CN116437952A - 具有缀合位点的t细胞调节多肽及其使用方法 - Google Patents

具有缀合位点的t细胞调节多肽及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供T细胞调节多肽(T细胞‑MP)，其包含化学缀合位点和至少一个免疫调节多肽序列，所述免疫调节多肽序列可经选择以展现与其同源共免疫调节多肽的降低的结合亲和力。所述未缀合T细胞‑MP可缀合于展示表位的分子，以形成T细胞‑MP‑表位缀合物。所述T‑细胞‑表位缀合物可用于调节对所述缀合表位具有特异性的T细胞的活性(例如，增加增殖或细胞毒性活性)，并且因此用作治疗剂。

Description

具有缀合位点的T细胞调节多肽及其使用方法
序列表并入
本申请含有经由EFS-web以电子方式提交的序列表，该序列表既可作为纸质副本，也可作为计算机可读形式(CRF)，并且由2021年7月13日创建的大小为641,516字节的名为“123640-8021US02_seqlist.txt”的档案组成，并且其以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
诱导适应性免疫反应的能力涉及存在于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)与小肽或非肽分子(例如，分子的表位，诸如多肽)的接合，该小肽或非肽分子由位于抗原呈递细胞(APC)表面上的主要组织相容性复合体(MHC；在人中也称为人白细胞抗原(HLA)复合体)呈递。此接合代表免疫系统的靶向机制且为用于T细胞调节(活化或抑制)和效应子功能的必不可少的分子相互作用。在表位特异性细胞靶向后，所靶向T细胞的反应由免疫调节分子(其中一些发现于APC表面上)的存在决定，所述分子通过与T细胞上的对应受体接合而起作用。需要两种信号——表位/TCR结合和免疫调节分子与T细胞上的其对应受体的接合—来驱动目标T细胞功能的活化或抑制。TCR对给定表位具有特异性；然而，免疫调节分子的对应受体不是表位特异性的，并且相反通常表达于所有T细胞或较大T细胞子集上。
发明内容
本发明提供T细胞调节多肽(一种“T细胞-MP”或多种“T细胞-MP”)，其尤其可用于体内、离体和体外治疗哺乳动物(例如，人)的各种疾病(例如，癌症、病毒感染和自身免疫性病症)和其他病症的方法以及用于制备用于此类治疗的药物中。在一个方面中，本文所述的T细胞-MP包含I类MHC-H多肽、β2M多肽、用于共价连接表位呈递分子的化学缀合位点和至少一种免疫调节多肽(本文中也称为“MOD多肽”或简称为“MOD”)。T细胞-MP中存在的任何一种或多种MOD可为野生型(“wt.”)或对其细胞结合配偶体/受体(例如，T细胞表面)展现改变的结合亲和力的变体，称为Co-MOD。
T细胞-MP可为未缀合的，在此情况下，其包含至少一个化学缀合位点，在该位点处，可共价结合包含目标抗原决定簇(例如，肽、糖肽或非肽，诸如呈递表位的碳水化合物)的分子以形成T细胞-MP-表位缀合物，以呈递至携载T细胞受体的细胞。包含用于连接表位的化学缀合位点的未缀合T细胞-MP可用于快速制备可调节对所呈递的表位具有特异性的T细胞的活性的T细胞-MP-表位缀合物，并且因此可用于调节个体中涉及那些T细胞的免疫反应。
本文所述的T细胞-MP适用于在基于细胞的表达系统中生产，其中大部分或实质上所有(例如，大于75％、85％或90％)或所有所表达的未缀合T细胞-MP多肽/蛋白处于可溶的非聚集状态下，该状态在37℃下为适当稳定的以用于在组织培养中生产和至少在高至该温度下使用。T细胞-MP可有利地作为由包含在单一载体中的核酸序列编码的单一多肽产生。T细胞-MP可形成高级结构，诸如双链体(参见例如图1)，其可为如图9中的同二聚体，或在由两个T细胞-MP形成时的异二聚体，例如，如图10和图11中所说明。未缀合T细胞-MP可以高产量表达，例如大于25、40、60或80毫克/升(mg/liter)(例如，在CHO细胞中约25至约40、约40至约60或约60至约80mg/l)。在MHC-H链α1螺旋的羧基端与MHC-H链α2-1螺旋之间存在二硫键(例如，Y84C-A139C二硫键)时，产量可尤其高，并且MHC-H多肽序列与β2M多肽之间的接头具有足够的长度(例如，约10至约50个aa长)。在α1与α2螺旋之间存在二硫键的情况下，未缀合T细胞-MP表达量可超过80mg/l(例如，约80至约100、约100至约120、约120至约140、约140至约160、约160至约180或约180至约200mg/l)。
