CN116456836A

CN116456836A - 酶饲料保存

Info

Publication number: CN116456836A
Application number: CN202180068957.8A
Authority: CN
Inventors: S·凯塞; C·尼芬格; M·T·科恩; F·博勒普
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2020-10-07
Filing date: 2021-10-07
Publication date: 2023-07-18
Also published as: US20230380448A1; CA3196405A1; WO2022074163A2; US20230363419A1; CL2023000991A1; AU2021356138A1; EP4225048A2; CN116600651A; EP4225049A1; MX2023004056A; WO2022074170A1; CA3196406A1; MX2023003821A; AU2021358426A1; WO2022074163A3

Abstract

披露了使用酶抗氧化剂保存动物饲料。具有过氧化氢酶活性和/或超氧化物岐化酶活性的多肽保存动物饲料或动物饲料添加剂或预防在动物饲料组分中含有的蛋白质、维生素、脂肪和脂质的降解。

Description

酶饲料保存

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

技术领域

用于保存动物饲料或动物饲料添加剂或用于预防在动物饲料组分中含有的脂肪、脂质、蛋白质和维生素的氧化降解的抗氧化剂酶。

背景技术

抗氧化剂预防由脂质的氧化引起的酸败。常用的抗氧化剂是合成化学品，导致监管机构和消费者对这些化合物的安全性感到担忧。

典型的动物饲料包括饲料谷物(例如玉米)以提供碳水化合物和纤维、蛋白质来源(例如大豆粉)、和其他成分。收获饲料谷物并且将其加工至动物饲料中，并且动物饲料在饲喂动物前被运输且储存。遗憾的是，当动物饲料的饲料谷物和其他成分的水分含量足够高时，在储存一段时间后，它们可以生长霉菌和/或真菌。霉菌或真菌的存在可以破坏动物饲料的有用性。除非使用保存添加剂，否则会发生霉菌生长，导致产生将复杂碳水化合物还原为单糖的酶，并且在糖上大量生长的细菌攻击蛋白质，将其转化为难以消化的材料，导致损失25％-35％的干物质，并且产生难闻的气味。

虽然抗氧化剂已被添加为饲料防腐剂以预防在动物饲料组分中含有的脂肪和脂质的降解，但是许多这些抗氧化剂(例如乙氧基喹啉、混合型生育酚(维生素E)、维生素C、和丁基羟基苯甲醚/丁基化羟基甲苯)价格昂贵，并且必须从精炼行业以外的来源中获得。另外，美国食品药物管理局(FDA)和其他监管机构，以及消费者对合成抗氧化剂(例如乙氧基喹啉、BHT和BHA)的安全性表示担忧。同样，本行业寻找天然解决方案，以负担得起的方式延长其产品的贮存期，同时维持产品的新鲜度和质量。

WO 2104/014860披露了用于保存食物产品的抗氧化剂，其中该抗氧化剂是从动物组织中提取的。

本领域需要生物替代的防腐剂抗氧化剂，其能够以有成本效益的方式用作饲料防腐剂并且能够容易和有效地获得，并且能够满足监管和消费者需求以及消费者对可用于各种类型的动物饲料的天然抗氧化剂的需求。

发明内容

本发明的方面涉及保存动物饲料或动物饲料添加剂的方法，该方法包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂，其中所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明的另外的方面涉及用于预防在动物饲料组分中含有的脂肪和脂质的降解的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中，其中所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明还涉及保存的动物饲料组合物，该组合物包含在有氧条件下储存的饲料谷物，所述组合物包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明还涉及保存的动物饲料组合物，该组合物包含在有氧条件下储存的饲料谷物，所述组合物包含防腐剂，所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明的另外的方面涉及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于保存动物饲料或动物饲料添加剂的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂。

本发明的替代限定涉及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于预防在动物饲料组分中含有的脂肪和脂质的降解的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括将防腐剂施加至动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中。

本发明的另外的可替代的方面涉及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于保存动物饲料或动物饲料添加剂的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂。

另外的方面涉及饲料防腐剂组合物，该组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，并且进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒和碘，其中所述饲料防腐剂组合物基本上不含丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

本发明的方面涉及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于保存动物饲料或动物饲料添加剂的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂。

本发明还涉及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于预防在动物饲料组分中含有的脂肪和脂质的降解的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中。

本发明的另外的方面涉及饲料防腐剂组合物，该组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的；并且进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒和碘，其中所述饲料防腐剂组合物基本上不含丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

本发明的另外的方面涉及保存饲料或饲料添加剂中的组分的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，其中该饲料或饲料添加剂的组分选自由以下组成的组：维生素、蛋白质和脂质。

本发明还涉及选自由以下组成的组的酶用于减少或预防动物的肠细胞的坏死或细胞凋亡的用途：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明还涉及预防组合物或所述组合物的组分的氧化降解的方法，该方法包括使用防腐剂，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽；具有超氧化物岐化酶活性的多肽；以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

序列表综述

SEQ ID NO 1是从橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 2是从橙色嗜热子囊菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 3是从橙色嗜热子囊菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 4是从橙色嗜热子囊菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 5是从橙色嗜热子囊菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 6是从橙色嗜热子囊菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 7是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列，该成熟多肽包含714个氨基酸残基。

SEQ ID NO 8是来自黑曲霉的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列，该成熟多肽包含730个氨基酸残基。SEQ ID NO 7以商品名Catazyme^TM出售。

SEQ ID NO 9是从迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 10是从柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 11是从樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 12是从Crassicarpon thermophilum可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 13是从埃默森青霉(Penicillium emersonii)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 14是从杂色曲霉(Aspergillus versicolor)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 15是从Thermomucor indicae-seudaticae可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 16是从烟曲霉(Aspergillus fumigatus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 17是从喜热梭孢壳(Thermothelomyces thermophilus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 18是从疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 19是从Mycothermus thermophilus可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列

SEQ ID NO 20是从Mycothermus thermophilus可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 21是从草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 22是从透明嗜热腐质霉(Humicola hyalothermophila)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 23是从坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 24是从澳洲梭孢壳(Thielavia australiensis)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 25是从赫卡尼亚梭孢壳(Thielavia hyrcaniae)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 26是从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 27是从粗糙脉孢菌可用的具有过氧化氢酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 28是从奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)可用的具有超氧化物歧化酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 29是从里氏木霉(Trichoderma reesei)可用的具有超氧化物歧化酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 30是从坦普利科拉曲霉(Aspergillus templicola)可用的具有超氧化物歧化酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO 31是从日本曲霉(Aspergillus japonicus)可用的具有超氧化物歧化酶活性的成熟多肽的氨基酸序列。

附图说明

图1是维生素E与维生素e类似物Trolox之间的比较。ROS反应性羟基基团在两个分子中都突出显示。

图2是超氧化物的竞争测定。超氧化物由次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶原位形成。超氧化物由自由基指示剂WST-1定量。存在的超氧化物越多，形成的甲臜就越多(更快)，其在450nm处吸收。这导致Abs450随时间急剧增加。如果添加SOD或一些其他消耗超氧化物的化合物，如Trolox，则用于显色反应的超氧化物较少，从而导致Abs450的急剧增加。

图3说明了如何通过在与过氧化物酶(POD)和ABTSred的偶联反应中形成ABTSox来定量过氧化氢或Trolox。

图4说明了多不饱和脂肪酸如何与ROS反应并形成脂质自由基。这种脂质自由基进一步反应形成过氧自由基，而过氧自由基又最终形成丙二醛(MDA)，这是脂质氧化的指纹。

图5说明了ROS对0.5μg/μLα-亚麻酸的影响。MDA用作脂质氧化的指纹，并且通过TBARS荧光进行定量。

图6说明了ROS对5μg/μLα-亚麻酸的影响。MDA用作脂质氧化的指纹，并且通过TBARS荧光进行定量。

具体实施方式

本发明涉及替代化学品(包括维生素)的生物溶液，以保存动物饲料组分。本发明的酶生物溶液可以独立于目前市场上的化学溶液使用或与化学溶液结合使用。

定义

动物：术语“动物”是指除人以外的任何动物。动物的实例是单胃动物，包括但不限于猪或生猪(包括但不限于仔猪、成长猪、和母猪)；家禽，例如火鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子(包括乳鸽)和鸡(包括但不限于肉用仔鸡(本文称为肉鸡)、小鸡、下蛋鸡(本文称为下蛋鸡))；宠物，例如猫和狗；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)，甲壳类动物(包括但不限于河虾和对虾)，以及鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或旨在用于由动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。单胃动物的动物饲料通常包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包括草料(包括粗粮和青贮)，并且可以进一步包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。

浓缩物：术语“浓缩物”意指具有高蛋白和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(例如来自玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或由破碎、碾磨等制备的)、油籽滤饼(例如来自棉籽、红花、向日葵、大豆(例如豆粕)、油菜籽/卡诺拉(canola)、花生或落花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和酒糟(例如湿酒糟(WDS)和具有可溶物的干酒糟(DDGS))。

饲料预混物：将如上文示例的饲料添加剂的组合物掺入动物饲料(例如家禽饲料)中在实践中是使用浓缩剂或预混物进行的。预混物是指一种或多种微小成分与稀释剂和/或载剂的优选均匀的混合物。预混物用于促进微小成分在较大混合物中均匀分散。根据本发明的预混物可以作为固体(例如作为水溶性粉末)或液体添加至饲料成分或饮用水中。

草料：如本文定义的术语“草料”还包括粗粮。草料是新鲜的植物材料，例如来自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、发芽谷物和豆类植物)或其任何组合的干草和青贮。草料植物的实例是紫花苜蓿(Alfalfa、lucerne)、百脉根、芸苔属植物(例如，羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、萝卜)、三叶草(例如，杂三叶、红三叶、地三叶、白三叶)、禾草(例如，百慕大草、雀麦、伪燕麦草、羊茅、石南草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅(orchard grass)、黑麦草、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、粟、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦和蔬菜(例如甜菜)。草料进一步包括来自谷物生产的作物残余物(例如玉米秸秆；来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的稻草)；来自蔬菜像甜菜缨(beet top)的残余物；来自油籽生产像来自大豆、油菜籽和其他豆科作物的茎和叶的残余物；以及来自用于动物或人消耗的谷物精制或来自燃料生产或其他行业的部分。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有SOD活性。从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的几个)氨基酸；其中该片段具有SOD活性。

