CN116457017A - 使用突变纳米抗体检测样品中的靶标的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用突变纳米抗体检测样品中的靶标的方法，其中存在于所述纳米抗体框架的FR1区的环中的氨基酸被突变为半胱氨酸。

Description

使用突变纳米抗体检测样品中的靶标的方法
技术领域
本公开涉及使用突变纳米抗体检测样品中的靶标的方法。
背景技术
流行病和泛流行病的爆发，如世界目前面临的COVID-19爆发，可以通过提供高效、便携和廉价的诊断设备来更好地管理。
“病毒生物传感器”的市场仍处于起步阶段，并且不能回应筛选大部分被感染的群体的当前需求，也不能提供可以以简单和个性化的方式实现日常诊断的工具。然而，生物传感器具有巨大的影响，即通过简单地重构其用于检测蛋白质生物标志物和病毒的感测模块而将当前的分析方法转变为诊断策略(Dong et al.,Bioelectrochemical andBioenergetics.1997,42,7；Xue et al.,Nature Communications.2014,5,4348；Yang etal.,Journal of Electroanalytical Chemistry 2001,516,10)。
毫无疑问，这种传感平台需要不断更新以应对病毒诊断中日益增长的挑战，因为这些病毒变化迅速，并且在很大程度上在人与人之间传播，表明早期诊断的紧迫性。这就需要开发一种易于感测的可以快速适应不断变化的需求的平台。此外，随着个性化医疗和适用于无线传感的技术的兴起，可以控制和限制数百万人当前和未来的病毒污染。通过这种方式，每周隔离的要求可以得到限制，甚至可以避免，对国家甚至全球的经济能够产生难以想象的积极影响。
目前，参考诊断是对鼻拭子(对有鼻咽涉及体征的早期感染有效)和气管拭子(对稍晚阶段的支气管肺病感染有效，但更具侵入性，因此保留用于重度病例)进行实时逆转录酶PCR测定。获得RT-PCR结果所需的时间很长，这在很大程度上限制了在发生大流行时所需的快速管理措施。此外，还有大规模筛查的问题，尤其是无症状患者。主要的挑战之一是在分析中赢得时间，但也要保持高度特异性并减少假阴性响应的量(如在RT-PRC分析中经常发生)。
因此，该问题的技术解决方案可以是使用基于智能便携式生物传感器的电化学读取，其通过对目标靶标特异性的纳米抗体的表面固定来快速和选择性地感测这种靶标。
近年来，已经报道了通过抗体固定到表面上(也称为免疫传感器或免疫生物传感器)来检测靶标物质的可能性。然而，多克隆抗体的批次间不一致性和单克隆抗体的大量生产时间造成了额外的限制。
单结构域抗体，也称为骆驼衍生的抗体或纳米抗体，是源自骆驼和美洲驼中发现的重链抗体的重组表达的结合片段。这些独特的结合元件提供了许多期望的特性，例如它们的小尺寸(～15kDa)和热稳定性，这使得它们成为常规单克隆抗体的有吸引力的替代品。据报道，这些纳米抗体由于高的重折叠效率而固有地不受温度变化的影响并能够保持其结构(Clingerman et al.,Biological Research for Nursing,2012,14,27；Cecchi etal.,Ecotoxicology and Environment Safety,2012,80,280；Goldman et al.,Analytical Chemistry 2006,78,8245)。例如，固定在磁性微球上的这些纳米抗体在夹心免疫测定中的成功利用已被证明在检测各种病原体和毒素中是有效的(Anderson et al.,Analytical Chemistry 2008,80,9604；Anderson et al.,Analytical Chemistry 2010,82,7202)。
US2017059561A1描述了单结构域抗体作为固定在免疫传感装置表面上的传感剂。然而，为了促进纳米抗体的固定，在纳米抗体的固定之前，导电电极通过至少一个自组装单层化学官能化，这是非常耗时的。此外，其未讨论纳米抗体的定向以优化其靶标识别能力。
例如，尚未报道使用纳米抗体开发用于快速读取的特定便携式生物传感器的材料。因此，存在对便携式检测装置的未满足的需求，该便携式检测装置易于设计，生产便宜，同时对目标靶标是特异性的，能够快速读取并且具有良好的统计结果。
本发明的发明人发现，纳米抗体在其序列的特定区域中的突变使得可以将其直接接枝到表面上，同时使得可以正确地定向纳米抗体的互补位。因此，所得到的感测平台可以通过能够以低成本进行快速检测且同时目标靶标是特异性的，来解决上述技术问题。
发明概述
