CN116445397A - 用于胚胎体外培养的培养方法及用于该方法的培养基和培养体系 - Google Patents
用于胚胎体外培养的培养方法及用于该方法的培养基和培养体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于胚胎体外培养的培养方法及用于该方法的培养基和培养体系。本发明提供的培养方法包括如下步骤:(i)将基质胶、支持细胞和培养基混合后静置;(ii)待步骤(i)中的基质胶凝固后,加入所述基质胶与所述培养基的混合液,并加入待培养物质,静置;(iii)加入所述培养基,进行培养,并每隔12~36h更换1/4~3/4步骤(iii)中加入的所述培养基。该培养方法是一种3D“三明治”式的培养方法,其可以将待培养物质包裹在培养环境中,并使得支持细胞和待培养物质之间可以相互交流,并且其可以成功实现E3.5至E7.5小鼠胚胎或多能干细胞或类器官的三维培养。
Description
技术领域
本发明属于生物材料培养技术领域,具体涉及用于胚胎体外培养的培养方法及用于该方法的培养基和培养体系。
背景技术
胚胎在母体子宫内极其精密复杂的发育过程涉及多个水平调控。受精后受精卵经历数次卵裂产生卵裂球,随后形成胚胎与胚外组织两个谱系,指导卵裂球命运(NatProtoc.2014Dec;9(12):2732-9)。在卵裂过程中,桑葚胚逐渐发育为一个中空的细胞球,即囊胚;而在哺乳动物胚胎发育过程中,一个关键性步骤就是囊胚植入母体子宫壁,为随后的正常发育奠定基础。哺乳动物胚胎在植入母体子宫后不久就确定了身体发育规划(Nature.2021May;593(7857):119-124),但由于此时胚胎位于子宫内无法直接观察,以及获得早期胚胎的方法存在困难,人们对胚胎的研究与操作在很大程度上受到了限制(Science.2020Apr 10;368(6487):181-186)。
目前已经建立数种胚胎的体外培养体系,包括80%加热灭活雄性大鼠血清和20%汉克斯平衡盐溶液混合的大鼠血清培养体系、N2/B27培养基(Methods Mol Biol.2019;1965:187-194,Biochem Biophys Res Commun.2015Dec 25;468(4):813-9)、在鸡血浆凝块上培养小鼠胚胎的静态培养系统(Nature.1963Jul 20;199:297-9)、在循环器中观察并培养胚胎的循环培养系统(JEmbryol Exp Morphol.1967Jun;17(3):513-25),和与电子气体调节模块融合的滚轮培养系统(Nature.2021May;593(7857):119-124)。目前建立的体外培养着床后小鼠胚胎的稳定系统,已经实现从前原肠胚阶段(E5.5)发育到高级器官发生阶段(E11)。但上述培养体系相对简化,目前仍无法在体外完全模拟子宫内环境。
此外,由于胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)相对容易获得与处理的特性,人们开始探索体外培养干细胞的方法与系统,并基于胚胎干细胞(ESCs)及其他多能干细胞建立多种类胚胎如拟胚体(embryoid bodies,EBs)(Cell Stem Cell.2008Nov 6;3(5):508-18,J Vis Exp.2015Nov24;(105):53252)、类原肠胚(gastruloids)(J VisExp.2015Nov 24;(105):53252,Development.2014Nov;141(22):4231-42),ETX胚胎(NatCell Biol.2018Aug;20(8):979-989),EPS-类囊胚(Cell.2019Oct 17;179(3):687-702.e18,Dev Cell.2019Dec 16;51(6):698-712.e8),iETX胚胎(Dev Cell.2021Feb8;56(3):366-382.e9),ETiX胚胎(Nature.2022Oct;610(7930):143-153),EiTiX胚胎(CellStem Cell.2022Oct 6;29(10):1445-1458.e8)等。但这些模型未能概括胚胎和胚胎外组织之间的相互作用,从而无法代表胚胎在体内的整体发育情况。
体内胚胎在子宫内膜分泌的各种因子刺激下进行一系列连续而复杂的发育。胚胎着床需要子宫内膜与胚胎的同步发育,子宫内膜细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)可以作用于囊胚的滋养外胚层(trophectoderm,TE),增强TE球体的粘附和侵袭能力,在促进胚胎着床方面发挥了重要的作用(Proteomics.2019Dec;19(23):e1800423,Mol HumReprod.2020Jul1;26(7):510-520)。此外,后续的胚胎发育过程,如胎盘形成,还依赖于新生血管的出现,即血管形成(Nat Med.1997Apr;3(4):443-6)。着床时,小鼠胚胎滋养层巨细胞集体迁移穿过子宫间质,表达血管受体、配体和粘附分子,与母体毛细血管接触,开始血管化(Dev Biol.2001Nov 1;239(1):161-75,Dev Cell.2021Dec 6;56(23):3276-3287.e8)。子宫内膜间充质细胞(endometrial mesenchymal stromal cells,endMSCs)是一种多能细胞,可以促进再生,但与来自endMSCs的EVs(EV-endMSCs)共培养的小鼠胚胎仅表现为卵裂球数量的增加,其囊胚的发育并没有受到影响(PLoS One.2018Apr23;13(4):e0196080)。
