MERS-CoV的防护12。在别处，基于SARS-CoV和MERS-CoV的T细胞表位相似性对开发出通用CoV疫苗的可能性进行了评价，表明冠状病毒之间交叉反应性的潜能13。因为SARS-CoV-2与SARS-CoV共享高遗传相似性，针对SARS-CoV开发的疫苗可以表现出对SARS-CoV-2的交叉反应性13-14。核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白以及MERS-Cov的E蛋白的潜在B细胞表位也表明是诱导T细胞和中和抗体反应两者的可能的免疫保护表位15-16。使用针对SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗的尝试已经实现了有限的成功。尽管它们具有显著的遗传同源性，但是在SARS-CoV-2表面抗原的氨基酸序列中存在着若干变异。因此，本领域需要开发出针对SARS-CoV-2以及其它肺病毒的疫苗。本文提供了本领域中的这种及其它需求的解决方案。
发明内容
在一个方面，提供了一种复合物，所述复合物包括：(a)包括金核的纳米粒子；以及(b)肺病毒蛋白或其片段、或者编码肺病毒蛋白或其片段的核酸，其中肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子连接。
在一个方面，提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本文所提供的复合物(包括其实施方案)，以及药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，提供了一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗或预防有效量的本文所提供的复合物(包括其实施方案)。
在另一方面，提供了一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗或预防有效量的本文所提供的疫苗组合物(包括其实施方案)。
在一个方面，提供了一种用于免疫易患肺病毒性疾病的对象的方法，所述方法包括在使得产生结合肺病毒蛋白或其片段的抗体的条件下，向对象施用本文所提供的复合物(包括其实施方案)。
在一个方面，提供了一种纳米粒子，所述纳米粒子包括与其连接的多个核酸以及与其连接的多个蛋白质，其中多个核酸各自编码不同的SARS-CoV-2病毒蛋白，并且多个蛋白质各自是不同的SARS-CoV-2病毒蛋白。
在一个方面，提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包括如本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)，以及药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，提供了一种在有此需要的对象中预防或治疗COVID-19的方法，所述方法包括向对象施用组合物，所述组合物包括向有此需要的对象施用有效量的如本文所提供的疫苗(包括其实施方案)、或如本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)。
在实施方案中，提供了一种在有此需要的对象中预防或治疗SARS-CoV-2病毒感染的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用组合物，所述组合物包括有效量的如本文所提供的疫苗(包括其实施方案)、或如本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)。
附图简述
图1是使用PolyGION-CD-CS纳米粒子(NP)递送SARS-CoV-2mRNA疫苗激活肺免疫反应的示意图。
图2A-2F呈现了PolyGION-CD-CS纳米粒子的示例性体外评价，以及通过功能表达分析得到的其在细胞中递送FLuc-mRNA的效率。图2A显示PolyGION的透射电子显微镜(TEM)图像。图2B显示PolyGION的能量弥散X射线光谱学(EDX)分析。图2C显示PolyGION-CD-CS的RNA负载效率。图2D-2E显示PolyGION-CD-CS纳米粒子的尺寸(图2D)和ζ电势(图2E)的DLS分析。图2F通过普鲁士蓝染色显示A549细胞中PolyGION-CD-CS-mRNA的细胞内递送。
图3显示使用PolyGION-CD-CS NP递送有FLuc-mRNA的动物的光学生物发光成像。每天用2μg剂量的FLuc-mRNA处理小鼠并在处理后24小时获取图像。
图4A-4C呈现了在五剂的PolyGION-CD-CS-FLuc-mRNA后组织的示例性体内微型计算机断层扫描(microCT)和光学成像，以及离体生物发光成像(BLI)。图4A显示对照和使用PolyGION-CD-CS-FLuc-mRNA处理的动物的microCT图像；图4B显示与microCT同一天成像的动物的BLI；并且图4C显示从处理组的动物提取的组织的离体BLI。
图5是体外和体内实验工作流程的示意图，其中各测定提出评估转染、免疫反应和致病性。
图6示出了各种形状和尺寸的Au-壳聚糖纳米粒子的DNA负载效率。左图和中图显示出直径为0.015至0.5nm的Au-Nanostar纳米粒子的数据，且右图显示出直径为0.015至0.5nm的Au-Nanosphere纳米粒子的数据。
图7A-7B显示不同尺寸和形状的Au-CH纳米粒子在细胞中的转染效率。(图7A)用负载有编码荧光素酶报告蛋白的DNA的Au-CH纳米粒子转染的细胞的代表性图像。荧光强度指示转染效率。(图7B)显示转染细胞的荧光强度的柱形图。
图8A-8C示出了哺乳动物细胞中Au-NS纳米粒子的DNA剂量依赖性转染。(图8A)用负载有各种量的编码荧光素酶报告蛋白的DNA的Au-CH纳米粒子转染的细胞的代表性图像。(图8B)事件数针对Fluc-EGFP-荧光强度的直方图，其显示染色细胞的偏移取决于负载在纳米粒子上的DNA的量。(图8C)显示负载有DNA的纳米粒子的转染效率，以及如由荧光强度所测量的负载的DNA的剂量依赖性表达的柱状图。
图9A-9H显示出负载在AuNS-CS NP上的SC2 DNA疫苗的体外表征。(图9A-9C)FE-SEM显微照片指示AuNS-壳聚糖和SC2 DNA的均一形态；(图9D)通过凝胶阻滞测定对AuNS-壳聚糖的DNA负载效率的评价；(图9E-9F)对于不同比率的SC2疫苗负载的AuNS的ζ电势和粒度(nm)所测量的DLS结果；(图9G)通过生物发光成像对递送的pcDNA-FLuc-eGFP质粒所评价的AuNS-壳聚糖的转染效率；(图9H)通过AuNS-壳聚糖在HEK293T细胞中转染的SC2 S蛋白的表达的免疫印迹分析。数据表示为平均值±SEM；使用单因素方差分析和Bonferroni事后检验来绘制如所指示的比较的显著性。如果p值<0.05则经调整的p值视为统计上显著的，且指示统计显著性的符号如下——ns代表无显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001且****代表p<0.0001显著性。
图10A-10D示出(图10A)实验设计的示意图：将五周龄BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠用经由IN途径施用的负载对照DNA或SC2-S DNA疫苗的AuNS-壳聚糖进行免疫，每周收集血清并评估针对CoV-1和CoV-2的纯化蛋白的抗SC2抗体；(图10B)用于筛选在不同处理时间点从以下收集的血清中的抗SC2抗体水平的基于化学发光的斑点印迹免疫测定：(图10C)BALB/c和(图10D)C57BL/6J小鼠，以及它们相应的定量图。数据表示为平均值±SEM。用Tukey T检验测定置信区间来执行双因素方差分析用于多重比较，并且结果如下表示：ns-代表无显著差异，*用于p<0.05，**用于p<0.01，***用于p<0.001且****用于p<0.0001。
图11A-11G示出用于筛选在不同处理时间点的(图11A)BALB/c和(图11B)C57BL/6J小鼠中抗SC2抗体水平的斑点印迹免疫测定。针对用编码SC2-SA-突变体和SC2-MN908947变体的S蛋白的质粒转染的HEK-293T细胞的细胞裂解物来探测血清，以确定疫苗接种策略在增强针对SC2的不同变体的免疫反应中的功效。(图11C)两个不同处理批次(各自n＝5)的血清中抗SC2抗体水平的反应指示一致的抗体反应；(图11D)施用AuNS-壳聚糖负载的pDNA/pDNA-SC2 DNA疫苗的BALB/c小鼠与在用经SC2-W和SC2-SA S蛋白工程化的假病毒攻击时野生型和ACE-2工程化C57BL/6J中所生成的抗SC2抗体水平的比较(*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001，**P<0.0001，ns：不显著)；在使用AuNS-壳聚糖经IN免疫SC2 S蛋白DNA疫苗后的抗体介导的免疫反应。使用ELISA来评价不同处理时间点免疫小鼠血清中的抗体反应。针对SC2S蛋白特异性IgA(图11E)、IgG(图11F)和IgM(图11G)水平所测量的ELISA测定。从3-5只BALB/c和3-5只C57BL/6J小鼠的汇集血清所生成的数据。所有小鼠在第14周接受加强剂量以评价粘膜和细胞介导的免疫反应。数据表示为平均值±SEM。用Tukey T检验测定置信区间来执行双因素方差分析用于多重比较，并且结果如下表示：ns-代表无显著差异，*用于p<0.05，**用于p<0.01，***用于p<0.001且****用于p<0.0001。
图12A-13B显示由mRNA疫苗诱导的抗S蛋白IgA(图12A)和IgG(图12B)反应。
图13A-13G显示了表达SC2 S蛋白的慢病毒作为假病毒对表达ACE2受体的细胞的特异性的评价。(图13A)细胞中的SC2转导机制；对表达SC2 S蛋白和Fluc-ZsGreen报告基因的慢病毒进行工程化，并将这些假病毒转导到对照和表达ACE2受体的细胞中，随后使用生物发光成像来定量感染性。(图13B-13C)使用工程化假病毒来评价DNA疫苗介导的诱导的抗SC2-S蛋白特异性抗体的中和效应，其通过在来自用DNA疫苗处理的小鼠的血清的中和抗体存在下定量感染细胞中假病毒介导的ZsGreen表达来评估；以及(图13D)疫苗接种后不同时间点收集的血清的中和效应。市售抗体用作阳性(+)对照。T1、T2、T3分别指示血清采集的时间点，即，1周、2周和3周后；使用工程化成展示不同变体的SC2 S蛋白并在工程化成表达ACE2受体的HEK-293T细胞中表达FLuc-ZsGreen报告基因的慢病毒-假病毒颗粒，测量由IN施用SC2-DNA疫苗诱导的中和抗体的病毒感染性抑制。在第18周测定来自SC2-DNA疫苗接种的C57BL/6J小鼠的血清样品(来自n＝3只动物的汇集血清)的中和活性，与市售SC2刺突抗体进行比较。针对用S蛋白SC2-MN908947(图13E)、SC2-SA-突变体(图13F)和SC2-D614G-突变体(图13G)变体工程化的慢病毒颗粒来执行感染性的相对抑制。每个点代表从三次技术平行测定的三只小鼠收集的血清的平均值。数据表示为平均值±SEM；使用单因素方差分析和Bonferroni事后检验来绘制如所指示的比较的显著性。如果p值<0.05则经调整的p值视为统计上显著的，且指示统计显著性的符号如下——ns代表无显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001且****代表p<0.0001显著性。
图14A-14D显示了在通过光学生物发光(BLI)成像的(图14A)HEK293和(图14B)A549细胞中使用AuNS-壳聚糖体外递送的Fluc mRNA。(图14C)两剂AuNS-壳聚糖-FLuc-mRNA递送后的组织的体内BLI和(图14D)离体BLI。在肺中存在萤火虫荧光素酶的显著表达，这由离体组织成像发现所支持。
图15示出了编码mRNA疫苗的靶蛋白的SARS-CoV-2基因组结构和位置。
图16A-16E显示用表达SC2的S蛋白的DNA疫苗IN处理的小鼠的肺中免疫细胞的募集(图16A)，以及脾(图16B)、肺(图16C)、胸腺(图16D)和淋巴结(图16E)中的常驻型T细胞分布。DNA疫苗诱导的表达记忆和组织驻留标记的CD4+T细胞用于评估。与对照DNA处理的小鼠相比，免疫小鼠肺中的肺常驻型CD4+T细胞的数目增加。在处理后14周解剖肺、脾、胸腺和淋巴结以评价T细胞亚型。(T细胞亚型：CD3/CD4、CD3/CD8；巨噬细胞：CD45/CD11b；树突细胞：CD45/CD11c；B细胞：CD19和CD22)。
图17A-17E示出了从经pDNA和SC2刺突DNA处理的BALB/c小鼠的脾(图17A)、肺(图17B)、胸腺(图17C)、淋巴结(图17D)和血液(图17E)分离的CD45+T细胞中IFNγ表达的流式细胞仪分析。
图18显示出用编码SARS-CoV-2S蛋白的DNA疫苗接种导致引流淋巴结中的T和B细胞激活。
图19显示出形成的聚合物的结构可以形成纳米粒子的外层。图19A显示出壳聚糖和壳聚糖-环糊精的结构以及用于合成环糊精缀合的壳聚糖(CD-CS)的反应。图19B显示出聚乙烯亚胺(PEI)(上图)和聚酰氨基胺(PAMAM)(下图)树枝状体的结构。
发明详述
虽然本文中显示和描述了本发明的各种实施方案和方面，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，这样的实施方案和方面仅作为实例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变型形式、改变和置换。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种另选方案。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献、或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文)出于任何目的据此明确地全文以引用方式并入。
本文使用的缩写具有其在化学和生物领域内的常规含义。本文所阐述的化学结构和式根据化学领域中已知的化学价的标准规则来构建。
除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语都具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。参见例如Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,MOLECULARCLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY1989)。与本文所述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料可用于实践本发明。以下定义被提供为便于理解本文中常用的某些术语，且不意在限制本公开的范围。
“核酸”是指核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)及其单链、双链或多链形式的聚合物、或其互补物；或核苷(例如，脱氧核糖核苷或核糖核苷)。在实施方案中，“核酸”不包括核苷。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“寡”等在通常和常规意义上是指核苷酸的线性序列。术语“核苷”在通常和常规意义上是指葡基胺，包括核碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)。核苷的非限制性实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。术语“核苷酸”在通常和常规意义上是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰形式。本文所设想的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂交分子。本文所设想的核酸(例如多核苷酸)的实例包括任何类型的RNA(例如mRNA、siRNA、miRNA和向导RNA)以及任何类型的DNA、基因组DNA、质粒DNA和微环DNA，以及它们的任何片段。在多核苷酸的语境中，术语“双链体”在通常和常规意义上是指双链型。核酸可以是线性或分支的。例如，核酸可以是核苷酸的线性链，或者核酸可以是分支的，例如，使得核酸包含核苷酸的一个或多个臂或分支。任选地，分支核酸是重复分支的以形成高序结构(如树枝状体)等。
核酸(包括例如具有硫代磷酸酯骨架的核酸)可以包括一个或多个反应性部分。如本文所用，术语反应性部分包括能够通过共价、非共价或其它相互作用与另一分子(例如，核酸或多肽)反应的任何基团。以举例的方式，核酸可以包括通过共价、非共价或其它相互作用与纳米粒子的外层反应的反应性部分。
术语也涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰骨架残基或键的核酸，它们是合成、天然存在以及非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。这样的类似物的实例包括但不限于磷酸二酯衍生物，包括例如磷酰胺、磷酰二胺、硫代磷酸(也称为在磷酸酯中具有替代氧的双键硫的硫代磷酸酯)、二硫代磷酸、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰基甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼、或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH,OxfordUniversity Press)以及对核苷酸碱基的修饰，如在5-甲基胞苷或假尿苷中；以及肽核酸骨架和键。其它类似物核酸包括具有阳性骨架的那些；非离子骨架、修饰糖和非核糖骨架(例如，如本领域已知的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或锁核酸(LNA))，包括美国专利No.5,235,033和5,034,506，以及第6和7章,ASC Symposium Series 580,CARBOHYDRATEMODIFICATIONS IN ANTISENSE RESEARCH,Sanghui&Cook,eds中所述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一种定义内。核糖-磷酸骨架的修饰可以出于多种原因进行，例如，为了增加这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期或者作为生物芯片上的探针。可以制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。在实施方案中，DNA中的核苷酸间键是磷酸二酯、磷酸二酯衍生物、或两者的组合。
核酸可以包括非特异性序列。如本文所用，术语“非特异性序列”是指含有一系列未设计成与任何其它核酸序列互补或仅部分互补的残基的核酸序列。以举例的方式，非特异性核酸序列是当与细胞或生物体接触时不用作抑制性核酸的核酸残基的序列。
多核苷酸典型地由四种核苷酸碱基的特异性序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T))。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，术语可适用于多核苷酸分子本身。这种字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。多核苷酸可以任选地包括一个或多个非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“互补序列”是指能够与互补核苷酸或核苷酸序列碱基配对的核苷酸(例如，RNA或DNA)或核苷酸序列。如本文所述和本领域中通常所知，腺苷的互补(匹配)核苷酸是胸苷，而鸟苷的互补(匹配)核苷酸是胞嘧啶。因此，互补序列可以包括与第二核酸序列的相应互补核苷酸碱基配对的核苷酸序列。互补序列的核苷酸可以部分或完全地匹配第二核酸序列的核苷酸。当互补序列的核苷酸完全匹配第二核酸序列的每个核苷酸时，互补序列与第二核酸序列的每个核苷酸形成碱基对。当互补序列的核苷酸与第二核酸序列的核苷酸部分匹配时，互补序列的仅一些核苷酸与第二核酸序列的核苷酸形成碱基对。互补序列的实例包括编码序列和非编码序列，其中非编码序列含有与编码序列互补的核苷酸，并因此形成编码序列的互补序列。互补序列的另一个实例是有义和反义序列，其中有义序列含有与反义序列互补的核苷酸，并因此形成反义序列的互补序列。
如本文所述，序列的互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对而匹配，或者是完全的，其中所有的核酸根据碱基配对而匹配。因此，彼此互补的两个序列可以具有指定百分比的相同核苷酸(即，在指定区域上约60％相同性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的相同性)。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团键合的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指自然界中不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
氨基酸可在本文中用其通常已知的三字母符号或者IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号指代。同样，核苷酸可以用其公认的单字母代码指代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地用于指氨基酸残基的聚合物，其中聚合物可在实施方案中缀合于不由氨基酸组成的部分。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”是指编码两个或更多个单独的蛋白质序列的嵌合蛋白，这些蛋白质序列重组表达为单一部分。
氨基酸或核苷酸碱基“位置”由基于其相对于N末端(或5'端)的位置顺序地标识参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)的数字表示。由于在确定最佳比对时必须考虑缺失、插入、截短、融合等，一般来讲，通过从N末端简单计数所确定的测试序列中的氨基酸残基数字不必与其在参考序列中的相应位置的数字相同。例如，在变体相对于比对的参考序列具有缺失的情况下，变体中不存在对应于参考序列中缺失位点处的位置的氨基酸。在比对的参考序列中存在插入的情况下，所述插入将不对应于参考序列中编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考或比对序列中可以存在一段不对应于相应序列中任何氨基酸的氨基酸。
当在对给定氨基酸或多核苷酸序列编号的语境中使用时，术语“参照……编号的”或“对应于”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时所指定参考序列的残基的编号。当蛋白质中的氨基酸残基占据蛋白质内与给定的残基相同的基本结构位置时，其“对应于”给定的残基。本领域技术人员将立即识别出具有不同编号系统的其它蛋白质中对应于蛋白质(例如，刺突蛋白)中特定位置的残基的相同性和位置。例如，通过与蛋白质(例如，刺突蛋白)执行简单的序列比对，在与所述蛋白质比对的其它蛋白质序列中鉴定了对应于所述蛋白质的特定位置的残基的相同性和位置。例如，当所选的残基与位置138处的谷氨酸占据相同的基本空间或其它结构关系时，所选蛋白质中的选择残基对应于位置138处的谷氨酸。在一些实施方案中，在所选蛋白质与蛋白质进行最大同源性比对的情况下，比对的所选蛋白质中与谷氨酸138比对的位置对应于谷氨酸138。替代一级序列比对，也可使用三维结构比对，例如，其中将所选蛋白质的结构与位置138处的谷氨酸进行最大对应性比对，并比较总体结构。在这种情况下，在结构模型中占据与谷氨酸138相同的基本位置的氨基酸对应于谷氨酸138残基。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列将编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一个位置处，密码子可改变为所描述的任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列也描述了核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG，以及通常为色氨酸的唯一密码子的TGG之外)可被修饰成产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或较小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽、或蛋白质序列的单独置换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域公知的。这样的保守修饰变体是本公开的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，且不排除本公开的多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八类各自含有彼此保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如Creighton,Proteins(1984))。
在两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，术语“相同的”或百分比“相同性”是指两个或更多个序列或子序列是相同的或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上约60％相同性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的相同性，当在比较窗口或特指区域上进行最大对应性比较和比对时)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或者通过手动比对和视觉检查所测量(参见例如NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等等)。这样的序列则据称为“基本上相同”。该定义还涉及或者可应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的那些。如下所述，优选的算法可考虑空位等等。优选地，相同性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选地长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。
“序列相同性百分比”通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)，以使两个序列最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目并将结果乘以100以产生序列相同性的百分比来计算百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括提及到选自例如全长序列或20至600、约50至约200、或约100至约150个氨基酸或核苷酸的连续位置数目中的任一种的链段，其中在两个序列最佳比对后，可将序列与连续位置数目相同的参考序列进行比较。用于比较的序列的比对方法是本领域中公知的。可以如下进行用于比较的序列的最佳比对：通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法的搜索、通过这些算法的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI中)、或者通过手动比对和视觉检查(参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