真菌来源：提及超氧化物歧化酶时，术语“真菌来源”旨在意指真菌中酶的来源。真菌是真核生物组中的任何成员，包括酵母和霉菌等微生物，以及更常见的蕈类。这些生物被分类为真菌界。目前，提出了七个门：微孢子虫门(Microsporidia)、壶菌门(Chytridiomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、新美鞭菌门(Neocallimastigomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、子囊菌门(Ascomycota)、和担子菌门(Basidiomycota)。合适的实例包括但不限于里氏木霉、杂色曲霉、弯头曲霉、埃及曲霉、韦斯特壳属物种AS85-2、曲霉属物种XZ2669、栖土光黑壳、锥毛壳属物种、球芽泛普可尼亚菌、Xylomelasma属物种XZ0718、弗氏光黑壳、Cladobotryum属物种、韦斯特壳属物种-46156、钩状木霉、Mycothermus thermophilus、Cephalotrichiella penicillate、大果毛壳、嗜热毛壳菌嗜热变种、透明嗜热腐质霉、变形沙氏壳、鞘氨醇杆菌属物种T2、俄罗斯木霉、力士木霉、木霉属物种-54723、霉白曲霉、坦普利科拉曲霉、厚垣孢普可尼亚菌棘孢变种、木霉属物种-44174、俄罗斯木霉、木霉属物种-54723、木霉属物种-44174、Metapochoniasuchlasporia、马昆德拟绿僵菌、对间座壳菌、弯颈霉属物种XZ2627、日本曲霉、绿僵菌属物种XZ2431、奥氏蜜环菌、螺旋木霉、雅致曲霉、弯梗木霉、绿木霉、哈茨木霉、Fusicollaacetilerea、小不整球壳属物种1-29、紫红玛利亚霉、草酸青霉菌、炭疽菌属物种-71086、曲霉属新物种XZ3202、近洋大戟草木霉、曲霉属新物种XZ3202、毛霉属物种XZ2651、米黑根毛霉、毛霉属物种XZ2651、圆孔壳科物种43674、棕黑腐质霉和红聚颈腔菌。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的组分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关联的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因天然相关联的启动子强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵培养液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

用质谱法对SOD的成熟N末端进行物理测定。将样品在水中稀释至0.1mg/ml。如果要在分析前去糖基化，则将样品悬浮在50mM乙酸铵缓冲液(pH 5.5)中。然后将样品置于8℃的Ultimate 3000UHPLC系统(赛默科技公司(Thermo Scientific))中，并在Advance Bio-RP脱盐柱(安捷伦公司(Agilent))上运行。使用的溶剂是A：LC/MS级水与0.1％甲酸，溶剂：B：95％乙腈与0.1％甲酸。梯度为经5分钟从5％-80％ B。将柱后的蛋白质洗脱液在BrukerMaxis II质谱仪(德国不莱梅)中分析，并通过提供的Bruker数据分析软件对所得的迹线进行分析。然后使用GPMAW(General Protein/Mass Analysis for Windows)软件12.20版将去卷积谱与预期的N和C末端情况下的计算的分子量进行比较。如果值在1道尔顿内匹配，则结束匹配。

获得自或可获得自：术语“获得自或可获得自”是指多肽可以在来自特定分类等级的生物中发现。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自真菌界，其中术语界是分类等级。在优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自子囊菌门(Ascomycota)，其中术语门是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自盘菌亚门(Pezizomycotina)，其中术语亚门是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自散囊菌纲(Eurotiomycetes)，其中术语纲是分类等级。

如果多肽的分类等级未知，则它可以容易地由本领域普通技术人员通过进行多肽的BLASTP检索(使用例如国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information，NCIB)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同系物进行比较来确定。技术人员还可以将序列与所提交的申请的序列进行比较。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为是属于相同的分类物种。包含在多达10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。

粗粮：术语“粗粮”意指具有高水平纤维的干植物材料，例如来自种子和谷物以及作物残余物(例如秸秆、干椰肉(copra)、稻草、谷壳、甜菜废料)的纤维、麸、苞叶。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组地相关的其他多肽材料的制剂。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。

Tm：实例中使用的术语Tm是指50％的蛋白质分子未折叠并且50％的蛋白质分子折叠时的温度。

变体：术语“变体”意指包含在一个或多个(例如，几个)位置处的一个或多个(几个)氨基酸残基的改变(即，取代、插入、和/或缺失)的具有SOD活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据该位置的氨基酸之后添加1、2、或3个氨基酸。

营养素：本发明中的术语“营养素”意指动物膳食饲料中含有的组分或元素，包括水溶性成分、脂溶性成分及其他。水溶性成分的实例包括但不限于碳水化合物，例如糖类(包括葡萄糖、果糖、半乳糖和淀粉)；矿物质，例如钙、镁、锌、磷、钾、钠和硫；氮源，例如氨基酸和蛋白质；维生素，例如维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、叶酸、维生素B12、生物素和泛酸。脂溶性成分的实例包括但不限于脂肪，例如脂肪酸(包括饱和脂肪酸(SFA)；单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA))、纤维、维生素，例如维生素A、维生素E和维生素K。

超氧化物：超氧化物是短寿命、膜不可渗透的超氧自由基阴离子的名称，它是在分子氧捕获单个电子时产生的。

超氧自由基可以作为单电子还原剂，如果它将电子捐赠给自身以外的分子(＝受体)。在这个过程中，超氧自由基被氧化(＝松散电子)，并且受体“接受”电子，从而被还原。

还原的受体可以通过接受来自第二个超氧自由基分子的另一个电子而被进一步还原。

如果没有受体接受来自超氧化物的电子，两个超氧化物分子将相互反应，形成过氧化氢。

然而，超氧化物的第二次还原需要在双原子氧分子上压缩两个完全负电荷，这是一个能量不利的过程。因此，超氧化物通常是比氧化剂更好的还原剂。

这也可以从超氧自由基阴离子的负氧化还原电位中看出。负氧化还原电位意指超氧自由基阴离子想要摆脱电子，而不是氧想要接受电子。(相比之下，过氧化氢具有正氧化还原电位，它想要接受电子，从而氧化它接受电子的分子。)

超氧化物岐化酶：超氧化物岐化酶(SOD)催化将两个超氧化物分子(＝超氧化物的岐化)变成过氧化氢和水的这种能量不利的反应。

因此，SOD去除了还原剂。换句话说，SOD是促氧化剂，而不是抗氧化剂。SOD的有益作用来自它们去除反应性和破坏性超氧自由基离子的能力，而不是抗氧化剂。

活性氧类：过氧化氢和超氧化物两者都是活性氧类。由于它们的反应性，它们与生物分子反应并破坏/失活那些。CAT和SOD“解除”这些活性氧类，使它们不能破坏/失活生物分子。ROS包括

·H₂O₂

·KO₂

·HX/XO

作用于各种ROS类型的活性氧类和酶的表：

ROS	代表	半衰期(s)
			超氧化物阴离子	O2^·-	10^-6
过氧化氢	H2O2	稳定的
			羟基自由基	OH^·	10^-9
一氧化氮	NO
			过氧亚硝基阴离子	ONOO^-
过氧自由基	RCOO^·	数秒
			有机过氧化氢	RCOOH	稳定的
单线态氧	¹O₂	10^-6
			臭氧	O₃	数秒

发明方法

本发明的第一方面涉及保存动物饲料或动物饲料添加剂的方法，该方法包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂，其中所述防腐剂包含具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。通常，在保存动物饲料或动物饲料添加剂的方法中，所述动物饲料或动物饲料添加剂是在有氧条件下的。

另外的方面涉及用于预防在动物饲料组分中含有的维生素、蛋白质、脂肪和脂质的氧化降解的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中，其中所述防腐剂包含具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。通常，用于预防在动物饲料组分中含有的维生素、蛋白质、脂肪和脂质的降解的方法中，所述动物饲料或动物饲料添加剂或饲料成分是在有氧条件下的。

在本发明的方法中，与不存在具有过氧化氢酶活性的多肽或不存在具有超氧化物岐化酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂相比，施加至所述动物饲料或动物饲料添加剂的化学防腐剂的水平通常降低。

将具有过氧化氢酶活性的多肽优选地以50至1000U酶蛋白/kg动物饲料的水平给药，例如100至1000U酶蛋白/kg动物饲料，例如200至900U、300至800、400至700、500至600酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合。

在本发明的方法中，其中与不存在具有过氧化氢酶活性的多肽或不存在具有超氧化物岐化酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂相比，施加至所述动物饲料或动物饲料添加剂的化学防腐剂的水平通常降低，还原的化学防腐剂适合选自丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

方法可以包括添加一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒、和碘，优选地一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素C、维生素E、维生素K和硒。

本发明还涉及方法用于预防在动物饲料组分中含有的维生素、蛋白质、脂肪和脂质的氧化降解的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的维生素：维生素E或其衍生物以及维生素C或其衍生物；以及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明还涉及方法用于预防在动物饲料组分中含有的维生素、蛋白质、脂肪和脂质的氧化降解的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中，其中所述防腐剂包含硒、以及具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

另外的方面涉及保存饲料或饲料添加剂中的组分的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，其中该饲料或饲料添加剂的组分选自由以下组成的组：维生素、蛋白质和脂质。

另外的方面涉及预防组合物或所述组合物的组分的氧化降解的方法，该方法包括使用防腐剂；其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽；具有超氧化物岐化酶活性的多肽；以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明的方法涉及向动物施用动物饲料。动物通常是单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于仔猪、成长猪、和母猪)；家禽(包括但不限于家禽、火鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、鸡、肉鸡、下蛋鸡、小母鸡和小鸡)；宠物(包括但不限于猫和狗)；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼、大比目鱼、爪哇鱼、野鲮属鱼、莱鱼、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼、珍珠斑点鱼、佩杰瑞鱼、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼、睡鲨、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼、丁鲷、特罗尔鱼、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼、和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。在更优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、家禽、甲壳类动物和鱼。在甚至更优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、仔猪、成长猪、母猪、鸡、肉鸡、下蛋鸡、小母鸡和小鸡。在另外的优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、仔猪、成长猪和母猪。

