CN116445403A - 一种扩增人Breg细胞的滋养层细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种扩增人Breg细胞的滋养层细胞及其应用。本发明提供的滋养层细胞为NIH‑3T3细胞，表达的细胞因子包括CD40L、IL‑21、BAFF。本发明基于滋养层细胞NIH‑3T3来进行Breg细胞的激活和扩增，扩增后的Breg细胞表现出良好的活性，提高了其安全性，具有理想的杀伤数据。本发明提供的滋养层细胞‑NIH‑3T3细胞可以有效地进行工程化改造，以表达各种Breg细胞激活分子从而使Breg细胞的纯度范围控制85‑90%左右。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种扩增人Breg细胞的滋养层细胞及其应用。
背景技术
成熟B细胞在生发中心的抗原刺激下，发生体细胞高频突变和抗体的亲和力成熟，进一步分化为终末阶段——分泌特异性抗体的浆细胞，参与了体液免疫反应。调节性B细胞是发现的一类具有免疫抑制功能的B细胞亚群，参与维持机体免疫稳态，并且在各种免疫病理过程中如自身免疫疾病、肿瘤免疫反应、移植免疫耐受、感染及变态反应中发挥着重要调节作用，
在特定的免疫微环境中，未成熟B细胞、初始B细胞和浆细胞均可被诱导分化为具有免疫抑制功能的Breg。Breg既可以通过分泌细胞因子（IL-10、TGF-β和IL-35等）抑制免疫反应，也可以通过与靶细胞膜表面分子（FasL、GITRL和PD-L1等）的相互作用调节免疫应答。大量的动物实验和临床研究发现，Breg的表型和功能在生理状态和病理过程中呈现着多样性，即Breg是目前还没有以细胞表面标记确定其功能的一群细胞。有研究发现低剂量的B细胞活化因子（BAFF）可诱导初始B细胞分化为具有分泌IL-10能力的CD1d+CD5+Breg，进一步的机制研究发现，B细胞膜表面的TACI受体介导了BAFF诱导的Breg分化，并且这群Breg具有MZ B细胞的表型。
初始B细胞膜表面的CD40与其配体CD40L的结合介导了初始B细胞的激活和分化。其机制之一是通过激活CD40从而诱导大量过渡期B细胞分泌IL-10。在正常人外周血B细胞中，CD40激活也可诱导初始B细胞中STAT3通路的活化和大量的IL-10分泌。
虽然Breg具有多样的表型，并且Breg的表面标志物有可能在炎症微环境刺激的状态下发生改变，但分泌抑炎性细胞因子IL-10是Breg的主要特征之一，研究发现，多种不同表型的Breg均可分泌IL-10而发挥调节功能。因此，通过对严重自体免疫患者的Breg细胞进行体外扩增和回输，可能会对疾病的治疗产生积极的作用。
现有技术中Breg细胞扩增方法得到的Breg细胞，从其杀伤数据以及临床表现来看，Breg细胞的活性还有较大的提升空间。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种扩增人Breg细胞的滋养层细胞，该滋养层细胞具有更高的活性。
本发明还提供了一种上述滋养层细胞在扩增人Breg细胞中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种滋养层细胞，所述滋养层细胞为NIH-3T3细胞，表达的细胞因子包括CD40L、IL-21、BAFF。
进一步的，所述CD40L包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述IL-21包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述BAFF包括如SEQID NO:7所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种细胞因子质粒，所述细胞因子质粒为CD40L编码序列、IL-21编码序列和BAFF编码序列的组合。
本发明的另一目的为提供了一种含有上述细胞因子质粒的细胞因子慢病毒，所述细胞因子慢病毒是由细胞因子慢病毒载体和辅助质粒共同导入哺乳动物细胞后所得；所述哺乳动物细胞为293FT细胞。
优选的，本发明所提供的滋养层细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）构建上述细胞因子慢病毒载体，与辅助质粒共同导入哺乳动物细胞，得到上述细胞因子慢病毒；
（2）将获得的细胞因子慢病毒侵染宿主细胞，进行转导，得到滋养层细胞。