适于测定序列相同性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，该短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，同上)。这些初始邻域字命中充当用于起始搜索的种子，以找到含有它们的较长HSP。字命中沿每个序列在两个方向上扩展，直到累积比对得分可增大。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当如下情况时，字命中在每个方向上的扩展被暂停：累积比对得分从其最大实现的值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的端部。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长3和期望值(E)10，且BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法所提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的指示在于，由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地基本上与第二多肽相同，例如，其中两种肽的区别仅在于保守置换。两个核酸序列基本上相同的另一个指示在于，两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的另一个指示在于，相同的引物可用于扩增所述序列。
抗体是具有复杂内部结构的大型复杂分子(分子量为约150,000或约1320个氨基酸)。天然抗体分子含有两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链依次由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区，以及与免疫系统的其它组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区(在本文中也分别称为轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域)在3维空间中结合在一起形成结合抗原(例如，细胞表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，存在三个称作互补决定区(“CDR”)的短区段(平均长度为10个氨基酸)。抗体可变结构域中的六个CDR(三个来自轻链且三个来自重链)在3维空间中折叠在一起形成对接到靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度由Kabat,E.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health andHuman Services,1983,1987精确定义。不包含在CDR中的可变区的部分被称作框架(“FR”)，其形成CDR的环境。确认的编码抗体的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
术语“抗原”和“表位”可互换地指由免疫系统的组分(例如，抗体、T细胞受体、或其它免疫受体，如自然杀伤(NK)细胞上的受体)特异性识别的分子的部分(例如，多肽)。如本文所用，术语“抗原”涵盖抗原表位及其抗原片段。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元可以具有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变重链”、“VH”、或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab；而术语“可变轻链”、“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
抗体功能片段的实例包括但不限于完整抗体分子、抗体片段，如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2'以及任何那些的组合或者能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其它功能部分(参见例如FundamentalImmunology(Paul编辑,第4版,2001))。如本领域技术人员所理解，各种抗体片段可以通过多种方法获得，例如，用酶如胃蛋白酶消化完整抗体；或从头合成。抗体片段通常以化学方式或者通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体包括通过修饰全抗体产生的抗体片段、或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如单链Fv)、或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见例如McCafferty等人,(1990)Nature 348:552)。术语“抗体”还包括二价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。二价和双特异性分子描述于例如Kostelny等人(1992)J.Immunol.148:1547，Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31:1579，Hollinger等人(1993),PNAS.USA 90:6444，Gruber等人(1994)J Immunol.152:5368，Zhu等人(1997)Protein Sci.6:781，Hu等人(1996)Cancer Res.56:3055，Adams等人(1993)Cancer Res.53:4026，以及McCartney,等人(1995)Protein Eng.8:301。
当提及到蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“与……特异性(或选择性)免疫反应性”是指通常在蛋白质和其它生物制剂的异质群体中确定蛋白质的存在的结合反应。因此，在特指的免疫测定条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，更典型是背景的10至100倍。在这种条件下与抗体的特异性结合需要针对其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。例如，可以选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原而不与其它蛋白质特异性免疫反应的抗体子集。这种选择可以通过扣除与其它分子交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(对于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow&Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual(1998))。
如本文所用，术语“刺突蛋白”或“S蛋白”包括任何重组或天然存在形式的刺突糖蛋白(也称为S糖蛋白、E2、包膜粒蛋白)、或维持刺突蛋白活性(例如，与刺突蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的刺突蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，刺突蛋白基本上与由UniProt参考号P0DTC2鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“包膜蛋白”或“E蛋白”包括任何重组或天然存在形式的包膜小膜蛋白(也称为sM蛋白)、或维持包膜蛋白活性(例如，与包膜蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的包膜蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，包膜蛋白基本上与由UniProt参考号P0DTC4鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“膜蛋白”或“M蛋白”包括任何重组或天然存在形式的膜蛋白、或维持膜蛋白活性(例如，与膜蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的膜蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，膜蛋白基本上与由UniProt参考号P0DTC5鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“核衣壳蛋白”或“N蛋白”包括任何重组或天然存在形式的核衣壳蛋白(也称为核蛋白、NC蛋白)、或维持核衣壳蛋白活性(例如，与核衣壳蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的核衣壳蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，核衣壳蛋白基本上与由UniProt参考号P0DTC9鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“糖蛋白G蛋白”或“G蛋白”包括任何重组或天然存在形式的主要表面糖蛋白G蛋白(也称为膜结合糖蛋白、mG蛋白)、或维持糖蛋白G蛋白活性(例如，与糖蛋白G蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的糖蛋白G相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，糖蛋白G蛋白基本上与由UniProt参考号P03423鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“糖蛋白F蛋白”或“F蛋白”包括任何重组或天然存在形式的融合糖蛋白(也称为融合糖蛋白F0、融合糖蛋白F2、间插区段、Pep27、肽27、融合糖蛋白F1)、或维持糖蛋白F蛋白活性(例如，与糖蛋白F蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的糖蛋白F蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，糖蛋白F蛋白基本上与由UniProt参考号P03420鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“糖蛋白SH蛋白”或“SH蛋白”包括任何重组或天然存在形式的小疏水蛋白(也称为小蛋白1A)、或维持糖蛋白SH蛋白活性(例如，与糖蛋白SH蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的糖蛋白SH蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，糖蛋白SH蛋白基本上与由UniProt参考号P0DOE5鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“血球凝集素-神经氨酸酶蛋白”或“HN蛋白”包括任何重组或天然存在形式的血球凝集素-神经氨酸酶、或维持血球凝集素-神经氨酸酶蛋白活性(例如，与血球凝集素-神经氨酸酶蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的血球凝集素-神经氨酸酶蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，血球凝集素-神经氨酸酶蛋白基本上与由UniProt参考号P21526鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“融合糖蛋白”或“F蛋白”包括任何重组或天然存在形式的融合糖蛋白0、或维持融合糖蛋白活性(例如，与融合糖蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的融合糖蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，融合糖蛋白基本上与由UniProt参考号P06828鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“基质蛋白”或“M蛋白”包括任何重组或天然存在形式的基质蛋白、或维持基质蛋白活性(例如，与基质蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的基质蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，基质蛋白基本上与由UniProt参考号P07873鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“衣壳糖蛋白VP1”或“VP1蛋白”包括任何重组或天然存在形式的衣壳糖蛋白VP1、或维持衣壳糖蛋白VP1活性(例如，与衣壳糖蛋白VP1相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的衣壳糖蛋白VP1相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，衣壳糖蛋白VP1基本上与由UniProt参考号U6BK95鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“衣壳糖蛋白VP0”或“VP0蛋白”包括任何重组或天然存在形式的衣壳糖蛋白VP0、或维持衣壳糖蛋白VP0活性(例如，与衣壳糖蛋白VP0相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的衣壳糖蛋白VP0相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，衣壳糖蛋白VP0基本上与由UniProt参考号D4NYJ3鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“六邻体蛋白”或“六邻体”包括任何重组或天然存在形式的六邻体蛋白、或维持六邻体蛋白活性(例如，与六邻体蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的六邻体蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，六邻体蛋白基本上与由UniProt参考号Q9DKL1鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“五邻体蛋白”或“五邻体”包括任何重组或天然存在形式的五邻体蛋白、或维持五邻体蛋白活性(例如，与五邻体蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的五邻体蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，五邻体蛋白基本上与由UniProt参考号Q2Y0H9鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“纤突蛋白”或“纤突”包括任何重组或天然存在形式的纤突蛋白、或维持纤突蛋白活性(例如，与纤突蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的纤突蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，纤突蛋白基本上与由UniProt参考号P04501鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“前六邻体连接蛋白IIIa”包括任何重组或天然存在形式的前六邻体连接蛋白IIIa(也称为衣壳顶点特异性组分IIIa、CVSC、蛋白IIIa、或pIIIa)、或维持前六邻体连接蛋白IIIa活性(例如，与前六邻体连接蛋白IIIa相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的前六邻体连接蛋白IIIa相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，前六邻体连接蛋白IIIa基本上与由UniProt参考号Q2Y0I0鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“前六邻体连接蛋白VIII”包括任何重组或天然存在形式的前六邻体连接蛋白VIII(也称为前蛋白VIII、pVIII、或蛋白VIII-N)、或维持前六邻体连接蛋白VIII活性(例如，与前六邻体连接蛋白VIII相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的前六邻体连接蛋白VIII相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，前六邻体连接蛋白VIII基本上与由UniProt参考号Q71BW3鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“六邻体交络蛋白(Hexon-interlacing protein)”包括任何重组或天然存在形式的六邻体交络蛋白(也称为蛋白IX)、或维持六邻体交络蛋白活性(例如，与六邻体交络蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的六邻体交络蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，六邻体交络蛋白基本上与由UniProt参考号Q71BW3鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“主要表面糖蛋白G”包括任何重组或天然存在形式的主要表面糖蛋白G(也称为附着糖蛋白G、膜结合糖蛋白、mG)、或维持主要表面糖蛋白G活性(例如，与主要表面糖蛋白糖G相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的主要表面糖蛋白G相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，主要表面糖蛋白G蛋白基本上与由UniProt参考号Q6WB94鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“融合糖蛋白F0”包括任何重组或天然存在形式的融合糖蛋白F0(也称为蛋白F)、或维持融合糖蛋白F0活性(例如，与融合糖蛋白F0相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的融合糖蛋白F0相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，融合糖蛋白F0基本上与由UniProt参考号Q6WB98鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“核蛋白”或“蛋白N”包括任何重组或天然存在形式的核蛋白(也称为核衣壳蛋白)、或维持核蛋白活性(例如，与核蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的核蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，核蛋白基本上与由UniProt参考号Q6WBA1鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“小疏水蛋白”或“SH蛋白”包括任何重组或天然存在形式的小疏水蛋白、或维持小疏水蛋白活性(例如，与小疏水蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的小疏水蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，小疏水蛋白基本上与由UniProt参考号Q6WB95鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“基质蛋白”或“M蛋白”包括任何重组或天然存在形式的基质蛋白、或维持基质蛋白活性(例如，与基质蛋白相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的基质蛋白相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，基质蛋白基本上与由UniProt参考号Q6WB99鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“衣壳蛋白VP1”包括任何重组或天然存在形式的衣壳糖蛋白VP1、或维持衣壳蛋白VP1活性(例如，与衣壳蛋白VP1相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的衣壳蛋白VP1相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，衣壳蛋白VP1基本上与由UniProt参考号I0B934鉴定的蛋白质相同。
如本文所用，术语“衣壳蛋白VP2”包括任何重组或天然存在形式的衣壳糖蛋白VP2、或维持衣壳蛋白VP2活性(例如，与衣壳蛋白VP2相比至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内的活性)的其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的衣壳蛋白VP2相比，变体或同源物在全序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。在实施方案中，衣壳蛋白VP2基本上与由UniProt参考号Q27XI9鉴定的蛋白质相同。
术语“疾病”或“病况”是指能够用本文所提供的化合物、药物组合物、或方法治疗的对象的生存状态或健康状况。疾病可以是自身免疫性、炎性、癌症、感染性、代谢性、发育性、心血管、肝脏、肠、内分泌、神经系统或其它疾病。在一些实例中，疾病是感染性疾病(例如冠状病毒感染)。
术语“感染”或“感染性疾病”是指可由生物体(如细菌、病毒、真菌或任何其它病原性微生物制剂)引起的疾病或病况。在实施方案中，感染性疾病由病原性病毒引起。病原性病毒是可以在细胞(例如人细胞)内感染和复制并引起疾病的病毒。在实施方案中，感染性疾病是病毒相关疾病。非限制性病毒相关疾病包括肝病毒性疾病(例如，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎)、疱疹病毒感染(例如，HSV-1、HSV-2、带状疱疹)、黄病毒感染、寨卡病毒感染、巨细胞病毒感染、呼吸道病毒感染(引起“肺病毒性疾病”)(例如，腺病毒感染、流感、严重急性呼吸综合征、冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、COVID-19、MERS))、胃肠病毒感染(例如，诺瓦克病毒感染、轮状病毒感染、星状病毒感染)、出疹类病毒感染(例如，麻疹、带状疱行疹、天花、风疹)、病毒性出血病(例如，埃博拉、拉沙热、登革热、黄热病)、神经系统病毒感染(例如，西尼罗病毒感染、脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、日本脑炎、狂犬病)和人乳头瘤病毒感染。在实施方案中，病毒相关疾病由肺病毒引起。
术语“肺病毒感染”或“肺病毒性疾病”是指由可在细胞内感染和复制并引起影响呼吸系统(例如，下呼吸系统、上呼吸系统和肺)的疾病或症状的病毒引起的病况。在实施方案中，引起肺病毒感染的病毒可以通过使用鼻和/或口作为进入口而进入对象。肺病毒感染可由病毒引起，包括但不限于人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人副流感病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)、腺病毒(ADV)、人冠状病毒(HCoV)、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、人偏肺病毒(HMPV)、或人博卡病毒(HBoV)。肺病毒感染可导致一种或多种如表2所列的症状。
术语“病毒”或“病毒颗粒”根据其在生物领域中的普通常规含义使用，并且是指包括以下的颗粒：病毒基因组(例如，DNA、RNA、单链、双链)、蛋白质的保护性外壳(例如衣壳)和相关蛋白质，以及在包膜病毒(例如疱疹病毒)的情况下的包括脂质和任选地宿主细胞膜的组分的包膜，和/或病毒蛋白。
“人冠状病毒”或“HCoV”是指可进入人细胞并在其中复制并且可引起疾病(例如呼吸道感染)的一类RNA病毒。在实施方案中，冠状病毒是具有正义单链RNA和核衣壳的有包膜病毒。冠状病毒的尺寸范围为且可为例如50至200nm直径。在实施方案中，冠状病毒包膜由脂双层构成，并且包括膜、包膜和刺突蛋白。在一些情况下，当刺突蛋白附着于宿主细胞受体时，HcoV进入宿主细胞。HCoV包括人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。在一些情况下，HcoV进入细胞中可以引起SARS、MERS、或COVID-19。
术语“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”或“SARS-CoV-2”是指引起冠状病毒病2019(COVID-19)的冠状病毒株。在实施方案中，SARS-CoV-2是一种正义单链RNA病毒。SARS-CoV-2属于β冠状病毒家族，其成员包括在新世纪引起严重疾病爆发的两种其它人兽共患病病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。SARS-CoV-2显示与在2002-2003年引发严重急性呼吸综合征(SARS)流行的SARS-CoV将近80％的遗传相似性。SARS-CoV-2与MERS-CoV是远亲关系，MERS-CoV是始于2012且仍然持续存在的中东呼吸综合征(MERS)流行的原因。参见例如Yuki等人,2020,Clin.Immun.215,108427；Chen等人2020,J.Med.Virol.92,418-423。术语“SARS-CoV”是指SARS冠状病毒。术语“SARS-CoV”包括任何冠状病毒，如SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS-CoV。
“COVID-19”是指由SARS-CoV-2引起的疾病。COVID-19具有2-14天的潜伏期，并且症状包括例如发烧、疲倦、咳嗽和呼吸短促(例如呼吸困难)。
术语“严重急性呼吸综合征冠状病毒”或“SARS-CoV-1”是指引起严重急性呼吸综合征(SARS)的冠状病毒株。在实施方案中，SARS-CoV-1是感染肺内的上皮细胞的有包膜的正义单链RNA病毒。在实施方案中，病毒通过结合血管紧张素转化酶2(ACE2)受体进入宿主细胞。
“MERS-CoV”是指中东呼吸综合征相关冠状病毒。参见例如Chung等人,GeneticCharacterization of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,South Korea,2018.Emerging Infectious Diseases,25(5):958-962(2019)。
“中东呼吸综合征”或“MERS”是指由MERS-冠状病毒引起的疾病。
“人呼吸道合胞病毒”或“RSV”(也称为人正肺病毒)是指可感染人细胞并且可引起具有影响呼吸道的症状的感染的病毒。在实施方案中，RSV是反义单链RNA病毒。RSV可以通过鼻或眼传播，并且在一些情况下可影响上下气道的柱状上皮细胞。RSV表面上的F蛋白可用于融合病毒和宿主细胞膜，因而导致宿主细胞的感染。在一些情况下，F和G糖蛋白用于病毒附着和宿主细胞的感染。可由RSV感染引起的症状和综合征包括肺炎、呼吸衰竭、呼吸暂停、呼吸窘迫和远端炎症。
“人副流感病毒”或“HPIV”是指感染细胞并且可引起人副流行性感冒的病毒。在实施方案中，HPIV是单链RNA病毒。HPIV包括人1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒和4型人副流感病毒。在一些情况下，HPIV通过病毒与宿主细胞脂膜之间的附着和融合来感染宿主细胞。例如，HPIV可以通过使用包膜蛋白和融合蛋白附着和融合到宿主细胞上以进入细胞而进入细胞。由HPIV感染引起的症状和综合征包括下呼吸道感染、上呼吸道感染、细支气管炎、肺炎、神经系统疾病和气道炎症。
“人鼻病毒”或“HRV”是指感染人并且可引起普通感冒的病毒。HRV包括鼻病毒A、鼻病毒B和鼻病毒C。在实施方案中，HRV是单链正义RNA病毒。在实施方案中，HRV通过呼吸飞沫或传染体的气溶胶而传播。由HRV感染引起的综合征和症状包括普通感冒、喉咙痛、流鼻涕、鼻塞、打喷嚏、咳嗽、肌肉酸痛、疲劳和头痛。