本发明人已经发现了一种基于电化学读取的设计和生产“生物传感器”的方法，所述电化学读取是通过对靶标(例如SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)蛋白)特异性的突变纳米抗体的表面固定。
本发明的一个第一方面涉及结合靶标的突变纳米抗体，其中存在于框架的FRl区的环中，优选在第12、13、14或15位处的氨基酸被突变为半胱氨酸。
在另一个方面，本发明涉及本发明的突变纳米抗体，其中所述突变纳米抗体附接至表面。
本发明还涉及包含本发明的表面的生物传感器，其用于检测样品中的靶标。
最后，本发明还涉及用于检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.提供本发明的生物传感器，
b.使生物传感器与样品接触，
c.测量生物传感器表面处的响应，以及
d.确定靶标的存在或不存在。
发明详述
定义
下文定义了贯穿本发明使用的术语。
如本文所用，术语“靶标”是指选自病毒蛋白、蛋白质生物标志物、细菌蛋白、膜蛋白、原生动物蛋白、真菌蛋白和朊病毒蛋白的检测靶标。在一个实施方案中，靶标源自感染原。在一个优选的实施方案中，靶标是病毒蛋白，优选SARS病毒蛋白，更优选SARS-CoV-2病毒蛋白，进一步优选SARS-CoV-2受体结合蛋白(RBP)。在另一个优选的实施方案中，靶标是HSV-I病毒蛋白。感染原的其他实例是本领域普通技术人员公知的，并且这样的实施方案在本发明的范围内。
如本文所用，术语“样品”是指生物流体，例如鼻拭子、口拭子、唾液、血液、羊水、房水、玻璃体液、胆汁、脑脊液、乳糜、内淋巴、外淋巴、女性射精、男性射精、淋巴、粘液(包括鼻引流和痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀黏液、痰(sputum)、滑液、阴道分泌物。在一个优选的实施方案中，本发明的样品选自鼻或口拭子、唾液和血液。根据本发明，可以在分析之前处理生物流体。例如，可以例如通过离心以除去细胞或通过脱蛋白质来处理血液以使其适合于通过本发明的电化学生物传感器装置进行分析。本领域技术人员知道如何根据其来源处理样品，以便使其适合于通过本发明的生物传感器装置进行分析。
如果在本文中没有另外说明，“约”是指±20％，优选±10％，更优选±5％。
突变纳米抗体
纳米抗体是一类来源于骆驼科动物的抗原结合蛋白，其仅包含单个15kDa的可变结构域。它们表现出更优的稳定性并且能够结合大量表位，有时甚至可以结合经典抗体不可及的那些表位。
在本发明中，我们依赖于Laura S.Mitchell，Lucy J.Colwell“Comparativeanalysis of nanobody sequence and structure data”Proteins.2018；1-10，其通过引用并入本文。该文章描述了纳米抗体的结构，如图1所示，其含有三个高度可变的环CDR1、CDR2和CDR3，也可称为H1、H2和H3。这些环在折叠的蛋白质结构域的一侧形成延伸的结构界面，其有助于测定纳米抗体抗原结合特异性的抗原结合界面或互补位。
在这三个CDR区之间存在框架。该框架由称为FR1、FR2、FR3和FR4的4个区组成。Laura S.Mitchell和Lucy J.Colwell的文章研究了从一种纳米抗体到另一种纳米抗体的突变频率，如图2所示。如所证明，从一个纳米抗体到另一个纳米抗体，纳米抗体不使它们的框架区多样化以补偿VL结构域的损失。根据Laura S.Mitchell和Lucy J.Colwell文章，从一个纳米抗体到另一个纳米抗体的框架，对于FRl而言从第1位延伸到第25位，对于FR2而言从第36位延伸到第49位，对于FR3而言从第60位延伸到第97位，并且对于FR4而言从第117位延伸到第126位。
本发明的突变纳米抗体在纳米抗体的框架中突变。为了确定序列中氨基酸的位置和突变氨基酸的位置，我们将在本发明中使用Laura S.Mitchell和Lucy J.Colwell的文章。该框架从一个纳米抗体到另一个是保守的，突变适用于所有纳米抗体。根据LauraS.Mitchell和Lucy J.Colwell文章中所述，在FRl区的环中的位置进行突变，并且所述突变在于用半胱氨酸(Cys或C)替换存在于上述位置的氨基酸。该突变在相对于互补位的相对侧的位置处进行，并且因此在纳米抗体的高度可变CDR区的相对侧进行。实际上，在距互补位的这样的位置使得使用本发明的突变纳米抗体以下述的方式接枝在表面上，所述方式为使得互补位在与所述表面相反的方向上定向，同时避免二聚化。优选地，在FRl区的第12、13、14或15位处进行突变。
本发明的一个第一方面涉及结合靶标的突变纳米抗体，其中存在于FRl区的环中，优选在第12、13、14或15位处，更优选在第13位处的氨基酸被突变为半胱氨酸。