综上,现有的胚胎体外培养体系与胚胎模型都只是对体内发育环境和过程的简化,仍无法在体外完全模拟子宫内环境,包括胚胎着床过程中子宫内膜分泌因子起到的作用和血管化过程,因此尽管已存在稳定的着床后小鼠胚胎从前原肠胚阶段(E5.5)发育到高级器官发生阶段(E11)体外培养系统,但小鼠胚胎囊胚期(E3.5)至原肠胚阶段(E7.5)并继续后续发育的技术瓶颈仍难以突破(Nature.2021 May;593(7857):119-124)。虽然当前最先进的着床后发育模型是类原肠胚(Science.2020 Dec 11;370(6522):eaba4937),但这些模型未能概括胚胎和胚胎外组织之间信号通路的时空相互作用,未能完全捕捉到胚胎整个发育规划的复杂的信号和形态事件。由于类原肠胚并不能代表完整的胚胎结构,用此类模型进行完善胚胎体外发育条件的研究仍有一定的局限性。
因此,建立稳定的、能够模拟小鼠胚胎整个植入阶段的子宫内环境的胚胎体外培养方法和体系,使小鼠囊胚在体外发育至原肠胚阶段,对研究小鼠胚胎乃至人胚的发育及微环境因子对其的调控机制具有重要意义。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的,例如目前胚胎的体外培养系统和模型无法在体外完全模拟子宫内环境,小鼠胚胎囊胚期(E3.5)至原肠胚阶段(E7.5)的培养并继续后续发育方面存在技术瓶颈等问题,本发明提供了用于胚胎体外培养的培养方法和用于该方法的培养基和培养体系,从而有利于囊胚早期(E3.5)至原肠胚期(E7.5)的小鼠胚胎的生长发育,突破了技术瓶颈,为后续深入研究胚胎着床这一关键过程中的物理和分子机制提供帮助。
用于解决问题的方案
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明提供了如下技术方案:
本发明第一方面提供了一种培养方法,所述方法包括如下步骤:
(i)将基质胶、支持细胞和培养基混合后静置;
(ii)待步骤(i)中的基质胶凝固后,加入所述基质胶与所述培养基的混合液,并加入待培养物质,静置;
(iii)加入所述培养基,进行培养,并每隔12~36h更换1/4~3/4步骤(iii)中加入的所述培养基。
进一步地,所述待培养物质包括哺乳动物胚胎、人多能干细胞或人的类器官;
优选地,所述哺乳动物胚胎包括小鼠胚胎;
可选地,所述小鼠胚胎包括E3.5至E7.5的小鼠胚胎。
进一步地,所述支持细胞包含hPPSCs和hUVECs。
进一步地,在所述步骤(i)中,所述hPPSCs和hUVECs在所述步骤(i)最终得到的混合物中的含量各自独立的为(3.0~3.5)×105个细胞/mL。
进一步地,在所述步骤(i)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为(6~8):5。
进一步地,在所述步骤(ii)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为1:(3~5)。
进一步地,所述步骤(i)中所述基质胶与所述培养基的总体积,与所述步骤(ii)中所述基质胶与所述培养基的总体积,和所述步骤(iii)中所述培养基的总体积的比例为(0.5~1.5):(0.5~1.5):(1~3)。
进一步地,在所述步骤(i)和所述步骤(ii)中,所述静置的时间各自独立的为15~25min。
本发明第二方面提供了一种培养体系,所述培养体系用于本发明第一方面提供的培养方法;
优选地,所述培养体系包含:
含有基质胶、支持细胞和培养基的底层成分,
和位于底层成分上层的含有待培养物质、基质胶和培养基的中层成分,
和位于中层成分上层的含有培养基的上层成分。
本发明第三方面提供了一种培养基,所述培养基用于本发明第一方面提供培养方法或用于制备本发明第二方面提供的培养体系;
优选地,所述培养基包含如下成分:马血清、N-2添加剂、B-27添加剂、高糖DMEM、羟乙基呱嗪乙硫磺酸、GlutaMax、青霉素-链霉素、MEM非必需氨基酸溶液、2-巯基乙醇、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、β-雌二醇、黄体酮和N-乙酰-L-半胱氨酸。
发明的效果
通过上述技术方案的实施,本发明取得了如下技术效果:
首先,本发明提供了一种培养方法,该培养方法是一种3D“三明治”式的培养方法,其可以将待培养物质包裹在培养环境中,并使得支持细胞和待培养物质之间可以相互交流。实验数据显示本发明提供的培养方法突破了将囊胚早期(E3.5)小鼠胚胎体外培养至原肠胚期(E7.5)的技术瓶颈,培养后的胚胎能表达相应阶段的胚胎细胞标记物,经体内移植后能够植入子宫,该培养方法能够模拟在小鼠胚胎整个植入阶段的子宫内环境,从而允许我们更加深入研究胚胎着床这一关键过程中的物理和分子机制。
进一步,本发明提供了用于上述培养方法的培养体系,其是一种3D“三明治”体外培养体系,其中,基质胶(Matrigel)的加入可以保证支持细胞hPPSCs和hUVECs与胚胎、胚胎与胚胎之间的相互交流、作用,同时,实验数据显示hPPSCs和hUVECs的加入显著提高了胚胎的大小,细胞数量,发育率和伸长率。
再进一步,本发明提供了用于上述培养方法和培养体系的培养基,其能够用于着床期胚胎的体外培养,特别是用于囊胚早期(E3.5)至原肠胚期(E7.5)的小鼠胚胎的体外培养,其中马血清、N-2添加剂和B-27添加剂的应用更有利于该阶段胚胎的生长发育。