本发明的另外的方面涉及饲喂动物(例如家禽或猪)的方法，该方法包括将防腐剂添加至饲料原料中，其中所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明的另外的方面涉及饲喂动物的方法，其中该动物饲料或动物饲料添加剂包含防腐剂，其中所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽以及具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，并且进一步包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：

i.一种或多种载剂；

ii.一种或多种微生物；

iii.一种或多种维生素；

iv.一种或多种矿物质；

v.一种或多种氨基酸；

vi.一种或多种有机酸；

vii.以及一种或多种其他饲料成分。

可另外施用另外的一种酶，但除了过氧化氢酶和超氧化物歧化酶之外，其他的酶对于本发明的有益效果并不是必要的。具有超氧化物岐化酶活性的多肽适合地获得自、可获得自或来源自奥氏蜜环菌、日本曲霉、里氏木霉和坦普利科拉曲霉。具有超氧化物岐化酶活性的多肽适合地选自由具有以下的多肽组成的组：

i)与SEQ ID NO:28具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

ii)与SEQ ID NO:29具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

iii)与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；以及

iv)与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

本发明的另外的方面涉及选自具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合的酶用于保存动物饲料或动物饲料添加剂的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂。

本发明的替代限定涉及选自具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合的酶用于预防在动物饲料组分中含有的维生素、蛋白质、脂肪和脂质的降解的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括将所述酶施加至动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中。

饲料防腐剂组合物、动物饲料添加剂和动物饲料

已发现优于化学溶液的生物溶液。已发现与维生素E相比，本发明的过氧化氢酶和本发明的超氧化物岐化酶中的任一者或两者在饲料中的抗氧化作用更优异。根据经验证的数据，使用SEQ ID NO 31进行计算，发现与维生素E相比，后者具有高2700倍的抗氧化作用。

本发明的方面涉及保存的动物饲料组合物，该组合物包含在有氧条件下储存的饲料谷物，所述组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。通常，与不存在具有过氧化氢酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂相比，保存的动物饲料组合物包含降低水平的化学防腐剂。动物饲料组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒和碘。保存的动物饲料组合物通常包含选自以下的降低水平的化学防腐剂：丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。保存的动物饲料组合物可以基本上不存在或不存在丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉的含量。

在典型的实施例中，动物饲料组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，并且进一步包含选自由以下组成的组的维生素：维生素E或其衍生物以及维生素C或其衍生物。

在典型的实施例中，动物饲料组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，并且进一步包含硒。

保存的动物饲料组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：

i.一种或多种载剂；

ii.一种或多种微生物；

iii.一种或多种氨基酸；

iv.一种或多种有机酸；

v.以及一种或多种其他饲料成分。

保存的动物饲料组合物可以以50至1000U酶蛋白/kg动物饲料的剂量，例如100至1000U酶蛋白/kg动物饲料，例如200至900U、300至800、400至700、500至600酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合包含具有过氧化氢酶活性的多肽。

保存的动物饲料组合物的蛋白质来源可以选自由以下组成的组：大豆、野生大豆、菜豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、胡豆(蚕豆)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、葵花籽、棉籽、油菜籽(油菜)或豌豆，或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)、葵花粉、棉籽粉、油菜籽粉、鱼粉、骨粉、羽毛粉、乳清、或其任何组合。

保存的动物饲料组合物的能量来源可以选自由以下组成的组：玉蜀黍、玉米、高粱、大麦、小麦、燕麦、稻、黑小麦、黑麦、甜菜、糖甜菜、菠菜、马铃薯、木薯、藜麦、卷心菜、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子，或处于其加工形式例如研磨的玉米、研磨的玉蜀黍、马铃薯淀粉、木薯淀粉、研磨的高粱、研磨的柳枝稷、研磨的粟、研磨的谷子、研磨的珍珠粟、或其任何组合。

保存的动物饲料组合物通常使具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌和黑曲霉，优选地橙色嗜热子囊菌。具有过氧化氢酶活性的多肽可以选自由以下组成的组：

a.与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

b.与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

c.与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

d.与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

e.与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

f.与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

g.与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

h.与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

i.与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

j.与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

k.与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

l.与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

m.与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

n.与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

o.与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

p.与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

q.与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

r.与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

s.与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

t.与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

u.与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

v.与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

w.与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

x.与SEQ ID NO:24具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

y.与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；

z.与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；以及

aa.与SEQ ID NO:27具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽。

具有过氧化氢酶活性的多肽更通常选自由以下组成的组：

e.与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽；以及

f.与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的具有过氧化氢酶活性的多肽。

具有超氧化物岐化酶活性的多肽获得自、可获得自或来源自奥氏蜜环菌、日本曲霉、里氏木霉和坦普利科拉曲霉。通常，具有超氧化物岐化酶活性的多肽选自由具有以下的多肽组成的组：

在优选的实例中，动物饲料可以进一步包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分，如本文所述。

在另外的方面，本发明涉及动物饲料添加剂以及包含如本文所定义的饲料防腐剂组合物的动物饲料。

饲料防腐剂组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽，并且进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒和碘，其中所述饲料防腐剂组合物通常基本上不含丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

饲料防腐剂组合物可以包含

a.一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽，其中该饲料防腐剂组合物进一步包含

b.一种或多种具有超氧化物岐化酶活性的多肽以及

c.一种或多种维生素，其中该一种或多种维生素优选地是脂溶性维生素，例如维生素E。

在另外的实施例中，饲料防腐剂组合物可以进一步包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：

i.一种或多种载剂；

ii.一种或多种微生物；

iii.一种或多种氨基酸；以及

iv.一种或多种有机酸。

预防维生素氧化

活性氧类(ROS)是由O2形成的反应性化学品，并且包括过氧化氢和超氧化物。ROS可以由氧气作为代谢/呼吸副产物或通过其他因素形成，例如热、辐射(UV，电离)、干旱、盐度、寒冷、病原体防御、营养素缺乏、金属毒性、毒素、异生素和污染物。ROS可以导致细胞和全身氧化还原失衡。为了重建氧化还原平衡，将抗氧化剂(例如维生素E(维生素C……))添加至食物和饲料中。全身摄取后，维生素E将自身插入细胞质膜并清除活性氧类，从而以相当低效的方式保护细胞免受ROS损伤，其中维生素E的一个分子可以清除ROS的一个分子。

维生素E容易被氧化，并且因此作为维生素-酯(即受保护的形式)添加至食物和饲料中。食用时，肠腔中的酯酶切割酯键并释放游离(现在未受保护)的维生素E。在被吸收之前，游离的维生素E会受到肠腔中ROS的影响。因此，我们评估了过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶是否可以保护维生素E免受ROS介导的胃肠道降解。这将允许完整的维生素E被全身吸收，并且因此将导致释放维生素E的全部潜力。

本文发现与Trolox相比，SOD在解除超氧化物方面的效率要高得多。本文发现过氧化氢酶在解除过氧化氢方面的效率比Trolox高得多。在腔中，SOD和CAT解除超氧化物和过氧化氢，并且因此保护Trolox和维生素E。因此，维生素可以全身完整地吸收，并且在进入细胞膜时发挥其抗氧化作用。相应地，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶中的每一种都对维生素E起保护作用。

本发明的方面涉及预防饲料或饲料添加剂中的维生素组分氧化的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

预防脂质氧化

活性氧类与脂质和脂肪酸缔合的重要性

活性氧类(ROS)是由O2形成的反应性化学品，并且包括过氧化氢和超氧化物，并且在脂质和脂肪酸的氧化中起重要作用。ROS可以由氧气作为代谢/呼吸副产物或通过其他因素形成，例如热、辐射(UV，电离)、干旱、盐度、寒冷、病原体防御、营养素缺乏、金属毒性、毒素、异生素和污染物。脂肪酸和脂质(像例如多不饱和脂肪酸)易受ROS破坏。当多不饱和脂肪酸与氧气自由基反应时，它形成脂质自由基。这种脂质自由基可以进一步反应以形成过氧自由基。在明确定义的链式反应中，过氧自由基最终成为丙二醛(MDA)，这是脂质氧化的指纹。

本发明的方面涉及预防饲料或饲料添加剂中的脂质或脂肪酸组分氧化的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

预防蛋白质氧化

本发明的方面涉及预防饲料或饲料添加剂中的蛋白质或多肽组分氧化的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

如实例7.1所示，rHSA被过氧化氢(+78Da)修饰，并且rHSA进一步被来自次黄嘌呤的黄嘌呤氧化酶生成的超氧化物(+43Da)修饰。超氧化物岐化酶预防rHSA的这种43道尔顿超氧化物修饰。

此外，已经证明过氧化氢酶对超氧化物歧化酶的稳定性发挥保护作用，并且超氧化物歧化酶对过氧化氢酶的稳定性发挥保护作用。

预防肠细胞的肠坏死

本发明的另外的方面涉及选自由以下组成的组的酶用于减少或预防动物的肠细胞坏死或细胞凋亡的用途：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

本发明的相关方面涉及预防肠中的哺乳动物细胞氧化降解的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用选自由以下组成的组的酶：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

动物通常是单胃动物，例如猪或生猪(包括但不限于仔猪、成长猪、和母猪)；家禽(包括但不限于家禽、火鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鹅、鸽子、乳鸽、鸡、肉鸡、下蛋鸡、小母鸡和小鸡)；宠物(包括但不限于猫和狗)；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼、大比目鱼、爪哇鱼、野鲮属鱼、莱鱼、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼、珍珠斑点鱼、佩杰瑞鱼、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼、睡鲨、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼、丁鲷、特罗尔鱼、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼、和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。在更优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、家禽、甲壳类动物和鱼。在甚至更优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、仔猪、成长猪、母猪、鸡、肉鸡、下蛋鸡、小母鸡和小鸡。在另外的优选的实施例中，动物选自由以下组成的组：生猪、仔猪、成长猪和母猪。哺乳动物通常选自由以下组成的组：生猪、仔猪、成长猪和母猪。