“腺病毒”或“ADV”是指可感染细胞并且可引起各种各样的呼吸道症状的病毒。在实施方案中，ADV是具有双链DNA基因组的无包膜病毒。在实施方案中，人ADV(HAdV)包括腺病毒A、腺病毒B、腺病毒C、腺病毒D、腺病毒E、腺病毒F和腺病毒G。在一些情况下，ADV细胞进入由纤突蛋白的突起结构域与宿主细胞受体的结合引发。在一些情况下，五邻体蛋白与整联蛋白分子相互作用，由此刺激腺病毒进入。腺病毒感染引起的症状和综合征包括扁桃体炎、细支气管炎和肺炎。
如本文所定义，关于分子(例如，多核苷酸或蛋白质)的活性和/或功能性的术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”等意指相对于不存在抑制时蛋白质的活性或功能而言不利地影响(例如，减小或降低)分子的活性或功能。因此，抑制包括至少部分、部分地或完全地阻断刺激，减小、阻止、或延迟激活，或者失活、不敏感化、或下调信号转导或酶活性或者蛋白质或多核苷酸的量。类似地，“抑制剂”是例如通过结合、部分或完全阻断、减小、阻止、延迟、失活、不敏感化、或下调靶生物分子的活性来抑制靶生物分子(即，核酸、肽、碳水化合物、脂质或可从自然界发现的任何其它分子)的化合物。在疾病预防性治疗的语境中，抑制是指减少疾病或疾病症状(例如Covid-19)。
如本文所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”(以及如本领域公知的)也广泛地包括在对象的病况中获得有益或期望结果(包括临床结果)的任何方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于缓解或改善一种或多种症状或病况，减弱疾病程度，稳定化(即，不恶化)疾病状态，预防疾病的传播或扩散，延迟或减缓疾病进展，改善或缓和疾病状态，减弱疾病的复发，以及减轻，无论是部分还是或全部以及无论可检测还是不可检测。换句话讲，如本文所用，“治疗”包括疾病的任何治愈、改善、或预防。治疗可以防止疾病发生；抑制疾病的扩散；减轻疾病的症状、完全或部分消除疾病的根本原因、缩短疾病的持续时间、或进行这些事情的组合。
如本文所用，“治疗(Treating)”和“治疗(treatment)”包括预防性治疗。治疗方法包括向对象施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可由单次施用组成，或者可包括一系列施用。治疗期的长度取决于多种因素，如病况的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、用于治疗的组合物的活性、或它们的组合。还应理解，用于治疗或预防的试剂的有效剂量可在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量的变化可以通过本领域已知的标准诊断测定而产生并且变得显而易见。在一些情况下，可能需要慢性施用。例如，将组合物以足以治疗患者的量和持续时间施用于对象。在实施方案中，治疗不是预防性治疗。
术语“预防”是指减少患者中疾病或疾病症状的发生。如上所指示，预防可以是完全的(无可检测的症状)或者部分的，使得观察到的症状比不存在治疗时可能出现的更少。
如本文所用，疾病的“症状”包括与疾病相关联的任何临床或实验室表现，并且不限于对象可感觉或观察到的。
在与疾病相关联的物质或物质活性或功能的语境中，术语“相关联的”或“与…相关联的”意指疾病可以(整体或部分地)由物质或物质活性或功能引起、或者疾病的症状可以(整体或部分地)由物质或物质活性或功能引起。当在症状的语境中使用该术语时，例如，症状与疾病或病况相关联，其意指症状可以指示疾病或病况存在于显示出症状的对象中。
“患者”或“有此需要的对象”是指患有或易患能够通过施用如本文所提供的药物组合物而治疗的疾病或病况的活生物体。非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿，以及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者是人。
“有效量”是相对于不存在化合物而言足以使化合物实现所陈述目的的量(例如，实现其施用的效应，治疗疾病，降低酶活性，增加酶活性，减少信号传导途径，或者减少疾病或病况的一种或多种症状)。“有效量”的实例是足以有助于治疗、预防、或减少疾病的一种或多种症状的量，其也可称为“治疗有效量”。一种或多种症状的“减少”(和该短语的语法等同物)意指减少一种或多种症状的严重程度或频率，或者消除一种或多种症状。药物的“预防有效量”是当施用于对象时将具有预期预防效应的药物的量，例如，预防或延迟损伤、疾病、病理或病况的发作(或复发)，或者降低损伤、疾病、病理、或病况、或其症状发作(或复发)的可能性。完全预防效应不一定通过施用一个剂量而发生，并且可以仅在施用一系列剂量后发生。因此，预防有效量能够以一次或多次施用来施用。如本文所用，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂而言降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂而言破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。确切的量将取决于治疗目的，并且将由本领域的技术人员使用已知的技术来确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
对于本文所述的任何化合物，治疗有效量最初可由结合测定或细胞培养测定来确定。目标浓度将是能够实现本文所述的方法的一种或多种活性化合物的那些浓度，如使用本文所述或本领域已知的方法所测量。
如本领域中所公知，用于人的治疗有效量也可从动物模型确定。例如，可配制用于人的剂量，以实现已发现在动物中有效的浓度。如上所述，可以通过监测化合物有效性以及向上或向下调整剂量来调整人的剂量。基于上述方法和其它方法调整剂量以在人中实现最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以改善如上所述的障碍的治疗剂的量。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、或至少100％的增加或减少。治疗功效也可表示为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可具有相对于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、或更大的效应。
剂量可以取决于患者的需求和所采用的化合物而变化。在本公开的语境中，施用于患者的剂量应当足以随时间推移在患者中实现有益的治疗反应。剂量的大小也由任何不良副作用的存在、性质和程度来决定。针对特定情形的适当剂量的确定在从业者的技能范围内。一般来讲，治疗以小于化合物的最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量以小增量增加，直到达到所处情形下的最佳效应。可以单独地调整剂量和间隔，以提供有效用于所治疗的特定临床适应症的所施用化合物的水平。这将提供与个体的疾病状态的严重程度相称的治疗方案。
如本文所用，术语“施用”意指口服施用，以气雾剂、干粉、鼻喷雾剂、栓剂、局部接触、静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用而施用，或将缓释装置(例如微量渗透泵)植入对象。施用是通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如颊面、舌下、腭、齿龈、鼻、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等。在实施方案中，施用不包括除所陈述的活性剂以外的任何活性剂的施用。
“共同施用”意指本文所述的组合物在施用一种或多种额外疗法的同时、临在之前、或临在之后施用。本文所提供的化合物可以单独施用或者可以共同施用于患者。共同施用意在包括单独或组合的化合物(多于一种化合物)同时或依序施用。因此，制备物也可根据需要与其它活性物质组合(例如，以减少代谢降解)。本公开的组合物可以经皮、经局部途径递送，或者配制成敷药棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、霜剂、软膏剂、糊剂、胶冻剂、涂剂、散剂和气雾剂。制备物还可以与吸入粘液溶解剂(例如，rhDNase，如本领域中已知)或者与吸入支气管扩张剂(短效或长效β激动剂、短效或长效抗胆碱能剂)、吸入皮质类固醇、或吸入抗生素组合，以通过提供加性或协同效应来改善这些药物的功效。本发明的组合物可以经皮、经局部途径递送，配制成敷药棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、霜剂、软膏剂、纳米粒子、糊剂、胶冻剂、涂剂、散剂和气雾剂。口服制备物包括适于被患者摄取的片剂、丸剂、散剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、锭剂、扁囊剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等。固体形式制备物包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。液体形式制备物包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液剂。本发明的组合物可额外包括提供缓释和/或舒适的组分。这样的组分包括高分子量阴离子粘液模拟(mucomimetic)聚合物、胶凝多糖和细粒药物载体基质。这些组分更详细地讨论于美国专利No.4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中。这些专利的全部内容出于所有目的全文以引用方式并入本文中。本发明的组合物还可以作为微球递送以在体内缓慢释放。例如，微球可以经由含药物微球的皮内注射进行施用，其在皮下缓慢释放(参见Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；作为可生物降解和可注射凝胶制剂(参见例如GaoPharm.Res.12:857-863,1995)；或者作为用于口服施用的微球(参见例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)进行施用。在另一个实施方案中，本发明组合物的制剂可以通过使用脂质体进行递送，所述脂质体与细胞膜融合或者被内吞，即，通过采用连接于脂质体的受体配体，所述受体配体结合细胞的表面膜蛋白受体，导致内吞作用。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异的受体配体，或者以其它方式优先针对特定器官的情况下，可以致力于将本发明的组合物的递送到体内靶细胞中(参见例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。
术语“疫苗”是指可提供针对特定疾病或病原体的主动获得性免疫和/或治疗效果(例如治疗)的组合物。疫苗典型地含有一种或多种可在对象中诱导针对病原体或疾病(即，靶病原体或疾病)的免疫反应的试剂。免疫原性试剂刺激机体的免疫系统，以将所述试剂识别为靶病原体或疾病存在的威胁或迹象，由此诱导免疫记忆，使得免疫系统可在后续暴露时更容易地识别和破坏任何病原体。疫苗可以是预防性的(例如，在易感对象中预防或改善未来被任何天然或病原体感染或预期的癌症发病的效应)或治疗性的(例如，在已诊断患有癌症的对象中治疗癌症)。疫苗的施用称为疫苗接种。在一些实例中，疫苗组合物可向对象提供编码抗原分子(例如肽)的核酸，例如mRNA。在对象中经由疫苗组合物递送的核酸可以表达成抗原分子并允许对象获得针对抗原分子的免疫力。在针对感染疾病进行疫苗接种的语境中，疫苗组合物可以提供编码与某些病原体相关联的抗原分子(例如，已知在病原体(例如，病原性细菌或病毒)中表达的一种或多种肽)的mRNA。在病毒疫苗的语境中，疫苗组合物可以提供编码某些病毒肽的mRNA，这些病毒肽是寻求免疫力的病毒所特有的，例如，在病毒表面(例如衣壳)上基本上专一或高度表达的肽。在用病毒疫苗组合物疫苗接种之后，对象可具有针对病毒肽的免疫力，从而特异性地杀伤表达它的细胞。
术语“佐剂”根据其在免疫学内的普通常规含义使用，并且是指通常用作疫苗组分的物质。当将一种或多种特异性抗原作为疫苗的一部分施用于对象时，佐剂可增加对象中的抗原特异性免疫反应。在实施方案中，佐剂加速对抗原的免疫反应。在实施方案中，佐剂延长对抗原的免疫反应。在实施方案中，佐剂增强对抗原的免疫反应。
本文所用的术语“免疫反应”包括但不限于“适应性免疫反应”，也称为“获得性免疫反应”，其中适应性免疫在对免疫反应所靶向的特定病原体或特定类型细胞的初始反应后诱发免疫记忆，并在随后遇到时导致对该靶标的增强反应。免疫记忆的诱导可以提供疫苗接种的基础。
术语“免疫原性”或“抗原性”是指当施用于免疫活性对象时诱导免疫反应，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、B细胞反应(例如，产生特异性结合表位的抗体)、NK细胞反应或它们的任何组合的化合物或组合物。因此，免疫原性或抗原性组合物是能够在免疫活性对象中诱发免疫反应的组合物。例如，免疫原性或抗原性组合物可以包括与免疫反应所靶向的病原体或特定类型细胞相关联的一个或多个免疫原性表位。此外，免疫原性组合物可以包括分离的核酸构建体(如DNA或RNA)，所述核酸构建体编码抗原性多肽的一个或多个免疫原性表位，可用于表达一个或多个表位(并因此用于诱发针对该多肽或与靶病原体或细胞类型相关联的相关多肽的免疫反应)。
根据本文所提供的方法，可以向对象施用有效量的一种或多种本文所提供的试剂、组合物或复合物(例如，复合物或包括其的疫苗组合物)，所有这些可在本文中互换使用。术语“有效量”和“有效剂量”可互换使用。术语“有效量”定义为产生期望的效应(例如，表达由核酸表达的免疫原性肽并表现出免疫原性肽的预期结果)所需的任何量。用于施用试剂的有效量和计划表可以由本领域技术人员凭经验确定。施用的剂量范围大到足以产生期望的效应，例如，核酸转染、基因表达的调节、基因编辑、干细胞的诱导、免疫反应的诱导等。剂量不应大到引起显著的不良副作用，如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量可随年龄、病况、性别、疾病类型、疾病或障碍的程度、施用途径、或其它药物是否包括在方案中而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的事件中，可以由个体医师调整剂量。剂量可以变化，并且能够以每天一次或多次剂量服用进行施用，持续一天或数天。用于给定类别的药物产品的适当剂量的指导可见于文献中。例如，对于给定的参数，有效量可显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、或至少100％的增加或减少。功效也可表示为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可具有相对于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、或更大的效应。确切的剂量和制剂可取决于治疗目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Gennaro,Editor(2003)和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文所用，“细胞”是指进行足以保存或复制其基因组DNA的代谢或其它功能的细胞。细胞可通过本领域中公知的方法鉴定，包括例如完整膜的存在，通过特定染料染色，产生子代的能力，或者在配子的情况下与第二配子组合以产生存活后代的能力。细胞可以包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞以及来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如灰翅夜蛾属(spodoptera))和人细胞。当细胞是天然非粘附的或者已经例如通过胰蛋白酶消化处理而不粘附于表面时，细胞可为有用的。
“对照”或“对照实验”根据其普通常规含义使用，并且是指其中实验的对象或试剂如平行实验中处理的实验，不同的是省略实验的程序、试剂、或变量。在一些情况下，对照用作评价实验效应的比较标准。在一些实施方案中，对照是在不存在如本文所述的化合物(包括实施方案和实例)时测量的蛋白质活性。
如本文所用，术语“结合”和“结合的”根据其普通常规的含义使用，并且是指原子或分子之间的缔合。缔合可为共价的(例如，通过共价键或接头)或非共价的(例如，静电相互作用(例如，离子键、氢键、或卤素键)、范德华相互作用(例如，偶极-偶极、偶极诱导的偶极、或伦敦色散力)、环堆积(pi效应)、疏水相互作用等等)。
“接触”根据其普通常规的含义使用，并且是指允许至少两种不同的物类(例如化合物，包括生物分子或细胞)变得接近到足以反应、相互作用或物理接触的过程。应当理解；然而，所得的反应产物可以直接由添加的试剂之间的反应产生，或者由可在反应混合物中产生的一种或多种添加的试剂的中间体产生。
术语“接触”可包括允许两种物类反应、相互作用、或物理接触，其中两种物类可为如本文所述的化合物以及蛋白质或酶。在一些实施方案中，接触包括允许本文所述的化合物与参与信号传导途径的蛋白质或酶相互作用。
如本文所用，当提及两个部分时，术语“缀合的”意指两个部分(例如，纳米粒子外层和核酸)是键合的，其中连接两个部分的一个或多个键可以是共价或非共价的。在实施方案中，两个部分彼此共价键合(例如，直接或者通过共价键合的中间体)。在实施方案中，两个部分是非共价键合的(例如，通过一个或多个离子键、一个或多个范德华键/相互作用、一个或多个氢键、一个或多个极性键、或它们的组合或混合物)。
如本文所用，术语“生物缀合物”和“生物缀合接头”是指“生物缀合反应性基团”或“生物缀合反应性部分”的原子或分子之间的所得缔合。缔合可以是直接的或间接的。例如，本文所提供的第一生物缀合反应性基团(例如，–NH2、–C(O)OH、–N-羟基琥珀酰亚胺、或-马来酰亚胺)和第二生物缀合反应性基团(例如，巯基、含硫氨基酸、胺、含胺侧链的氨基酸、或羧酸酯)之间的缀合物可以是直接的，例如，通过共价键或接头(例如，第一接头或第二接头)，或者是间接的，例如通过非共价键(例如，静电相互作用(例如，离子键、氢键、卤素键)、范德华相互作用(例如，偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦色散力)、环堆积(pi效应)、疏水相互作用等等)。在实施方案中，使用生物缀合化学(即，两个生物缀合反应性基团的缔合)形成生物缀合物或生物缀合接头，包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(例如，迈克尔反应、狄尔斯-阿尔德加成)。这些和其它可用的反应讨论于例如March,ADVANCED ORGANICCHEMISTRY,第3版,John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,BIOCONJUGATETECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996；和Feeney等人,MODIFICATION OFPROTEINS；Advances in Chemistry Series,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，卤代乙酰基部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，吡啶基部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如–N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，胺)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，马来酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，巯基)。在实施方案中，第一生物缀合反应性基团(例如，-磺基–N-羟基琥珀酰亚胺部分)共价连接至第二生物缀合反应性基团(例如，胺)。
用于本文的生物缀合化学的可用生物缀合反应性部分包括例如：
(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)可转化为酯、醚、醛等的羟基。
(c)卤代烷基，其中卤化物可随后被亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子、或醇盐离子替换，由此导致新基团在卤素原子的位点处共价连接；
(d)能够参与狄尔斯-阿尔德反应的亲二烯体基团，例如马来酰亚胺基或马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基，使得后续衍生化可以经由形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)，或者经由如格氏加成或烷基锂加成的机制；
(f)磺酰卤基团，用于后续与胺反应以例如形成磺酰胺；
(g)硫醇基团，其可转化成二硫化物，与酰卤反应，或者键合至金属如金，或者与马来酰亚胺反应；
(h)胺或巯基(例如，存在于半胱氨酸中)，其可以是例如酰化、烷基化或氧化的；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；
(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；
(k)可用于核酸合成的亚磷酰胺和其它标准官能团；
(l)金属硅氧化物键合；以及
(m)金属键合至反应性磷基团(例如膦)以形成例如磷酸二酯键。
(n)使用铜催化的环加成点击化学将叠氮化物偶联至炔烃。
(o)生物素缀合物可以与亲和素或链霉亲和素反应，以形成亲和素-生物素复合物或链霉亲和素-生物素复合物。
生物缀合反应性基团可选择成使得它们不参与或者干扰本文所述的缀合物的化学稳定性。或者，通过保护基的存在，可以保护反应性官能团免于参与交联反应。在实施方案中，生物缀合物包含衍生自不饱和键如马来酰亚胺和巯基的反应的分子实体。
“可检测试剂”或“可检测部分”是组合物、物质、元素、或化合物；或其部分；可通过适当的手段检测，如光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像、或其它物理手段。例如，可用的可检测试剂包括18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32P、荧光团(例如荧光染料)、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用)、生物素、地高辛、顺磁分子、顺磁纳米粒子、超小超顺磁氧化铁(“USPIO”)纳米粒子、USPIO纳米粒子聚集体、超顺磁氧化铁(“SPIO”)纳米粒子、SPIO纳米粒子聚集体、单晶氧化铁纳米粒子、单晶氧化铁、纳米粒子造影剂、脂质体或其它含有钆螯合物(“Gd-螯合物”)分子、钆、放射性同位素、放射性核素(例如，碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如，氟-18标记的)、任何发射γ射线的放射性核素、发射正电子的放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体的递送载具，微泡(例如包括微泡壳，包括白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物；微泡气核，包括空气、一种或多种重气、全氟碳、氮气、八氟丙烷、全氟己烷脂质微球、全氟丙烷等)、碘化造影剂(例如，碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘昔兰、碘普罗胺、泛影酸盐、甲泛影酸盐、碘克沙酸盐)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米粒子、金纳米粒子聚集体、荧光团、双光子荧光团、或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性反应的肽或抗体中而变得可检测的其它实体。可检测部分是单价可检测试剂或能够与另一种组合物形成键的可检测试剂。
根据本公开的实施方案可用作成像剂和/或标记剂的放射性物质(例如放射性同位素)包括但不限于18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。根据本公开的实施方案可用作额外成像剂的顺磁离子包括但不限于过渡金属和镧系元素金属(例如，原子序数为21-29、42、43、44、或57-71的金属)的离子。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
如本文所用，术语“低聚物”和“聚合物”是指具有多个重复亚单元(例如聚合单体)的化合物。术语“共低聚物”或“共聚物”是指包括2个或更多个不同残基(单体单元或单体，其可在本文中互换使用)的低聚物或聚合物。低聚物中单体的数目通常小于聚合物中单体的数目。因此，在一些实例中，低聚物可以具有1至约10个单体、1至约20个单体、1至约30个单体、1至约40个单体、1至约50个单体、1至约100个单体、1至约150个单体、1至约200个单体、1至约250个单体、1至约300个单体、1至约350个单体、1至约400个单体、1至约450个单体或1至约500个单体的长度。在一些实例中，低聚物可具以有小于约500个单体、小于约450个单体、小于约400个单体、小于约350个单体、小于约300个单体、小于约250个单体、小于约200个单体、小于约150个单体、小于约100个单体、小于约50个单体、小于约40个单体、小于约30个单体、小于约20个单体或小于约10个单体的长度。在聚合物的语境中，聚合物中单体的数目通常大于低聚物中单体的数目。因此，在一些实例中，聚合物可以具有约500至约1000个单体、约500至约2000个单体、约500至约3000个单体、约500至约4000个单体、约500至约5000个单体、约500至约6000个单体、约500至约7000个单体、约500至约8000个单体、约500至约9000个单体、约500至约10000个单体、或大于10000个单体的长度。在实施方案中，聚合物是生物聚合物。如本文所用，“生物聚合物”是指活生物体的细胞中所产生的聚合物。在实施方案中，聚合物是多糖。在实施方案中，聚合物是阳离子多糖。在实施方案中，多糖是有机单体(例如单糖)的重复单元或多种不同有机单体的重复单元。在实施方案中，多糖是单糖(例如，葡糖胺、葡萄糖、甲基葡萄糖苷等)的重复单元或多种不同单糖的重复单元。在实施方案中，多糖是聚糖。
术语“可聚合单体”根据其在聚合物化学领域中的含义使用，并且是指可化学地共价结合至其它单体分子(如相同或不同的其它可聚合单体)以形成聚合物的化合物。
术语“嵌段共聚物”根据其常规含义使用，并且是指通过共价键连接的聚合单体的两个或更多个部分(例如嵌段)。在实施方案中，嵌段共聚物是聚合物的重复模式。在实施方案中，嵌段共聚物包括呈周期性(例如，重复模式)序列的两种或更多种单体。例如，二嵌段共聚物具有下式：–B-B-B-B-B-B–A-A-A-A-A–，其中“B”是共价结合在一起的第一亚基并且“A”是第二亚基。因此，三嵌段共聚物是具有三个不同嵌段的共聚物，其中两个可以是相同的(例如–A-A-A-A-A–B-B-B-B-B-B–A-A-A-A-A–)，或者所有三个是不同的(例如–A-A-A-A-A–B-B-B-B-B-B–C-C-C-C-C–)，其中“A”是第一亚基，“B”是第二亚基，并且“C”是第三亚基，其共价结合在一起。
短语“平均分子量”是指聚合物的重均分子量，如通过凝胶渗透色谱法(也称为GPC或尺寸排阻色谱法(SEC))使用四氢呋喃(THF)作为溶剂并且使用分子量校准曲线采用聚苯乙烯标准所测定。
如本文所用，“纳米粒子”是最长直径小于或等于1000纳米的粒子。纳米粒子的最长尺度可在本文中称为纳米粒子的长度。纳米粒子的最短尺度可在本文中称为纳米粒子的宽度。纳米粒子可以由任何适当的材料构成。例如，纳米粒子核可以包括适当的金属及其金属氧化物(例如，金属纳米粒子核)、碳(例如，有机纳米粒子核)、硅及其氧化物(例如，硅纳米粒子核)或硼及其氧化物(例如，硼纳米粒子核)、或它们的混合物。在实施方案中，纳米粒子具有球体、棒、星形、立方体、三角形、六边形、圆柱体、球柱体、或椭圆体的形状。纳米粒子还可以包括覆盖大部分(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)或全部纳米粒子核的外层。纳米粒子的外层可以包括与一种或多种生物分子(例如，肺病毒蛋白、编码所述肺病毒蛋白的核酸)连接的部分。