本发明还提供了一种上述滋养层细胞、细胞因子质粒、细胞因子慢病毒在扩增人Breg细胞中的应用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明基于滋养层细胞NIH-3T3来进行Breg细胞的激活和扩增，扩增后的Breg细胞表现出良好的活性，提高了其安全性，具有理想的杀伤数据。
（2）本发明提供的滋养层细胞-NIH-3T3细胞可以有效地进行工程化改造，以表达各种Breg细胞激活分子从而使Breg细胞的纯度范围控制85-90%左右。
附图说明
图1为本发明所述的NIH-3T3-CD40L/IL-21/BAFF片段修饰示意。
图2为CD40L、IL-21、BAFF质粒成功构建琼脂糖凝胶电泳图。
图3为NIH-3T3细胞内各种细胞因子的表达情况。
图4为Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制、Th1、Th17、Treg表达检测结果。
图5为Breg细胞与CD4+T细胞共培养检测IL-10、INF-γ结果。
图6为基因重组NIH-3T3细胞的建立流程示意图。
图7为Breg细胞的诱导扩增示意图。
具体实施方式
本申请提供一种滋养层细胞，所述滋养层细胞表达细胞因子，所述细胞因子包括CD40L、IL-21、BAFF具体的，所述滋养层细胞为NIH-3T3细胞。其中，所述CD40L包括如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。所述IL-21包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。所述BAFF包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
本申请还提供一种细胞因子质粒，所述慢病毒用于制备上述滋养层细胞。具体的，所述质粒包括CD40L编码序列、IL-21编码序列、BAFF编码序列任意一种或至少两种的组合。
另外，本申请还提供一种细胞因子慢病毒，所述细胞因子慢病毒包括上述细胞因子慢病毒载体。具体的，所述细胞因子慢病毒由上述细胞因子慢病毒和辅助质粒共同导入哺乳动物细胞后得到；所述哺乳动物细胞包括293FT细胞。
本申请提供一种上述滋养层细胞的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：构建上述细胞因子慢病毒，与辅助质粒共同导入哺乳动物细胞，得到上述细胞因子慢病毒；将获得的细胞因子慢病毒侵染宿主细胞，进行转导，得到滋养层细胞。
本申请提供一种上述滋养层细胞的培养基，所述Breg细胞培养基还包括基础培养液、血清、或抗生素中的任意一种或至少两种的组合。
本申请是基于滋养层细胞NIH-3T3来进行Breg细胞的激活和扩增，扩增后的Breg细胞表现出良好的严重自体免疫患者疾病治疗、和较好的安全性。另外，NIH-3T3作为异种来源的细胞，其本身就是Breg细胞的靶细胞，会被高细胞毒性的Breg细胞清除，即便不经过辐照也无因残留引发的安全性问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
分别提供了一种细胞因子慢病毒的构建方法。其区别之处在于制备的细胞因子慢病毒中细胞因子的种类不同。具体操作步骤如下：
（1）获取细胞因子的编码序列信息，设计引物并由第三方公司进行引物合成；
（2）克隆细胞因子的编码区域，并经酶切，转化，经测序正确后，摇菌、提取，获得细胞因子质粒；其中，细胞因子编码序列信息的获取途径为NCBI数据库；编号1-3对应的细胞因子种类、及其编码序列信息、及其对应的引物信息如表1所示。
表1各细胞因子的编码序列信息及其对应的引物信息
；
其中：
SEQ ID NO:2 TTATCCTTGCTGAACTGTGA
SEQ ID NO:3 TTACTGTTGGCTTCGCTTA
SEQ ID NO:5 CCTTGTCTGTCTGGTAGTC
SEQ ID NO:6 CGAGGTCAATGATGAATGTC
SEQ ID NO:8 TACAGCCAGGTTCTATACAC
SEQ ID NO:9 CGAGTAGCAGGAATTGTTG
本发明提供了一种细胞因子慢病毒的生产方法
（1）慢病毒转染：培养293FT细胞，DMEM+ 10% FBS，37℃，5%CO2。待细胞稳定传代后，将细胞接种至6孔板中，每孔1×106细胞，按照磷酸钙法转染IL-21质粒、CD40L质粒、BAFF质粒。转染24小时后将293FT吹打制成单细胞悬液，转染IL-21质粒、CD40L质粒、BAFF质粒，细胞取1×106，染相应抗体，室温避光孵育15min、300g离心5min，沉淀用200mL PBS重悬后上机检测；