过氧化氢酶

具有过氧化氢酶活性的多肽选自包含以下的组：分类为EC 1.11.1.6过氧化氢酶的多肽以及分类为EP 1.11.1.21过氧化氢酶过氧化物酶的多肽。

在优选的实施例中，具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自真菌。通常，具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、柄篮状菌、樟绒枝霉、Crassicarpon thermophilum、埃默森青霉、Thermomucor indicae-seudaticae、喜热梭孢壳、疣枝弯孢、Mycothermus thermophilus、草酸青霉菌、透明嗜热腐质霉、坚脆嗜热子囊菌、澳洲梭孢壳、赫卡尼亚梭孢壳和粗糙脉孢菌。根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉和烟曲霉。优选地，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌和黑曲霉，优选地橙色嗜热子囊菌。

具有过氧化氢酶活性的多肽优选地选自由以下组成的组：

具有过氧化氢酶活性的多肽更优选地选自由以下组成的组：

在优选的实施例中，具有过氧化氢酶活性的多肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、和SEQ ID NO:6中任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且获得自、可获得自或来源自橙色嗜热子囊菌。

过氧化氢酶的热稳定性

过氧化氢酶是适当热稳定的，使得当在50℃和pH 7下测量时它保留其至少40％的活性，例如保留至少50％的活性，例如保留至少55％的活性，例如保留至少60％的活性，例如保留至少65％的活性，例如保留至少70％的活性，例如保留至少75％的活性，例如保留至少80％的活性。

不同pH下的热稳定性

在本发明的实施例中，过氧化氢酶是热稳定的，使得当在50℃和pH 5下测量时它保留其至少50％的活性，例如保留至少55％的活性，例如保留至少60％的活性，例如保留至少65％的活性，例如保留至少70％的活性，例如保留至少75％的活性，例如保留至少80％的活性。在本发明的实施例中，过氧化氢酶是热稳定的，使得在pH 5下其Tm是至少50℃。

在本发明的替代实施例中，过氧化氢酶是热稳定的，使得当在50℃和pH 4下测量时它保留其至少50％的活性，例如保留至少55％的活性，例如保留至少60％的活性，例如保留至少65％的活性，例如保留至少70％的活性，例如保留至少75％的活性，例如保留至少80％的活性。本发明的方面涉及包含过氧化氢酶的动物饲料添加剂，其中该过氧化氢酶是热稳定的，使得在pH 4下其Tm是至少50℃。

在本发明的替代实施例中，过氧化氢酶是热稳定的，使得当在40℃和pH 3下测量时它保留其至少50％的活性，例如保留至少55％的活性，例如保留至少60％的活性，例如保留至少65％的活性，例如保留至少70％的活性，例如保留至少75％的活性，例如保留至少80％的活性。本发明的方面涉及包含过氧化氢酶的动物饲料添加剂，其中该过氧化氢酶是热稳定的，使得在pH 3下其Tm是至少40℃。

过氧化氢酶的胃稳定性

来自牛肝脏的过氧化氢酶(酶委员会(EC)编号：1.11.1.6CAS号：9001-05-2，分子量：250kDa)具有3524U/mg EP的活性和胃稳定性，其中在实例4的胃稳定性研究中，该过氧化氢酶仅保留其40％的活性。

在本发明的替代实施例中，过氧化氢酶是胃稳定的，使得当根据实例4中所述的测试方法测量时它保留其至少40％的活性，例如保留至少50％的活性，例如保留至少55％的活性，例如保留至少60％的活性，例如保留至少65％的活性，例如保留至少70％的活性，例如保留至少75％的活性，例如保留至少80％的活性。从实例4的表中可以看出，真菌来源的过氧化氢酶在pH 3且暴露于胃蛋白酶时保留其至少50％的活性。

超氧化物歧化酶

防腐剂进一步包含真菌来源的具有超氧化物岐化酶活性的多肽。超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)是可替代地催化超氧化物(O₂ ^-)自由基歧化(或分裂)为普通分子氧(O₂)或过氧化氢(H₂O₂)的酶。

本发明的超氧化物歧化酶可以获得自以下、可以从以下获得或可衍生自以下：可从真菌获得的超氧化物歧化酶，该真菌选自由以下组成的组：里氏木霉、杂色曲霉、弯头曲霉、埃及曲霉、韦斯特壳属物种AS85-2、曲霉属物种XZ2669、栖土光黑壳、锥毛壳属物种、球芽泛普可尼亚菌、Xylomelasma属物种XZ0718、弗氏光黑壳、Cladobotryum属物种、韦斯特壳属物种-46156、钩状木霉、Mycothermus thermophilus、Cephalotrichiella penicillate、大果毛壳、嗜热毛壳菌嗜热变种、透明嗜热腐质霉、变形沙氏壳、鞘氨醇杆菌属物种T2、俄罗斯木霉、力士木霉、木霉属物种-54723、霉白曲霉、坦普利科拉曲霉、厚垣孢普可尼亚菌棘孢变种、木霉属物种-44174、俄罗斯木霉、木霉属物种-54723、木霉属物种-44174、Metapochonia suchlasporia、马昆德拟绿僵菌、对间座壳菌、弯颈霉属物种XZ2627、日本曲霉、绿僵菌属物种XZ2431、奥氏蜜环菌、螺旋木霉、雅致曲霉、弯梗木霉、里氏木霉、绿木霉、哈茨木霉、Fusicolla acetilerea、小不整球壳属物种1-29、紫红鸽玛利亚霉、草酸青霉菌、炭疽菌属物种-71086、曲霉属新物种XZ3202、近洋大戟草木霉、曲霉属新物种XZ3202、毛霉属物种XZ2651、米黑根毛霉、毛霉属物种XZ2651、圆孔壳科物种43674、棕黑腐质霉和红聚颈腔菌。

超氧化物岐化酶通常选自披露于WO 2020/200321的那些。在适合的实施例中，超氧化物歧化酶获得自、或可获得自奥氏蜜环菌、日本曲霉、里氏木霉和坦普利科拉曲霉。在适合的实施例中，超氧化物岐化酶选自具有以下的多肽：

酶组合物和配制品

本发明的具有过氧化氢酶活性的多肽可以配制为液体或固体。针对液体配制品，配制剂可以包含多元醇(例如像，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(例如像，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或者糖或糖衍生物(例如像，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是液体组合物，该组合物包含本发明的多肽和一种或多种选自由以下组成的列表的配制剂：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨醇。液体配制品可以喷洒在已经丸粒化(pelleted)的饲料上，或可以添加到供给动物的饮用水中。

在一个实施例中，该液体配制品还包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选25％-75％多元醇，更优选30％-70％多元醇，更优选35％-65％多元醇，或最优选40％-60％多元醇。在一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇，优选25％-75％多元醇，更优选30％-70％多元醇，更优选35％-65％多元醇或最优选40％-60％多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选25％-75％多元醇，更优选30％-70％多元醇，更优选35％-65％多元醇或最优选40％-60％多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。

在一个实施例中，该液体配制品还包含防腐剂，优选地选自由以下组成的组：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，该液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选地0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选地0.1％至0.5％w/w的防腐剂。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，优选0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选0.05％至1.0％w/w的防腐剂，或最优选0.1％至0.5％w/w的防腐剂，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

针对固体配制品，该配制品可以例如作为颗粒、喷雾干燥粉末或凝集物(例如，如在WO 2000/70034中所披露)。配制剂可以包含盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，例如像，诸如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或者糖或糖衍生物(例如像，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。

在一个实施例中，该组合物是固体组合物，例如喷雾干燥组合物，该固体组合物包含本发明的具有SOD活性的多肽和一种或多种选自由以下组成的列表的配制剂：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选实施例中，配制剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、硫酸镁和碳酸钙。

本发明还涉及包含本发明的具有过氧化氢酶活性的多肽的酶颗粒/粒子任选地与一种或多种另外的酶的组合。该颗粒由核心以及任选地包围该核心的一种或多种包衣(外层)构成。

通常，该颗粒/粒子的粒度(granule/particle size)(测量为当量球径(基于体积的平均粒度))是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。

用于制备核心的方法可见于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；C.E.Capes的Particle size enlargement[粒度增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制技术，例如：

a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含酶的颗粒状材料；

b)层状产品，其中酶在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液通常在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有希望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有希望尺寸的粒子。这种类型的产品描述于例如WO 97/23606中；

c)吸收的核心粒子，其中不是将该酶在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶。这样的方法描述于WO 97/39116中。

d)挤出或丸粒化的产品，其中将含酶的糊剂压成丸粒(pellet)或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些粒子。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的；

e)喷射造粒产品，其中将酶粉末悬浮于熔化的蜡中，并将悬浮液喷射(例如通过转盘喷雾器)到冷却室中，在此冷却室中液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]；1998；第71卷；第140-142页；Marcel Dekker[马塞尔·德克尔公司])。所获得的产品是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产品。此外，US 4,016,040和US 4,713,245是与此技术有关的文献；

f)混合造粒产品，其中将液体添加至例如常用造粒组分的干燥粉末组合物中，经由液体或粉末或二者引入该酶。将液体和粉末混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。这样的方法描述于US 4,106,991和有关的文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机的此方法的特定产品中，将由作为酶的酶、填料和黏合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granulate)。经强化的粒子更加坚固，酶粉尘释放更少。

g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产品过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于(Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社])中；

h)流化床造粒，其涉及将颗粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷洒液体到流态化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着于其上并形成颗粒；

i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用其他已知的在饲料或洗涤剂工业中用于干燥颗粒的方法。干燥优选地在从25℃至90℃的产品温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在包衣之前含有少量的水。如果在过量水除去之前水敏性酶被包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心优选含有0.1％-10％w/w的水。

该核心可以包含另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。

核心可以包括黏合剂，例如合成聚合物、蜡、脂肪或碳水化合物。

核心通常作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。

在一个实施例中，该核心包含选自由以下组成的组的材料：盐(例如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或者糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作水性页硅酸铝)。在一个实施例中，该核心包含粘土矿物质，例如高岭石或高岭土。

该核心可以包含惰性粒子，其中酶被吸附到该惰性粒子之内，或者被施加(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。