同时,本发明提供的上述培养方法、培养体系和培养基不仅可用于小鼠胚胎,还可用于人多能干细胞以及其他人的类器官的培养。
附图说明
图1A为小鼠胚胎从E3.5发育至E7.5的3D“三明治”胚胎体外培养方案示意图。
图1B为人EBs发育至类原肠胚的3D“三明治”胚胎体外培养方案示意图。
图2A为hPPSCs和hUVECs在显微镜下的明场照片。
图2B为hPPSCs的标志物荧光检测结果
图2C为mCherry标记hPPSCs和EGFP标记hUVECs共培养的荧光观察结果。
图3A为在IVCM组或IVCM+Cells组体外培养小鼠胚胎E3.5至E6.5的胚胎明场图像,比例尺50μm。
图3B为IVCM组或IVCM+Cells组小鼠E5.5胚胎的免疫荧光图像;其中,a为Oct4检测结果,b为Nanog检测结果;比例尺200μm。
图3C为比较IVCM组和IVCM+Cells组小鼠E5.5胚胎中各阳性细胞的比例结果;其中,a为Oct4+细胞比较结果,b为Nanog+细胞比较结果;各组n=11-23,P<0.05为有统计学意义。
图3D为小鼠E5.5胚胎体内移植4天后的代孕鼠子宫情况;其中,a为IVCM组,无胚胎着床,移植胚胎数15个;b为IVCM+Cells组,可见7个胚胎着床点,移植胚胎数15个;比例尺=1mm。
图4A为在IVCM组或IVCM+Cells组体外培养小鼠胚胎E3.5至E7.5过程中每12h胚胎正常发育率比较结果,每组N=5-23;P<0.05为有统计学意义。
图4B为在IVCM组或IVCM+Cells组体外培养小鼠胚胎E3.5至E7.5过程中每12h胚胎直径比较结果,每组N=5-23;P<0.05为有统计学意义。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明,但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成,在发明请求保护的范围内可以进行各种变更,而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
在本发明中,使用“数值A~数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
在本发明中,使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。
在本发明中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中,“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生,并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在本发明中,术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”,也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
在本发明中,术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时,“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的,排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在本发明中,术语“约”可以表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此,除非另有明确的说明,应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处,“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的±10%、±5%、±1%或±0.5%之内。
除非另有定义,本发明所用的其他技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
以下对本发明提供的技术方案进行更具体的说明:
培养方法
本发明提供了一种培养方法,主要用于体外培养包括哺乳动物的胚胎、人多能干细胞或人的类器官,优选用于体外培养包括小鼠的胚胎、人多能干细胞或人的类器官。
在一些具体的实施方案中,本发明提供的培养方法用于体外培养小鼠着床期的胚胎,例如E3.5至E7.5的小鼠胚胎。本发明提供的培养方法突破了将囊胚早期(E3.5)小鼠胚胎体外培养至原肠胚期(E7.5)的技术瓶颈,实验数据显示培养后的胚胎能表达相应阶段的胚胎细胞标记物,经体内移植后能够植入子宫,该培养方法能够模拟在小鼠胚胎整个植入阶段的子宫内环境,从而允许我们更加深入研究胚胎着床这一关键过程中的物理和分子机制。
进一步地,在一些具体的实施方案中,所述培养方法包括如下步骤:
(i)将基质胶、支持细胞和培养基混合后静置;
(ii)待步骤(i)中的基质胶凝固后,加入所述基质胶与所述培养基的混合液,并加入待培养物质,静置;
(iii)加入所述培养基,进行培养,并每隔12~36h更换1/4~3/4步骤(iii)中加入的所述培养基。