（2）慢病毒制备：将所述携带有目的基因的IL-21质粒、CD40L质粒、BAFF质粒、pCMV载体和pMD 2G载体混合后转染到293FT细胞中，转染后6小时更换为含10%FBS和1%谷氨酰胺的DMEM完全培养基培养，48小时后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45mm滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒溶液，浓缩将获得的沉淀用DMEM（含FBS）培养基重悬，获得携带细胞因子基因的慢病毒，冻存于-80℃冰箱，备用。
图2为CD40L、IL-21、BAFF质粒成功构建琼脂糖凝胶电泳图。从图2得知：已成功构建CD40L、IL-21、BAFF质粒。
表2 对应细胞因子慢病毒
本制备例提供了一种包括3种细胞因子的NIH-3T3滋养层细胞的制备方法，具体流程图如图6所示。3种细胞因子分别为CD40L、IL-21、BAFF。利用的3种细胞因子慢病毒分别为制备例1-3制备且经制编号4-6生产的CD40L慢病毒、IL-21慢病毒、BAFF慢病毒，获得最适合的重组NIH-3T3滋养细胞。
（3）滋养细胞制备：将购买的NIH3T3小鼠成纤维细胞，用含10%FBS和1%谷氨酰胺的DMEM完全培养基培养，细胞按照4×105个/孔接种于6孔板的孔中，按照MOI=5加入浓缩后的重组的CD40L慢病毒、IL-21慢病毒、BAFF慢病毒溶液；同时加入终浓度为500U/mLIL-2和4ug/mL polybrene，混匀，37℃ 5%CO2，培养6小时，换液含10%FBS和1%谷氨酰胺的DMEM完全培养基培养，继续培养48小时；
单克隆筛选细胞系，步骤如下：
（1）根据有限稀释法，将感染表达IL-21、CD40L和BAFF的NIH-3T3细胞稀释至3个/孔、1个/孔、0.3个/孔，接种到96孔板中，37℃ 5% CO2进行培养；
（2）3周后统计有阳性细胞的孔数，4周后在有克隆的孔中取2×105细胞，同时取2×105个NIH-3T3正常细胞，作为阴性对照。分别染PEIL-21、CD40L、BAFF，室温避光孵育15min、400g离心5min，沉淀用200ml PBS重悬后上机检测；
图3为NIH-3T3细胞内各种细胞因子的表达情况。从图3得知：NIH-3T3细胞内CD40L表达量98.8%，IL-21表达量97.4%，BAFF表达量98.2%，滋养层细胞构建成功。
NIH-3T3-IL-21-CD40L-BAFF滋养层细胞的辐照，步骤如下：
（1）使用DMEM（含10%FBS）培养基扩大培养该滋养层细胞，直至细胞数量达到可以进行实验即可；
（2）使用0.25%胰酶将该滋养层细胞消化起来，使用完全培养基进行重悬，并用120Gy剂量的γ射线进行辐照，以备后续实验。
Breg细胞的分离培养
采用磁珠分选方法获得外周血中的初始B细胞（CD19+）。提取外周血或脐血中PBMC，具体步骤如下：
（1）用50 ml注射器将血液从集血袋中吸出，置于50ml离心管，升6降4，1200 rpm离心10 min；
（2）小心吸取上层血浆，将下层的血与生理盐水按1：1混匀；
（3）按2：1比例小心滴加到ficoll的上层，升6降4，1200 rpm离心20 min；
（4）离心完成后，小心弃去上层上清液，小心吸取中间白膜层，尽量不要吸到红细胞。将吸取的白膜层加入到生理盐水中洗涤，升9降9，1200 rpm离心10 min，重复一次。细胞计数，得到PBMC。
使用CD19 mAb包被的磁珠与分离的PBMC结合，缓冲液洗去未结合的磁珠后，使用免疫磁珠细胞分选系统（MACS）对PBMC中CD19+的B细胞进行阳性筛选，具体步骤如下：
（1）将所得到的PBMC以升9降9，300 g离心5 min，加入分选缓冲液重悬细胞，可以选用30 um的尼龙网过滤（避免阻塞柱子，过滤前先用分选缓冲液润湿过滤器）；
（2）细胞计数，4 ℃，300 g离心10 min，缓冲液定容80 ul/107个细胞；
（3）加入磁珠标记鼠抗人单抗CD19 7 ul，混匀，冰浴10 min4 ℃，300 g离心10min，弃去上清；
（4）分选缓冲液重悬细胞，定容到500 ul/108个细胞；
（5）准备好分离柱（置于磁场中），500 ul MS缓冲液清洗柱子。把细胞悬液倒入柱子中，弃去流出细胞到新管中；
（6）重复过三次柱子。去除磁场后500 ul缓冲液清洗柱子，收集洗脱的细胞；