该核心的直径可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以被至少一种包衣包围，例如以改善储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。任选的一种或多种包衣可以包括盐和/或蜡和/或面粉包衣或其他合适的包衣材料。

可以将该包衣按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、1％或5％)的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。

包衣优选地是至少0.1μm厚，特别是至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在一些实施例中，包衣的厚度低于100μm，例如低于60μm或低于40μm。

包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封或封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。层或包衣特别应在厚度上是均匀的。

该包衣可以进一步含有其他本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，例如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

该颗粒可以包含核心(其包含本发明的具有SOD活性的多肽)、一种或多种盐包衣和一种或多种蜡包衣。具有多个包衣的酶颗粒的实例示于WO 1993/07263、WO 1997/23606和WO 2016/149636中。

盐包衣可以包含按重量计至少60％的盐，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中这些细粒子是少于50μm，例如少于10μm或少于5μm)中添加。

盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃在100g水中至少0.1g的溶解度，优选至少0.5g/100g水，例如至少1g/100g水、例如至少5g/100g水。

该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、山梨酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别是，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，特别是超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。该盐包衣可以如WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034、WO 2006/034710、WO2008/017661、WO 2008/017659、WO 2000/020569、WO 2001/004279、WO 1997/05245、WO2000/01793、WO 2003/059086、WO 2003/059087、WO 2007/031483、WO 2007/031485、WO2007/044968、WO 2013/192043、WO 2014/014647和WO 2015/197719在所述或是如WO 2001/00042中所述的聚合物包衣。

合适的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2、乙酸镁、乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌和山梨酸锌。

该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，例如描述于WO 99/32595中。特定实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4.7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。

优选地，作为盐溶液施加该盐，例如使用流化床。

蜡包衣可以包含按重量计至少60％的蜡，例如按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

蜡的具体实例是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂油例如聚乙二醇(PEG)、甲基羟丙基纤维素(MHPC)、聚乙烯醇(PVA)、氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化大豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或二甘油酯，诸如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；以及脂肪酸，诸如氢化的线性长链脂肪酸及其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。

可以产生非粉尘颗粒，例如如美国专利号4,106,991和4,661,452中所披露，并且这些颗粒可以任选地通过本领域已知的方法来包衣。包衣材料可以是蜡状包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。合适的用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。

该颗粒可以进一步包含一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于更多颗粒中，确保酶的更均匀分布，并且还由于不同的粒度而减少不同酶的物理分离。用于产生多酶共颗粒的方法披露于ip.com公开内容IPCOM000200739D中。

动物饲料

动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪饮食可以如WO 01/58275的表B第2-3栏所指示来表征。鱼饮食可以如表B第4栏所示来表征。此外，此类鱼饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且另外包含如本文所述的一种或多种具有SOD活性的多肽。

此外或在(以上指示的粗蛋白含量的)替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在特定的实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275表B中的范围2、3、4或5(R.2-5)中的任一个内。

粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis[官方分析方法]第14版,Association of Official Analytical Chemists[官方分析化学家集],华盛顿特区)。

可代谢能量可以根据如下进行计算：NRC出版物Nutrient requirements inswine[猪的营养需求],第九次再版1988,subcommittee on swine nutrition,committeeon animal nutrition,board of agriculture,national research council.[美国国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会]National Academy Press[美国国家科学院出版社],华盛顿特区,第2-6页；以及European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs[欧洲家禽饲料能量值表],Spelderholt centre for poultry research andextension[斯克得霍特家禽研究与推广中心],7361DA贝克贝亨,荷兰.Grafisch bedrijfPonsen&looijen bv,瓦赫宁恩(Wageningen).ISBN 90-71463-12-5。

动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的饮食含量基于如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde vanvoedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7等饲料表来计算。

在特定的实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白质。

本发明的动物饲料组合物还可以含有动物性蛋白质，例如肉和骨粉、羽毛粉和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains with Solubles，DDGS)，通常量为0-30％。

在又另外的特定的实施例中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。

该动物饲料可以包含植物性蛋白质。在特定的实施例中，植物蛋白的蛋白含量是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(w/w)。植物性蛋白质可以衍生自植物性蛋白质来源，例如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉、油菜籽粉及其组合。

在特定的实施例中，植物性蛋白质来源是来自蝶形花科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆)的材料。在另一个特定的实施例中，植物性蛋白质来源是来自藜科的一种或多种植物(例如甜菜、糖甜菜、菠菜或藜麦)的材料。植物性蛋白质来源的其他实例是油菜籽和卷心菜。在另一个特定的实施例中，大豆是优选的植物性蛋白质来源。植物蛋白源的其他实例是谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。

可以将动物饮食制成例如粉状饲料(非丸粒化)或丸粒化饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。作为固体或液体酶配制品添加酶。例如，对于粉状饲料，在成分混合步骤前或期间可以添加固体或液体酶配制品。对于丸粒化饲料，在饲料成分步骤前或期间还可添加该(固体或液体)SOD/酶制剂。通常，液体酶制剂包含本发明的SOD，任选地伴随着多元醇，如甘油、乙二醇或丙二醇，并且是在丸粒化步骤后添加，如通过将该液体配制品喷涂至丸粒上。也可以将该SOD掺入饲料添加剂或预混物中。

在一个实施例中，组合物包含一种或多种另外的酶。在一个实施例中，组合物包含一种或多种微生物。在一个实施例中，组合物包含一种或多种维生素。在一个实施例中，组合物包含一种或多种矿物质。在一个实施例中，组合物包含一种或多种氨基酸。在一个实施例中，组合物包含一种或多种其他饲料成分。

在另一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种另外的酶。在一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种微生物。在一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种维生素。在一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽和一种或多种矿物质。在一个实施例中，组合物包含本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种氨基酸。在一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种其他饲料成分。

在另一个实施例中，组合物包含一种或多种本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种选自由以下组成的列表的组分：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分。

最终过氧化氢酶在饮食中的浓度是在下述范围内：100至1000mg酶蛋白/kg动物饲料，例如200至900mg、300至800mg、400至700mg、500至600mg酶蛋白/kg动物饲料，或这些区间的任何组合。

最终过氧化氢酶在饮食中的浓度也可以单位/kg饲料确定，其范围为100至3000单位/kg动物饲料，例如200至3000U/kg、300至2000U/kg、100至800U/kg、100至400U/kg、或这些区间的任何组合。

在另一个实施例中，本文描述的组合物任选地包括一种或多种用于改善饲料消化率的酶。酶可在来自NC-IUBMB，1992年的酶命名法(Enzyme Nomenclature)手册的基础上分类，还可以在以下网址参见ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为其提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database[ENZYME数据库],2000,Nucleic Acids Res[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，有时基于它们的分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。

因此，本发明的组合物还可以包含至少一种选自下组的其他酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.23)、酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.72)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)(EC 3.2.1.25)、植酸酶(EC 3.1.3.8，EC 3.1.3.26，EC 3.1.3.72)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC3.1.1.4)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、或其任何组合。

在另一个实施例中，该动物饲料可以包含一种或多种维生素，如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施例中，该动物饲料可以任选地包含一种或多种矿物质，如一种或多种痕量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。

通常，脂溶性维生素和水溶性维生素以及微量矿物质形成所谓的旨在添加到饲料中的预混合物的一部分，而巨量矿物质通常被分开地添加到饲料中。

脂溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的非限制性实例包括维生素C、维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、碘、硒和锌。

常量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、磷、钾和钠。

在一个实施例中，维生素的量按重量计为组合物的0.001％至10％。在一个实施例中，矿物质的量按重量计为组合物的0.001％至10％。

这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养需求意指应在饮食中提供指示浓度的这些组分。

在替代方案中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种意指一种或两种或三种或四种等直至所有十三种或直至所有十五种单独组分中的任一种、一种或多种。更特别地，此至少一种单独组分以提供在表A的第四栏、或第五栏、或第六栏指示的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包含在本发明的添加剂中。

在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种以下维生素，优选以提供落入下表1中所限定的范围之内(分别针对仔猪饮食和肉鸡饮食)的饲料中浓度。

在适合的实施例中，本发明涉及动物饲料和改善动物中一个或多个性能参数的方法，该方法包括向该动物施用包含一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该一个或多个性能参数选自由以下组成的组：欧洲生产效率因子(EPEF)、饲料转化率(FCR)、生长速率(GR)、体重增加(WG)、死亡率(MR)和群体均匀性(FU)。

实例1、2、3、和4支持这些特征。如通常所知，改善的FCR比对照FCR低。在特定的实施例中，与对照相比，该FCR改善了(即，减少了)至少1.0％，优选至少1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、或至少2.5％。

如本文所用，术语“死亡率”是指生长阶段结束时的活动物与最初包括在池中的动物数量的比率。可以基于鱼类激发试验进行确定，该试验包括两组受到特定鱼类病原体激发的鱼类，目的是引起未处理组中的动物死亡率达到40％至80％。然而，在以适当浓度/Kg饲料喂食至少两种根据本发明化合物的混合物的激发组中，与未处理组相比，死亡率降低至少5％，优选至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或至少50％。

表1：典型维生素推荐

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在一些实施例中，本发明涉及动物饲料和在动物中改善或增强免疫应答和/或减少炎症和/或用于调节肠道菌群的方法，该方法包括向该动物施用包含一种或多种具有超氧化物歧化酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂。

实例1支持这些特征，因为前两个特征与氧化应激密切相关。申请人测试的不同体外模型还表明，任选地与过氧化氢酶组合的SOD对于降低氧化应激/迸发非常有效。

热应激和氧化应激的失调作用也有助于维持肠道完整性和功能。因此，本发明还支持对肠道菌群，特别是微生物肠道菌群的积极调节。

如本文所用，术语“肠道”是指胃肠或消化道(还称为消化管(alimentarycanal))，并且它是指多细胞动物中的器官系统，该器官系统摄取食物，将其消化以提取能量和营养，并且排出剩余的废弃物。