“无机纳米粒子”是指不含碳的纳米粒子。例如，无机纳米粒子可以指金属或其金属氧化物(例如，金纳米粒子、铁纳米粒子)、硅及其氧化物(例如，二氧化硅纳米粒子)、或钛及其氧化物(例如，二氧化钛纳米粒子)。在实施方案中，无机纳米粒子是金纳米粒子。无机纳米粒子可为金属纳米粒子。当纳米粒子是金属时，金属可为钛、锆、金、银、铂、铈、砷、铁、铝或硅。金属纳米粒子可为钛、锆、金、银、或铂以及它们的适当金属氧化物。在实施方案中，纳米粒子是氧化钛、氧化锆、氧化铈、氧化砷、氧化铁、氧化铝、或氧化硅。金属氧化物纳米粒子可为二氧化钛或氧化锆。纳米粒子可为钛。纳米粒子可为金。在实施方案中，金属纳米粒子为金纳米粒子。在实施方案中，无机纳米粒子还可包括含有碳的部分。
术语“佐剂”根据其在免疫学内的普通常规含义使用，并且是指通常用作疫苗组分的物质。当将一种或多种特异性抗原作为疫苗的一部分施用于对象时，佐剂可增加对象中的抗原特异性免疫反应。在实施方案中，佐剂加速对抗原的免疫反应。在实施方案中，佐剂延长对抗原的免疫反应。在实施方案中，佐剂增强对抗原的免疫反应。
术语“药学上可接受的盐”意在包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于存在于本文所述的化合物上的特定取代基。当本公开的化合物含有相对酸性官能团时，可通过使这样的化合物的中性形式与足量的期望碱(纯的或处于合适的惰性溶剂中)接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐、或类似的盐。当本公开的化合物含有相对碱性官能团时，可通过使这样的化合物的中性形式与足量的期望酸(纯的或处于合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸等的那些，以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本公开的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团两者，其允许化合物转化为碱或酸加成盐。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指有助于将活性剂施用于对象并且被对象吸收并且可包括在本公开的组合物中而不对患者造成显著不利毒理效应的物质。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐溶液、乳酸林格氏液、生理蔗糖、生理葡萄糖、粘结剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(如林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和着色剂等。可将这样的制剂灭菌，并且根据需要与辅剂混合，所述辅剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳族物质等，其不与本公开的化合物有毒地反应。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂可用于本公开。
术语“制备物”旨在包括活性化合物与作为载体的包封材料的制剂，从而提供胶囊，其中在具有或不具有其它载体的情况下活性组分被载体包围，载体因此与之缔合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适于口服施用的固体剂型。
如本文所用，“协同量”是指导致协同效应(即，大于加和效应效应)的第一量(例如，本文所提供的化合物的量)和第二量(例如，治疗剂)的总和。因此，本文可互换使用的术语“协同”、“协同作用”，“协同的”、“组合协同量”和“协同治疗效果”是指组合施用的化合物的测量效应，其中测量效应大于作为单一试剂单独施用的本文所提供的化合物的各自单独效应的总和。
在实施方案中，当与治疗剂分开使用时，协同量可以为本文所提供的化合物的量的约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。在实施方案中，当与本文所提供的化合物分开使用时，协同量可以为治疗剂的量的约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。
复合物
本文尤其提供了复合物，所述复合物包括与一个或多个肺病毒蛋白或者一个或多个编码肺病毒蛋白的核酸连接的纳米粒子。如本文所用，术语“肺病毒”是指可进入细胞(例如人细胞)并在其内复制并引起影响肺和/或呼吸道的感染或感染性疾病的病毒。例如，肺病毒感染可引起包括但不限于呼吸短促(气促)、呼吸困难、疲劳、咳嗽和胸痛的症状。由肺病毒引起的临床综合征可包括普通感冒、急性和慢性支气管炎、细支气管炎、哮吼、肺炎、哮喘、支气管扩张、肺炎、肺栓塞、肺动脉高压、结节病、睡眠呼吸暂停和远端炎症作用。在实施方案中，肺病毒引起如表2所列出的一种或多种综合征。因此，“肺病毒蛋白”是指在肺病毒(例如，人冠状病毒、腺病毒等)的基因组内编码的蛋白质(例如，刺突蛋白等)。
本文所提供的复合物(包括其实施方案)包括纳米粒子，其中纳米粒子包括金核。金核适于将病毒蛋白或编码病毒蛋白的核酸连接(例如通过间接或直接连接)到纳米粒子上。在一些情况下，病毒蛋白或核酸可以间接连接到纳米粒子金核，例如通过共价接头(例如，肽接头、化学接头、生物缀合接头等)或者通过与纳米粒子外层的连接。因此，在一个方面，提供了一种复合物，所述复合物包括：(a)包括金核的纳米粒子；以及(b)肺病毒蛋白或其片段、或者编码肺病毒蛋白或其片段的核酸，其中肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子连接。在实施方案中，复合物包括至少一种肺病毒蛋白或其片段以及至少一种编码肺病毒蛋白或其片段的核酸。
在实施方案中，复合物包括多个肺病毒蛋白或其片段。在实施方案中，多个肺病毒蛋白包括不同的肺病毒蛋白。在实施方案中，复合物包括多个编码肺病毒蛋白或其片段的核酸。在实施方案中，多个核酸编码不同的肺病毒蛋白或其片段。在实施方案中，复合物包括多个肺病毒蛋白或其片段以及多个编码肺病毒蛋白或其片段的核酸。
在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人副流感病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)、腺病毒(ADV)、人冠状病毒(HCoV)、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、人偏肺病毒(HMPV)、或人博卡病毒(HBoV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人呼吸道合胞病毒(HRSV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人副流感病毒(HPV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人鼻病毒(HRV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自腺病毒(ADV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人冠状病毒(HCoV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人偏肺病毒(HMPV)的蛋白质。在实施方案中，肺病毒蛋白是来自人博卡病毒(HBoV)的蛋白质。
在实施方案中，来自HRSV的肺病毒蛋白是糖蛋白G(受体结合)、糖蛋白F(膜融合)、或糖蛋白SH。在实施方案中，来自HRSV的肺病毒蛋白是糖蛋白G。在实施方案中，来自HRSV的肺病毒蛋白是糖蛋白F。在实施方案中，来自HRSV的肺病毒蛋白是糖蛋白SH。在实施方案中，来自HPV的肺病毒蛋白是HN-四聚体、F-蛋白三聚体、或基质蛋白(M)。在实施方案中，来自HPV的肺病毒蛋白是HN-四聚体。在实施方案中，来自HPV的肺病毒蛋白是F-蛋白三聚体。在实施方案中，来自HPV的肺病毒蛋白是基质蛋白(M)。在实施方案中，来自HRV的肺病毒蛋白是病毒衣壳糖蛋白VP1、病毒衣壳糖蛋白VP2、病毒衣壳糖蛋白VP3、或病毒衣壳糖蛋白VP4。在实施方案中，来自HRV的肺病毒蛋白是病毒衣壳糖蛋白VP1。在实施方案中，来自HRV的肺病毒蛋白是病毒衣壳糖蛋白VP2。在实施方案中，来自HRV的肺病毒蛋白是病毒衣壳糖蛋白VP3。在实施方案中，来自HRV的肺病毒蛋白是病毒衣壳糖蛋白VP4。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是六邻体、五邻体、纤突、IIIa、VIII、或IX。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是六邻体。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是五邻体。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是纤突。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是IIIa。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是VIII。在实施方案中，来自ADV的肺病毒蛋白是IX。在实施方案中，来自HCoV的肺病毒蛋白是包膜、膜、刺突蛋白、或核衣壳蛋白。在实施方案中，来自HCoV的肺病毒蛋白是包膜蛋白。在实施方案中，来自HCoV的肺病毒蛋白是膜蛋白。在实施方案中，来自HCoV的肺病毒蛋白是刺突蛋白。在实施方案中，来自HCoV的肺病毒蛋白是核衣壳蛋白。在实施方案中，来自SARS-CoV的肺病毒蛋白是包膜、膜、刺突蛋白、或核衣壳蛋白。在实施方案中，来自SARS-CoV的肺病毒蛋白是包膜蛋白。在实施方案中，来自SARS-CoV的肺病毒蛋白是膜蛋白。在实施方案中，来自SARS-CoV的肺病毒蛋白是刺突蛋白。在实施方案中，来自SARS-CoV的肺病毒蛋白是核衣壳蛋白。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是糖蛋白-G、融合蛋白-F、核蛋白-N、SH-蛋白、或基质蛋白。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是糖蛋白-G。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是融合蛋白-F。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是核蛋白-N。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是SH-蛋白。在实施方案中，来自HMPV的肺病毒蛋白是基质蛋白。在实施方案中，来自HBoV的肺病毒蛋白是病毒衣壳蛋白1(VP2)或/和病毒衣壳蛋白2(VP2)。在实施方案中，来自HBoV的肺病毒蛋白是病毒衣壳蛋白1(VP2)。在实施方案中，来自HBoV的肺病毒蛋白是病毒衣壳蛋白2(VP2)。
在实施方案中，肺病毒是SARS-CoV-2。在实施方案中，肺病毒蛋白或其片段是S蛋白、N蛋白、M蛋白、或E蛋白。在实施方案中，肺病毒蛋白或其片段是S蛋白。在实施方案中，肺病毒蛋白或其片段是N蛋白。在实施方案中，肺病毒蛋白或其片段是M蛋白。在实施方案中，肺病毒蛋白或其片段是E蛋白。因此，在实施方案中，核酸编码S蛋白、N蛋白、M蛋白、或E蛋白。在实施方案中，核酸编码S蛋白。在实施方案中，核酸编码N蛋白。在实施方案中，核酸编码M蛋白。在实施方案中，核酸编码E蛋白。
对于本文所提供的复合物，在实施方案中，金核是金-氧化铁核。在实例中，氧化铁组分可用于成像或诊断方法(例如MRI)。
对于本文所提供的复合物，在实施方案中，纳米粒子通过将外层连接至金核来修饰。因此，在实施方案中，纳米粒子包括外层。纳米粒子的外层可包括具有官能团的化合物(例如，聚合物、阳离子多糖)，病毒蛋白或编码病毒蛋白的核酸可通过所述官能团连接(例如，通过静电相互作用(例如，离子键、氢键、卤素键)或疏水相互作用，通过共价缀合化学)至纳米粒子。对于病毒蛋白或核酸与外层的共价连接，可以使用本领域所公知和本文所述的共价缀合方法。
在实施方案中，纳米粒子的外层共价连接至纳米粒子核(例如，通过外层上的硫醇基团(-SH)连接至金核的表面)。在实施方案中，纳米粒子的外层非共价地连接至纳米粒子核(例如，与金核的离子静电相互作用)。例如，金核的带负电荷的表面可以通过离子相互作用连接至带正电荷的外表面(例如，壳聚糖、壳聚糖-环糊精)。
在实施方案中，外层包括聚合物。在实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)或聚酰氨基胺(PAMAM)。在实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在实施方案中，聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。在实施方案中，聚合物是聚酰氨基胺(PAMAM)。在实施方案中，外层包括阳离子多糖。在实施方案中，阳离子多糖包括壳聚糖。在实施方案中，阳离子多糖包括壳聚糖-环糊精。因此，在一个实施方案中，外层是通过非共价相互作用连接至纳米粒子金核的壳聚糖多糖。在另一个实施方案中，外层是通过非共价相互作用连接至纳米粒子金核的壳聚糖-环糊精多糖。
在实施方案中，外层包括氨基酸，其包括伯胺基团。在实施方案中，外层包括硫醇(-SH)基团。例如，外层上的硫醇基团可用于将外层连接到纳米粒子核上。用于产生纳米粒子的方法进一步描述于Sukumar,U.K.；Bose,R.J.C.；Malhotra,M.；Babikir,H.A.；Afjei,R.；Robinson,E.；Zeng,Y.；Chang,E.；Habte,F.；Sinclair,R.；Gambhir,S.S.；Massoud,T.F.；Paulmurugan,R.,Intranasal delivery of targeted polyfunctional gold-ironoxide nanoparticles loaded with therapeutic microRNAs for combinedtheranostic multimodality imaging and presensitization of glioblastoma totemozolomide.Biomaterials 2019,218,119342.，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。
在实施方案中，肺病毒蛋白或编码蛋白质的核酸与纳米粒子共价连接。例如，用硫醇官能化的肺病毒蛋白或核酸可以吸附到纳米粒子金核上。在实施方案中，肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子的外层共价连接。例如，纳米粒子外层可以包括能够与病毒蛋白或编码所述病毒蛋白的核酸上的第二反应性部分形成共价键的第一反应性部分。例如，纳米粒子外层上的硫醇基团可以与病毒蛋白或核酸上的硫醇基团反应形成共价二硫键。例如，用共价反应性部分修饰的核酸或蛋白质可以使用本文所述和本领域已知的多种缀合方法共价连接至纳米粒子外层。
在实施方案中，肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子非共价连接。例如，肺病毒蛋白或核酸可以通过非共价键(例如，静电相互作用(例如，离子键、氢键、卤素键)、疏水相互作用)连接至纳米粒子。例如，官能化或非官能化蛋白质可以通过疏水相互作用连接至纳米粒子金核。在实施方案中，肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子的外层非共价连接。例如，带负电荷的核酸可以通过非共价键(例如，离子静电相互作用)连接至带正电荷的外层(例如壳聚糖)。
在实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸。在实施方案中，核酸是核糖核酸。核酸可以经化学修饰，如以增加稳定性和/或细胞渗透。本文所提供的核酸可以包括一个或多个反应性部分，例如共价反应性部分。反应性部分可以使用任何适当的接头如本领域已知的聚合物接头(例如，聚乙二醇接头或等同物)连接至核酸。如本文所用，术语“共价反应性部分”是指能够与第二共价反应性部分(例如，聚合物(例如聚合物外层)上的官能团)化学反应形成共价键的化学部分。类似地，本文所提供的肺病毒蛋白(包括其实施方案)可以被修饰(例如，以增加稳定性和/或细胞渗透)。在实施方案中，肺病毒蛋白可被修饰成包括反应性部分(例如，硫醇基团等)作为连接至纳米粒子(例如，纳米粒子核、纳米粒子外层)的手段。
在实施方案中，本文所提供的复合物包括可检测部分。可检测部分可以是本领域已知和本文描述的任何部分。在实施方案中，可检测部分是酶、生物素、地高辛、顺磁分子，造影剂、钆、放射性同位素、放射性核素、氟脱氧葡萄糖、硫酸钡、二氧化钍、金、荧光团、半抗原、蛋白质、荧光部分、或它们的两种或更多种的组合。在实施方案中，造影剂是磁共振成像造影剂、X射线造影剂、或碘化造影剂。在实施方案中，可检测试剂是荧光团(例如，荧光素、罗丹明、香豆素、花菁、或它们的类似物)。在实施方案中，可检测试剂是化学发光试剂。在实施方案中，可检测试剂是放射性核素。在实施方案中，可检测试剂是放射性同位素。在实施方案中，可检测试剂是顺磁分子或顺磁纳米粒子。可检测部分可以连接于纳米粒子核、纳米粒子的外层、肺病毒蛋白、或核酸。在实施方案中，可检测部分是酶(例如，可检测蛋白(例如荧光素酶))。在实施方案中，复合物包括可检测蛋白质(例如荧光素酶)，其中蛋白质连接于纳米粒子。在实施方案中，复合物包括编码可检测蛋白(例如荧光素酶)的核酸(例如，DNA、mRNA)，其中核酸连接于纳米粒子。
本文所提供的复合物(包括其实施方案)可进一步通过尺寸表征。如本文所提及，复合物(例如纳米粒子(例如核、核与外层)和肺病毒蛋白或核酸)的尺寸为复合物的平均直径。因此，在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约25nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约35nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约40nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约45nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约50nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约55nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约60nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约65nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约70nm至约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约75nm至约80nm。
在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约75nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约70nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约65nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约60nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约55nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约45nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约35nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约30nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm至约25nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75或80nm。
在实施方案中，复合物的尺寸为约20nm。在实施方案中，复合物的尺寸为20nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约25nm。在实施方案中，复合物的尺寸为25nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm。在实施方案中，复合物的尺寸为30nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约35nm。在实施方案中，复合物的尺寸为35nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约45nm。在实施方案中，复合物的尺寸为45nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约55nm。在实施方案中，复合物的尺寸为55nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约60nm。在实施方案中，复合物的尺寸为60nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约65nm。在实施方案中，复合物的尺寸为65nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约70nm。在实施方案中，复合物的尺寸为70nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约75。在实施方案中，复合物的尺寸为75。在实施方案中，复合物的尺寸为约80nm。在实施方案中，复合物的尺寸为80nm。
在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约32nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约34nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约36nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约38nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约40nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约42nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约44nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约46nm至约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约48nm至约50nm。
在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约48nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约46nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约44nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约42nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约38nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约36nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约34nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm至约32nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm、32nm、34nm、38nm、40nm、42nm、44nm、48nm、或50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约30nm。在实施方案中，复合物的尺寸为30nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约32nm。在实施方案中，复合物的尺寸为32nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约34nm。在实施方案中，复合物的尺寸为34nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约36nm。在实施方案中，复合物的尺寸为36nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约38nm。在实施方案中，复合物的尺寸为38nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为40nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约42nm。在实施方案中，复合物的尺寸为42nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约44nm。在实施方案中，复合物的尺寸为44nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约46nm。在实施方案中，复合物的尺寸为46nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约48nm。在实施方案中，复合物的尺寸为48nm。在实施方案中，复合物的尺寸为约50nm。在实施方案中，复合物的尺寸为50nm。
在实施方案中，纳米粒子核的尺寸(例如平均直径)为约4nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约6nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约8nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约10nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约12nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约14nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约16nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约18nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约20nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约22nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约24nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约26nm至约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约28nm至约30nm。