纳米抗体是本领域技术人员熟知的(Serge Muyldermans“Nanobodies:NaturalSingle-Domain Antibodies”Annu.Rev.Biochem.2013.82:775–97；Laura S.Mitchell,Lucy J.Colwell“Comparative analysis of nanobody sequence and structure data”Proteins.2018；1–10)。因此，根据待检测的靶标，本领域技术人员将知道如何产生对所述靶标特异性的纳米抗体，从而将根据本发明的上述技术转置到对任何靶标特异性的任何纳米抗体。通过美洲驼免疫和噬菌体展示产生纳米抗体的过程描述于Desmyter et al,CurrOpin Struct Biol.2015；32:1-8。因此，本发明不受限制，而是涵盖通过根据本发明突变的特异性纳米抗体检测目标靶标的所有可能性。
通常，本发明的突变纳米抗体可以包含标签序列，例如聚组氨酸标签。通常，本发明的突变纳米抗体可以连接至另一种肽或多肽，例如连接至另一种纳米抗体以形成双体。另一种纳米抗体可以结合与本发明的突变纳米抗体的靶标相同的靶标或其他靶标。
附接至表面的突变纳米抗体
纳米抗体已成功应用于生物传感器的开发。生物传感器是生物受体(在这种情况下为纳米抗体)与将生物识别事件转化为可测量的信号的表面(特别是换能器)紧密接触的装置。
在本发明的一个实施方案中，突变纳米抗体附接至表面。“表面”在本发明中是指可以是平坦或弯曲的导电基板。在一个实施方案中，表面是金表面，并且优选地是工作电极。在另一个实施方案中，表面选自石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物，或除金以外的金属表面，例如碳、铂、镍、铜、银。在一个优选的实施方案中，表面是石墨烯表面。优选地，表面是工作电极。在一个优选的实施方案中，表面是生物传感器装置的工作电极。
本发明还涉及用于检测样品中的靶标的包含本发明的表面的生物传感器。
纳米抗体修饰的工作电极成为能够分别使用电化学技术在传感器芯片上实时分析分子间相互作用的生物传感器。在传感器芯片上形成金表面层或选自由石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物所组成的组的表面层或除金之外的金属表面，使得本发明的半胱氨酸修饰的纳米抗体可以以其高结合能力被稳定地接枝。如果纳米抗体与样品中的靶标相互作用，则可以实时检测结合和解离。
关于电化学传感器，在靶标与附接至感测电极表面的纳米抗体结合时，感测电极表面处的电化学性质(例如电子转移性质)的变化可以通过测试设备测量。可以由测试设备测量的感测电极表面处的各种电化学性质包括但不限于电阻、电势和电流变化。在某些实施方案中，测试设备是电压表、欧姆表、电流表、万用表或恒电位仪。在另一个实施方案中，用该设备进行的测试可以是差分脉冲伏安法、电化学阻抗谱(EIS)、循环伏安法(CV)、线性扫描伏安法(LSV)计时电流法(CA)或计时电位法。
差分脉冲伏安法(DPV)是用于进行电化学测量的伏安法方法。它是线性扫描伏安法的衍生，具有叠加在电势线性扫描或阶梯上的一系列规则电压脉冲。在每次电位变化之前立即测量电流，并将电流差绘制为电位的函数。通过恰好在电势改变之前采样电流，可以降低充电电流的影响，有利于法拉第电流，使得该方法高度灵敏。
DPV使得能够直接分析低至pM蛋白质浓度和低细菌浓度等。在本发明中，使用的氧化还原探针是二茂铁-甲醇(FcMeOH)，但可以是任何其他氧化还原对，例如二茂铁胺(Fc-NH2)、铁氰化物(Fe(CN)6 3-]、亚铁氰化物Fe(CN)6 4-]、钌六胺(Ru(NH3)6)等，用于检测靶标与接枝纳米抗体的相互作用，因为相互作用将显著降低电子电荷转移相互作用。靶标的存在充当扩散屏障，阻碍电荷从氧化还原探针转移到表面。样品中存在的靶标的添加导致氧化还原电流的降低，因为复合纳米抗体-靶标形成屏障。
因此，结合有本发明的纳米抗体的电化学传感器可用作分析靶标-纳米抗体相互作用的生物传感器装置。
在另一方面，本发明涉及用于检测样品中的靶标，优选病毒的方法，所述方法包括：
a.提供如本发明所定义的生物传感器，
b.使生物传感器与样品接触，
c.测量生物传感器表面的电化学响应，和
d.确定靶标的存在或不存在。
在本发明的方法中，在允许形成纳米抗体-靶标复合物的条件下，使含有待测量的靶标的样品与传感器接触足以形成这种复合物的时间段。在一个优选的实施方案中，在仅允许或促进本发明的纳米抗体的互补位与样品中的靶标之间的特异性结合的条件下，使含有待测量的靶标的样品与传感器接触。本发明的纳米抗体对目标靶标具有特异性，避免了纳米抗体与样品中的其他化学物质之间的非特异性结合。足以形成纳米抗体-靶标复合物的时间段可以是约1分钟至约60分钟、约1分钟至约10分钟或约5分钟。