（7）细胞缓冲液洗重悬细胞，4 ℃，300 g离心10 min，定容1 ml/107个细胞；
（8）取少量细胞加入PerCP/Cy5.5 -CD19避光孵育20 min，PBS清洗2-3遍，流式检测纯度。
Breg细胞的诱导扩增
重组NIH-3T3细胞与初始B细胞共培养，前期培养添加外源IL-4，使Breg前体细胞成熟为能分泌IL-10的Breg细胞，后期培养使用NIH-3T3细胞与外源IL-21，用以扩增Breg细胞。
具体方法如图7所示：
(1)将辐照后的NIH-3T3滋养层细胞复苏于10cm组织培养皿中，初始细胞数为3x106个，随后加入5x105个经过纯化的初始B细胞，使用RPMI-1640培养基进行培养，其中包括10％FBS、M2-ME、HEPES20mmol/L、丙酮酸钠1mM、青霉素、链霉素以及IL-450ng/ml，诱导培养4天；
(2)第4天时，将培养液中的B细胞收集离心，重新接种于含新的5x105个滋养层细胞的10cm组织培养皿中，使用RPMI-1640培养基进行培养，10％FBS、M2-ME、HEPES20mmol/L、丙酮酸钠1mM、青霉素、链霉素以及IL-4，诱导培养5天；
(3)在第4天及第9天收集细胞时，分别用台盼蓝进行染色检测活率。
效果验证
（一）Breg细胞体外功能验证
CFSE染色CD4+T细胞
（1）常规密度梯度离心法分离PBMC或脐血单个核；
（2）采用CD4+T 细胞分选试剂盒按说明分选CD4+T细胞；
（3）24h后离心收集T细胞，调整细胞密度为1×106/ml，加入CFSE 染色；
（4）37℃孵育30min后，加入5倍体积的预冷的培养基冰上孵育5min终止；
（5）离心细胞，并用新鲜的预冷培养基洗涤细胞3遍；
（6）收集细胞并用T细胞培养基重悬为单细胞悬液。
（二）Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制作用
采用CFSE标记的CD3、CD28激活的CD4+T细胞与Breg细胞共培养
（1）将CFSE染色的T细胞加入CD3、CD28、IL-2激活培养；
（2）计数后调整细胞密度为1×105/ml，每孔100ul铺96孔板；
（3）按照Breg细胞与T细胞的比例为1:5、1:10加入Breg细胞进行72小时共培养；
（4）流式检测细胞判断Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制强度，Th1、Th17、Treg表达检测结果；
从图4得知： Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制，在效靶比为1:5时Th1抑制率为73.97%，在效靶比为1:10时，Th1抑制率为56.85%；Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制，在效靶比为1:5时Th17抑制率为84.38%，在效靶比为1:10时，Th17抑制率为79.46%； Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制，在效靶比为1:5时Treg促进率：191.78%，在效靶比为1:10时，Treg促进率38.36%；
（5）实验分组：未活化的CD4+T 细胞对照组、CD3、CD28抗体活化 CD4+T 细胞组、CD3、CD28抗体活化CD4+T 细胞与CD19+IL-10 Breg细胞共培养实验组。每组设置3复孔。
（三）ELISA检测共培养上清中IL-10、IFN-r的表达情况
按照Breg细胞与T细胞的比例为1:5、1:10加入Breg细胞进行72小时共培养。收集以上各组培养上清，按照ELISA试剂盒的步骤进行上清中IL-10、IFN-r分泌表达情况的检测。具体步骤如下：
（1）取培养皿中的培养基1 ml，300 g离心后取上清液；
（2）ELISA试剂盒中标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，在小试管中进行稀释；
（3）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加第一步中得到的上清稀释液10 µl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
（4）温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min；
（5）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