在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约28nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约26nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约24nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约22nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约18nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约16nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约14nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约12nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约10nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约8nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm至约6nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm、6nm、8nm、10nm、12,nm、14nm、16nm、18nm、20nm、22,nm、24nm、26nm、28nm、或30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约4nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为4nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约6nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为6nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约8nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为8nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约10nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为10nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约12nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为12nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约14nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为14nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约16nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为16nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约18nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为18nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约20nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为20nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约22nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为22nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约24nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为26nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约28nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为28nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为约30nm。在实施方案中，纳米粒子核的尺寸为30nm。
疫苗和药物组合物
设想本文所提供的复合物在用于预防肺病毒感染的疫苗组合物中特别有效。申请人已发现本文所述的复合物有效地向肺递送核酸载物。向肺递送复合物导致针对由核酸编码的蛋白质的有效免疫反应。因此，在一个方面，提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括本文所提供的复合物(包括其实施方案)，以及药学上可接受的赋形剂。
在实施方案中，疫苗组合物还包括稳定剂、佐剂和防腐剂中的一种或多种。在实施方案中，疫苗组合物包括稳定剂。在实施方案中，疫苗组合物包括佐剂。在实施方案中，疫苗组合物包括防腐剂。
在实施方案中，所述组合物被配制用于经鼻施用。
在一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本文所述的复合物(包括其实施方案)，以及药学上可接受的赋形剂。在实施方案中，本文所提供的组合物用于治疗性目的。在一些实施方案中，治疗性目的涵盖预防目的(预防疾病或病况发生的目的)和治疗目的(治疗现有疾病或病况的目的)。设想药物组合物有效地治疗肺病毒感染(例如Covid-19)或与病毒感染相关的病况。在实施方案中，当施用于对象时，复合物可诱导免疫反应，即，是免疫原性的。当来自肺病毒的一种或多种抗原肽或由载物核酸编码的一种或多种抗原肽在对象中表达时，这种免疫原性可被至少部分地诱导。
预防和治疗病毒感染的方法
本文所提供的复合物(包括其实施方案)特别可用于治疗或预防肺病毒感染。申请人已发现，所述复合物在进入口(例如，上和下呼吸道)和受肺病毒侵袭的区域(例如肺)处诱导抗原特异性免疫反应。因此，在一个方面，提供了一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗或预防有效量的本文所提供的复合物(包括其实施方案)。
在实施方案中，复合物通过鼻内途径施用。在实施方案中，复合物通过口鼻途径施用。在实施方案中，复合物施用于肺。
在一个方面，提供了一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗或预防有效量的本文所提供的疫苗组合物(包括其实施方案)。
在实施方案中，疫苗组合物通过鼻内途径施用。在实施方案中，疫苗组合物通过口鼻途径施用。在实施方案中，疫苗组合物施用于肺。
在实施方案中，包括本文所提供的复合物(包括其实施方案)的组合物具有预防活性，使得疫苗可预防或降低对象中疾病(例如COVID-19)或病况发生的可能性。在组合物用于预防目的的实施方案中，对象可为不患有疾病或病况的动物，例如，未被诊断患有疾病或病况或者不具有与疾病或病况相关联的明显症状的人。
在实施方案中，包括本文所述的复合物的组合物用于预防目的，尤其是在被认为易患感染但目前尚未患有病毒性疾病的对象中。预防性疫苗可施用于易感对象，并且预防或降低对象中病毒性疾病发生的可能性。
在实施方案中，组合物具有治疗效果，使得组合物可用于治疗疾病(例如，肺病毒性疾病)或病况。所述组合物可以表现出一种或多种抗病毒活性，例如，减少病毒颗粒数目，减少和/或抑制病毒复制和感染性。
在实施方案中，包括本文所提供的复合物的组合物可以通过递送处于单一组合物中的两种分开的肺病毒蛋白或编码所述蛋白的核酸序列来提供治疗和预防效果两者。因此，在实施方案中，组合物可以(1)用第一免疫原性病毒蛋白或其片段诱导对现有肺病毒感染或病况的更加即时的治疗效果，以及(2)用第二免疫原性病毒蛋白或其片段在对象中诱导适应性免疫，以用于将来发生的不同的肺病毒性疾病或病况。因此，在实施方案中，组合物包括包含两个或更多个不同肺病毒蛋白或编码其的核酸的复合物，其中每种蛋白质分别独立地表现出治疗或预防效果。
诱导免疫反应的方法
在一个方面，提供了一种用于免疫易患肺病毒性疾病的对象的方法，所述方法包括在使得产生结合肺病毒蛋白或其片段的抗体的条件下，向对象施用本文所提供的复合物(包括其实施方案)。
在一个方面，提供了一种用于免疫易患肺病毒性疾病的对象的方法，所述方法包括在使得产生结合肺病毒蛋白或其片段的抗体的条件下，向对象施用本文所提供的疫苗组合物(包括其实施方案)。
在实施方案中，抗体是IgG、IgA或IgM抗体。在实施方案中，抗体是IgG抗体。在实施方案中，抗体是IgA抗体。在实施方案中，抗体是IgM抗体。
在实施方案中，肺病毒性疾病是COVID-19。在实施方案中，肺病毒性疾病是MERS。在实施方案中，肺病毒性疾病是严重急性呼吸综合征(SARS)。在实施方案中，肺病毒性疾病是HRSV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是HPV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是HRV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是HCoV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是HBoV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是HMPV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病是ADV感染。在实施方案中，肺病毒性疾病引起如表2所列的一种或多种综合征。在实施方案中，肺病毒性疾病引起远端炎症作用。
用于监测免疫反应诱导的方法是本领域中公知的，如通过测量抗体滴度。
施用方法
在一个方面，提供了用于向对象递送本文所提供的组合物(包括其实施方案)以治疗或预防对象的肺病毒性感染的方法。在实施方案中，组合物包括复合物，所述复合物包括(a)包括金核的纳米粒子；以及(b)肺病毒蛋白或其片段、或者编码肺病毒蛋白或其片段的核酸，其中肺病毒蛋白或核酸与纳米粒子连接。在实施方案中，可以将组合物以足以在对象中实现至少部分预期效应的有效量施用于对象。
“施用(Administration)”、“施用(administering)”等在与组合物结合使用时是指如下两种情况：直接施用，其可以是在体外施用于细胞，在体内施用于细胞，由医学专业人员施用于对象或者由对象自身施用；和/或间接施用，其可以是本公开的组合物的处方行为。典型地，施用有效量，所述量可以由本领域的技术人员确定。组合物(例如复合物)可通过例如将组合物添加至细胞培养基或体内注射而施用于细胞。向对象的施用可以经由例如通过吸入(例如，鼻内途径、口鼻途径)来实现。
在实施方案中，本文所提供的组合物(包括其实施方案)作为包含肺药物赋形剂的肺药物组合物来提供。术语“肺药物组合物”等等是指旨在用于肺施用(例如，鼻内途径、口鼻途径)的药物组合物。术语“肺施用”等等在常见和常规意义上是指用于实现吸入疗法的施用(例如，鼻内途径、口鼻途径)。术语“吸入疗法”等等是指将药物通过吸入直接递送至肺。在实施方案中，当通过吸入药物递送系统直接递送至肺时，本文所提供的复合物(包括其实施方案)是有效的。术语“肺药物液体”是指呈液体的肺药物组合物。术语“肺药物固体”、“肺药物固体”等等是指呈固体(例如粉末)的肺药物组合物。
在实施方案中，本文所提供的组合物以吸入药物递送系统提供。在实施方案中，吸入药物递送系统是(i)雾化器；(ii)加压定量吸入器(pMDI)；或(iii)干粉吸入器(DPI)。雾化器明显不同于pMDI和DPI，因为活性剂溶解或悬浮于极性液体(例如水)中。相比之下，pMDI和DPI是含有悬浮或溶解于非极性挥发性推进剂或在患者吸入时流化的干粉混合物中的活性剂(例如，纳米粒子复合物)的团注药物递送装置。与雾化器相比，pMDI和DPI具有大大减少的治疗时间。术语“肺药物递送装置”等等是指适于递送(例如，鼻内、口鼻递送等)药物组合物的吸入药物递送系统。
施用于对象的剂量和频率(单剂或多剂)可以取决于多种因素而变化，例如，对象是否患有另一种疾病、其施用途径；接受者的体型、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；所治疗疾病的症状的性质和程度、并行治疗的种类、所治疗疾病的并发症或其它健康相关问题。其它治疗方案或试剂可以与本文所述的方法和组合物(包括其实施方案)结合使用。确定剂量的调整和操作(例如，频率和持续时间)完全在本领域的技术人员的能力范围内。
在实施方案中，本文所提供的组合物(包括其实施方案)以向对象递送约2ug至约50ug的核酸(例如，编码肺病毒蛋白的DNA或RNA)的剂量(或量)施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约4ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约8ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约12ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约14ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约16ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约18ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约20ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约22ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约24ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约26ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约28ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约30ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约32ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约34ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约36ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约38ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约40ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约42ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约44ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约46ug至约50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约48ug至约50ug的核酸的剂量施用。
在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约48ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约46ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约44ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约42ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约40ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约38ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约36ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约34ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约32ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约30ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约28ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约26ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约24ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约22ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约18ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约16ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约14ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约12ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约10ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约8ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约6ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug至约4ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约2ug、4ug、6ug、8ug、10ug、12ug、14ug、16ug、18ug、20ug、22ug、24ug、26ug、28ug、30ug、32ug、34ug、36ug、38ug、40ug、42ug、44ug、46ug、48ug或50ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送2ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送4ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送6ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送8ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送10ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送12ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送14ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送16ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送18ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送22ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送24ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送26ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送28ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送30ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送32ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送34ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送36ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送38ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送40ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送42ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送44ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送46ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送48ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送50ug的核酸的剂量施用。
在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约12ug至约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约14ug至约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约16ug至约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约18ug至约20ug的核酸的剂量施用。
在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约18ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约16ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约14ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug至约12ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug、12ug、14ug、16ug、18ug或20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约10ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送10ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约12ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送12ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约14ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送14ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约16ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送16ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约18ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送18ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送约20ug的核酸的剂量施用。在实施方案中，组合物以向对象递送20ug的核酸的剂量施用。
纳米粒子组合物
在一个方面，提供了一种纳米粒子，所述纳米粒子包括与其连接的多个核酸以及与其连接的多个蛋白质，其中多个核酸各自编码不同的SARS-CoV-2病毒蛋白，并且所述多个蛋白质各自是不同的SARS-CoV-2病毒蛋白。在实施方案中，纳米粒子是生物相容性的。在实施方案中，纳米粒子包括核，其中所述核包括金。在实施方案中，纳米粒子的核是金-氧化铁核。
在实施方案中，纳米粒子包括核和外层，其中所述外层包括壳聚糖-环糊精聚合物。在实施方案中，多个核酸和多个蛋白质与纳米粒子的外层连接。在实施方案中，一个或多个核酸包括编码SARS-CoV-2病毒蛋白的RNA序列。在实施方案中，RNA序列是mRNA序列。在实施方案中，SARS-CoV-2病毒蛋白选自S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白。
在一个方面，提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包括如本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)，以及药学上可接受的赋形剂。在实施方案中，疫苗制剂还包括疫苗赋形剂。在实施方案中，疫苗赋形剂是稳定剂、佐剂或防腐剂。在实施方案中，疫苗制剂包括多种纳米粒子。
在一个方面，提供了一种在有此需要的对象中预防或治疗COVID-19的方法，所述方法包括向所述对象施用组合物，所述组合物包括给予有此需要的对象的有效量的如本文所提供的疫苗(包括其实施方案)、或如本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)。在实施方案中，组合物经由鼻内途径施用。在实施方案中，组合物经由口鼻途径施用。
在实施方案中，组合物施用于呼吸道。在实施方案中，组合物施用至呼吸道，包括暴露于淋巴组织的沃尔德艾尔环。在实施方案中，组合物施用于肺。在实施方案中，组合物施用至呼吸道(包括暴露于淋巴组织的沃尔德艾尔环)和肺。
在实施方案中，组合物包括多种纳米粒子。
在一个方面，提供了一种在对象中预防或治疗COVID-19的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用组合物，所述组合物包括有效量的如本文所提供的疫苗(包括其实施方案)、或本文所提供的纳米粒子(包括其实施方案)。在实施方案中，递送可以通过鼻内或口鼻递送。在实施方案中，执行一种抗SARS-CoV-2疫苗中的多种mRNA的气道靶向。在实施方案中，本文提供了针对COVID-19的疫苗开发的组合纳米生物技术和治疗诊断策略。在实施方案中，本文提供了经由IN或口鼻途径直接递送到气道中的针对SARS-CoV-2的RNA疫苗。在实施方案中，本文提供了通过编码多种SARS-CoV-2表面抗原(例如，S、N、M和E蛋白)或其片段以及多种表面抗原(例如，S、N、M和E蛋白)或其片段的mRNA的稳健表达而产生的RNA多价疫苗。在实施方案中，本文提供了工程化多功能NP，所述工程化多功能NP具有特异性针对IN或口鼻施用和后续靶向表达ACE2受体的呼吸气道纤毛柱状细胞(及其祖细胞)而定制的多种组分，以递送“病毒”抗原以及多种S、N、M和E蛋白的合成mRNA序列。在实施方案中，本文提供了SARS-CoV-2抗原的摄取和功能效应的体外评价，其是通过使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP在哺乳动物肺细胞中转染后测量其表达、细胞表面展示和抗体识别。在实施方案中，本文提供了使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP经由IN或口鼻途径在小鼠中评价引入SARS-CoV-2的所有四种表面抗原以及S、N、M和E蛋白的mRNA多价疫苗，以评价它们在小鼠模型中的体内免疫反应。
实施方案
P实施方案1：一种纳米粒子，其包含与其连接的多个核酸以及与其连接的多个蛋白质，其中所述多个核酸各自编码不同的SARS-CoV-2病毒蛋白，并且所述多个蛋白质各自是不同的SARS-CoV-2病毒蛋白。