如本文所用，术语肠道“微生物菌群”是指自然微生物培养物，该自然微生物培养物居住在肠道中并且通过适当地帮助消化来维持健康。

如本文所用的与肠道微生物群相关的术语“调节”通常意指改变、操纵、调改或调整健康和正常功能动物的功能或状态，即非治疗用途。

如本文所用，术语“支持免疫系统功能”是指通过根据本发明的化合物获得的免疫刺激作用。

在第五和第六实施例中，本发明涉及减少或消除施用至动物饲料的抗生素的使用的方法，或减少动物体内活性氧或自由基的细胞标志物的方法，该方法包括向该动物施用包含一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂。实例1至4支持这些实施例。

在第七实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有超氧化物歧化酶(SOD)的多肽的动物饲料添加剂或动物饲料预混物，其中该饲料添加剂或预混物进一步包含

·一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽和/或

·一种或多种维生素，其中该一种或多种维生素优选地是脂溶性维生素，例如维生素E。

如实例1所示，这种预混物具有很强的抗氧化特性，并且可以任选地与硒组合使用，用作饲料和饲料预混物中的抗氧化剂，或作为动物饲料中抗生素的替代品或部分替代品。

动物饲料的蛋白质来源选自由以下组成的组：大豆、野生大豆、菜豆、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、胡豆(蚕豆)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、卡诺拉、葵花籽、棉籽、油菜籽(油菜)或豌豆，或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)、葵花粉、棉籽粉、油菜籽粉、鱼粉、骨粉、羽毛粉、乳清、或其任何组合。

动物饲料的能量来源选自由以下组成的组：玉蜀黍、玉米、高粱、大麦、小麦、燕麦、稻、黑小麦、黑麦、甜菜、糖甜菜、菠菜、马铃薯、木薯、藜麦、卷心菜、柳枝稷、粟、珍珠粟、谷子，或处于其加工形式例如研磨的玉米、研磨的玉蜀黍、马铃薯淀粉、木薯淀粉、研磨的高粱、研磨的柳枝稷、研磨的粟、研磨的谷子、研磨的珍珠粟、或其任何组合。

在优选的实例中，动物饲料进一步包含一种或多种选自由以下组成的列表的组分：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分，如本文所述。

在另外的实施例中，本发明涉及包含一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽的动物饲料添加剂或动物饲料预混物，其中该饲料添加剂或预混物进一步包含

d.一种或多种具有超氧化物歧化酶活性的多肽和/或

e.一种或多种维生素，其中该一种或多种维生素优选地是脂溶性维生素，例如维生素E。

根据本发明的过氧化氢酶的优选实例是与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO 4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的多肽。

优选的动物饲料预混物(动物饲料添加剂)包含一种或多种具有过氧化氢酶活性的多肽、维生素E和任选地硒，并用作抗氧化剂，优选在饲料和饲料预混物中或作为动物饲料中抗生素的替代品或部分替代品。

商业维生素E和硒的实例是E50和SePlex(帝斯曼营养产品公司(DSMNutritional Products))。

酶配制品

在一个实施例中，该组合物是固体组合物，例如喷雾干燥组合物，该固体组合物包含本发明的具有过氧化氢酶活性的多肽和一种或多种选自由以下组成的列表的配制剂：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选实施例中，配制剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、硫酸镁和碳酸钙。

该颗粒可以包含核心(其包含本发明的具有过氧化氢酶活性的多肽)、一种或多种盐包衣和一种或多种蜡包衣。具有多个包衣的酶颗粒的实例示于WO 1993/07263、WO 1997/23606和WO 2016/149636中。

优选地，作为盐溶液施加该盐，例如使用流化床。

实例

实例1过氧化氢酶克隆和表达

菌株

使用购自英杰公司(赛默飞世尔公司(Thermofisher Inc.))的大肠杆菌Top-10菌株来繁殖本文的表达载体。

将米曲霉菌株MT3568(描述于WO 2015040159)用于表1中描述的基因的异源表达。

培养基

DAP4C培养基由以下构成：11g MgSO₄·7H₂O、1g KH₂PO₄、2.2g柠檬酸·H₂O、20g葡萄糖、10g麦芽糖、5.2g K₃PO₄·H₂O、0.5g酵母提取物、1.25g CaCO₃、0.5ml AMG痕量元素溶液和补足至1升的去离子水。高压灭菌后，向上述培养基的每400ml中添加3.3ml的20％乳酸(经高压灭菌)和9.3ml的50％(NH₄)₂HPO₄(经无菌过滤)。

AMG痕量元素溶液由以下构成：6.8g ZnCl₂、2.5g CuSO₄.5H₂O、0.24g NiCl₂·5H₂O、13.9g FeSO₄.7H2O、13.6g MnSO₄.5H₂O、3g柠檬酸·H₂O、以及补足至1000ml的去离子水。

LB板由以下构成：10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂、以及补足至1000ml的去离子水。

LB培养基由以下构成：1g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、和10g的氯化钠、以及补足至1000ml的去离子水。

COVE蔗糖板由以下构成：342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液、以及补足至1升的去离子水。通过高压灭菌来为培养基灭菌。对于MT3568的转化，当培养基冷却到60℃时，添加10mM乙酰胺。

如果是单一的转化体，用于分离的COVE-2板/管：30g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L纯净琼脂(Difco，目录号214220)。

COVE盐溶液由以下构成：26g的MgSO₄·7H₂O、26g的KCL、26g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1000ml的去离子水。

COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₄·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O、以及补足至1000ml的去离子水。

实例2：真菌过氧化氢酶的克隆、表达和发酵

过氧化氢酶基因来源于使用标准微生物分离技术从环境样品分离的真菌菌株。鉴别供体菌株HEAL7001，并基于ITS的DNA测序对分类进行指定(表1)。HEAL7060的供体真菌生物是疣枝弯孢，一种公开的菌株，其最初从非洲冈比亚共和国(The Gambian Republic，Africa)的禾草花序中分离出来。该菌株最初于1966年收集：Curvularia verruculosa[疣枝弯孢]Tandon和Bilgrami ex M.B.Ellis,Mycological Papers[真菌学论文]106:20(1966)。

通过QIAamp Dneasy试剂盒(凯杰公司，希尔登，德国)分离来自各个菌株的染色体DNA。使用Illumina技术将5μg的每个基因组DNA样品发送进行全基因组测序。基因组测序、随后的读段的装配、和基因发现(即基因功能的注释)对于本领域技术人员是已知的并且该服务也是可商购的。

BLAST分析了来自PFAM数据库家族PF00199和PF18011的推定的过氧化氢酶的基因组序列。该分析鉴定了个编码推定的过氧化氢酶的基因，这些基因随后被克隆并在米曲霉中重组表达。

通过PCR分别从上述分离的基因组DNA中扩增过氧化氢酶基因。根据制造商的说明书，通过用IN-FUSION^TMCF脱水克隆试剂盒(克隆技术实验室有限公司，山景城，加利福尼亚州，美国)连接，将纯化的PCR产物克隆到之前消化的pDau109中。质粒pDAu109及其使用在(WO 2005/042735)中描述。使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(描述于Strains[菌株]中)。对克隆基因进行测序并确认其与基因组序列中发现的相应基因相同，并通过Christensen等人,1988,Biotechnology[生物技术]6,1419-1422和WO 04/032648中描述的方法转化到米曲霉菌株MT3568(WO 11/057140)中。基于由表达载体中的选择性标记赋予的能力，在从原生质体再生期间选择转化体，以利用乙酰胺作为氮源，并且随后在选择下将这些转化体再分离。

通过在96孔深孔微量滴定板中在30℃在0.25ml或0.75ml体积的YPG培养基(WO05/066338)中或DAP-4C-1培养基(WO 12/103350)或两者中将转化体培养4天并通过SDS-PAGE监测肽表达来评估重组过氧化氢酶肽的产生。根据微孔板发酵中评估的表达产量，针对每个基因选择单个曲霉菌转化体。

基于这两个选择标准，将最好表达的转化体的孢子涂布于用于再分离的COVE-2板上，以分离单个菌落。然后将单个菌落涂布于COVE-2管上直到孢子形成。

为了更大规模地生产重组酶，将曲霉菌转化体在含有150ml的发酵培养基的500ml带挡板的烧瓶中培养。将表达过氧化氢酶肽的转化体在DAP-4C-1培养基中发酵(WO 12/103350)。将培养物在旋转台上以150RPM振荡4天，随后通过0.22um的过滤装置将培养液与细胞材料分离。

实例3：过氧化氢酶活性测定

来自牛肝脏的过氧化氢酶(酶委员会(EC)编号：1.11.1.6，CAS号：9001-05-2，分子量：250kDa)具有3524U/mg EP的活性。通过在240nm处检测到的H₂O₂还原来确定过氧化氢酶活性。首先，用MQ水和0.01％ Triton X-100以不同的稀释倍数稀释过氧化氢酶。将10μl酶样品、90μl活性缓冲液(K₂HPO₄/KH₂PO₄与终浓度为100mM PBS(pH7.0)混合)添加到50μl 0.2％ H₂O₂溶液(将30％H₂O₂在活性缓冲液中稀释至0.2％)中。在室温下，在240nm下测量混合物10分钟(间隔34秒，第一次读数前震荡)。将来自/>的商业过氧化氢酶、来自牛肝脏的过氧化氢酶(C1345)设定为参考。

这允许选择合适的酶剂量。

实例4：过氧化氢酶的胃稳定性测定

以人工胃液作为应激条件，测定胃稳定性。将具有适当稀释度的10μl过氧化氢酶添加到90μl应激缓冲液(100mM NaCI，0.0013MHCI，pH3.0)中。通过添加1.11mg/ml胃蛋白酶(来自猪胃粘膜，P7000，西格玛公司，474U/mg)制备具有胃蛋白酶的应激缓冲液作为pH3+胃蛋白酶缓冲液，并与10ul过氧化氢酶孵育。将混合物在37℃下在热混器中分别孵育0、30、60和90分钟。将从混合物中提取的10μl样品添加到90μl活性缓冲液中作为终止混合物。然后向100μl终止混合物中添加50μl 0.2％ H₂O₂溶液以测量吸光度。在室温下，在240nm下测量吸光度10分钟(间隔34秒，第一次读数前震荡)。可以通过OD相比于min来计算一个斜率，其代表了活性。将pH7.0时无应激条件下的活性设定为参考，并将应激条件下(pH3.0或pH3.0+胃蛋白酶)的残余活性与参考相比计算为相对稳定性。