在一些具体的实施方案中,所述支持细胞包含hPPSCs和hUVECs;其中,hPPSCs全称为人胎盘周围血管干细胞(human placenta perivascular stemcells),hUVECs全称为人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells),hPPSCs和hUVECs如图2A所示。所述hPPSCs共表达CD248,CD276和CD44,同时,hPPSCs还表达α-SMA,NG2,CD140b,CD105,CD90和CD73(如图2B所示),但不表达CD34,CD31和vWF。所述hPPSCs可以从人足月分娩后无传染及遗传性疾病胎盘中利用血管周干细胞培养基培养得到。所述hPPSCs及其具体获取方法可以参照专利申请CN202310362085.7中所示出的内容,上述专利的全部内容通过引用并入本申请。所述hUVECs可以从人脐静脉中分离得到,也可以购买市售成品。mCherry标记hPPSCs和EGFP标记hUVECs共培养的荧光观察结果如图2C所示。
进一步地,在一些实施方案中,在所述步骤(i)中,所述hPPSCs和hUVECs在所述步骤(i)最终得到的混合物中的含量各自独立的为(3.0~3.5)×105个细胞/mL,优选均为3.3×105个细胞/mL。
本发明通过在体外培养过程中加入支持细胞,特别是hPPSCs和hUVECs,显著提高了待培养物质如小鼠胚胎的大小,细胞数量,发育率和伸长率。
为了更好的保证支持细胞所在环境的稳定性,以便支持细胞与待培养物质之间能够有效的交流,在一些具体的实施方案中,在所述步骤(i)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为(6~8):5,优选为7:5。
同样,为了保证待培养物质所在环境的稳定性,在一些具体的实施方案中,在所述步骤(ii)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为1:(3~5),优选为1:4。
为了更好地起到体外培养作用,并方便更换新鲜培养基,在一些实施方案中,所述步骤(i)中所述基质胶与所述培养基的总体积,与所述步骤(ii)中所述基质胶与所述培养基的总体积,和所述步骤(iii)中所述培养基的总体积的比例为(0.5~1.5):(0.5~1.5):(1~3),优选比例为1.2:1:2。
为了避免有害物质积累,并及时补充充足的营养物质,在一些具体的实施方案中,在所述步骤(iii)中,进行培养时,每隔24h更换1/2新鲜的所述步骤(iii)中加入的培养基。
为了使培养方法获得更好的培养效果,在一些具体的实施方案中,所述步骤(i)和所述步骤(ii)中所述静置的时间各自独立的为15~25min。
培养体系
本发明提供了一种培养体系,其主要用于上述培养方法。
在一些具体的实施方案中,所述培养体系包含:含有基质胶、支持细胞和培养基的底层成分,和位于底层成分上层的含有待培养物质、基质胶和培养基的中层成分,和位于中层成分上层的含有培养基的上层成分。
本发明提供的培养体系是一种3D“三明治”培养体系,由基质胶、支持细胞等构建的血管化微环境能显著促进着床期胚胎的发育,其中基质胶(Matrigel)的加入可以保证支持细胞与待培养物质之间以及待培养物质自身之间的相互交流和作用。
为了更好地起到体外培养作用,并方便更换新鲜培养基,在一些实施方案中,所述底层成分中所述基质胶与所述培养基的总体积,与所述中层成分中所述基质胶与所述培养基的总体积,和所述上层成分中所述培养基的总体积的比例为(0.5~1.5):(0.5~1.5):(1~3);优选比例为1.2:1:2。
在一些具体的实施方案中,所述底层成分由基质胶、支持细胞和所述培养基组成。
对于培养体系中使用的支持细胞,如培养方法部分所述。
在一些具体的实施方案中,所述支持细胞包含hPPSCs和hUVECs。
进一步地,在一些实施方案中,所述hPPSCs和hUVECs在所述底层成分中的含量各自独立的为(3.0~3.5)×105个细胞/mL,优选均为3.3×105个细胞/mL。
本发明通过在培养体系中添加支持细胞,特别是hPPSCs和hUVECs,显著提高了待培养物质如小鼠胚胎的大小,细胞数量,发育率和伸长率。
为了更好的保证底层成分的稳定性,在一些具体的实施方案中,在所述底层成分中,所述基质胶与所述培养基的体积比为(6~8):5,优选为7:5。
在一些具体的实施方案中,所述中层成分由待培养物质、基质胶和所述培养基组成。
为了增加中层成分的稳定性,在一些具体的实施方案中,在所述中层成分中,所述基质胶与所述培养基的体积比为1:(3~5),优选为1:4。
同时,本发明还提供了所述培养体系的制备方法,其包括如下步骤:
配制底层成分的步骤:将所述基质胶、所述支持细胞和所述培养基混合后静置,即得所述底层成分;
配制中层成分的步骤:待所述底层成分中的所述基质胶凝固后,加入所述基质胶与所述培养基的混合液,并加入待培养物质,静置,即得所述中层成分;
配置上层成分的步骤:加入所述培养基,即得所述上层成分。
为了使底层成分和中层成分更好的凝固稳定,在一些具体的实施方案中,所述配制底层成分的步骤和所述配制中层成分的步骤中所述静置的时间各自独立的为15~25min,优选为20min。
培养基
本发明提供了一种培养基,其主要用于上述培养方法或用于构建上述培养体系。
在一些具体的实施方案中,所述培养基包含如下成分:马血清、N-2添加剂、B-27添加剂、高糖DMEM、羟乙基呱嗪乙硫磺酸、GlutaMax、青霉素-链霉素、MEM非必需氨基酸溶液、2-巯基乙醇、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、β-雌二醇、黄体酮和N-乙酰-L-半胱氨酸。