P实施方案2：根据P实施方案1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含核，其中所述核包含金。
P实施方案3：根据P实施方案2所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子的所述核是金-氧化铁核。
P实施方案4：根据P实施方案1所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子包含核和外层，其中所述外层包含壳聚糖-环糊精聚合物。
P实施方案5：根据P实施方案4所述的纳米粒子，其中所述多个核酸以及所述多个蛋白质与所述外层连接。
P实施方案6：根据P实施方案5所述的纳米粒子，其中所述一种或多个核酸包含编码所述SARS-CoV-2病毒蛋白的RNA序列。
P实施方案7：根据P实施方案5所述的纳米粒子，其中所述SARS-CoV-2病毒蛋白选自S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白。
P实施方案8：一种疫苗制剂，其包含根据P实施方案1-7中的一项所述的纳米粒子以及药学上可接受的赋形剂。
P实施方案9：根据P实施方案8所述的疫苗制剂，其还包含疫苗赋形剂。
P实施方案10：根据P实施方案9所述的疫苗制剂，其中所述疫苗赋形剂是稳定剂、佐剂或防腐剂。
P实施方案11：一种在有此需要的对象中预防或治疗COVID-19的方法，所述方法包括向所述对象施用组合物，所述组合物包含给予有此需要的对象的有效量的根据P实施方案8-10中的一项所述的疫苗或根据P实施方案1-7中的一项所述的纳米粒子。
P实施方案12：根据P实施方案11所述的方法，其中所述组合物经由鼻内途径施用。
P实施方案13：根据P实施方案11所述的方法，其中所述组合物经由口鼻途径施用。
P实施方案14：根据P实施方案11所述的方法，其中将所述组合物施用于肺。
P实施方案15：一种在有此需要的对象中预防或治疗SARS-CoV-2病毒感染的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用组合物，所述组合物包含有效量的根据P实施方案8-10中的一项所述的疫苗或根据P实施方案1-7中的一项所述的纳米粒子。
实施方案
实施方案1：一种复合物，其包含：(a)包含金核的纳米粒子；以及(b)肺病毒蛋白或其片段、或者编码所述肺病毒蛋白或其片段的核酸，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子连接。
实施方案2：根据实施方案1所述的复合物，其包含多个肺病毒蛋白或其片段。
实施方案3：根据实施方案2所述的复合物，其中所述多个肺病毒蛋白包含不同的肺病毒蛋白。
实施方案4：根据实施方案1所述的复合物，其包含多个编码所述肺病毒蛋白或其片段的核酸。
实施方案5：根据实施方案4所述的复合物，其中所述多个核酸编码不同的肺病毒蛋白或其片段。
实施方案6：根据实施方案1至5中任一项所述的复合物，其中所述肺病毒是人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人副流感病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)、腺病毒(ADV)、人冠状病毒(HCoV)、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、人偏肺病毒(HMPV)或人博卡病毒(HBoV)。
实施方案7：根据实施方案6所述的复合物，其中所述肺病毒是SARS-CoV-2。
实施方案8：根据实施方案7所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或其片段是S蛋白、N蛋白、M蛋白、或E蛋白。
实施方案9：根据实施方案1至8中任一项所述的复合物，其中所述金核是金-氧化铁核。
实施方案10：根据实施方案1至9中任一项所述的复合物，其中所述纳米粒子包含外层。
实施方案11：根据实施方案10所述的复合物，其中所述外层与所述金核共价连接。
实施方案12：根据实施方案10所述的复合物，其中所述外层与所述金核非共价连接。
实施方案13：根据实施方案10至12中任一项所述的复合物，其中所述外层包含聚合物。
实施方案14：根据实施方案10至13中任一项所述的复合物，其中所述外层包含阳离子多糖。
实施方案15：根据实施方案14所述的复合物，其中所述阳离子多糖包含壳聚糖。
实施方案16：根据实施方案14所述的复合物，其中所述阳离子多糖包含壳聚糖-环糊精。
实施方案17：根据实施方案1至16中任一项所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子共价连接。
实施方案18：根据实施方案17所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子的所述外层共价连接。
实施方案19：根据实施方案1至16中任一项所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子非共价连接。
实施方案20：根据实施方案19所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子的所述外层非共价连接。
实施方案21：根据实施方案1至20中任一项所述的复合物，其中所述核酸是脱氧核糖核酸。
实施方案22：根据实施方案1至20中任一项所述的复合物，其中所述核酸是核糖核酸。
实施方案23：根据实施方案1至22中任一项所述的复合物，其中所述复合物的直径为约20nm至约80nm。
实施方案24：根据实施方案1至23中任一项所述的复合物，其中所述复合物的直径为约40nm。
实施方案25：一种疫苗组合物，其包含根据实施方案1至24中任一项所述的复合物以及药学上可接受的赋形剂。
实施方案26：根据实施方案25所述的疫苗组合物，其还包含稳定剂、佐剂和防腐剂中的一种或多种。
实施方案27：根据实施方案25或26所述的疫苗组合物，其中所述组合物被配制用于经鼻施用。
实施方案28：一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的根据实施方案1至24中任一项所述的复合物。
实施方案29：根据实施方案28所述的方法，其中所述复合物通过鼻内途径施用。
实施方案30：根据实施方案28所述的方法，其中所述复合物通过口鼻途径施用。
实施方案31：根据实施方案28所述的方法，其中将所述复合物施用于肺。
实施方案32：一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的根据实施方案25至27中任一项所述的疫苗组合物。
实施方案33：根据实施方案32所述的方法，其中所述组合物经由鼻内途径施用。
实施方案34：根据实施方案32所述的方法，其中所述组合物经由口鼻途径施用。
实施方案35：根据实施方案32所述的方法，其中将所述组合物施用于肺。
实施方案36：一种用于免疫易患肺病毒性疾病的对象的方法，所述方法包括在使得产生结合所述肺病毒蛋白或其片段的抗体的条件下，向所述对象施用根据实施方案1至24中任一项所述的复合物。
实施方案37：根据实施方案36所述的方法，其中所述抗体为IgG、IgA或IgM抗体。
实施例
实施例1：示例性实验介绍
核酸疫苗安全且易于开发，因为它们的生产仅涉及制备遗传材料，而非病毒本身。抗COVID-19核酸疫苗需要将编码单独的蛋白质或蛋白质片段的病毒RNA的特定部分递送到人细胞中，然后针对所递送RNA产生病毒蛋白的拷贝。mRNA疫苗能够诱导抗原特异性T和B细胞反应17-18。到2020年4月30日，至少20个团队正在研究SARS-CoV-2DNA或RNA用于促进免疫反应的用途。当与传统或DNA疫苗形成对照时，RNA疫苗具有若干重要益处：(1)RNA疫苗不用病原体颗粒制备，因此它们呈非感染性，并且一旦制备蛋白质，信使RNA(mRNA)链就迅速降解。(2)与依赖于细胞和核膜穿孔以到达核进行转录且进一步翻译成蛋白质的pDNA不同，RNA链进入胞质溶胶进行翻译就已足够。(3)DNA表达盒具有基因组整合、插入诱变、长期表达和诱导抗DNA抗体的理论风险。(4)一些早期临床试验结果指示，RNA疫苗可以生成可靠的免疫反应，并且被健康个体良好耐受，副作用可忽略不计。(5)它可以更快速地生产，并且更容易标准化，这改善了对新出现的爆发的反应性。
值得注意的是，大多数核酸疫苗只编码S蛋白。相反，本文尤其提供了用于编码SARS-CoV-2的两种或更多种表面抗原(例如，S、N、M和E蛋白)的mRNA的稳健表达的多价(多抗原)疫苗策略。即使SARS-CoV-2与其它冠状病毒具有显著的同源性，其也在一些抗原中具有显著变异。这些变异在SARS-CoV-2中通过其感染模式、致病性、扩散和疾病严重程度的差异而明显地反映。因此，用于设计表位疫苗的一种或多种可能的病毒蛋白的基于预测的方法可能由于它们较差成功率而不具前景性。表达两种或多种表面抗原的多价mRNA疫苗提供了较好的成功。
本文尤其提供了可对于感染个体呈治疗性(例如，通过诱导免疫抗体，同时通过阻断ACE2受体来预防进一步感染)并且/或者对于未感染个体呈预防性的疫苗。工程化mRNA序列使得合成mRNA比以前更加可翻译——mRNA的体内半衰期可以通过使用各种碱基修饰和递送方法进行调节。因此，通过将mRNA配制到载体载具之中/之上，允许在宿主细胞的细胞质中快速摄取和表达，实现有效的体内递送。在一些方面，将鼻内(IN)递送与新型纳米载体组合用于临床环境中针对COVID-19的多价mRNA疫苗策略。
本文尤其提供了经由IN途径递送RNA疫苗以表达针对SARS-CoV-2的抗原的有效纳米载体。用于IN递送的有效递送系统的使用可以显著降低生成有效免疫反应所需的剂量，而无需额外的常规佐剂。因此，本文描述了携带合成mRNA的纳米制剂，所述合成mRNA编码作为独立转录物的SARS-CoV-2S、N、M和E蛋白中的两种或多种或它们的片段，或者S、N、M和E蛋白中的两种或多种或它们的片段。将mRNA和蛋白质负载到生物相容纳米粒子(NP)上并且将其与临床上实用的递送方法联用，为多价SARS-CoV-2疫苗的成功表达以用于针对COVID-19免疫提供了简便、安全、微创和组织特异性方法。
我们先前开发了针对脑癌、胶质母细胞瘤(GBM)的分子靶向治疗诊断纳米制剂。该纳米制剂包括用于经由IN递送将治疗性微RNA递送至小鼠GBM的50nm多官能金-铁氧化物NP(称作polyGION)21。用环糊精-壳聚糖(CD-CS)杂化聚合物表面官能化的PolyGION提供了用于通过静电相互作用来表面负载带负电荷的RNA的有效平台21。此外，为了作为治疗剂的价值，polyGION的靶向递送和它们运输的可视化至少在临床前研究中是必需的。因此，我们开发出并实验验证了IN递送的GION核-壳(允许CT和MR成像)、用GBM细胞靶向T7肽包被、用缀合的CD-CS杂化聚合物官能化，并且预负载治疗性miRNA作为针对GBM的有效治疗诊断系统21。我们在IN递送后在携带原位植入的GBM的小鼠中临床前评价该纳米制剂，并且发现了GBM增殖的显著抑制和动物存活率的同时改善21。此外，polyGION的存在允许IN递送并运输至颅内肿瘤的同时多模式成像21。
我们在我们的小鼠研究中发现，IN-施用的polyGION-CD-CS NP的运输由治疗时小鼠的呼吸率来确定。当我们在深度麻醉下向小鼠施用polyGION-CD-CS NP时，大多数递送的NP粘在鼻粘膜上，并随时间推移运输至脑的病理区。相比之下，当我们在清醒的小鼠中施用NP时，我们发现主要量的NP超越鼻腔，进入气道，并然后定居在远端肺中。利用这一观察，使用我们的polyGION-CD-CS纳米制剂对每种抗原特异的病毒RNA的非侵入性呼吸道粘膜靶向递送为COVID-19疾病提供了新的抗-SARS-CoV-2多价疫苗以直接靶向气道和肺——精确地主要初始靶器官，以激活肺免疫反应。当向BALB/c小鼠IN施用时，发现使用表达MERS-CoV的S蛋白的基于重组腺病毒的疫苗的类似方法诱导显著的免疫反应12。我们先前展示金NP是无毒的22-24。在一些方面，可以从polyGION-CD-CS纳米制剂中移除氧化铁组分。
IN和呼吸气道途径(例如，通过鼻喷雾剂/滴注剂、或口鼻雾化剂或吸入剂)的优点包括避免循环血液，减少全身副作用和肝/肾清除，产生气道和肺常驻型记忆T细胞反应，以及实际重复或慢性疫苗施用的可能性。此外，其作为具有高依从性和快速起效的鼻喷雾剂或吸入剂向个体的非侵入性、无痛和方便的施用提供了抗-SARS-CoV-2疫苗的新型特征。
实施例2：mRNA负载的纳米粒子的IN递送的结果
PolyGION-CD-CS NP充当治疗剂的IN递送的生物相容性无毒平台.
我们测试了使用FLuc-mRNA作为报道分子，向小鼠肺递送编码SARS-CoV-2抗原的mRNA作为疫苗以诱导呼吸道粘膜和肺免疫反应的可行性。FLuc-mRNA递送有利于通过使用生物发光成像(BLI)来监测递送的RNA在肺中的递送、稳定性和表达。我们通过测量N/P比率来测试PolyGION-CD-CS中FLuc-mRNA的负载效率(图2C)，以及使用光学BLI测试在细胞(HEK293和A549细胞)中的转染效率。我们的结果显示，荧光素酶在两种细胞类型中的较强和mRNA剂量依赖性表达。我们还通过使用普鲁士蓝染色证实了细胞内PolyGION的存在(图2F)。
使用BLI监测PolyGION-CD-CS NP介导的IN递送的FLuc-mRNA表达和肺驻留的GION
研究PolyGION-CD-CS-FLuc-mRNA复合物向小鼠的IN递送。在每个鼻孔中施用5μl的NP复合物4次(每个剂量总共20μl；2μg的mRNA当量)。在清醒的小鼠中递送NP复合物。在递送后24小时的时间点获得BLI，并且每天继续剂量施用。在6天后，对小鼠进行体内和处死后离体BLI成像。小鼠在第一次给予后在气管中显示强BLI信号，并且48小时后在肺中显示强信号。五次给予后肺中的信号显著地较强(图3)。处死前BLI显示肺中的局部信号(图4B)。离体分析(肺、脾、肝、气管和肾)显示在肺和气管支气管连接处的强BLI信号。在包括脾在内的其它器官中没有信号(图4C)。
实施例3：研究设计和方法
通过评价使用IN相容的PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP在哺乳动物肺细胞中转染 后的SARS-CoV-2mRNA的表达、细胞表面展示和抗体识别来鉴定SARS-CoV-2mRNA的最佳比 率。
宿主组织中无论何处mRNA表达的病毒抗原均可以递送针对病毒蛋白的抗体反应并保护患者免受感染。然而，肺免疫反应对于感染呼吸道的病原体也很重要，尤其是为了允许快速恢复或者防止疾病发展。呼吸道粘膜免疫反应也将保留肺常驻型记忆B和T细胞，这些细胞提供对病毒的持久中和免疫力25。由于不存在临床免疫学数据来帮助我们鉴定可有效诱导宿主体液和细胞免疫反应且同时产生中和抗体的SARS-CoV-2抗原的表位，我们递送病毒的所有表面蛋白作为抗原来诱导抗体反应作为快速开发抗COVID-19疫苗的手段。虽然不受理论的束缚，SARS-CoV-2的至少两种抗原(S、N、E和M蛋白)的表达可以产生多价免疫反应，包括记忆B和T细胞反应。如果抗原在呼吸道粘膜和肺中表达，这可能更有效。
作为实现该目标的第一步，我们将在细胞培养研究中评价抗原的mRNA介导的表达的稳健性、蛋白质稳定性，以及在将它们扩展到体内研究中之前实现所有抗原的接近等同水平所需的不同mRNA的比率。使用具有来源于人PDGF受体(PDGFR)的C末端信号肽的mRNA允许在转染细胞的表面上展示抗原，并因此更有效地在体内诱导免疫反应26-27。与更可能在细胞内保留并因此对免疫细胞识别不太有效的普通抗原相比，这可有利于它们在人中的后续应用。
在使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP转染后，使用C末端PDGFR信号肽编码序列标 记的SARS-CoV-2抗原在体外肺细胞中评价细胞中mRNA的稳定性、抗原表达和表面展示。
由于我们在临床应用中使用人PDGFR的C末端肽序列在细胞表面上展示抗原，评价一种或多种抗原表面展示对靶细胞的效应很重要。此处，我们通过肺细胞的体外转染来优化抗原的表达、稳定性和表面展示。我们还使用萤火虫荧光素酶(FLuc)报道分子mRNA用于共转染实验以通过使用BLI评价转染效率和归一化。
实验方法
我们使用全长刺突蛋白(1273aa)、核蛋白(479aa)、包膜蛋白(75aa)和膜蛋白(222aa)作为抗原来设计mRNA转录物。我们通过体外转录产生具有源于人PDGFR受体的C末端信号肽的杂合mRNA作为所有四种抗原的编码序列。我们使用A549肺癌细胞来评价体外表达。使用免疫染色和针对所有四种抗原的全长蛋白产生的小鼠单克隆抗体，针对细胞表面上的病毒抗原展示来分析使用PolyGION-CD-CS化聚合物NP在12孔培养板中针对各抗原用0.5μg/孔mRNA独立转染的细胞。我们还使用Western印迹分析细胞裂解物。此外，我们在共转染实验中使用100ng的针对FLuc报告基因合成的mRNA来通过BLI评价转染效率。在转染后纵向监测细胞三代以检查表达的长度，这为后续的体内实验提供了信息，其中重复转染以表达诱导宿主免疫反应的足够水平的抗原。
使用ELISA测定评价由这种新mRNA疫苗表达的SARS-CoV-2抗原与相应抗体结合的 功能效率。
除了评价细胞表面展示，以及蛋白质表达的稳定性和数量，我们评价了所有四种SARS-CoV-2抗原的这些特性的程度。使用ELISA测定，我们表征了这些特性的抗原。
实验方法
我们使用类似于用于评价A549肺癌细胞中mRNA的抗原表达和表面展示的转染方案。我们对转染后48小时分离的细胞裂解物的总蛋白质浓度进行定量，并且使用等量的全细胞裂解物进行ELISA测定。我们通过将抗体稀释在100mM碳酸氢钠缓冲液中使用10μg/ml抗体浓度通过在37℃下孵育4-6小时来包被Maxisorb ELISA板。使用Miltenyi封闭缓冲液封闭板1小时，然后捕获含有SARS-CoV-2抗原的细胞裂解物。我们使用针对C末端标签产生的抗PDGFR抗体作为具有HRP的夹心第二抗体，作为第二抗体用于检测。我们遵循ELISA测定的标准方案。
讨论
通过免疫组织化学和western印迹分析来评价肺细胞中使用mRNA疫苗转染的四种抗原。由于我们使用人PDGFR跨膜信号肽作为与各病毒抗原的C末端融合体，预计抗原展示在转染细胞的膜上。单次转染后对细胞的连续评价预计验证细胞表达的寿命。另外，使用PolyGION-CD-CS进行转染为评价IN递送的mRNA疫苗的免疫提供了其在体内应用的信心。基于BLI的FLuc mRNA共转染的使用预计提供关于转染效率的额外定量信息。通过完成这些实验，我们鉴定了在本文提出的体内研究中实现不同表面抗原的表达水平接近等同所需的四种mRNA各自的最佳浓度。
实施例4：评价使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP的IN递送的SARS-CoV-2的表面抗原(S、N、E和M)的mRNA疫苗以及BALB/c免疫活性小鼠体内的免疫反应。
CD-CS杂化聚合物包被的PolyGION显示核酸的有效负载。我们先前已显示该策略在小鼠模型中将治疗性miRNA有效地IN递送至GBM21。可以通过调节递送时动物的呼吸率来控制经由IN途径的治疗性核酸的递送。向正常呼吸(无麻醉)动物递送的NP导致大部分NP进入气管并到达肺。由于PolyGION-CD-CS具有较强的转染细胞的倾向，预计包被的mRNA将进入肺细胞中。当在肺细胞上展示SARS-CoV-2抗原时，将发生免疫细胞的募集以导致肺免疫反应的激活，以及先天和细胞介导的免疫的产生。此外，长期的记忆细胞可以维持针对病毒的保护性免疫。
我们评价了BALB/c亲本品系和转基因BALB/c小鼠中针对SARS-CoV-2的所有四种表面抗原的IN递送的mRNA疫苗的免疫，该转基因BALB/c小鼠被工程化成表达人ACE2受体，因为这种受体对于病毒在感染、疾病发展和进展期间进入细胞很重要。
评价使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP的IN递送的SARS-CoV-2的mRNA疫苗以及 免疫活性BALB/c小鼠体内的免疫反应。
对于体内IN递送，我们使用所鉴定的所有四种mRNA的最佳浓度用以接近相等水平的表达。我们将PolyGION-CD-CS-SARS-CoV-2-mRNA递送至无麻醉的活跃小鼠。通过将小鼠按70°角保持在仰卧位以利于IN施用，我们在每个鼻孔内施用5μl NP-mRNA复合物。我们在每次施用时施用20μl体积的NP-mRNA复合物。各20μl复合物含有500ng的各mRNA+PolyGION-CD-CS(含有58.9μg的CD-CS和2.0×109GION NP)。我们还补充500ng的FLuc-mRNA以利于BLI，以评价体内转染的效率和转染的位置。为了跟踪PolyGION的分布，我们执行了全身microCT和MR成像。我们检测了NP向脑部的任何可能的运输，因为我们关注于肺，以观察预期的mRNA递送。
在完成递送的初始成像评价之后，我们研究三个小鼠组中的免疫反应：G1：没有任何治疗的对照；G2：PolyGION-CD-CS-Scrambled-RNA；和G3：PolyGION-CD-CS-SARS-CoV-2-mRNA。在收集血样用于免疫评价之前，我们每天给予动物四次IN剂量(基于初步结果)。我们使用颌下采血法，每周采集200μl血液。我们从血液中分离血清，并使用ELISA测定进行针对用于免疫的各病毒抗原的抗体滴定。我们遵循与本文先前所述的相同方案。基于我们的初始结果，我们还根据需要递送额外的加强剂量。递送scRNA包被的PolyGION-CD-CS的动物和未处理的那些充当对照。一旦我们达到针对所有四种抗原的抗体滴度的最高血液水平(一个月的间隔最多三次加强剂量)，我们停止加强剂量并在接下来的六个月内通过每两周一次的评估来监测小鼠中的抗体滴度。我们具有单独的动物组，其中我们将测试免疫细胞亚型，以了解在递送最后一次加强后一周激活的T和B细胞类型的变化。我们在六个月后对小鼠执行类似的评价。这允许我们针对长期免疫保护效应来评估动物中的抗体水平和免疫细胞分布两者。我们还执行各种组织(肾、肺、肝、脾、胰腺和脑)的离体组织学，以评价任何抗原和NP递送相关联的病理效应。
评价使用PolyGION-CD-CS杂化聚合物NP的IN递送的SARS-CoV-2的mRNA疫苗及其 在表达人ACE2受体的转基因BALB/c小鼠中的体内免疫反应和致病性。
实验方法
在使用表达人ACE2受体的BALB/c转基因小鼠时，我们遵循与对mRNA疫苗的IN递送所描述的相同策略。我们培育雄性和雌性纯合TgBALB/c(K18-ACE2)2Prlmn小鼠(来自Jackson Laboratory)以获得纯合后代小鼠。由于表达的抗原(尤其是刺突蛋白抗原)因其对ACE2受体的强结合亲和力而可在这些动物中显示不同的反应，我们仔细监测动物的任何病理效应，并基于小鼠的健康状况根据需要调整治疗计划表。
讨论
在接受mRNA疫苗的BALB/c和BALB/c-hACE2转基因动物的血清中SARS-CoV-2中和抗体的评价预计显示相似的效应，但是我们预期与BALB/c动物在相似条件下相比，在BALB/c-hACE2中观察到具有较差存活率的严重病理效应。我们预计与亲本BALB/c品系相比，转基因动物中的持久循环抗体连同B和T细胞反应要高得多。
实施例5：用于呼吸道粘膜免疫的SARS-CoV-2DNA疫苗的金-Nanostar-壳聚糖介导的递送
COVID-19大流行病由冠状病毒SARS-CoV-2(SC2)引起。多种抗SC2疫苗已被批准用于人类应用，包括使用信使RNA(mRNA)、表达SC2刺突(S)蛋白的腺病毒和灭活病毒的那些。由这些肌内施用的疫苗提供的免疫保护期目前是未知的。能够经由消除性中和抗体增强长期免疫的替代的可自身施用疫苗极度地有利于处理新出现的突变SC2变体。这也可以减少疫苗接种个体充当COVID-19的被动带菌者的可能性。在此，我们在BALB/c和C57BL/6J免疫活性小鼠模型中研究了编码SC2的S蛋白的新型鼻内(IN)递送的DNA疫苗的潜能。对在修饰金-壳聚糖纳米载体上转运的这种SC2-刺突DNA疫苗的IN递送的免疫反应显示出抗体(IgG、IgA和IgM)的较强且一致的激增，以及表达不同SC2变体(MN908947(Genbank登录号)、SouthAfrican和D614G)的S蛋白的假病毒的有效中和。免疫分型和组织学分析揭示出涉及常驻型树突细胞和肺泡巨噬细胞对SC2 S抗原识别的时序事件，这引发了引流淋巴结和脾充分发展的SC2特异性细胞和体液免疫反应。在肺粘膜和组织常驻型记忆T细胞中可达到的高水平抗SC2 IgA可在进入部位处有效地抑制SC2及其变体，并且也提供长期免疫。
引言
冠状病毒病2019(COVID-19)大流行影响了全世界数十亿人。致病病原体即严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或SC2)属于β冠状病毒的家族1。冠状病毒是感染人和哺乳动物的有包膜的单链正义RNA病毒。由于这种病毒具侵袭性且不受控制地扩散，在疫苗开发和紧急使用授权批准期间采用了快速、高度优先的方法2。目前有几种策略被考虑用于SC2疫苗开发，包括mRNA、DNA、灭活病毒、表达SC2刺突(S)蛋白的腺病毒，以及肽疫苗品种3。大多数疫苗目前针对作为主要抗原的SC2的S蛋白，如Moderna的mRNA-1273、或Pfizer的mRNA-BNT162b24。灭活病毒(Covaxin)和表达SC2 S蛋白的腺病毒(Covishield和Sputnik)疫苗也在人类中施用。
mRNA疫苗由编码病毒蛋白的合成的体外转录RNA序列开发而来，但是疫苗之间的差异是基于这些合成mRNA和它们的纳米制剂载具的稳定性5。尽管肌内(IM)疫苗接种诱导了保护肺免受感染和病理学的全身体液和细胞介导的免疫反应，但它不赋予消除性免疫。此外，将疫苗无意注射到具有不良血管分布的皮下脂肪层中可导致抗原的缓慢动员和加工，导致疫苗失效。因此，在IM疫苗接种后是否产生足够的长期主动免疫性仍然是未知的6,7。最佳的疫苗接种策略的目标是消除性疫苗以导致长期免疫。编码抗原的DNA和mRNA构建体两者的优点在于它们比开发灭活病毒或制备重组蛋白更简单且更快生产，并且可以避免使用活病毒/病原体的风险8。
与IM注射形成对照，鼻内递送(IN)疫苗优选用于呼吸道感染以实现体液和先天免疫反应两者，同时还在呼吸道和肺中产生消除性免疫。然而，IN递送需要能够将负载的核酸疫苗转运穿过鼻腔并向下进入肺中的纳米载体。有效的纳米粒子(NP)递送系统也是增强有效的DNA/RNA疫苗免疫反应的关键。任何理想的递送系统需要展示出高负载能力、稳定性和生物相容性的组合。在该方面，除了脂质体之外，阳离子多糖和天然生物聚合物(如壳聚糖)已被用作疫苗递送系统中的佐剂9。壳聚糖是无毒的、生物粘附的、可生物降解和生物相容的聚合物，其可穿透上皮细胞的粘膜表面和它们紧密的细胞间连接进行疫苗递送10,11。虽然壳聚糖提供了穿过细胞膜的核酸的有效负载和递送以及在肺中的有效转染，但它需要包被到生物相容性固体纳米载体的表面上以提供穿过鼻腔进入肺的动员。此处，我们开发并评价了金-nanostar-壳聚糖(AuNS-壳聚糖)纳米制剂用于IN递送表达SC2的S蛋白的DNA载体加上编码萤火虫荧光素酶报告蛋白的mRNA。
最近的研究显示，在不存在粘膜免疫时，鼻腔可能成为SC2的贮库，从而使患者处于再感染或疾病传播给他人的风险中13。IN疫苗接种可以克服这个缺点，因为它可用于经由中和IgG、粘膜IgA和T细胞刺激广泛的免疫反应，这可以引发鼻腔中的局部粘膜免疫，这对于阻断感染和从该贮库扩散是关键的。肺与其它粘膜部位共有多种特征，但是保持其精细的组织形态学完整性需要在面对外部损伤时促炎与抗炎反应之间的精细相互作用。适时、适当定位且严格调节的T和B细胞反应对于防止感染是必需的，而调节不良的炎症则促使组织损伤和疾病发展14。IN递送存在许多其它优点，包括避免注射，以及人使用中可能的高耐受性和依从性。此外，经由IN途径的呼吸道免疫可以靶向大表面积以诱导免疫反应，包括建立丰富的抗原呈递细胞。IN疫苗接种触发了上和下呼吸道粘膜和粘膜下表面的保护性体液和细胞病原体特异性免疫反应，这些免疫反应在这些病原体的进入口处也保持较高水平。
肺泡巨噬细胞(AM)、树突细胞(DC)、上皮M细胞、上皮内淋巴细胞以及上呼吸道和支气管树的淋巴结和淋巴组织都有助于介导对疫苗的强免疫反应16。组织驻留型和循环白细胞迁移通过肺在IN疫苗接种中发挥重要作用。为了追踪这种动态相互作用，我们在具有Ccr2RFPCx3cr1GFP双报道分子的C57BL/6J转基因小鼠(C57BL/6J-DR)以及BALB/c小鼠中评价这种疫苗接种方法。CX3CR1+受体主要在白细胞如CD8+、CD4+和γδT淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞、DC和单核细胞/巨噬细胞中表达。另一方面，工程化CCR2-RFP允许跟踪常驻型单核细胞和AM17。