将本发明的纳米抗体接枝到表面上
本发明的纳米抗体可以以各种方式附接至表面。在某些实施方案中，纳米抗体以共价方式附接至表面。出于实际目的，以共价方式结合确保纳米抗体永久地附接至传感器，这避免了例如在传感器的洗涤期间纳米抗体的损失。在另一个实施方案中，纳米抗体以非共价方式附接至表面。
将纳米抗体固定到表面上是构建本发明的生物传感器装置的关键步骤，因为其影响选择性和灵敏度。在一个实施方案中，传感器修饰基于纳米抗体的硫醇基团通过通常用于金电极修饰的Au-S键的形成与金的相互作用。硫醇和金表面之间形成的金-硫(Au-S)相互作用的强度为制造用于不同应用的稳健的自组装单层提供了基础。在另一个实施方案中，传感器修饰基于选自石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物的表面或除金以外的金属表面(例如碳、铂、镍、铜、银)与纳米体的硫醇基团的相互作用，这为制造用于不同应用的稳健自组装单层提供了基础。
在某些方面，传感器修饰基于纳米抗体与金表面或选自石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物的表面或除金以外的金属表面(例如碳、铂、镍、铜、银，优选金或石墨烯)之间的短接头的相互作用，以使得纳米抗体的半胱氨酸与所述表面的距离小于1纳米(1nm)的方式。短距离使得可以制造用于不同应用的稳健的自组装单层。在某些方面，短接头可以是具有附接的官能末端(例如COOH、NH2或马来酰亚胺(MAL)，或PEG-芳基基团，例如PEG-芳基重氮盐)的基于芘的接头，其通过还原芳基重氮离子攻击表面。芳基重氮盐的实例是4-[(三异丙基硅基)乙烯基]苯重氮四氟硼酸盐(TIPS-Eth-ArN2+)、4-硝基苯重氮四氟硼酸盐、4-甲氧基苯重氮四氟硼酸盐、4-溴苯重氮四氟硼酸盐和4-羧酸苯重氮四氟硼酸盐。在一个实施方案中，附接至金表面或选自石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物的表面、或金以外的金属表面(如碳、铂、镍、铜、银)的芳基重氮的官能团可以用连接至纳米抗体的硫醇基团的PEG-马来酰亚胺、PEG-碘乙酰1-芘基丁酸(PBA)、1-芘基丁酸琥珀酰亚胺酯(PBASE)或芘-马来酰亚胺(Py-MAL)而进行后功能化。
本发明的纳米抗体被突变以用半胱氨酸替换框架的氨基酸。半胱氨酸残基的硫化物基团使得可以将本发明的突变纳米抗体直接接枝到金表面上。由于插入序列中的半胱氨酸残基相对于互补位的较远位置，本发明的纳米抗体以互补位在与传感器表面相反的方向上的方式定向。通过这种方式，接枝到表面上的每个纳米抗体能够结合样品中存在的靶标。此外，将纳米抗体直接接枝到表面上或通过本发明的短接头接枝能够减少电子需要行进以触发生物传感器信号的距离。以这种方式，本发明的突变纳米抗体能够更容易、快速地接枝，并提供对目标靶标具有特异性、具有快速读数的生物传感器。在一个实施方案中，接枝不使用纳米抗体和传感器表面之间的接头。
在一个实施方案中，用于表面接枝的突变纳米抗体的量为0.01-20mg/mL，优选0.05-10mg/mL，并且更优选0.1-lmg/mL。接枝时间为2至24小时，优选3至12小时，更优选9至12小时。PBS 1X稀释液的溶液pH为5-8，优选6-8，更优选7.4-8。
附图说明
图1：该图对应于来自文章Laura S.Mitchell,Lucy J.Colwell“Comparativeanalysis of nanobody sequence and structure data”Proteins.2018；1–10的图1(B)，显示左：纳米抗体VHH结构域的二级结构，其由9个由环区分开的β片层组成，其中3个是高变的(H1、H2和H3)。四个框架区(FR)分隔可变环。
图2：该图对应于来自文章Laura S.Mitchell,Lucy J.Colwell“Comparativeanalysis of nanobody sequence and structure data”Proteins.2018；1–10的图3(A)，显示了序列标志图，其显示了纳米抗体之间的氨基酸变异。
图3：实施例2VHH C13(A)和VHH C12(B)的接枝金电极的差分脉冲伏安图。二茂铁甲醇(FcMeOH，1mM)的PBS(0.1M)溶液。DPV参数：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；T＝0.02s；扫描速率：0.06V/s.