在本发明中,所述N-2添加剂是一种化学成分确定的无血清添加剂,可与DMEM培养基配合使用;所述B-27添加剂是一种经过优化的无血清添加剂,用于支持胚胎、出生后和成年海马及其他CNS神经元的低密度或高密度生长以及短期或长期存活;所述高糖DMEM包含碳水化合物、氨基酸、维生素、无机盐等营养物质,是经典的基础培养基;所述羟乙基呱嗪乙硫磺酸是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围;所述GlutaMax是L-谷氨酰胺的替代品,具有更好的稳定性,可改善细胞健康,与L-谷氨酰胺相比,GlutaMAX可显著减少有毒氨的积累,改善细胞活力和生长情况,并在很宽的温度范围内保持稳定;所述青霉素-链霉素对革兰阳性细菌和革兰阴性细菌具有有效的联合抗菌作用,可用于防止细胞培养受到细菌污染;所述MEM非必需氨基酸溶液用作细胞培养基的添加剂,可以提高细胞生长和活性,其具有与标准最小必需培养基(MEM)中相同的100×浓度非必需氨基酸;所述2-巯基乙醇是细胞培养基中用于防止氧自由基中毒的有效还原剂;所述胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇作为基础培养基补充剂,可以减少培养细胞所用的血清的量;胰岛素可促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂肪形成、细胞内运输以及蛋白和核酸的合成;转铁蛋白是一种铁载体,也有助于降低氧自由基和过氧化物的毒性水平;硒(以亚硒酸钠提供)是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白的一种辅因子,在培养基中用作抗氧化剂;乙醇胺是磷酸甘油酯的前体,对质膜和细胞器的结构至关重要;所述β-雌二醇是一种类固醇激素和主要的女性性激素,目前其可作为体外成熟培养基(IVM)中的一种补充剂;所述黄体酮是一种黄体分泌的类固醇激素,其可以诱导子宫内皮细胞的成熟和分泌活性;所述N-乙酰-L-半胱氨酸是一种粘液溶解剂,可用于减少粘液的厚度,同时其还是一种活性氧(ROS)抑制剂。
本发明对上述培养基中的各成分的来源不做特别限定,例如可以购买市售成品。
在一些具体的实施方案中,所述各成分在所述培养基中的浓度如下:高糖DMEM(Adamas life,C8013)和马血清(Gibco,26050088)1:3混合,添加成份有11mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)(Solarbio,H1095),2mM GlutaMax(Gibco,35050-061),1%(v/v)青霉素-链霉素(Penicillin Streptomycin)(Gibco,15140-122),100μM MEM非必需氨基酸溶液(MEMNEAA)(Gibco,11140-050),55μM 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)(Gibco,21985-023),1%(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(Gibco,51500-056),8nMβ-雌二醇(β-estradiol)(Sigma,HY-B0141),200ng/mL黄体酮(Progesterone)(Sigma,HY-N0437),25μMN-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)(Sigma,HY-B0215),0.25%(v/v)N-2添加剂(Gibco,17502048),1%(v/v)B-27添加剂(Gibco,17504044)。
同时,本发明还提供了所述培养基的制备方法,其包括将所述培养基的各成分混合的步骤。
在一些实施方案中,所述制备方法包括将各成分根据其各自溶解特性分类溶解后混合的步骤。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用材料或仪器除非特别说明,均为可以使用通过市购获得的常规产品。
实施例1:一种囊胚早期(E3.5)至原肠胚期(E7.5)小鼠胚胎的3D“三明治”体外培养方法
为证明hPPSCs和hUVECs对小鼠胚胎发育有支持作用,我们设有两种培养方式。对照组培养体系中底层不添加hPPSCs和hUVECs,称“IVCM组”,实验组培养体系中底层添加hPPSCs和hUVECs,称“IVCM+Cells组”。
实验动物:
6-7周雌性昆明(KM)小鼠,和11-12周雄性KM小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司,置于12小时光照与黑暗循环,19-22℃,充足水与饲料环境饲养。
1、IVCM培养基的配置