配制到NP之上/之中的抗原可以到达气道和肺中的呼吸道粘膜以被相关免疫细胞摄取18。随着对IN施用活减毒病毒疫苗的日益关注，基于NP的载体是生成更安全的粘膜免疫的有前景性的替代方案。因此，我们在小鼠中研究了AuNS-壳聚糖用于将SC2疫苗IN递送至上和下呼吸道粘膜的潜能。对于疫苗接种，金NP最近被用作抗原载体和免疫细胞激活剂19。这些NP是无毒的并且已用于各种应用中20。配制用于IN施用的金NP已显示扩散到淋巴结中，以触发稳健的抗原特异性细胞毒性T细胞免疫反应21。据此，我们使用AuNS-壳聚糖作为小鼠中IN递送的载体，测试了DNA(表达SC2的S蛋白)疫苗介导的抗体产生。另外，我们测试了IN递送的携带编码荧光素酶报道分子的mRNA的AuNS-壳聚糖靶向呼吸气道的可行性，并且作为概念验证和模型平台用于我们的SC2mRNA疫苗递送策略的未来适应性。这种方法的最终临床转化应当是当前mRNA疫苗的无缝扩展。
避免使用病原体颗粒赋予了当前mRNA疫苗明显的优势，因为它们在性质上是非感染性的。一旦产生蛋白质，mRNA链就迅速降解。与依赖于细胞和核膜穿孔以到达核进行转录且进一步翻译成蛋白质的pDNA不同，mRNA链进入胞质溶胶进行翻译就已足够。一些早期临床试验结果指示，RNA疫苗可以生成可靠的免疫反应，并且被健康个体良好耐受，副作用可忽略不计。另一方面，DNA是比mRNA更稳定的分子，并且DNA的使用可以得到具有适用于世界各地分布的更长保存期的稳健疫苗。然而，DNA表达盒具有基因组整合、插入诱变、长期表达和诱导抗DNA抗体的理论风险。鉴于这两种核酸疫苗的许多利弊，在此，我们最初开发并在临床前使用我们的AuNS-壳聚糖递送载具来评价IN施用的抗SC2 DNA疫苗。在概念上，我们的目标是通过首先证实其稳定性和成功的器官特异性表达(使用同时递送的荧光素酶报道分子mRNA的体内成像)，建立我们的使用该DNA疫苗的IN递送平台的原理验证，并且建立随后小鼠中的稳健疫苗介导的免疫效应的存在。我们扩展了该相同的策略以产生和评价相似的IN施用的抗SC2 mRNA疫苗，并将在临床转化之前进行这两种纳米技术的比较研究。然而，适用于这两种所提出的疫苗的关键先决条件在于是否足够的SC2核酸可利用我们的AuNS-壳聚糖NP转移穿过细胞膜。由于电穿孔是DNA摄取穿过细胞和核膜通常所必需的，我们推断抗SC2 DNA疫苗的初始测试对于确立这种NP载具代替电穿孔的能力是有用的。此外，如果单独的AuNS-壳聚糖可以将足够的DNA稳健地递送到胞质溶胶并随后细胞核中以进行后续S蛋白表达，这将表明使用单独mRNA的相似未来策略最可能成功，该策略仅需要进入胞质溶胶进行S蛋白翻译。
已经充分确立S蛋白经由与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体相互作用继之以胞吞作用来介导病毒转导。因此，基于S蛋白的疫苗可诱导抗体阻断病毒与表达ACE2受体的呼吸气道纤毛柱状细胞(及其祖细胞)的结合和融合，或者中和病毒感染22。此外，与SC2的所有结构蛋白相比，S蛋白似乎是诱导针对病毒感染的细胞和体液免疫两者的主要免疫原性蛋白。
与注射的蛋白质抗原的短半衰期相比，DNA疫苗可以在更长的时段内提供抗原的组织特异性表达，由此更好地引发免疫系统23。因此，我们设计AuNS-壳聚糖来IN递送SC2DNA疫苗以刺激广泛的免疫反应，包括鼻腔和呼吸道中的全身(中和IgG)和局部免疫(粘膜IgA和T细胞)。我们发现该IN疫苗接种策略也在肺粘膜和组织常驻型记忆(TRM)T细胞中实现了显著水平的抗SC2 IgA，其有效中和SC2假病毒及其变体，因而提供长期免疫。
结果和讨论
不同摩尔比下的金Nanostar合成、物理化学特性、稳定性、壳聚糖包被以及DNA负载效率的体外表征。
我们使用我们先前概述的改良程序来制备AuNS-壳聚糖20。其出于所有目的全文以引用方式并入本文。我们优化反应条件以生成金纳米八足形体，其提供用于引入有效载荷的充足表面积。使用阳离子生物聚合物壳聚糖对如所制备的AuNS的表面进行修饰，以改善它们的生物相容性、胶体稳定性，并实现足以负载阴离子核酸的表面电势。在高分辨率透射电子显微照片(TEM)上，修饰AuNS上的壳聚糖的均一单层是明显的，这也与NP表面电势测量中的明显变化相关。TEM揭示了NP的窄粒度分布，其中NP核的平均尺寸为20nm且突起的尖刺为约20-30nm(图9A-9C)。原始AuNS具有-5.6mV(±2.89mV)的表面电势，在用阳离子壳聚糖聚合物封端时，其偏移至+35.8mV(±3.59mV)的阳离子表面电势。我们使用凝胶阻滞测定来估计AuNS-壳聚糖的pDNA(SC2 S蛋白的编码序列)负载效率。我们将SC2质粒(2μg)与增加量的AuNS-壳聚糖复合，并且所得的多聚复合物展示包封的pDNA的一致增加。多聚复合物量中2.5μL AuNS-壳聚糖将2μg的pDNA-SC2质粒包封在NP中，导致pDNA在凝胶阻滞测定中的电泳期间完全保留在孔中(图9D)。我们还使用动态光散射(DLS)和表面ζ电势测量来评价多聚复合物的流体动力学尺寸，这也与凝胶电泳发现一致。随着SC2质粒在具有AuNS-壳聚糖的多聚复合物中的量增加，pDNA通过静电相互作用被越来越多地捕获在NP的表面上，因此，在1μL NP与1μg的SC2质粒的多聚复合物比率下，ζ电势下降至+2.12(±3.4mV)的接近净中性的表面电势，指示AuNS-壳聚糖的最大负载效率。同样，在具有大于1μg pDNA的多聚复合物比率下，表面ζ电势进一步减小至负表面电势，指示在NP的表面上松散结合的pDNA过量，这在凝胶阻滞测定中也是清楚明显的。尽管多聚复合物的各比率的展示出不同的表面电势，但是pDNA负载的AuNS-壳聚糖的尺寸恒定在35-48nm的范围内(图9E-9F)。为了确定质粒递送的最佳多聚复合物比率，我们向AuNS-壳聚糖负载pcDNA-FLuc-eGFP质粒，并使用生物发光成像(BLI)评价其在A549(非小细胞肺癌)细胞中的转染效率。与凝胶阻滞测定和ζ电势测量一致，我们在1μg的质粒和1μL的AuNS的组合下观察到最大转染效率。为了评价使用pcDNA-SC2质粒(DNA疫苗)的S蛋白表达，我们使用具有最佳比率的AuNS，用SC2质粒的不同变体(MN908947、SA和D614G)转染HEK293T细胞，并且使用抗兔SC2刺突抗体探测细胞裂解物的S蛋白表达。我们还使用抗SC2抗体测定CoV-2和CoV-1蛋白，以验证它们在后续的斑点印迹和ELISA免疫测定中的意义(图9H)。总之，所提出的DNA疫苗制剂由三种组分组成：AuNS、壳聚糖聚合物和质粒DNA。
鼻内施用负载有SC2 DNA疫苗的AuNS-壳聚糖在转基因C57BL/6J-DR和BALB/c小鼠中体现出S抗原特异性免疫反应。
本文描述了作为IN mRNA疫苗基础的IN DNA疫苗平台的开发和原理验证。已经显示SC2 S蛋白的亚单位疫苗与作为佐剂的脂质体STING激动剂可以一起在小鼠模型中IN递送时诱导强粘膜免疫13。然而，亚单位疫苗可能无法诱发足以覆盖针对目前全球扩散的各种各样变体的防护的中和抗体。因此，我们评价了我们针对SC2 S蛋白的IN-DNA疫苗，并且该策略可以扩展到编码不同SC2结构蛋白(S、N、E和M)的mRNA疫苗，以诱发可防护所有病毒蛋白中的所有不同变体的免疫力。我们使用BALB/c和C57BL/6J-DR转基因小鼠来验证该IN递送疫苗的广泛免疫能力，而C57BL/6J-DR转基因小鼠允许更特异性地使用工程化荧光蛋白来评价T细胞激活和运输。为了评价SC2 DNA疫苗的IN递送效率，我们在BALB/c和C57BL/6J-DR小鼠(各N＝10)中经由IN递送来递送负载到AuNS-壳聚糖上的表达S蛋白的pDNA。小鼠以图10A-10B所显示的间隔给予10μg的DNA。
使用基于S蛋白的斑点印迹测定所确定的来自SC2疫苗接种的小鼠的血清与SARS-CoV-1和SC2的S蛋白的反应性。
利用小鼠在疫苗接种后生成的抗SC2特异性免疫球蛋白的既定证据，我们进一步研究了血清与来自2003SARS爆发的SARS-CoV-1(SC1)的S1亚基的交叉反应性26。我们使用化学发光斑点印迹测定来测试在不同时间点从对照和SC2疫苗接种的BALB/c和C57BL/6J-DR小鼠两者收集的血清中利用抗S蛋白抗体针对来自SC1和SC2的纯化S蛋白。我们清楚地观察到，针对所递送的DNA疫苗的抗体早在疫苗接种后两周就产生(图10C)。即使SC1的S蛋白显示出与SC2的S蛋白的显著同源性，但与SC2相比，使用SC2疫苗诱导的小鼠的血清对SC1 S蛋白显示出较低的敏感性。在所有时间点从BALB/c和C57BL/6J-DR小鼠两者收集的血清的评价指示，SC2蛋白检测的灵敏度与SC1相比要高得多，并且在两种小鼠模型中也是一致的(图10C)。SC1的检测信号的有效性比SC2低近40-60％，指示显著的交叉反应性——这与此处所概述的疫苗接种方法可潜在地提供针对沙贝病毒(sarbecovirus)亚属的相关病毒的防护的早期发现一致，与SC2相比具有相似的效率27。与BALB/c小鼠相比，C57BL/6J-DR小鼠在研究的所有时间点具有略高的抗体滴度，这可能与其遗传和免疫背景的变化有关。总之，血清检测水平的趋势遵循与ELISA测定中所观察到的相同模式，在C57BL/6J-DR和BALB/c小鼠中，抗SC2 S蛋白抗体的最高血清水平分别在处理的第4和5周达到峰值。这提供了在DNA疫苗接种后触发的B细胞介导的体液免疫反应的证据(图10D)。尽管两种小鼠模型中的趋势一致，但C57BL/6J-DR的血清中的峰值抗体水平比BALB/c小鼠高出约25％。观察到的血清抗体水平和它们的峰值时间的差异可能是由于这两种近交小鼠品系的免疫学差异28,29。然而，在这两种模型中，体液免疫反应的疫苗接种功效和模式是显著的。
鼻内疫苗接种加强针对SC2突变型变体的交叉变体体液免疫反应。
随着SC2感染的全球性激增，经历突变的病毒易感性也随着扩散和时间推移而增加，这导致新的突变型变体的出现30。新出现的SC2变体由于对先前感染或疫苗接种诱发的中和抗体的抗性而引起关注。在新出现的S蛋白变体中存在的突变降低了对来自疫苗接种个体的单克隆抗体、恢复期血浆以及血清的中和的敏感性31。作为这种日益担忧的结果，我们进一步评价IN SC2(MN908947)疫苗接种的小鼠血清是否可显示与SC2的其它新出现变体的交叉反应性。我们使用经编码SC2-MN908947S蛋白和SC2-South Africa(SA)突变体S蛋白的质粒转染的HEK-293T细胞的总细胞裂解物的免疫印迹测定来探测从BALB/c和C57BL/6J-DR小鼠收集的血清中针对SC2-SA-突变体的交叉变体中和抗体。我们发现SC2-MN908947和SC2-SA-突变体S蛋白两者同样由所有时间点收集的血清检测出(图11A-11B)。这些发现在这两种小鼠模型中是一致的，并且它们较强地指示我们的疫苗接种方法针对SC2的新毒株的功效。另一方面，这些结果还指出，当使用我们提出的策略时，对于给未感染和先前感染的对象两者在未来疫苗接种以诱发交叉变体中和抗体的重要性和需求32。我们通过使用不同的测定验证了SC2 S抗原特异性免疫反应的血清水平的趋势。此外，为了确立这种疫苗接种方法的一致性，我们将来自两个采用每组五只C57BL/6J-DR小鼠批次的独立研究的中和抗体的血清水平进行比较(图11C)。针对纯化SC2和SC1蛋白来评价免疫后四周收集的血清的比较免疫印迹分析，并且结果指示在两个批次中的中和抗体的血清水平相似，支持该IN免疫方法的再现性。
为了将DNA疫苗介导的免疫与实际感染介导的免疫进行比较，我们研究了表达人ACE2受体的转基因小鼠连同相应的对照品系(C57BL/6J和C57BL/6J-ACE2)对经由IN途径递送的SC2假病毒的免疫反应。我们在野生型和ACE2工程化C57BL/6J小鼠中测试了对应于SC2-MN908947和SC2-SA-突变体的假病毒的两种不同变体。在假病毒感染后五天从小鼠收集的血清的评价显示在野生型和ACE2转基因小鼠两者中抗SC2抗体的显著(p<0.01)水平(图11D)。通过比较，结果指示，在研究的类似时间点(3剂SC2 DNA疫苗或SC2-MN908947和SC2-SA假病毒处理后5天)，通过IN施用我们的负载到AuNS-壳聚糖NP上的SC2 DNA疫苗生成的体液免疫反应的程度比通过假病毒介导的转导所实现的要高近30％。
使用AuNS-壳聚糖鼻内递送表达SC2 S蛋白的DNA疫苗显示体液肺免疫的有效激活。
SC2进入细胞由病毒S糖蛋白的受体结合结构域(RBD)与ACE2的相互作用引发，ACE2充当靶细胞表面上的病毒受体33。可以使用基于S蛋白的ELISA筛选针对SC2 S抗原生成的抗体。通过IN途径的粘膜免疫可诱发局部免疫反应，包括分泌性IgA抗体以在呼吸道病原体的初始进入部位之处或附近赋予保护34。为了评估负载有SC2 S DNA疫苗的AuNS-壳聚糖的免疫原性和保护功效，我们使用两种不同的小鼠品系BALB/c和C57BL/6J-DR。
我们将10μg的SC2-DNA疫苗以优化的比率包封到AuNS-壳聚糖上之后IN施用。在第一周向小鼠施用三剂DNA疫苗，接着连续三周施用一剂。我们在第一次给予后继续收集血液八周，如图10A中示意性显示。我们分析了不同时间点血清中的S蛋白抗体反应，以确定疫苗接种的小鼠与对照小鼠相比的SC2 S蛋白特异性IgA、IgG和IgM滴度。如ELISA结果所指示，AuNS-壳聚糖-SC2-刺突，而非对照DNA负载的AuNS-壳聚糖的IN免疫诱导了血清中高水平的S蛋白特异性IgG、IgA和IgM抗体(图11A-11G)。我们使用ELISA测定法连续测量了BALB/c和C57BL/6J-DR小鼠两者中的血清中疫苗诱导的IgG、IgA和IgM，最多至八周。早在第一周(在三剂后)，两种小鼠品系中的S抗原特异性IgG水平呈指数上升，并保持在峰值持续八周，而与疫苗接种的进一步剂量无关(图11E)。动物维持14周而无需任何进一步给予。在第14周，我们收集血样并给予额外的加强剂量。在第14周施用加强剂量后，IgG水平进一步增加，在第15周达到最大值，并在后续几周保持较高(图11E)。同样，AuNS-壳聚糖-SC2-刺突DNA疫苗也以相似的诱导动力学和时间与峰值水平诱发S抗原特异性IgA(图11F)。它还在血清中表现出持续两至八周的峰值平台，这通常无法在IM疫苗接种后观察到——尤其是因为它的短半衰期和血清转化模式。
这种在疗程内生成的始终较高水平IgA的不同模式可被认为是关键优势，尤其是因为IgA在粘膜表面上的空间分布和本研究中使用的IN施用途径。多项研究已发现，当与针对流感和针对SC2的IgG相比时，IgA具有优异的抗病毒特性。Sterlin等人最近提出，IgA主导对SC2的早期中和反应，并且他们推论血清IgA在病毒中和方面比血清IgG有效7倍35；我们的研究中采用的疫苗接种策略可以有效地利用这些优势。鉴于病毒通过与2型肺泡细胞表面上的ACE2蛋白对接来攻击呼吸道上皮细胞，我们经由IgA提高粘膜免疫的发现可在预防SC2感染中赋予重要优势36,37。
另一方面，现有证据指示血清与唾液IgM和IgG抗体水平之间有良好的相关性，而血清与唾液IgA抗体之间的相关性却弱得多。这不是意料不到的，因为唾液IgM和IgG很大程度上来源于循环，而唾液IgA主要在唾液腺中局部生成38。因此，可以确信地推断，疫苗接种的小鼠的支气管肺泡灌洗液和唾液中S抗原特异性IgA的水平将比从血清测定的值要高得多。SC2特异性IgM和IgA作为早期抗体反应生成，继之为SC2特异性IgG抗体35。IgG水平被认为作为针对SC2的保护性抗体持续终生。然而，血清转化的开始也决定了免疫球蛋白的相应水平，包括IgG和IgM同步血清转化；IgM血清转化早于IgG，以及IgM血清转化晚于IgG39。IgG和IgA维持它们的水平直到第14周，并且用单一加强剂量升到甚至更高(图11E-11G)。第14周加强剂量后IgG、IgA和IgM水平的迅速激增也代表了能够触发快速回忆反应的持久记忆B和T细胞的明显证据。体液免疫反应典型地特征为初次IgG1抗体反应，继之以与免疫记忆相关联的二次抗体反应(由IgG、IgA和IgE构成)。此处，我们在血池中观察到SC2特异性中和抗体形式的对SC2的体液反应。总之，我们的发现展示，AuNS-壳聚糖-SC2-刺突DNA疫苗在免疫活性小鼠中有效地诱导S抗原特异性IgG、IgA和IgM反应，其中它们在血清中的持久性有显著差异。
使用AuNS-壳聚糖鼻内递送表达SC2的S蛋白的DNA疫苗显示肺免疫被中和抗体有效的激活。
在通过递送的DNA疫苗成功评价抗体诱导之后，我们使用展示SC2的S蛋白并表达萤火虫荧光素酶(FLuc)-ZsGreen报告基因的慢病毒-假病毒作为用于中和测定的假病毒(BEI resources,NIAID)测试了抗体的中和效应。我们首先测试了刺突-慢病毒-假病毒对表达人ACE2受体的细胞的感染性的特异性。我们用相同滴度的病毒感染对照细胞和表达ACE2的HEK293T(HEK293T-ACE2)细胞，并使用BLI在转导后72小时评估感染性。我们观察到假病毒选择性转导到HEK293T-ACE2细胞中，这将它们确立为在不同条件下中和抗体存在下模拟SC2感染性的合适模型(图13A)。在确认假病毒的选择性后，我们将病毒与DNA疫苗递送后不同时间点收集的小鼠(BALB/c和C57BL/6J-DR)的血清一起用于评价中和抗体效应。我们使用来自商业来源的经验证中和抗体(SARS-CoV/SARS-CoV-2刺突抗体,Chimeric Mab[SinoBiological])作为阳性对照，而从对照DNA处理的小鼠收集的血清用作阴性对照。将不同稀释度的血清/Ab与假病毒(5×106个病毒颗粒)在50μL无血清培养基中一起孵育1小时，并通过与50μL的2X培养基混合而添加到细胞中(96孔板中0.5×104个细胞/孔)。将细胞进一步孵育60小时，并在添加100μg/mL D-虫荧光素(D-Luc)后使用IVIS Lumina成像系统用于BLI。来自用MN908947品系的AuNS-壳聚糖-SC2-刺突蛋白免疫的小鼠的抗体中和了编码相同品系的S蛋白的表达荧光素酶的SC2假病毒，这以FLuc信号的下降反映出。还使用基于ZsGreen的FACS分析来测量抗体滴度的时间依赖性变化，这与在BLI中观察到的趋势良好地相关(图13B-13D)。在第3周从疫苗接种的小鼠收集的血清的存在下，HEK293T-ACE2细胞中假病毒转导的ZsGreen表达的直方图完全移向下端，并与未经受假病毒转导的对照细胞的重叠。我们的发现指示出在疫苗接种的小鼠中生成的高滴度中和抗SC2 S抗原特异性抗体的存在，其可以完全预防HEK293T-ACE2细胞中SC2假病毒的感染。
使用AuNS-壳聚糖鼻内递送表达SC2的S蛋白的DNA疫苗诱导有效针对SC2的不同变体的中和抗体的有效产生。
为了研究在疫苗接种的小鼠中生成的针对新出现的SC2突变型变体的中和抗体的功效，我们评价了疫苗接种的小鼠血清针对具有MN908947株、D614G突变体和SouthAfrican变体(SC2-SA-突变体)的S蛋白的SC2假病毒的感染性抑制40。我们通过从用DNA疫苗处理的小鼠收集的血清观察到剂量依赖性中和效应，并且结果表示为感染性的相对抑制(图13E-13G)。在从对照DNA处理的小鼠收集的血清存在下用假病毒转导的HEK293T-ACE2细胞充当对照，具有100％感染性。在对照DNA处理的小鼠血清中不存在SC2 S抗原特异性抗体时，假病毒感染性的水平与在不存在血清时用假病毒转导的细胞的那些相似。我们使用疫苗接种的C57BL/6J小鼠血清来评价中和测定，其中在加强剂量施用后实现抗SC2抗体的峰值滴度，其对应于在研究的第18周收集的血清。我们使用不同稀释度的血清来研究血清中抗体滴度与假病毒的感染性的相关性，并与市售的抗SC2抗体进行比较。我们观察到剂量依赖性(血清稀释度)感染性下降，并且在血清的1:50稀释度下，我们发现几乎完全抑制感染性，这几乎类似于通过4μg/mL浓度的商业抗体(SARS-CoV/SARS-CoV-2刺突抗体，ChimericMAb)所实现的。这些趋势在针对SC2 S蛋白的不同变体(即，SC2-MN908947、SC2-SA-突变体和SC2-D614G-突变体)工程化的所有三种假病毒株中是一致的，在较高血清稀释度下具有细微抑制差异。在1:50血清稀释度下，SC2-MN908947假病毒和SC2 D614G-突变型变体的感染性分别减弱至38％±22％和38％±5％，而对于SC2-SA-突变型变体，感染性仅降至67％±7％。尽管在较高血清稀释度下的这些变化，当我们使用1:10的血清稀释度进行测定时，所有三种变体的感染性都被完全抑制，这指示该DNA疫苗接种方法对新出现的突变型变体的功效(图13E-13G)。
使用AuNS-壳聚糖鼻内递送表达SC2 S蛋白的DNA疫苗在C57BL/6J-DR小鼠中有效地诱导细胞介导的免疫。
细胞介导的免疫反应在对抗病毒感染中发挥关键作用41。它由T细胞反应组成，从根本上不同于抗体(体液)反应，因为它们导致感染控制。细胞介导的免疫主要由成熟T细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞和释放的细胞因子响应于抗原递送而驱动42。为了推导IN DNA疫苗接种后细胞介导的免疫的作用，我们使用AuNS-壳聚糖NP，对从使用对照DNA和编码SC2的S蛋白的DNA递送的小鼠的肺、脾、胸腺和淋巴结收集的白细胞执行免疫表型分析。赋予肺免疫系统保护作用的主要免疫细胞亚群包括AM、DC、T辅助性(TH)淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL或TC)、记忆淋巴细胞、NK细胞和B细胞43,44。我们在所有四个样品来源中以大于90％的纯度成功地分离出CD45+阳性群体(图16B-16E)。
SC2-刺突DNA疫苗介导的肺和脾中的抗原加工和免疫细胞激活。
肺免疫的重要细胞介质由吞噬细胞(AM、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞)和NK细胞组成45。它们具有识别和中和表达SC2刺突抗原的细胞的能力。尽管循环的幼稚T淋巴细胞是细胞介导的免疫中的主要应答者，但它们离开血流并迁移到外周组织中的能力有限。因此，在肺中诱导针对SC2的适应性免疫之前，一个重要要求是将抗原从最初暴露部位转运到引流淋巴结的T细胞46。这种经由传入淋巴管的抗原转运是肺泡DC的特化功能47。在我们对来自SC2刺突疫苗接种小鼠的肺的免疫组织化学分析中，我们观察到这些相互作用的初始事件。
为检测免疫细胞和S蛋白而染色的肺组织显示出转染的S蛋白在支气管和肺泡内衬的内皮细胞中表达，其被DC选择性地识别。这些刺突-DNANP中的一些也被来自通过上皮连接的延伸的DC以及被其它抗原呈递细胞(APC)直接捕获和内在化48。这些S抗原引发DC加工抗原并排入淋巴结中(图18)以引发细胞介导的免疫反应的其它组分归巢到肺。在近端气道中以高密度存在的DC及其固有的高吞噬能力使它们置于理想位置以捕获由内皮细胞表达的S抗原。它们的战略性分布，以及它们捕获和加工抗原并将它们呈递给淋巴结中T细胞的能力，都使DC成为肺和其它粘膜表面中的关键APC49。
例如，肺中刺突表达和免疫呈递的分析显示，存在于气道上皮中的免疫监视DC与表达SPK抗原的细胞的相互作用赋予它们作为对NK细胞的专职性抗原呈递细胞的作用并刺激T细胞反应(数据未显示)。吞噬性肺泡巨噬细胞也补充抗原呈递中的DC，但水平相对较低，因为它们缺乏共刺激分子。
我们对S处理的小鼠的肺中淋巴细胞的FACS分析结果揭示CD11c+DC增加(7.5％)，也伴随CD8+T细胞激增(5.5％)。这解释了CTL(MHC I类-限制性T细胞)从淋巴结到达肺中(图16C)。CD11c+DC代表肺中与CD8+T细胞交叉呈递抗原的主要DC亚群，从而促进病毒清除并且指导对S抗原的2型辅助性T细胞(Th2)反应50。另一方面，CD4+T细胞应答于主要位于APC上的MHC-II上呈递的抗原。
可能暴露于S抗原可诱导幼稚CD4 T细胞扩增和分化成效应细胞TH1、TH2、TH17、或Treg表型，一些经历进一步分化成记忆细胞，在抗原再暴露后迅速再激活51。因此，我们不仅出于效应子和记忆功能，而且还出于它们作为辅助性T细胞在脾和淋巴结生发中心中的作用而评价了S疫苗接种的小鼠的肺中CD4+T细胞的扩增52。我们观察到S处理的小鼠中CD4+辅助性T细胞的水平略微增加4.2％，这似乎解释了作为驻留型效应记忆细胞保留在肺泡中的存活T细胞的存在。一旦被激活，辅助性T细胞就激活淋巴结(B细胞区)中的B细胞，并经由体循环将它们重新导入肺中53。与该途径一致，SPK处理的小鼠表现为CD19+B细胞群增加6.1％(图16B-16E)。由于这些肺驻留型B细胞代表适应性免疫的主要组分，并且是针对SC2疫苗的抗原特异性免疫球蛋白的原因，可以肯定地推论，肺中B细胞的增加与全身SC2特异性IgM、IgA和IgG免疫球蛋白反应的生成相关(图11E-11G)。
除了DC和T细胞之外，驻留型AM占肺泡腔中细胞的>90％，并与肺泡壁中的DC间接接触，这促使DC对S抗原呈递的反应54。我们还观察到S疫苗接种的小鼠的肺中CD11b+巨噬细胞水平的显著增加(10.3％)，指示它们在备战细胞介导的免疫反应中的作用。由于这些驻留型AM与内皮细胞非常接近，它们也与常规DC接触，这些DC扩展到树突状呼吸管进入肺泡腔。
例如，未处理的小鼠、pcDNA处理的小鼠和SPK DNA疫苗转染的小鼠的肺中单核细胞、NK细胞和DC分布的分析显示出肺泡和支气管中DC的存在增加(数据未显示)。这指示循环DC的到达补充了组织驻留型肺泡DC在SPK抗原识别和加工中的作用。单核细胞和肺泡巨噬细胞是另一类驻留型肺吞噬细胞，它们被募集到肺泡以及与表达S蛋白的支气管上皮密切相关以介导额外的白细胞亚群募集到肺。此外，在IN施用SPK疫苗后NK细胞对肺中的DC和T细胞反应的作用的评价显示，SPK疫苗接种的肺中外周、未成熟局部DC的增加以及它们的成熟和向引流淋巴结的迁移驱动了来自淋巴结的T细胞反应(CD4+和CD8+T细胞)(数据未显示)。作为这种效应T反应的结果，CD4+和CD8+T细胞在肺中增加。另一方面，先天免疫系统的经典效应细胞(即NK细胞)的增加补充了增强T细胞介导的SPK免疫原性，并且还通过调节DC功能以影响T细胞反应而在减轻炎症和组织损伤中发挥保护作用。
从循环中，DC可以进入在白髓与红髓(RP)之间边界处的边缘区(MZ)窦中的脾，并作出反应。我们在S疫苗接种的小鼠的脾组织学上观察到DC从边缘区迁移到GC中的这种事件。这与来自pDNA处理的小鼠的脾形成鲜明对比。白髓(WP)中DC存在的增加触发了来自脾的针对同期胰肾(SPK)抗原的适应性免疫反应55。因此，IN免疫诱导大量DC迁移到WP的T细胞区中(图16B-16E)。
例如，脾中免疫细胞的表征(数据未显示)显示出DC亚群的差异脾内迁移调整了适应性免疫。脾按功能和结构分为红髓(RP)和白髓(WP)；介于这两个区域之间是边缘区(MZ)。从刺突疫苗接种的肺而来的cDC调节了脾中调控T和B细胞反应的免疫细胞的动态构造。在被针对S抗原的先天免疫反应激活时，cDC从脾的“外周组织”(MZ和RP)迁移到脾的“淋巴结”(WP)，即脾T细胞区。DC从边缘区迁移到生发中心导致了选择性诱导CD4+或CD8+T细胞反应。
同样，来自SC2刺突DNA疫苗接种的BALB/c小鼠的脾细胞的FACS分析也指示CD11c阳性树突细胞增加7.4％，伴随B细胞群增加6.31％。这些结果与cDC(循环DC)从边缘区迁移到GC中的组织学证据良好地相关(图16B)。
疫苗接种的小鼠的脾中DC和B淋巴细胞的同步激增表明，DC涉及SC2抗原向幼稚B淋巴细胞的转运和转移，并且在这种过继性抗原转移后，B细胞触发SC2特异性抗体反应(图11E-11G)56,57。另一方面，SC2激活的cDC与B淋巴细胞的相互作用也引发后续T细胞依赖性反应，并且与该假设一致，疫苗接种的小鼠表现为CD4-CD8双阳性T细胞增加约7.9％(图16B)。
除了专职性APC(如DC)之外，其它APC(巨噬细胞)也作为生发中心B细胞反应的促进者主动参与58。脾巨噬细胞被划分为白髓、红髓和边缘区，并且它们各个在免疫反应中发挥不同的作用。SC2激活巨噬细胞到达边缘区和白髓的战略位置中，使它们紧密靠近以与B和T细胞两者相互作用，从而参与SC2免疫反应(数据未显示)。重要地，边缘区(MZ)B细胞以及骨髓、树突和基质细胞是边缘区的主要成分。这些MZ B细胞是针对S抗原的IgM抗体的主要生产者。MZ B细胞的富集和动员指示脾免疫反应的特征。
类似地，我们观察到来自SC2疫苗接种的小鼠的脾的白髓和边缘区中的巨噬细胞和单核细胞的发生率增加。这与CD11b+巨噬细胞的10.3％的同步激增良好地相关，伴随着SC2疫苗接种的BALBc小鼠脾中B细胞的6.3％增加(图16B)。
最后，我们评价了用多剂DNA疫苗处理的小鼠的肺中和对照(N＝3)中任何毒性效应的存在。对于这些毒理学观察，完成了从使用AuNS-壳聚糖递送的pDNA或pDNA-SC2-刺突处理的小鼠收集的肺和脾组织的组织学切片的苏木精和伊红染色(数据未显示)。我们观察到在用S DNA疫苗进行疫苗接种的小鼠的肺中不存在显著的组织损伤。
SC2-刺突DNA疫苗介导的抗原加工以及淋巴结中的B和T细胞激活。