一旦纯化，大部分、实质上所有(例如，大于85％或90％的T细胞-MP)或所有所表达的未缀合T细胞-MP蛋白即使在缀合于表位(例如，肽表位)后仍保持在可溶性非聚集状态下且与未缀合T细胞-MP相比是类似稳定的。未缀合T细胞-MP和其表位缀合物可另外包含可将T细胞-MP表位缀合物引导至特定细胞或组织(例如，肿瘤)的靶向序列。有效负载(例如，生物活性物质或标记)，诸如用于与特定目标表位共同递送的治疗剂(例如，化学治疗剂)，也可诸如通过交联剂而共价连接至T细胞-MP。因此，T细胞-MP-表位缀合物可被视为以表位特异性方式任选地在靶向序列辅助下藉以将MOD(例如，IL-2、4-1BBL、FasL、TGF-β、CD70、CD80、CD86或其变体)和/或有效负载(例如，化学治疗剂)递送至T细胞的手段。
T细胞-MP可包含有助于在细胞内运输期间和/或在即便在不存在相关表位(例如，肽表位)的情况下也由表达多聚体多肽的细胞分泌之后使未缀合T细胞-MP稳定的修饰。一种此类修饰为形成于I类MHCα1螺旋(或其侧接氨基酸序列aac1和aac2)的羧基端的氨基酸位置84与I类MHCα2-1螺旋(或其侧接氨基酸序列aac3和aac4)的氨基端的氨基酸位置139之间的键(例如，二硫键)。举例而言，在MHC-H的氨基酸84(Y84C取代)和139(A139C取代)或等效位置(例如参见图3I)处插入半胱氨酸残基可形成有助于使T细胞-MP稳定的二硫键。参见例如，Z.Hein等人，(2014),Journal of Cell Science 127:2885–2897。
本文所述的T细胞-MP分子的一个方面广泛关于一种未缀合T细胞-MP，该多肽包含(例如，自N端至C端)：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2接头多肽序列，其将一个或多个任选的MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；
(v)I类MHC-H多肽序列；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中未缀合T细胞调节多肽包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造，诸如半胱氨酸取代提供)。
应了解，此类未缀合T细胞-MP不包含共价连接的表位(例如，肽表位)；然而，本发明包括且提供T细胞-MP表位缀合物，其进一步包含共价连接的表位。共价连接的表位可定位于MHC-H/β2M多肽序列的结合槽(binding cleft)内且呈递至TCR，从而允许将分子用作临床测试药剂和诊断剂以及用作治疗剂。本文所述的T细胞-MP和其表位缀合物代表可调整的抗原呈递细胞非依赖性(APC非依赖性)免疫治疗剂，其能够视所存在的MOD而定实现临床有效程度的抗原特异性T细胞调节(例如抑制或活化)。此外，T细胞MP的可为免疫球蛋白Fc结构域的支架部分允许将MHC表位缀合物和MOD部分多价呈递至同源T细胞以便足够使其活化。
附图说明
图1描绘双链体T细胞-MP-表位缀合物的实施方案对T细胞的优先活化，其中将表位间接(通过接头)共价连接至β2M多肽且携载MOD，所述MOD可为野生型和/或变体MOD(例如，对其受体的亲和力降低(Co-MOD))。由于TCR和Co-MOD两者的有效接合，第一表位特异性T细胞经活化。相比之下，由于表位不能接合TCR且因此MOD自身未引起有效接合，因此第二表位非特异性T细胞未活化。接头和任选的接头的位置由连接T细胞-MP元件的黑线表示。
图2A至图2H提供免疫球蛋白重链多肽的氨基酸序列(包括SEQ ID NO.1-13)。
图2I提供人免疫球蛋白J链的序列(SEQ ID NO:14)。
图2J提供Ig CH1结构域序列的序列(SEQ ID NO:15)。
图2K提供Igκ和Igλ链的序列(SEQ ID NO:16-17)。
图3A、图3B和图3C提供I类主要组织相容性复合体重链(MHC-H；也称为I类人白细胞抗原(HLA)重链)多肽的氨基酸序列。信号序列，aa 1至24，用粗体和下划线表示。图3A条目：3A.1为HLA-A重链(HLA-A*01:01:01:01或A*0101)(NCBI登录NP_001229687.1)，SEQ IDNO:18；条目3A.2为HLA-A*1101，SEQ ID NO:19；条目3A.3为HLA-A*2402，SEQ ID NO:20；并且条目3A.4为HLA-A*3303，SEQ ID NO:21。图3B提供HLA-B*07:02:01(HLA-B*0702)(NCBIGenBank登录NP_005505.2)的序列，SEQ ID NO:22。图3C提供HLA-C*0701(GenBank登录NP_001229971.1)(HLA-C*07:01:01:01或HLA-Cw*070101)、(HLA-Cw*07)(参见GenBank登录CAO78194.1)的序列，SEQ ID NO:23。