IVCM培养基(in vitro culture medium)包含组分为:高糖DMEM(Adamas life,C8013)和马血清(Gibco,26050088)1:3混合,添加成份有11mM羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)(Solarbio,H1095),2mM GlutaMax(Gibco,35050-061),1%(v/v)青霉素-链霉素(Penicillin Streptomycin)(Gibco,15140-122),100μM MEM非必需氨基酸溶液(MEMNEAA)(Gibco,11140-050),55μM 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)(Gibco,21985-023),1%(v/v)胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(Gibco,51500-056),8nMβ-雌二醇(β-estradiol)(Sigma,HY-B0141),200ng/mL黄体酮(Progesterone)(Sigma,HY-N0437),25μMN-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)(Sigma,HY-B0215),0.25%(v/v)N-2添加剂(Gibco,17502048),1%(v/v)B-27添加剂(Gibco,17504044)。
2、E3.5小鼠胚胎的体外培养
(1)在96孔板的一孔中加入35μl基质胶(Matrigel)(Corning,354277)与25μlIVCM培养基的混合液,以及密度都为3.3×105个细胞/mL的hPPSCs和hUVECs后,置入培养箱20min;
(2)Matrigel凝固后,加入10μl Matrigel与40μl已预热IVCM培养基的混合液,再加入获得的E3.5小鼠胚胎,置入培养箱孵育20min;
(3)加入100μl已预热IVCM培养基,置于5% CO2,37.5℃的恒温培养箱中培养,每24h上层更换半量新鲜IVCM培养基,4天后即可获得E7.5小鼠胚胎。
其中,IVCM组步骤(1)中不添加hPPSCs和hUVECs。
其中,使用的IVCM培养基即为前述方法制备的小鼠胚胎体外培养基。
其中,培养箱条件均为5% CO2,37.5℃恒温。
其中,获得E3.5小鼠胚胎的具体步骤为:KM雌鼠(6-7周)腹腔注射10U PMSG(宁波第二激素厂,110254564),48h后腹腔注射10U hCG(宁波第二激素厂,110251283)。将超排后的雌鼠与KM雄鼠1:1合笼,第二天早上检查阴道栓。见栓当天中午定义为性交后E0.5天,有阴道栓的雌鼠记为E0.5天胚胎供体鼠。3天后,颈椎脱臼法处死E3.5天胚胎供体鼠,打开腹腔,分离子宫,去除子宫系膜,取出带有输卵管子宫置于已预热的生理盐水(ZhejiangGuojing Pharmaceutical Co.,Ltd.,C21031704)中。剪去输卵管,立体显微镜下用27号注射器(Tansoole,02026616-TS069-004)从一侧子宫角近子宫颈处注射已预热的M2(EmdMillipore Corp,MR-015-D)。倒置显微镜下将冲出的胚胎用口吸管依次在M2微滴和IVCM微滴中各清洗3遍以洗去杂质。
上述步骤为具有三层结构的3D“三明治”胚胎体外培养方案。首先,25%高糖DMEM和75%马血清以及N2/B27等多种添加成分混合作为胚胎体外培养基(IVCM),通过与Matrigel以一定比例混合建立底层和中层的3D培养环境。hPPSCs和hUVECs作为支持细胞处于底层,E3.5小鼠囊胚在中层发育,上层仅添加IVCM为胚胎提供必需营养物质。培养2天后的E5.5胚胎移入子宫后可重新着床,E3.5胚胎在该体系下能发育至E7.5阶段,该培养方法还可用于人EBs发育至类原肠胚的培养。方案模式图如图1A和图1B所示。
3、经体外培养的小鼠胚胎的形态学检测及统计学分析
形态学检测和统计学分析的具体步骤如下:
(1)形态学检测:每12h在倒置显微镜下观察上述步骤(2)中培养的小鼠胚胎。
(2)统计学分析:本研究资料类型为定量资料,统计值以平均值±标准差表示。应用IBM SPSS Statistics 25对实验数据统计分析:首先用Skewness/S.E与Kurtosis/S.E检验样本数据的正态性,若同时满足比值<1.96则数据符合正态性;两样本比较使用成组T检验,α=0.05。多组独立样本比较,α=0.05,P>0.1判定为方差齐,数据满足正态性,独立性与方差齐性的基础上使用单因素方差分析;多组比较方差不齐使用秩和检验。P值以数值表示,P<0.05认为差异具有统计学意义,使用GraphPad Prism 8.0.1作图。胚胎发育率统计方法为自胚胎期(embryonic day(E))3.5胚胎种于基质胶起,每隔12h分别统计IVCM组与IVCM+Cells组胚胎的发育率。在倒置显微镜下,每次统计各组胚胎的总数及发育至相应阶段的胚胎个数(E3.5:早期囊胚(Early blastocyst),E4.0:Blastocyst(囊胚),E4.5:Lateblastocyst(晚期囊胚),E5.0:Epiblast rosette-like(玫瑰花样外胚层),E5.5:Eggcylinder-like(卵圆筒样结构),E6.0:Pregastrula-like(前原肠胚样结构),E6.5:Earlygastruloid(类原肠胚早期),E7.0:Mid gastruloid(类原肠胚中期),E7.5:Lategastruloid(类原肠胚晚期)(Nat Cell Biol.2018Aug;20(8):878-887,Nature.2021May;593(7857):119-124),计算胚胎发育率(胚胎发育率=发育至相应阶段的胚胎个数/胚胎的总数);伸长程度的量化方法为将明场视野下200×的胚胎导入ImageJ 1.53a(Java 1.8.0_112(64bit)),用直线工具测量胚胎的最长体轴作为胚胎的长度。然后根据时间点和条件绘制出所有胚胎的伸长率。