淋巴结是免疫反应的关键指挥中心，容纳T细胞、B细胞和协调适应性免疫的APC59。APC(如单核细胞和DC)可以在使用AuNS-壳聚糖IN递送DNA疫苗时内在化肺中表达的S抗原，并将疫苗物理性携载至淋巴结。除了该作用之外，淋巴结驻留型DC具有重要的功能如交叉呈递以用于引发CD8+T细胞，这在一些组织驻留型DC中不存在60。从DC与肺中表达S蛋白的细胞的相互作用明显看出(数据未显示)，预计这些DC捕获S抗原，将其蛋白水解为短肽片段，并将这些肽负载到I类和II类MHC分子上，然后将它们物理呈递到CD8+和CD4+T细胞的表面上61。同时，预计已经遇到SC2刺突抗原的APC迁移至最近的淋巴结，以激活幼稚辅助性T细胞。一旦被激活，辅助性T细胞就激活遇到由DC和巨噬细胞呈递的相同S抗原的B细胞62。与典型的巨噬细胞不同，被膜下淋巴窦巨噬细胞通过将抗原分程传递至B细胞、产生细胞因子信号级联以引起DC、嗜中性粒细胞、NK细胞的流入，或在一些条件下将抗原呈递给T细胞来引导针对多种淋巴携带的病原体的特异性免疫反应，并且SC2疫苗接种的小鼠显示这种被膜下淋巴窦巨噬细胞和DC的存在(数据未显示)63。B细胞的激活通常由S抗原与B细胞受体的结合触发，这可以通过淋巴结中的APC细胞膜上捕获的S抗原的B细胞识别而发生64。我们可以看到疫苗接种的小鼠中S特异性免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)的一致剂量依赖性激增，可确定这些小鼠中的B细胞被递送的S DNA疫苗激活并协调抗原特异性反应。鉴于这个概念，我们进一步研究了淋巴结在建立这种B细胞反应中的作用，尤其是因为它们在B细胞的成熟和激活中的关键作用。我们的组织学染色结果显示，引流淋巴结将刺突激活的cDC、NK细胞和巨噬细胞聚集在一起，用于生成来自B细胞成熟中心(即生发中心(GC))的刺突抗原特异性免疫反应(数据未显示)。疫苗接种的小鼠的淋巴结描绘了具有多灶性生发中心和广泛B细胞增殖的反应性淋巴结的特征。GC中并指状滤泡树突细胞(FDC)的存在也验证了GC中的S特异性B细胞分类，并解释了免疫接种的小鼠中免疫球蛋白水平(IgG、IgM和IgA)的快速激增。B细胞迁移穿过边缘区进入滤泡间空间的事件代表了短寿命抗体产生细胞(称作浆母细胞)。滤泡间区引发适当的T细胞反应以及B细胞成熟。
为了研究SC2 DNA疫苗是否可在淋巴结中触发这种特征性S特异性免疫反应，我们从使用SC2DNA疫苗处理的BALB/c小鼠中收获淋巴结，连同pDNA处理的小鼠作为对照(各条件N＝3只动物)，并使用FACS分析以鉴定免疫细胞群的分布。这些淋巴结也是细胞毒性T细胞用专职性APC(尤其是DC)呈递的S抗原训化的地方65。我们的FACS分析结果指示与pDNA疫苗接种的小鼠相比，S疫苗接种的小鼠中CD4+T细胞的这种调节(图16B-16E)。来自疫苗接种的小鼠的肺的组织学指示S抗原的成功递送和表达，并且还捕获了DC与这些表达S的细胞的相互作用(数据未显示)。
肺中这些迁移DC可以将抗原转移到淋巴结驻留型DC66。这些S抗原识别事件指导对抗原的免疫反应以激活先天免疫系统模式识别受体或细胞因子，以及响应于S抗原介导的免疫在淋巴结中诱导的趋化因子。淋巴结中B和T细胞两者的FACS分析揭示，它们在处理的小鼠中的S抗原特异性增强(即，CD19+B细胞增加18.6％，且CD4+T细胞增加6.3％)。在其它临床前模型中的免疫研究表明，需要大量抗原来驱动CD8+T细胞反应66，而在我们的方法中，经由IN途径实现了DC的有效抗原加工和交叉呈递，这也导致来自淋巴结的T细胞免疫反应的激增。可用抗原的更高水平和滤泡辅助性T细胞的更多产生可以控制淋巴结GC反应。
来自使用SC2-刺突疫苗接种的C57BL/6J-DR小鼠的淋巴结的组织学指示抗原激活的特征性特征。T和B细胞被区室化到特定位置中，其中T细胞主要位于淋巴结的较深副皮质区中，而B细胞处于卵泡中(数据未显示)。由淋巴或淋巴迁移APC携带到淋巴结的S抗原到达引流淋巴结的被膜下淋巴窦。通过与S抗原结合而接收初始信号传导的B细胞进入卵泡的特化亚区(GC)。当与对照小鼠相比时，免疫接种的小鼠中B细胞的这种动态动员是明显的(数据未显示)67。在T细胞依赖性抗体反应期间，GC在次级淋巴组织的B细胞滤泡中产生68。产生GC的B细胞最初必须在卵泡外(即，在与并指状细胞和辅助性T细胞关联的富含T细胞的区中)被激活69。预计亮区中的滤泡DC(FDC)经由Fc和补体受体捕获和保留S抗原，它们可在延长的时段内呈递给局部B细胞70,71。在GC内，B细胞可以从FDC获取抗原，将其加工并呈递在II类MHC分子上。激活的B细胞可离开GC，变成短寿命抗体产生细胞(称为浆母细胞)。组织学染色显示的结果(数据未显示)示出了B细胞从GC迁移到光区中，作为产生抗体的浆母细胞响应于SC2 DNA疫苗而移动的证据。聚集在淋巴结中的抗原的量与免疫淋巴结中产生的T滤泡辅助性细胞和GC B细胞的数量直接相关72。因此，S抗原递送到滤泡DC的效率也将影响对免疫的反应。FDC与B细胞一起位于任何次级淋巴器官的滤泡中73。在适应性免疫反应期间，FDC在生成和选择高亲和力浆细胞(即，记忆B淋巴细胞)方面具有非常重要的功能74。FDC的一个关键特性是它们能够以高度刺激的方式捕获和展示抗原作为免疫复合物，以增殖B细胞。在淋巴结内，存在包括FDC的基质细胞网络。FDC首先被鉴定为“抗原保留网状细胞”75。随后，FDC由于其在延长时段内保留抗原的独特能力而被认识到。FDC的这种特性对于几种免疫功能是关键的，包括GC形成和长期免疫记忆76。我们的淋巴结组织学指示在B细胞滤泡(BCF)中存在这样的FDC，其中GC由于T细胞依赖性抗体反应而发展。激活T细胞和APC沿着鼻淋巴途径排出并最终进入颈淋巴结77。因此，我们观察到颈淋巴结的完全重塑，其中B细胞以GC为中心，并且在这些GC中在B细胞附近存在DC(数据未显示)。总之，我们的结果确认，通过使用AuNS-壳聚糖递送DNA疫苗表达的S抗原在淋巴结中显示出有效的细胞介导的免疫。
考虑到IFNγ在识别和消除病原体中具有关键作用的事实，其已被鉴定为疫苗反应的预后标记。I型IFN是多效性抗病毒细胞因子，可以影响对SC2疫苗接种的免疫反应的几乎每个步骤——范围从S蛋白表达、DC激活，到T细胞分化。令人惊奇地，已发现I型IFN是针对SC2疫苗的T和B细胞反应的中心介质。我们还注意到，T细胞在淋巴结和血液中表达INFγ增加(图17A-17E)78。表达IFNγ(即先天和适应性免疫系统两者的标志性细胞因子)的脾CD8+T细胞的增加仅在SC2疫苗接种的小鼠而非pDNA对照载体处理的小鼠中是明显的。
AuNS-壳聚糖在IN递送时显示FLuc mRNA在小鼠肺中的稳健递送(如使用生物发光成像所测量)。
由于DNA疫苗的IN递送在实现显著表达和诱导肺免疫反应方面是成功的，我们使用BLI进一步评价了在细胞中使用AuNS-壳聚糖递送的mRNA以及在小鼠中IN递送后的稳定性和表达。我们使用编码FLuc报告基因的mRNA作为该原理验证研究组分。使用最佳N/P比复合物，经不同mRNA浓度(50、100和200ng)转染的HEK-293T和A549细胞中的体外结果展示了在两种细胞类型中的剂量依赖性荧光素酶表达(图14A-14B)。我们使用最佳的AuNS-壳聚糖-FLuc-mRNA复合物用于小鼠中的IN递送；5μL的NP复合物，每个鼻孔四次(每个剂量总共20μL；2μg的RNA当量)。我们使用3只小鼠，各自用于处理和对照。我们递送了AuNS-壳聚糖-mRNA，在递送后每24小时获得BLI，并每天继续给药，持续三天。在最后一次给药后三天，对小鼠进行体内生物发光信号成像，然后处死小鼠以用于离体组织生物分布。小鼠在肺中揭示出强BLI信号(图14C)。离体分析(肺、脾、肝、气管和肾)显示在肺和气管支气管连接处的强BLI信号。在包括脾在内的其它器官中不存在信号(图14D)。这些发现清楚地支持了AuNS-壳聚糖用于体外和体内递送合成mRNA的效率，以及mRNA用于体内应用的稳定性和功能效率。
结论
我们评价了使用编码其S蛋白的DNA作为抗原的新型SC2疫苗的IN递送的潜在优势。使用AuNS-壳聚糖NP递送DNA疫苗得到了该抗原在小鼠呼吸道粘膜和肺中的成功表达，这导致抗原呈递DC向肺的募集以及增强的体液抗体反应。早在IN递送三剂DNA疫苗后1周就产生抗体反应。如在两种不同的小鼠模型(BALB/c和C57BL/6J-DR)中所展示，抗体水平持续在数周内始终较高而无显著下降。抗体反应导致高水平的IgG和IgA，它们显示对表达SC2的不同刺突变体(MN908947、D614G和SA突变体)的假病毒的强中和效应。使用基于免疫染色的FACS和共聚焦显微镜对细胞介导的免疫反应的额外评价显示出在肺和淋巴结中T和B细胞反应的有效激活，这与通常观察到的针对感染性疾病的免疫反应相似。我们的发现强调了使用AuNS-壳聚糖作为有效的体外和体内纳米制剂递送DNA和合成mRNA的优点，以及其在稳定化核酸进行功能性体内转染用于未来mRNA疫苗开发和应用中的作用。该原理验证研究强调了该IN SC2 DNA疫苗产生强粘膜免疫反应的能力，并且也提供了使用编码SC2的不同抗原(N、E、M和S蛋白)的mRNA疫苗的路线图。这可导致持久、广谱的抗体反应，以对抗分布在世界各地且持续进化的大量SC2变体。
材料和方法
材料
我们购买了TritonX-100、四氯金酸氢、硼氢化钠(NaBH4)、抗坏血酸(AA)、硝酸银(AgNO3)，得自Sigma-Aldrich；和氯化金(III)三水合物(HAuCl4·3H2O)、L(+)-抗坏血酸(AA)、柠檬酸钠二水合物、1N盐酸溶液(HCl)、壳聚糖和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，得自Sigma-Aldrich(St Louis,MO)，以最高纯度等级获得。我们在所有制备物中使用重蒸馏水。碳涂覆的铜TEM载网获自VWR(Radnor,PA)。我们将用于金NP合成的玻璃器具在王水中预处理30分钟，然后在超声处理(3分钟)下用重蒸馏水清洗三次。
方法
AuNS合成
我们使用改良的种子辅助生长的金Nanostar合成程序合成了金Nanostar八足形体，如先前所报道20。简而言之，通过NaBH4在0.15M TritonX-100中从AuCl4生成金纳米种子，并将所得胶体金用作nanostar生长的种子。将5μL的种子金NP添加到5mL水溶液中，该水溶液在水中含有0.1M TritonX-100和250μL的0.004M AgNO3。然后，向所得混合物中补充大约5mL的HAuCl4(0.001M)并在70℃下搅拌30分钟。在完成所有组分的均匀溶解后，我们将溶液温度降低至37℃并添加400μL的0.0788M抗坏血酸水溶液。我们将该水溶液搅拌30分钟，并再滴加0.6mL的0.001M NaBH4溶液的预先冰冷却溶液。将混合物以1000rpm不断搅拌，得到均匀的悬浮液，其随后变为深绿色，此时通过将温度降低至约4℃使反应停止。将所得的金Nanostar通过在13,000rpm下离心30分钟进行分离，并用蒸馏水洗涤三次，然后用于进一步体外和体内研究。
SC2质粒或pcDNA负载的AuNS的制剂。
使用LV1-微流体系统(Microfluidics,Westwood,MA)，在30,000psi下微流化溶解于0.2％乙酸中的壳聚糖。我们在出口处以0.5mg/mL的浓度提取了壳聚糖悬浮液，并将其用于涂覆AuNS。我们然后将溶解的壳聚糖与400μL(储备液-5mg/mL)AuNS在旋转培养箱中以200rpm在30℃下孵育过夜。在共孵育之前，通过简短探针超声处理(即5秒“开”，振幅40％)，将如所制备的Au Nanostar分散在无菌重蒸馏水中，以形成5mg/mL的NP均匀悬浮液。在孵育过夜后，我们使反应混合物在13,000rpm下经受离心分离30分钟，并将所得沉淀在规定体积的600μL无菌重蒸馏水中汇集在一起。我们使用以DEPC水稀释至200ng/μL的储备SC2质粒(2μg)，并与增加量的壳聚糖封端的AuNS复合，然后在37℃下孵育15分钟。将复合物加载到0.7％琼脂糖凝胶上，并在40V下运行电泳45分钟。在运行之后，在BioRad Gel Doc XR+GelDocumentation系统(Bio Rad,Hercules,CA,USA)中对凝胶成像，以进一步定量和分析DNA包封的程度。优化的SC2质粒或pcDNA负载的AuNS-壳聚糖适于后续体外和体内研究。在研究的每个时间点以20μL的剂量施用质粒DNA负载的复合物。
纳米粒子表征。
我们使用动态光散射(DLS)，在25℃下以90°的散射角在Malvern Zetasizer NanoZ系统中，针对平均流体动力学直径和ζ电势表征了合成程序期间AuNS表面修饰的每个步骤。我们使用Smoluchowski近似确定了基于AuNS的NP的ζ电势(表面电荷)。我们在PBS中制备样品并用去离子水稀释以确保测量在低离子强度条件下执行，其中可精确地测量粒子的表面电荷。我们使用透射电子显微镜(TEM,FEI-Tecnai G2 F20 X-TWIN)表征了负载有SC2质粒的AuNS-壳聚糖的粒度和形态。使用ORIUS CCD相机通过数码显微摄影获取图像，并通过FEI-TIA界面记录能量弥散X射线光谱(EDS)。对于样品制备，将10μL的负载有SC2质粒的AuNS-壳聚糖滴铸在具有纯碳支撑膜的辉光放电铜载网上，并孵育10-15分钟，然后用超纯水洗涤。
AuNS-壳聚糖介导的DNA转染在细胞中的体外评价。
我们使用BLI定量地估计了通过AuNS-壳聚糖的细胞摄取和FLuc质粒递送。将A549细胞用负载在AuNS-壳聚糖上的FLuc EGFP(1μg)质粒处理。在48小时，我们使用IVISLumina-III In Vivo成像系统在D-Luc(150μg/mL)底物存在下对经处理的细胞进行生物发光信号成像。对所有处理条件的生物发光信号进行定量以得出清楚的相关性。
小鼠品系和免疫。
我们购买了6-8周龄BALB/c雌性小鼠，得自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)；和C57BL/6J小鼠，以及携带Ccr2RFPCx3cr1GFP双报道分子的小鼠，得自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。将小鼠维持在特定的无病原体条件下。我们在我校实验动物管理部门(Administrative Panel on Laboratory Animal Care，APLAC)的指导下执行所有动物实验。我们用10μg的SC2 DNA或pcDNA疫苗的溶液IN免疫小鼠。我们使用异氟烷气体麻醉，在轻度镇静下在小鼠中执行NP制剂的IN递送，以使动物能够在数分钟内恢复。我们将每只小鼠置于诱导室中并将氧气流量计调整至0.8–1.5L/分钟。一旦建立稳定的呼吸率，我们就在15-20分钟内以5μL/滴IN施用20μL纳米制剂。在每滴施用后，我们停止3-4分钟以确保动物吸入滴剂并且其以稳定速率呼吸。密切观察鼻孔有无堵塞或刺激迹象。在施用全剂量后，允许每只动物在转移至其笼之前从麻醉中恢复。
使用假型慢病毒的血清中和测定。
抗体的病毒中和是许多病毒性疾病的重要预后因子。为了容易且快速地测量血清或血浆中的中和抗体的滴度，我们开发了假病毒颗粒。使用SC2刺突(Genbank登录#QHD43416.1；具有D614G突变)代替常用的VSV-G作为包膜糖蛋白来产生SC2刺突D614G假型慢病毒。这些假病毒含有由CMV启动子驱动的FLuc基因；因此，可以经由FLuc成像方便地确定刺突介导的细胞进入。SC2刺突D614G假型慢病毒可用于在生物安全第2等级设施中测量针对SC2的中和抗体的活性。称为B.1.351的变体在南非共和国(Republic of SouthAfrica)于2020年的秋季首次被鉴定出来。该South African变体(也称为501Y.V2)具有许多突变，其可导致更高的传染性和感染性。使用SC2 B.1.351变体刺突(Genbank登录#QHD43416.1，具有B.1.351突变；作为包膜糖蛋白代替常用的VSV-G)来产生刺突(B.1.351变体)(SC2)假型慢病毒。
我们在感染前一天将HEK293T-ACE2细胞以5×104个细胞/孔接种在96孔板中。在感染前一天，我们将HEK293FT和HEK293T-ACE2细胞接种在96孔板(ThermoFisher,US)中。将假型MLV病毒添加到预培养的细胞中。我们在37℃和5％CO2下培养细胞2天。在D-Luc底物存在下，测定各孔中所有细胞的荧光素酶表达水平。在验证假病毒的ACE2受体特异性转染后，我们在动物血清存在下评价其感染性。我们使用含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和200μg/mL潮霉素B的DMEM作为稀释剂以50μL的体积连续稀释血清，并与50μL假型病毒在37℃下一起预孵育1小时。对于这些感染，在不存在血清时使用稀释的病毒原液。然后用血清/假病毒颗粒混合物感染细胞。在感染后48小时使用D-Luc底物测量荧光素酶。我们使用Prism 8(GraphPad,US)绘制中和滴度。
外周血中SPK特异性IgG、IgM和IgA抗体的测量。
在第一次免疫前两天，第一次和第二次免疫后12天，以及最后一次免疫后15天，我们从全部五组的每只小鼠的尾部抽取血液，以评价体液免疫反应。将血液离心，并分离血清用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行特异性IgG、IgM和IgA检测。简而言之，我们在4℃下用50μL的5μg/mL SPK肽的磷酸盐缓冲盐水(PBS)包被96孔板(Maxisorp,Nunc)过夜。在室温下用100μL的1％牛血清白蛋白的PBS封闭板2小时。我们将来自单独小鼠的血清稀释至1:1600或1:400，添加到孔中，并在室温下孵育1小时。在用PBST将其洗涤三次后，我们将板在室温下用缀合于辣根过氧化物酶(Serotec,Oxford,UK)的第二抗体兔抗小鼠IgG、IgA或IgM(1:2000)孵育1小时。然后，我们添加200μL的底物TMB(3,3′,5,5′-四甲基对二氨基联苯)/H2O2(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)并在室温下于暗处孵育30分钟，并且通过添加50μL H2SO4 2N终止反应。使用Tecan分光光度计在OD450 nm处读取板，且抗体滴度表示为平均吸光度±标准偏差(SD)。
免疫印迹分析。
为了确定SPK蛋白在转染细胞中的表达并且筛选针对SC2的突变型变体的SC2抗体关于纯化SPK蛋白的特异性，我们使用抗SC2 SPK抗体执行免疫印迹分析。我们将500,000个HEK293细胞接种在10cm孔板中，并使用lipofectamine 3000试剂(Thermo FisherScientific)用10μg pDNA(pcDNA、SC2-MN908947、SC2-SA-突变体和SC2-D614G-突变体)转染，并在48小时处理后，我们收获并进一步处理细胞用于使用抗SPK抗体进行免疫印迹分析。简而言之，我们在500μL裂解缓冲液中裂解细胞，并将100μg总蛋白与β-巯基乙醇(Bio-Rad)和10μL的NuPAGE LDS(4X)上样缓冲液混合，在95℃下加热5分钟，并上样到4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳梯度凝胶(Invitrogen)中，并在80V下运行2小时。然后将从凝胶中分离的蛋白质电印迹到0.2μm孔径的硝酸纤维素膜(Schleicher&Schuell,Keene,NH,USA)上。将膜用含有0.01％Tween-20的tris-缓冲盐水(TBS-T，pH 7.6)中的5％脱脂奶粉封闭30分钟，并在4℃下在摇摆平台上与抗兔SPK单克隆抗体一起孵育过夜。次日，我们用PBST洗去第一抗体，添加过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG第二抗体(1:10 000稀释，RocklandImmunochemicals,Gilbersville,PA,USA)，并允许其在室温下摇动2小时。用Pierce ECLWestern印迹底物(Thermo Fisher Scientific,USA)显影印迹，并用IVIS Lumina III In-Vivo成像系统成像和定量。
肺、脾和淋巴结的组织学。
我们在深度麻醉下对动物执行心脏灌注以收获器官用于组织学。简而言之，在麻醉下，我们将每只小鼠在膈下方解剖并切开胸腔以暴露出心脏。我们进行了左心室切开术，并将针插入主动脉并夹紧，然后切开右心房以允许流动。每只动物使用30mL PBS经心脏灌注4-5分钟或者直至肝脏清除血液。接下来，为了保留组织形态并保持靶分子的抗原性，我们用30mL 4％多聚甲醛灌注动物4分钟。在醛固定后，我们收获组织(脾、淋巴结和肺)，转移到30％蔗糖的PBS中平衡过夜，然后处理用于OCT包埋。使用恒冷箱切片机将OCT块切成5μm厚的组织切片，并解冻固定到明胶包被的组织载玻片上。然后，将载玻片在37℃下干燥30分钟，并在洗涤缓冲液中再水合10分钟。在室温下，使用1％牛血清白蛋白的PBS封闭组织30分钟，然后与抗原特异性抗小鼠荧光团标记的抗体(CD4-FITC、CD8-Alexa-700、CD19 Alexa-700)一起孵育，并在2-8℃下孵育过夜。在孵育时间后，我们在洗涤缓冲液中洗涤抗体三次，每次15分钟。然后，将载玻片在300μL的Hoechst 33342稀释溶液中孵育，并在室温下孵育5分钟。最后将载玻片用PBS冲洗一次，并用抗褪色封固介质封固，并使用Leica DMi8共聚焦显微镜在相应的滤波器下观察。
流式细胞术免疫分型：我们使用流式细胞术对肺、脾、淋巴结、胸腺和血液样品执行了基于细胞表面标记的免疫细胞分析。简而言之，我们使用机械解离由组织制备单细胞悬浮液，并使用ACK裂解缓冲液移除红细胞。最后一次洗涤后，我们通过70-μm细胞过滤网过滤细胞，并使用0.1％台盼蓝检查生存力。将一百万个细胞用荧光染料(即CD45–Pac-Blue、CD3/CD4/CD8PE-CY7/FITC/Alexa-700、CD45/CD11b PacBlue/APC-Cy7、CD45/CD11cPacBlue/PE-Cy7、CD45/CD86Pac Blue/PE、CD19 Alexa-700、CD22 Alexa-700(Biolegend))标记的细胞表面标记特异性抗小鼠抗体进行标记。包括同种型抗体用于门控和补偿。在添加抗体后，我们将细胞于暗处保持30分钟。我们用PBS洗涤细胞并悬浮于新鲜PBS中，然后使用easyCyteTM流式细胞仪针对20,000个事件分析。
统计分析：我们使用GraphPad Prism 8(8.0a版本；GraphPad Soft-ware,Inc.,LaJolla,CA,USA)绘制所有图并执行统计分析。我们汇集了来自独立实验的3-5只小鼠的数据，并且结果呈现为平均值±标准偏差(SD)或平均值的标准误差(SEM)，如附图图例中所指示，并且采用第一(第25百分位数)和第三(第75百分位数)之间的四分位数间距进行分析。我们使用双尾Students t检验比较了分组数据，并计算分组数据的多重比较。对于ELISA和中和滴度之间的相关性分析，使用Prism 9.0(Graphpad)计算显著性(p)。
当p值小于0.05时，认为差异是显著的。p值如果未在相应的附图图例中指示，则表示显著性水平(*表示0.01<p<0.05，**表示0.001<p<0.01，***表示0.0001<p<0.001，以及****表示p<0.0001)。
表
表1.复合物尺寸和表面特征。尺寸以直径显示。对于不具有外层和/或核酸的复合物，尺寸以纳米粒子核显示。
表2.本文所提供的复合物靶向的病毒和抗原.
实施例1-4的参考文献
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Claims (37)

1.一种复合物，其包含：
(a)包含金核的纳米粒子；以及
(b)肺病毒蛋白或其片段，或者
编码所述肺病毒蛋白或其片段的核酸，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子连接。
2.根据权利要求1所述的复合物，其包含多个肺病毒蛋白或其片段。
3.根据权利要求2所述的复合物，其中所述多个肺病毒蛋白包含不同的肺病毒蛋白。
4.根据权利要求1所述的复合物，其包含多个编码所述肺病毒蛋白或其片段的核酸。
5.根据权利要求4所述的复合物，其中所述多个核酸编码不同的肺病毒蛋白或其片段。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肺病毒是人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人副流感病毒(HPV)、人鼻病毒(HRV)、腺病毒(ADV)、人冠状病毒(HCoV)、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、人偏肺病毒(HMPV)或人博卡病毒(HBoV)。
7.根据权利要求6所述的复合物，其中所述肺病毒是SARS-CoV-2。
8.根据权利要求7所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或其片段是S蛋白、N蛋白、M蛋白、或E蛋白。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述金核是金-氧化铁核。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述纳米粒子包含外层。
11.根据权利要求10所述的复合物，其中所述外层与所述金核共价连接。
12.根据权利要求10所述的复合物，其中所述外层与所述金核非共价连接。
13.根据权利要求10所述的复合物，其中所述外层包含聚合物。
14.根据权利要求13所述的复合物，其中所述外层包含阳离子多糖。
15.根据权利要求14所述的复合物，其中所述阳离子多糖包含壳聚糖。
16.根据权利要求14所述的复合物，其中所述阳离子多糖包含壳聚糖-环糊精。
17.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子共价连接。
18.根据权利要求10所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子的所述外层共价连接。
19.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子非共价连接。
20.根据权利要求10所述的复合物，其中所述肺病毒蛋白或核酸与所述纳米粒子的所述外层非共价连接。
21.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核酸是脱氧核糖核酸。
22.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核酸是核糖核酸。
23.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物的直径为约20nm至约80nm。
24.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物的直径为约40nm。
25.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1所述的复合物以及药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求25所述的疫苗组合物，其还包含稳定剂、佐剂和防腐剂中的一种或多种。
27.根据权利要求25所述的疫苗组合物，其中所述组合物被配制用于经鼻施用。
28.一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的根据权利要求1所述的复合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述复合物通过鼻内途径施用。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述复合物通过口鼻途径施用。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述复合物施用于肺。
32.一种在需要治疗或预防的对象中治疗或预防肺病毒性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的根据权利要求25所述的疫苗组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物经由鼻内途径施用。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物经由口鼻途径施用。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物施用于肺。
36.一种用于免疫易患肺病毒性疾病的对象的方法，所述方法包括在使得产生结合所述肺病毒蛋白或其片段的抗体的条件下，向所述对象施用根据权利要求1所述的复合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗体为IgG、IgA或IgM抗体。
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