图4：作为受体结合蛋白的对数浓度的函数的电流变化：根据SARS-CoV-2的受体结合蛋白的不同浓度，实施例2的接枝金电极VHH C13的差分脉冲伏安图的校准曲线。二茂铁甲醇(FcMeOH，1mM)的PBS(0.1M)溶液。DPV参数：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；T＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。
图5：与RT-PCR相比，实施例2的接枝金电极的稀释测试。白色柱对应于RT-PCR，浅灰色对应于VHH 72生物素，深灰色对应于本发明的VHH C13，并且黑色对应于未突变的VHH72。
图6：使用来自RT-PCR给出Covid-19阳性或阴性结果的患者的样品，用非突变的VHH 72、生物素修饰的VHH 72和半胱氨酸修饰的纳米抗体VHH C13修饰的三种不同的感测界面的结果。在VHH C13结果的情况下，基于100个PCR阴性样品(深灰色项目符号)和73个PCR阳性样品(浅灰色项目符号)测试RT-PCR和本发明的突变的SARS-CoV-2纳米抗体之间的一致性。
图7：作为HSV-1病毒浓度的对数的函数的电流变化。
图8：作为实施例2的VHH C12(A)和VHH C13(B)的培养的SARS-CoV-2病毒颗粒的对数浓度的函数的电流变化。二茂铁甲醇(FcMeOH，1mM)溶于PBS(0.1M)。DPV参数：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；T＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。
具体实施方式
实施例1：对SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白具有特异性的非突变和突变纳米抗体的产生
1.对SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白具有特异性的非突变纳米抗体VHH 72的产 生
对SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白具有特异性的非突变纳米抗体的序列如下：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFVATISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAAGLGTVVSEWDYDYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH(SEQ ID NO:1)
所述纳米抗体含有C-末端聚组氨酸标签以便于纯化。
该非突变纳米抗体在37℃下在Turbo肉汤培养基(Athena)中培养4小时的T7表达大肠杆菌细胞(NEB)中产生。在该阶段，用0.3mM IPTG诱导表达，并将温度降至17℃，并使细胞再生长18小时。通过在4℃下以5000g离心10分钟使细胞沉淀。将沉淀在液氮中快速冷冻，然后在室温下解冻。然后将沉淀重悬于裂解缓冲液(50mM Tris、300mM NaCl、5％甘油、0.1％Triton、5mM咪唑、20ug/ml DNase、0.1M PMSF、0.1mg/ml溶菌酶)中，并在4℃下搅拌45分钟。将细胞以50％振幅超声处理3轮30秒。将裂解物在4℃下以13000g离心30分钟，然后将上清液在5ml Ni-NTA柱(GE Healthcare)上在50mM Tris、5％甘油、5mM咪唑、300mM NaCl(pH 8.0)中纯化。通过使用Amicon Ultra IOkDa截留浓缩器离心浓缩在250mM咪唑中洗脱的级分，然后加载到在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的HiLoad 16/60Superdex 75pg凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。通过离心浓缩纯化的纳米抗体；其浓度通过用NanoDrop 2000(ThermoScientific)测量280nm处的吸光度来测定。
2.对本发明的SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白特异的突变纳米抗体VHH C13的产 生
第1点的未突变纳米抗体在第13位处突变，以便按照下文的程序用半胱氨酸(C)替换谷氨酰胺(Q)。编码突变蛋白的合成基因已从Twist bioscience订购。按照与第1点中的关于非突变纳米抗体所记载的相同的方案产生突变纳米抗体。
获得的本发明的突变纳米抗体VHH C13的序列如下：
QVQLQESGGGLVCAGGSLRLSCAASGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFVATISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAAGLGTVVSEWDYDYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH(SEQ ID NO:2)