倒置显微镜下观察体外培养的小鼠胚胎,结果如图3A所示。在E5.0之前,两组胚胎均具有典型的囊胚形态,囊胚腔扩大显著,但IVCM+Cells组最终形成的囊胚腔显著大于IVCM组,胚胎细胞数也高于IVCM组。E5.0后,IVCM+Cells组胚胎经历管腔化并持续伸长,E5.5时形成蛋筒样结构,并从透明带中孵化出来,在E6.5时形成前羊膜腔,并打破原有对称性。IVCM组胚胎在E5.5时开始发育异常,胚胎逐渐萎缩,E6.5时崩解死亡。
统计两组对应时期胚胎发育率,结果显示,E5.0前两组胚胎发育率差异无统计学意义。IVCM+Cells组E5.0 epiblast rosette-like发育率比IVCM组高27.52%(n(IVCM)=10,n(IVCM+Cells)=22,P=0.000179),E5.5 egg cylinder-like发育率高出18.81%(n(IVCM)=11,n(IVCM+Cells)=22,P=0.000234),E6.0 pregastrula-like发育率高出30.75%(n(IVCM)=8,n(IVCM+Cells)=12,P=0.001961),E6.5 early gastruloid发育率高出44.15%(n(IVCM)=9,n(IVCM+Cells)=13,P<0.00001),E7.0 mid gastruloid发育率高出33.31%(n(IVCM)=5,n(IVCM+Cells)=8,P=0.002143),E7.5 late gastruloid发育率高出40.63%(n(IVCM)=5,n(IVCM+Cells)=9,P=0.000057),皆具有统计学意义(如图4A和表1所示)。
表1来自IVCM组和IVCM+Cells组胚胎的正常发育率
统计不同培养阶段的胚胎直径,可评估两种培养方案下小鼠胚胎的大小和伸长程度。E5.0及以前两组胚胎的直径差异无统计学意义,E5.0后IVCM+Cells组胚胎直径显著高于IVCM组。与IVCM组相比,IVCM+Cells组的胚胎直径在E5.5时高出11.11μm(n(IVCM)=11,n(IVCM+Cells)=23,P=0.032),在E6.0时高出20.85μm(n(IVCM)=7,n(IVCM+Cells)=12,P=0.000306),在E6.5时高出37.84μm(n(IVCM)=8,n(IVCM+Cells)=13,P<0.0001),在E7.0时高出40.92μm(n(IVCM)=5,n(IVCM+Cells)=8,P<0.0001),在E7.5时高出38.58μm(n(IVCM)=6,n(IVCM+Cells)=9,P<0.0001),皆具有统计学意义(如图4B所示)。
结果表明,培养方案支持E3.5-E7.5阶段的胚胎体外发育。并且hPPSCs和hUVECs这些支持细胞的存在显著提高小鼠胚胎的大小,细胞数量,发育率和伸长率。
4、经体外培养的E5.5小鼠胚胎的免疫表型检测
将上述步骤(2)获得的E5.5小鼠胚胎进行免疫荧光染色检测E5.5时期胚胎中Oct4,Nanog的表达情况,用以评估两种培养条件下胚胎的发育水平。
免疫荧光染色检测的具体步骤如下:将培养孔中的胚胎转移到60μl 1%(w/v)BSA(Beyotime,ST025-29g)微滴中。倒置显微镜下,用口吸管转移胚胎至1%(w/v)BSA微滴中洗去杂质,再转移到4%(v/v)多聚甲醛(Jiangsu Yonghua Fine Chemical Co.,Ltd.,30525-89-4)中固定20min,1%(w/v)BSA洗涤2次。在0.5%(v/v)Triton X-100(Sigma-aldrich,066K0089)通透1h后,1%(w/v)BSA清洗。一抗孵育1h后,1%(w/v)BSA洗涤2次。二抗避光孵育30min后,1%(w/v)BSA洗涤2次。在载玻片上滴加DAPI(Solarbio,S2110),将胚胎转移至其中后,盖上盖玻片,用指甲油封片,在湿盒中4℃避光保存。
其中,Rabbit anti-OCT4 Polyclonal Antibody(Thermofisher,PA5-27438)以1:200在1%(w/v)BSA中稀释,Rabbit anti-Nanog(Thermofisher,PA5-85110)以1:100的比例在1%(w/v)BSA中稀释,FITC Goat anti-Rabbit IgG(H+L)(Thermofisher,F-2765)以1:750的比例在1%(w/v)BSA中稀释。
在荧光倒置显微镜下观察,Oct4共染IVCM+Cells组胚胎11个,IVCM组胚胎23个,均为阳性(如图3Ba所示)。但在11个IVCM+Cells组胚胎和17个IVCM组胚胎中,Nanog仅在IVCM组胚胎中表达,IVCM+Cells组胚胎不表达Nanog或胚胎中仅有少数Nanog+细胞(如图3Bb所示)。
量化胚胎中Oct4+,Nanog+细胞的数量,对胚胎中Oct4+/DAPI+或Nanog+/DAPI+进行分析。统计结果显示,两组Oct4+细胞比例无显著差异(n(IVCM)=23,n(IVCM+Cells)=11,P>0.01)(如图3Ca所示),而与IVCM组胚胎相比,IVCM+Cells组Nanog+细胞比例显著下降(n(IVCM)=17,n(IVCM+Cells)=11,P<0.0001)(如图3Cb所示),Nanog表达量显著下调。