（6）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干；
（7）加酶：每孔加入酶标试剂50 µl，空白孔除外；
（8）温育：操作同（4）；洗涤：操作同（6）；
（9）显色：每孔先加入显色剂A 50 µl，再加入显色剂B 50 µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；
（10）终止：每孔加终止液50 µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；
（11）测定：以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；
图5为Breg细胞与CD4+T细胞共培养检测IL-10、INF-γ结果。
从图5得知： Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制：在效靶比为1:5时IL-10浓度为121（pg/ml），在效靶比为1:10时IL-10浓度为65（pg/ml）。Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制：在效靶比为1:5时INF-γ表达量为0.82，在效靶比为1:10时INF-γ表达量为0.23，
结果与讨论
从图2得知：已成功构建CD40L、IL-21、BAFF质粒。从图3得知：成功挑选的的滋养层细胞单克隆细胞NIH-3T3细胞内CD40L表达量98.8%，IL-21表达量97.4%，BAFF表达量98.2%，滋养层细胞构建成功；在从图4得知： Breg细胞对CD4+T细胞增殖的抑制在效靶比为1:5时Th1抑制率为73.97%， Th17抑制率为84.38%，Treg促进率：191.78%。从图5得知：在效靶比为1:5时INF-γ表达量为0.90，IL-10浓度为121（pg/ml）。
本发明是开发一种基因重组的NIH-3T3细胞，通过与经磁珠筛选的初始B细胞养，产生的Breg细胞在1:5对CD4+T细胞增殖的有抑制作用，抑制率为h1抑制率为73.97%， Th17抑制率为84.38%。
本发明是开发一种基因重组的NIH-3T3细胞，通过与经磁珠筛选的初始B细胞共培养，用于体外激活扩增Breg细胞，扩增后的Breg细胞可在体外培养较长时间且表现出 良好的抑制能力活性。本申请较比使K562滋养层细胞更加安全。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种滋养层细胞，其特征在于，所述滋养层细胞为NIH-3T3细胞，表达的细胞因子包括CD40L、IL-21、BAFF。
2.根据权利要求1所述的滋养层细胞，其特征在于，所述CD40L包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述IL-21包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述BAFF包括如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
3.一种细胞因子质粒，其特征在于，所述细胞因子质粒为CD40L编码序列、IL-21编码序列和BAFF编码序列的组合。
4.一种含有权利要求3所述的细胞因子质粒的细胞因子慢病毒，其特征在于，所述细胞因子慢病毒是由细胞因子慢病毒载体和辅助质粒共同导入哺乳动物细胞后所得；所述哺乳动物细胞为293FT细胞。
5.一种权利要求1或2所述的滋养层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建上述细胞因子慢病毒载体，与辅助质粒共同导入哺乳动物细胞，得到上述细胞因子慢病毒；
（2）将获得的细胞因子慢病毒侵染宿主细胞，进行转导，得到滋养层细胞。
6.一种如权利要求1或2所述的滋养层细胞、权利要求3所述的细胞因子质粒、权利要求4所述的细胞因子慢病毒在扩增人Breg细胞中的应用。
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2022
- 2022-12-23 CN CN202211661780.5A patent/CN116445403A/zh active Pending
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