实例5：预防维生素氧化

氧化还原酶SOD和CAT与Trolox相比的ROS解除效率的比较实验：SOD与Trolox的比较

为了比较SOD与Trolox相比的超氧化物解除效率，我们制备了一系列具有对Trolox的剂量应答，对SOD的剂量应答或对两者的剂量应答组合的样品。我们使用竞争性测定来测量Trolox、SOD或两者的组合解除超氧化物(由次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶生成，参见图2)的效率。剩余的超氧化物由自由基指示剂WST-1定量，自由基指示剂WST-1在与超氧化物反应时形成甲臜。该甲臜在450nm处吸收。

数据评估：SOD与Trolox的比较

对于每个孔，使用图2中概述的竞争性测定随时间在450nm处测量吸收。对于每个孔的动力学测量(仅为便于在图3A中显示NZ标准的剂量应答子集)，确定斜率并将其绘制为酶剂量的函数，即浓度或活性(图3B)。逻辑4参数函数用于SAS JMP16中以将逻辑函数拟合到数据。该函数用于计算达到与测定中给定Trolox样品相同的斜率所需的SOD的量(图3C)。图3C中线性部分的斜率描述了mg或单位酶含有多少克Trolox当量。对所有SOD候选物和为所有SOD候选物计算的mg或单位酶的Trolox当量进行该程序。

标准的动力学测量，其中在450nm处的Abs作为时间的函数进行测量。所获得的斜率绘制为酶剂量的函数(mg或单位)。使用4参数逻辑函数来描述数据。使用此函数和此关系计算达到与Trolox的给定量相同的超氧化物竞争的SOD的量。线性部分的这个图的斜率描述了mg或单位酶含有多少克Trolox当量。

表1：对于SOD和CAT酶的Trolox当量。

实验：CAT与Trolox的比较

为了比较CAT与Trolox相比的过氧化氢解除效率，我们制备了一系列具有对Trolox的剂量应答，对CAT的剂量应答或对两者的剂量应答组合的样品。我们使用竞争性测定来测量Trolox、CAT或两者的组合解除过氧化氢的效率。过氧化氢酶或Trolox可以将过氧化氢降解成水和氧气：2H2O2→2H2O+O2。剩余的过氧化物通过与过氧化物酶(POD)和ABTSred的偶联反应中形成的ABTSox来定量。

数据评估：

对于每个样品，剩余的过氧化物通过ABTSox的形成来定量，ABTSox在450nm处吸收。在450nm处的吸收绘制为酶剂量的函数，即，浓度或活性。逻辑4参数函数用于SAS JMP16中以将逻辑函数拟合到数据。该函数用于计算达到与测定中给定Trolox样品在450nm处相同的吸收所需的CAT的量。斜率描述了mg或单位酶含有多少克Trolox当量，并且这用于计算mg或单位酶的Trolox当量。

结论：SOD和/或CAT与Trolox的比较

SOD在解除超氧化物方面的效率比Trolox高得多。CAT在解除过氧化氢方面的效率比Trolox高得多。在腔中，SOD和CAT解除超氧化物和过氧化氢，并且因此保护Trolox和维生素E。因此，维生素可以全身完整地吸收，并且在进入细胞膜时发挥其抗氧化作用。

实例6：预防脂质氧化

通过氧化还原酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)保护脂质免受活性氧类的影响

在所有实验中，所用的过氧化氢酶是SEQ ID NO:6，且所用的SOD是SEQ ID NO:28。

ROS可以由氧气作为代谢/呼吸副产物或通过其他因素形成，例如热、辐射(UV，电离)、干旱、盐度、寒冷、病原体防御、营养素缺乏、金属毒性、毒素、异生素和污染物。脂肪酸和脂质(像例如多不饱和脂肪酸)易受ROS破坏。当多不饱和脂肪酸与氧气自由基反应时，它形成脂质自由基。这种脂质自由基可以进一步反应以形成过氧自由基。在明确定义的链式反应中，过氧自由基最终成为丙二醛(MDA)，这是脂质氧化的指纹。

当与硫代巴比妥酸(TBA)反应时，MDA可以通过所得TBARS产品的吸收和荧光进行定量。吸收和荧光信号的强度与待分析样品中存在的MDA成正比。我们使用试剂盒来定量脂质过氧化，其中MDA与(TBA)反应以形成比色(532nm)/荧光(λ_ex＝532/λ_em＝553nm)产品，与存在的MDA成比例。根据已知MDA浓度的标准曲线，确定样品的MDA含量。

实验

测试了过氧化氢和超氧化物对游离脂肪酸α-亚麻酸(ALA)的影响。此外，分别测试了过氧化氢酶和超氧化物歧化酶是否可以保护游离脂肪酸α-亚麻酸(ALA)免受过氧化氢或超氧化物的氧化/过氧化。

制备以下反应混合物(pH＝8，总体积＝500μl)，并且在30℃下孵育2小时和24小时，然后使用MDA定量试剂盒定量脂质过氧化：

低浓度的α-亚麻酸样品：

i.0,5μg/μLα-亚麻酸

ii.0,5μg/μLα-亚麻酸+0.145％(w/v)H2O2

iii.0,5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)

iv.0,5μg/μLα-亚麻酸+0.145％(w/v)H2O2+100U/mL CATv.0,5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)+1.818U/mL SOD

vi.0,5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)+1.818U/mL SOD+100U/mL CAT

通过试剂盒测定的MDA定量结果(低浓度的α-亚麻酸)显示在图5中。(条形遵循序列i.-vi.，然后再次重复i.–vi.)

高浓度的α-亚麻酸样品：

i.5μg/μLα-亚麻酸

ii.5μg/μLα-亚麻酸+0.145％(w/v)H2O2

iii.5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)

iv.5μg/μLα-亚麻酸+0.145％(w/v)H2O2+100U/mL CAT

v.5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)+1.818U/mL SOD

vi.5μg/μLα-亚麻酸+0.102mM次黄嘌呤/0.0013U/mL黄嘌呤氧化酶(超氧化物生成系统)+1.818U/mL SOD+100U/mL CAT

通过试剂盒测定的MDA定量结果(低浓度的α-亚麻酸)显示在图6中。(条形遵循序列i.-vi.，然后再次重复i.–vi.)

结论

0,5μg/μLα-亚麻酸和2小时反应(图5，左侧)：当α-亚麻酸在存在过氧化氢的情况下孵育时，与α-亚麻酸对照相比，MDA的量增加并且因此脂质氧化增加。除过氧化氢外添加CAT时，脂质氧化与α-亚麻酸对照相当或甚至略低，因此显示CAT对过氧化氢具有良好的保护作用。当使用超氧化物作为应激物(通过次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统形成)时，观察到类似的情况。与α-亚麻酸对照相比，超氧化物会导致更多的脂质氧化(和MDA形成)。当在超氧化物上添加SOD时，α-亚麻酸受到保护，并且MDA水平与α-亚麻酸对照大致相当且低于α-亚麻酸+超氧化物样品。

0,5μg/μLα-亚麻酸和24小时反应(图5，右侧)：当α-亚麻酸在存在过氧化氢的情况下孵育时，与α-亚麻酸对照相比，MDA的量增加并且因此脂质氧化增加。除过氧化氢外添加CAT时，脂质氧化甚至低于α-亚麻酸对照，因此显示CAT对过氧化氢具有良好的保护作用。当使用超氧化物作为应激物(通过次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统形成)时，观察到类似的情况。与α-亚麻酸对照相比，它会导致更多的脂质氧化(和MDA定量)。当在超氧化物上添加SOD或SOD和CAT时，α-亚麻酸受到保护，并且MDA水平与α-亚麻酸对照相当/略低。

5μg/μLα-亚麻酸和2小时反应(图6，左侧)：当α-亚麻酸在存在过氧化氢的情况下孵育时，与α-亚麻酸对照相比，MDA的量增加并且因此脂质氧化增加。除过氧化氢外添加CAT时，脂质氧化甚至低于α-亚麻酸对照，因此显示CAT对过氧化氢具有良好的保护作用。当使用超氧化物作为应激物(通过次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统形成)时，观察到类似的情况。与α-亚麻酸对照相比，它会导致更多的脂质氧化(和MDA定量)。当在超氧化物上添加SOD或SOD和CAT时，α-亚麻酸受到保护，并且MDA水平略低于α-亚麻酸对照。

5μg/μLα-亚麻酸和24小时反应(图6，右侧)：与2小时孵育相比，脂质氧化要高得多。此外，过氧化氢和超氧化物的添加几乎不影响荧光量，并且因此也不影响脂质氧化。

实例7-预防蛋白质氧化

7.1保护rHSA免受超氧化物和过氧化氢的影响。

实验

制作了六个样品，每个样品的最终rHSA浓度为1mg/ml。下面列出了样品的组合物。将所有样品孵育60分钟。

1.样品1(T1.3)用作未经修饰的rHSA的对照。

2.样品2(T2.3)含有rHSA和ROS过氧化氢(0.01％(w/v))

3.样品3(T3.3)含有rHSA、ROS过氧化氢(0.01％(w/v))和100U/mL过氧化氢酶

4.样品4(T4.3)含有rHSA、和来自次黄嘌呤(0.112mM)的黄嘌呤氧化酶(0.0014U/mL)生成的ROS超氧化物

5.样品5(T5.3)含有rHSA、来自次黄嘌呤(0.112mM)和10U/mL超氧化物岐化酶的黄嘌呤氧化酶(0.0014U/mL)生成的ROS超氧化物。

6.样品6(T6.3)含有rHSA、来自次黄嘌呤(0.112mM)、10U/mL超氧化物岐化酶和100U/mL过氧化氢酶的黄嘌呤氧化酶(0.0014U/mL)生成的ROS超氧化物。

结论

rHSA被过氧化氢(+78Da)修饰。rHSA进一步被来自次黄嘌呤的黄嘌呤氧化酶生成的超氧化物(+43Da)修饰。超氧化物岐化酶预防rHSA的这种43道尔顿超氧化物修饰。