作为小鼠胚胎发育过程中的重要多能性蛋白,Oct4和Nanog的表达可以提示小鼠胚胎的发育情况。正常情况下,Oct4在着床阶段的胚胎中持续表达,而Nanog在E5.5胚胎中表达下调(Cell.2003May 30;113(5):643-55,Nature.2017Dec 14;552(7684):239-243)。因此,上述结果表明,IVCM组的胚胎持续表达Nanog,提示此时胚胎发育异常。而来自IVCM+Cells组的胚胎Nanog表达下调,说明在蛋白水平这些胚胎与E5.5自然胚胎更相似。
5、经体外培养的E5.5小鼠胚胎的体内发育能力检测
为了探究两种培养方案下胚胎的体内发育潜能,我们将培养2天的胚胎移植到E3.5假孕鼠子宫中,并在4天后解剖子宫。
胚胎体内移植的具体步骤如下:将超数排卵后的6-7周雌性KM小鼠与行输精管结扎术的11-12周雄性KM小鼠1:1合笼,第二天早上将有阴道栓的雌鼠记为E0.5天假孕鼠。3天后麻醉E3.5假孕鼠,暴露子宫。将体外培养至E5.5的胚胎从培养孔转移到M2微滴中。在倒置显微镜下,在M2微滴中清洗胚胎2次后,用口吸管将胚胎注射入假孕鼠的一侧已被27-G针头刺破的子宫角,并缝合肌肉切口与皮肤。在代孕鼠E7.5天取出连有卵巢的双角子宫并解剖,观察移植胚胎的着床和发育情况。
结果显示,15个移植的IVCM组胚胎都未在子宫内着床(如图3Da和表2所示),而将15个IVCM+Cells组胚胎移入子宫一侧后,子宫充血肿胀,移植侧子宫角出现7个着床点,胚胎着床率为46.67%(如图3Db和表2所示)。结果表明,仅在IVCM中培养的胚胎虽能发育至一定阶段,但胚胎在2天后已无法继续在子宫内着床,即已丧失部分发育潜能。而在此基础上添加hPPSCs和hUVECs的培养体系,能够模拟小鼠胚胎的早期发育环境,使经体外培养的胚胎在移植到子宫内后能重新植入子宫,并发育成一个完整个体,表现出在子宫内继续发育成完整个体的潜能。
表2来自IVCM组和IVCM+Cells组的胚胎体外移植结果
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Claims (10)
1.一种培养方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(i)将基质胶、支持细胞和培养基混合后静置;
(ii)待步骤(i)中的基质胶凝固后,加入所述基质胶与所述培养基的混合液,并加入待培养物质,静置;
(iii)加入所述培养基,进行培养,并每隔12~36h更换1/4~3/4步骤(iii)中加入的所述培养基。
2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述待培养物质包括哺乳动物胚胎、人多能干细胞或人的类器官;
优选地,所述哺乳动物胚胎包括小鼠胚胎;
可选地,所述小鼠胚胎包括E3.5至E7.5的小鼠胚胎。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法,其特征在于,所述支持细胞包含hPPSCs和hUVECs。
4.根据权利要求3所述的培养方法,其特征在于,在所述步骤(i)中,所述hPPSCs和hUVECs在所述步骤(i)最终得到的混合物中的含量各自独立的为(3.0~3.5)×105个细胞/mL。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的培养方法,其特征在于,在所述步骤(i)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为(6~8):5。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的培养方法,其特征在于,在所述步骤(ii)中,所述基质胶与所述培养基的用量的体积比为1:(3~5)。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的培养方法,其特征在于,所述步骤(i)中所述基质胶与所述培养基的总体积,与所述步骤(ii)中所述基质胶与所述培养基的总体积,和所述步骤(iii)中所述培养基的总体积的比例为(0.5~1.5):(0.5~1.5):(1~3)。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的培养方法,其特征在于,在所述步骤(i)和所述步骤(ii)中,所述静置的时间各自独立的为15~25min。
9.一种培养体系,其特征在于,所述培养体系用于根据权利要求1~8中任一项所述的培养方法;
优选地,所述培养体系包含:
含有基质胶、支持细胞和培养基的底层成分,
和位于底层成分上层的含有待培养物质、基质胶和培养基的中层成分,
和位于中层成分上层的含有培养基的上层成分。
10.一种培养基,其特征在于,所述培养基用于根据权利要求1~8中任一项所述的培养方法或用于制备根据权利要求9所述的培养体系;
优选地,所述培养基包含如下成分:马血清、N-2添加剂、B-27添加剂、高糖DMEM、羟乙基呱嗪乙硫磺酸、GlutaMax、青霉素-链霉素、MEM非必需氨基酸溶液、2-巯基乙醇、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、β-雌二醇、黄体酮和N-乙酰-L-半胱氨酸。
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2023
- 2023-06-02 CN CN202310651899.2A patent/CN116445397A/zh active Pending
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