3.对SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白特异性的突变纳米抗体VHH-生物素的产生
将第1点的非突变纳米抗体通过下述的步骤用生物素标记。将在0.1M碳酸氢盐缓冲液pH 9(100mL：80mL H20+0.765g碳酸氢钠+0.095碳酸钠，用H20调节至100mL)中的1mg的非突变纳米抗体与以10mg/mL溶解在DMSO中的染料混合。将混合物在远离光的持续搅拌下保持1小时，然后进行离心和凝胶过滤。
4.对本发明的SARS-Cov-2病毒的受体结合蛋白特异的突变纳米抗体VHH C12的产 生
将第1点的未突变纳米抗体在第12位处突变，以按照下文的程序用半胱氨酸(C)替换缬氨酸(V)。编码突变蛋白的合成基因已从Twist bioscience订购。将合成物插入用于哺乳动物表达的载体中。在来自ThermoFisher的Expi 293表达培养基中在37℃、150rpm下培养的HEK Expi 293细胞中产生与FC结构域融合的突变纳米抗体，直到细胞为约1，10^6个细胞/mL。在此阶段，用75μg DNA和225μgPEI Max-transfection grade linear(Polysciences)转染细胞，并使细胞再生长96小时。在第一个24小时后，向细胞添加添加剂：0.5mM丙戊酸、4g/L葡萄糖和20％胰蛋白胨N1。96小时后，通过在4℃下以700g离心10分钟使细胞沉淀，然后在5ml Ni-NTA柱(GE Healthcare)上在50mM Tris、5％甘油、5mM咪唑、300mM NaCl(pH8.0)中纯化上清液。通过使用Amicon Ultra IOkDa截留浓缩器离心浓缩在250mM咪唑中洗脱的级分，然后加载到在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的HiLoad 16/60Superdex 75pg凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。通过离心浓缩纯化的纳米抗体-FC；它们的浓度通过用NanoDrop2000(ThermoScientific)测量280nm处的吸光度来测定。
通过以1：10的比例使用TEV蛋白酶分离VHH和FC结构域。在室温下裂解一夜后，将产物加载到在PBS中平衡的HiLoad 16/60Superdex 75pg凝胶过滤柱上。使用Amicon Ultra3kDa截留浓缩器通过离心来浓缩纯化的纳米抗体，通过测量280nm处的吸光度来测定浓度，并使用来自Nanotemper Technologies的Tycho NT.6来确定变性曲线。
获得的本发明的突变纳米抗体VHH C12的序列如下：
QVQLQESGGGLCQAGGSLRLSCAASGRTFSEYAMGWFRQAPGKEREFVATISWSGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAAGLGTVVSEWDYDYDYWGQGTQVTVSSGSHHHHHH(SEQ ID NO:4)
实施例2：SARS-CoV-2纳米抗体接枝在金电极上
在将实施例1的SARS-CoV-2纳米抗体接枝到金电极上之前，按照以下程序清洁金界面：
用UV-OZONE照射电极5分钟。然后用mQ水洗涤，用干燥空气干燥。在第二次中，用0.5M H2SO4溶液电化学性地清洗电极。为此，将电极连接至恒电位仪(Palmsens，Sensit)，在电极上沉积H2SO4并开始清洁方法(表1)。当该方法完成时，用mQ水冲洗电极，然后用干燥空气干燥。
表1-清洁参数
循环伏安法
清洁后，使用实施例1的3种不同的纳米抗体制备3种类型的金电极。
1.用本发明的突变纳米抗体VHH C13或VHHC12接枝的金电极
在两个步骤中制备金电极：将Au电极在室温下暴露于10μL 3-巯基丙酸(25mM)的水溶液30分钟。然后将酸封端的表面用EDC/NHS(1：1摩尔比，15mM)活化20分钟，然后在4℃下浸入NH2-PEG6-马来酰亚胺(10μL,0.1mg/m,在PBS 1×中)中2小时，并用MQ-水洗涤。将实施例1的第2点的SARS-CoV-2纳米抗体VHH C13或实施例1第4点的VHHC12的100μg/mL的PBSlx溶液滴在电极上，并在潮湿气氛下保持4℃过夜。将表面洗涤、干燥并保持在4℃直至使用。
2.用未突变纳米抗体VHH接枝的金电极
将2mM的L-半胱氨酸(SigmaAldrich，法国)在PBS lx中的溶液滴在电极上，并在潮湿气氛下在4℃下保持过夜。洗涤电极，干燥，并将15mM的NHS/EDC(SigmaAldrich，法国)的溶液滴在表面上(在4℃下2小时)，2小时后洗涤、干燥电极，并用实施例1第1点的SARS-Cov-2纳米抗体VHH的100μg/mL的溶液在4℃下在潮湿气氛下孵育过夜。将表面洗涤、干燥并保持在4℃直至使用。
3.用生物素突变纳米抗体VHH-生物素接枝的金电极