7.2过氧化氢酶的保护

如美国专利4,106,991，实例1中所述的制备包含单独过氧化氢酶、单独超氧化物歧化酶及其组合的颗粒。使用的过氧化氢酶是以商品名Terminox^TM(SEQ ID NO：6)出售的来自橙色嗜热子囊菌的具有过氧化氢酶活性的多肽。

过氧化氢酶颗粒

将具有以下组成的粉末混合物

1200g 纤维素，Arbocel BC200

1200g 高岭土

11693g 研磨的Na₂SO₄

在混合器FM 50中用由以下组成的造粒液造粒：

900g 蔗糖

14g 过氧化氢酶浓缩物

1942g 水

将颗粒在流化床干燥器中干燥至含水量小于1％并过筛以获得具有250至850微米的粒度的产物。

包含超氧化物岐化酶的颗粒

将具有以下组成的粉末混合物

960g纤维素，Arbocel BC200

1540g糊精，高岭土

8867g磨碎的Na₂SO₄

在混合器FM 50中用由以下组成的造粒液造粒：

480g糊精

1331g含有SEQ ID No:1的多肽的超氧化物岐化酶浓缩物

242g水

将颗粒在流化床干燥器中干燥至含水量小于1％并过筛以获得具有250至1200微米的粒度的产物。

过氧化氢酶和超氧化物岐化酶共颗粒

将具有以下组成的粉末混合物

960g 纤维素，Arbocel BC200

960g 高岭土

957g 喷雾干燥的超氧化物岐化酶

8036g 研磨的Na₂SO₄

在混合器FM 50中用由以下组成的造粒液造粒：

720g 糊精

1926g 含有SEQ ID No:1的多肽的超氧化物岐化酶浓缩物

3g 含有SEQ ID No:6的多肽的过氧化氢酶浓缩物

将颗粒置于实验室规模的蒸箱中，其中将它们暴露在95℃的温度和95％的相对湿度下，调节时间为90秒。

实例说明即使是本发明的过氧化氢，也提供了对过氧化氢酶的稳定影响。实例是用本发明的SOD进行的，并且显示出对过氧化氢酶的高稳定影响。

实例8–预防哺乳动物细胞氧化的SOD和过氧化氢酶

8.1：基于细胞的体外系统，通过氧化还原酶超氧化物歧化酶(SOD)生成活性氧类并中和。

细胞系：

1)HD11/k7(鸡巨噬细胞样细胞，注意包括NFKB-Luc报告基因)，

2)IPECJ2(生猪肠上皮细胞)

超氧化物生成：

1)PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)，PKC激活物经由NADPH氧化酶生成超氧化物。

2)HX+XO：次黄嘌呤(HX)和黄嘌呤氧化酶的细胞外添加。

超氧化物监测：WST1还原，A450读数增加

SOD：HEAL-7057-6

实验1(ELN-21-LNHS-105)：

将HD11/k7鸡巨噬细胞暴露于指定剂量的PMA以生成ROS。添加SOD，并且通过WST-1的细胞外还原监测ROS的水平。

通过还原WST1测量的超氧化物的生成导致在450nm处的吸光度增加：

1.将种子细胞置于孔板中过夜，并且进行PMA处理以生成超氧化物。

2.用WST-1(取出PMA)在具有和不具有HBSS中的SOD的96孔中重新接种细胞。

3.OD每20分钟一次，持续8小时。

结论：PMA生成的超氧化物被SOD中和，从而降低了细胞的氧化程度。

8-12：将培养为融合单层的IPECJ2细胞暴露于通过添加次黄嘌呤(1mM)以及增加黄嘌呤氧化酶的单位生成的超氧化物。以8U/ml添加SOD

实验概述的方案。

1.将IPEC-J2细胞接种在96孔中4天(单层)

2.用HX和XO和WST-1处理细胞

3.测量4小时OD

结论：HX+XO系统可以在IPECJ2细胞上生成超氧化物。超氧化物的生成随着XO水平的增加而增加。这损害细胞。这种损害通过SOD降低。

8.3通过过氧化氢酶(CAT，HEAL-7009-4)保护IPEC-J2细胞免受活性氧类过氧化氢的有害影响将IPECJ2细胞暴露于2mM H2O2以及增加单位的过氧化氢酶。

实验概述的方案。

4.将IPEC-J2细胞接种在96孔中4天(单层)

5.首先用过氧化氢酶处理细胞，然后用过氧化氢处理

6.测量8小时OD

结论：暴露于H2O2导致单层融合的快速丧失，这可以通过与过氧化氢酶孵育来保护。

从结果可以得出结论，在热湿处理期间SOD的存在稳定了过氧化氢酶。使用的过氧化氢酶是以商品名Terminox^TM(SEQ ID NO：6)出售的来自橙色嗜热子囊菌的具有过氧化氢酶活性的多肽。

Claims

1.一种保存动物饲料或动物饲料添加剂的方法，该方法包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂，其中所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

2.根据权利要求1所述的保存动物饲料或动物饲料添加剂的方法，其中所述动物饲料或动物饲料添加剂是在有氧条件下的。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中与不存在包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合的防腐剂的动物饲料或动物饲料添加剂相比，施加至所述动物饲料或动物饲料添加剂中的化学防腐剂的水平降低，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，该方法进一步包括一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒、和碘，优选地一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素C、维生素E、维生素K和硒。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与不存在包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合的防腐剂的动物饲料或动物饲料添加剂相比，施加至所述动物饲料或动物饲料添加剂中的化学防腐剂的水平降低，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，其中该化学防腐剂选自丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自包含以下的组：分类为EC 1.11.1.6过氧化氢酶的多肽以及分类为EP 1.11.1.21过氧化氢酶过氧化物酶的多肽。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自真菌。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、柄篮状菌、樟绒枝霉、Crassicarpon thermophilum、埃默森青霉、Thermomucorindicae-seudaticae、喜热梭孢壳、疣枝弯孢、Mycothermus thermophilus、草酸青霉菌、透明嗜热腐质霉、坚脆嗜热子囊菌、澳洲梭孢壳、赫卡尼亚梭孢壳和粗糙脉孢菌。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉和烟曲霉。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌和黑曲霉，优选地橙色嗜热子囊菌。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自由以下组成的组

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自由以下组成的组

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述具有超氧化物岐化酶活性的多肽获得自、可获得自或来源自奥氏蜜环菌、日本曲霉、里氏木霉和坦普利科拉曲霉。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽选自由具有以下的多肽组成的组：

15.一种保存的动物饲料组合物，该组合物包含在有氧条件下储存的饲料谷物，所述组合物包含防腐剂，所述防腐剂包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

16.根据权利要求15所述的保存的动物饲料组合物，该组合物包含与不存在包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合的防腐剂的动物饲料或动物饲料添加剂相比，降低水平的化学防腐剂，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

17.根据权利要求15或16所述的保存的动物饲料组合物，该组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒、和碘，优选地一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素C、维生素E、维生素K和硒。

18.根据权利要求15至17所述的保存的动物饲料组合物，该组合物包含降低水平的化学防腐剂，该化学防腐剂选自丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉，例如保存的动物饲料组合物基本上不含丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

19.根据权利要求15至18所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自包含以下的组：分类为EC 1.11.1.6过氧化氢酶的多肽以及分类为EP1.11.1.21过氧化氢酶过氧化物酶的多肽。

20.根据权利要求15至19所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自真菌。

21.根据权利要求15至20所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、柄篮状菌、樟绒枝霉、Crassicarpon thermophilum、埃默森青霉、Thermomucor indicae-seudaticae、喜热梭孢壳、疣枝弯孢、Mycothermusthermophilus、草酸青霉菌、透明嗜热腐质霉、坚脆嗜热子囊菌、澳洲梭孢壳、赫卡尼亚梭孢壳和粗糙脉孢菌。

22.根据权利要求15至21所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌、黑曲霉、迟缓曲霉、杂色曲霉和烟曲霉。

23.根据权利要求15至22所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽获得自或可获得自或来源自选自由以下组成的组的真菌：橙色嗜热子囊菌和黑曲霉，优选地橙色嗜热子囊菌。

24.根据权利要求15至23所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自由以下组成的组

25.根据权利要求15至24所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有过氧化氢酶活性的多肽选自由以下组成的组

26.根据权利要求15至25所述的保存的动物饲料组合物，其中所述具有超氧化物岐化酶活性的多肽获得自、可获得自或来源自奥氏蜜环菌、日本曲霉、里氏木霉和坦普利科拉曲霉。

27.根据权利要求26所述的保存的动物饲料组合物，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽选自由具有以下的多肽组成的组：

28.具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于保存动物饲料或动物饲料添加剂的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括向所述饲料或饲料添加剂中施加防腐剂。

29.具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合用于预防在动物饲料组分中含有的脂肪和脂质的降解的用途，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，该用途包括将防腐剂施加至所述动物饲料或所述动物饲料中的动物饲料添加剂或饲料成分中。

30.一种饲料防腐剂组合物，该组合物包含具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的；

并且该组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的抗氧化剂：维生素A、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、类胡萝卜素(例如虾青素、角黄素……)、硫胺素、核黄素、尼克酸、吡哆醇、生物素、必需脂肪酸、精油、甲硫氨酸、铁、锌、锰、铜、硒和碘，其中所述饲料防腐剂组合物基本上不含丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基苯甲醚(BHA)和乙氧基喹啉。

31.一种保存饲料或饲料添加剂中的组分的方法，该方法包括将防腐剂施加至所述饲料或饲料添加剂中，其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的，其中该饲料或饲料添加剂的组分选自由以下组成的组：维生素、蛋白质和脂质。

32.选自由以下组成的组的酶用于减少或预防动物的肠细胞的坏死或细胞凋亡的用途：具有过氧化氢酶活性的多肽、具有超氧化物岐化酶活性的多肽、或具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。

33.一种预防组合物或所述组合物的组分的氧化降解的方法，该方法包括使用防腐剂

其中所述防腐剂包含选自由以下组成的组的多肽：具有过氧化氢酶活性的多肽；具有超氧化物岐化酶活性的多肽；以及具有过氧化氢酶活性的多肽和具有超氧化物岐化酶活性的多肽的组合，其中该具有超氧化物岐化酶活性的多肽是真菌来源的。