将2mM的L-半胱氨酸在PBS 1x中的溶液滴在电极上，并在潮湿气氛下在4℃下保持过夜。清洗、干燥电极，并将表面在4℃下与15mM NHS/EDC一起孵育2小时。2小时后，清洗、干燥电极，并将链霉抗生物素蛋白溶液(ThermoFisher，法国)与表面在4℃下在潮湿气氛下孵育过夜。第二天，洗涤、干燥电极，并用100μg/mL的实施例1第3点的SARS-Cov-2纳米抗体VHH-生物素的溶液孵育2小时。将表面洗涤、干燥并保持在4℃直至使用。
在每个金电极的接枝之后，测量每个最终电极的差分脉冲伏安图(DPV)。测量所用的溶液是在PBS(0,1M)中的二茂铁甲醇(FcMeOH，1mM)。DPV参数如下：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；t＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。DPV的结果如图3所示。可以看出，接枝有本发明的突变纳米抗体VHH C13(图3A)和VHH C12(图3B)的金电极能够具有大电流，特别是由于本发明的突变纳米抗体较少地阻断电子从纳米抗体转移到电极的事实。而其他电极的情况并非如此。
然后，通过根据不同浓度的SARS-CoV-2RBP(在PBS中的RBP的储备溶液的稀释度(0.1M))和病毒样品(在PBS中的SARS-CoV-2培养病毒中的储备溶液的稀释度(0.1M))建立DPV的校准曲线，测量每个最终电极特异性结合SARS-CoV-2受体结合蛋白(RBP)和培养的SARS-CoV-2病毒样品的能力。开始用培养的病毒的最低浓度的RBP孵育10分钟，记录DPV信号，然后添加更高浓度的RBP。测量所用的溶液是在PBS(0,1M)中的二茂铁甲醇(FcMeOH,1mM)。DPV参数如下：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；t＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。RBP的结果显示于图4，并且SARS-CoV-2病毒样品的结果显示于图8(A)和(B)。可以看出，本发明的突变纳米抗体VHH C13在4至5nM的SARS-CoV-2RBP浓度下快速结合，而就其他电极而言，结合发生较晚并且在高4倍和12倍的浓度下发生。用SARS-CoV-2病毒样品获得了类似的结果(参见图8(A)和(B))。因此，SARS-CoV-2纳米抗体在其序列中的特定位置，特别是在第13位处通过半胱氨酸的突变使得可以获得满足装置规格的非常灵敏和快速读取的电极。
使用了针对SARS-CoV-2RBP的不同的双体代替纳米抗体进行了测试，获得了具有0.28nM、0.082nM和0.018nM的结合亲和力的等效结果。
这些双体以及本发明的突变纳米抗体VHH C13已经在SARS-CoV-2变体，特别是UK、South African和Delta变体上进行了测试。已经获得了类似的结果。
实施例3：通过稀释测试将本发明的突变金电极与RT-PCR进行比较
在确定了本发明的传感电极对SARS-CoV-2的功效和灵敏度后，将其与诊断SARS-CoV-2的黄金标准(PCR)进行比较。
从患者收集的鼻咽样本保存在病毒转运培养基(VTM/UTM)中。将强阳性样品(PCT 18计数)在阴性样品中连续稀释10倍。
在MGISP-960自动样品制备系统上使用MGI Easy核酸提取试剂盒进行提取。
使用TaqPathTM COVID-19 Combo试剂盒(多重实时RT-PCR检测，旨在对SARS-CoV-2核酸进行推定定性检测，)在QuantStudio 5实时PCR系统上进行RT-PCR。
测试实施例2的三个金电极：本发明的非突变型SARS-CoV-2纳米抗体电极、生物素突变的SARS-CoV-2纳米抗体电极和半胱氨酸突变的SARS-CoV-2纳米抗体(VHH C13)电极。结果如图6所示。如所证明，RT-PCR能够检测SARS-CoV-2病毒直到第5次稀释，未突变的VHH72能够检测SARS-Cov-2病毒直到第2次稀释，VHH-生物素能够检测SARS-Cov-2病毒直到第4次稀释，并且本发明的VHH-72-Cys(VHH C13)能够检测SARS-CoV-2病毒直到第7次稀释。因此，本发明的突变的SARS-CoV-2纳米抗体能够以特异性方式检测非常低浓度的SARS-CoV-2病毒，并且能够通过检测PCR不再能够检测的病毒而超越黄金标准诊断方法的限制。因此，本发明的突变的SARS-Cov-2纳米抗体可以成为诊断病毒，特别是SARS-Cov-2病毒的新的黄金标准。
实施例4：与PCR黄金标准相比，本发明的突变的SARS-Cov-2纳米抗体的临床试验
临床试验根据以下方案进行。
表2-通过根据本发明的便携式和连接式的生物传感器快速检测COVID-19的研究设计
临床试验的结果如图6所示。可以看出，本发明的突变的SARS-CoV-2纳米抗体(VHHC13)能够与阴性样品的PCR结果具有95％的一致性，仅5个PCR阴性样品用本发明的突变的SARS-CoV-2纳米抗体检测为阳性。关于PCR阳性样品，证明了99％的一致性，仅1个PCR阳性样品用本发明的突变的SARS-Cov-2纳米抗体检测为阴性。
实施例5：本发明的突变纳米抗体对HSV-1的应用
HSV-1纳米抗体VHH 05cys的实例
VHH 05cys的序列如下：
QVQLVESGGGLVCPGGSLTLSCAASGFSFSTTTMKWVRQAPG KGLERVSFINRDSTFTQYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKP EDTAVYYCATASRITEGADFRGQGTQVTVSSGSHHHHHH(SEQ ID NO:3)
纳米抗体含有C-末端聚组氨酸标签以便于纯化。
在将实施例2的HSV-1纳米抗体接枝到金电极上之前，按照以下程序清洁金界面：用UV-OZONE照射电极5分钟。然后用mQ水洗涤，用干燥空气干燥。在第二次中，用0.5M H2SO4溶液电化学性地清洗电极。为此，将电极连接至恒电位仪(Palmsens，Sensit)，在电极上沉积H2SO4，并开始清洁方法(表1)。当该方法完成时，用mQ水冲洗电极，然后用干燥空气干燥。清洁后，使用2种不同的纳米抗体制备2种类型的金电极：
1.用本发明的突变纳米抗体VHH 05cys接枝的金电极
将100μg/mL的HSV-1纳米抗体VHH 05cys在PBSlx中的溶液滴在电极上，并在潮湿气氛下在4℃下保持过夜。将表面洗涤、干燥并保持在4℃直至使用。
2.使用EDC/NHS化学在L-半胱氨酸修饰的界面上用非突变纳米抗体(VHH 05)接枝的金电极。将2mM的L-半胱氨酸(SigmaAldrich，法国)在PBS 1x中的溶液滴在电极上，并在潮湿气氛下在4℃下保持过夜。洗涤、干燥电极，并将15mM的NHS/EDC(SigmaAldrich，法国)的溶液滴在表面上(在4℃下2小时)。2小时后洗涤、干燥电极，并用100μg/mL的HSV-1纳米抗体VHH 05的溶液在4℃下在潮湿气氛下孵育过夜。将表面洗涤、干燥并保持在4℃直至使用。
在各个金电极的接枝之后，测量每个最终电极的差分脉冲伏安图(DPV)。测量所用的溶液是在PBS(0,1M)中的二茂铁甲醇(FcMeOH,1mM)。DPV参数如下：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；t＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。然后，通过根据在PBS(0.1M)中的不同HSV-1病毒浓度(病毒的储备溶液的稀释度为107pfu/mL)建立DPV的校准曲线，测量每个最终电极特异性结合HSV-1病毒的能力(capacity)。开始用最低浓度的HSV-1病毒孵育10分钟，记录DPV信号，并添加下一个更高浓度的HSV-1病毒。测量所用的溶液是在PBS(0.1M)中的二茂铁甲醇(FcMeOH，1mM)。DPV参数如下：平衡时间3s；Estep＝0.01V；Epuls＝0.06V；t＝0.02s；扫描速率：0.06V/s。
结果如图7所示。可以看出，本发明的突变纳米抗体VHH 05cys从103pfu/mL起快速结合到HSV-I，就其他电极而言，没有观察到病毒结合。因此，HSV-I纳米抗体在其序列中的特定位置处，特别是在第13位处通过半胱氨酸的突变使得可以获得满足装置规格的非常灵敏和快速读取的电极。

Claims (13)

1.一种突变纳米抗体，其结合靶标，其中存在于框架的FRl区的环中的氨基酸被突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的突变纳米抗体，其中第12、13、14或15位处的氨基酸被突变为半胱氨酸。
3.根据权利要求1所述的突变纳米抗体，其中第13位处的氨基酸被突变为半胱氨酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的突变纳米抗体，其中所述靶标选自病毒蛋白、蛋白质生物标志物、细菌蛋白、膜蛋白、原生动物蛋白、真菌蛋白和朊病毒蛋白。
5.根据权利要求4所述的突变纳米抗体，其中所述靶标源自感染原。
6.根据权利要求4所述的突变纳米抗体，其中所述靶标是病毒蛋白，优选SARS病毒蛋白，更优选SARS-CoV-2病毒蛋白，进一步优选SARS-CoV-2受体结合蛋白(RBP)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的突变纳米抗体，其中所述突变纳米抗体附接至表面。
8.根据权利要求7所述的突变纳米抗体，其中所述表面是金表面或选自石墨烯、还原氧化石墨烯及其衍生物的表面，或除金之外的金属表面，例如碳、铂、镍、铜、银，优选金或石墨烯表面。
9.根据权利要求7或8所述的突变纳米抗体，其中所述表面是生物传感器装置的工作电极。
10.根据权利要求7-9所述的突变纳米抗体，其中所述突变纳米抗体用短接头，优选用基于芘的接头或PEG-芳基附接至所述表面。
11.一种生物传感器，其包含权利要求7-9中任一项所定义的表面，其用于检测样品中的靶标。
12.一种用于检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：
a.提供权利要求11的生物传感器，
b.使生物传感器与样品接触，
c.测量生物传感器表面处的响应，以及
d.确定靶标的存在或不存在。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品选自鼻或口拭子、唾液和血液。
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