图3D提供十一种成熟MHC-H多肽序列在不具有其所有或实质上所有前导序列、跨膜结构域和胞内结构域区域的情况下的所有或实质上所有α1、α2和α3结构域的比对。经比对序列包括人HLA-A*0101，SEQ ID NO:24(也参见SEQ ID NO:18)；HLA-B*0702，SEQ ID NO:25；HLA-C，SEQ ID NO:26；HLA-A*0201，SEQ ID NO:27；小鼠H2K蛋白序列，SEQ ID NO:28；HLA-A的三个变体(var.2、var.2C[具有Y84C和A139C取代]和var.2CP)，SEQ ID NO:29-31；3种人HLA-A分子(HLA-A*1101(HLA-A11)，SEQ ID NO:32；HLA-A*2402(HLA-A24)，SEQ ID NO:33；和HLA-A*3303(HLA-A33)，SEQ ID NO:34)。HLA-A*0201为HLA-A的变体。HLA-A的Y84A和A236C变体经标记为HLA-A(var.2)。标记为HLA-A(var.2C)的第七HLA-A序列显示HLA-A在位置84、139和236处经C残基取代，并且第八序列在前一序列的C端处添加一个额外脯氨酸。第九至第十一序列分别来自HLA-A11(HLA-A*1101)、HLA-A24(HLA-A*2402)和HLA-A33(HLA-A*3303)，其在某些亚洲人群中较普遍。比对中指示可插入半胱氨酸残基以代替该位置处的aa以在不存在经结合肽表位的情况下形成使MHC-H-β2M复合体稳定的二硫键的位置(成熟蛋白质的84和139)。比对中也展示可经半胱氨酸残基置换的(成熟多肽的)位置236，该半胱氨酸残基可与β2M形成链间二硫键(例如，在成熟多肽的aa 12处形成例如HLA-A*0201A236C-β2MR12C二硫键)。每个那些位置上方出现一箭头，并且残基以粗体表示。侧接残基84、139和236的方框展示那些六组五个残基的任一侧上的五个aa的组，其表示为aa集群1、2、3、4、5和6(图中分别展示为aac 1至aac 6)，其可经独立地选自以下的1至5个aa置换：(i)任何天然存在的aa或(ii)除脯氨酸或甘氨酸之外的任何天然存在的aa。
图3E至图3G分别提供若干成熟I类HLA-A、HLA-B和HLA-C重链的所有或实质上所有α1、α2和α3结构域的aa序列的比对。提供成熟蛋白的一部分的序列(不具有其所有或实质上所有前导序列、跨膜结构域或胞内结构域)。如图3D中所述，也展示aa残基84、139和236和其侧接残基(aac 1至aac 6)的位置，所述侧接残基可经独立地选自以下的1至5个aa置换：(i)任何天然存在的aa或(ii)除脯氨酸或甘氨酸之外的任何天然存在的aa。也提供各图式中所提供的每组HLA等位基因的共有序列，所述图将可变aa位置展示为依序编号的“X”残基，并且aa 84、139和236的位置以双下划线显示。
图3H提供HLA-E、HLA-F和HLA-G多肽中的每一种的所有或实质上所有α1、α2和α3结构域的共有序列，其中可变aa位置表示为经依序编号的“X”残基且aa 84、139和236的位置以双下划线显示。
图3I提供HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G的共有aa序列的比对，所述序列在图3E至图3H中给出(SEQ ID NO:39、47和57-60)。比对展示不同序列之间的aa的对应。各序列中的可变残基被列为移除序列编号的“X”。可通过参考图3E至图3H来判定各可变残基处的可允许aa。如图3D中所指示，也展示aa 84、139和236以及其侧接五aa集群的位置，所述侧接五aa集群可经独立地选自以下的1至5个aa置换：(i)任何天然存在的aa或(ii)除脯氨酸或甘氨酸之外的任何天然存在的aa。
图4提供来自智人(NP_004039.1；SEQ ID NO:61)、黑猩猩(Pan troglodytes)(NP_001009066.1；SEQ ID NO:62)、恒河猕猴(Macaca mulatta)(NP_001040602.1；SEQ ID NO:63)、欧洲牛(Bos Taurus)(NP_776318.1；SEQ ID NO:64)和家鼷鼠(Mus musculus)(NP_033865.2；SEQ ID NO:65)的β2M前驱物(即，包括前导序列)的多aa序列比对。加下划线的aa1至20为信号肽(有时称为前导序列)。成熟β2M序列始于aa 21。
图5提供经标记为A至F的六个未缀合T细胞-MP的实施方案(结构)。在各情况下，T细胞-MP包含：至少一个MOD多肽序列；一个核心结构，其在N端至C端方向上包含以下元件：β2M多肽序列；包含MHC-Hα1、α2和α3结构域序列的I类MHC-H多肽序列；和支架多肽序列(例如，Ig Fc多肽序列)。在所展示的实施方案中，α1和α2多肽序列通过经例如Tyr 84和Ala139(Y84C和A139C取代)取代的半胱氨酸之间的肽内键连接。一个或多个MOD位于核心结构的氨基和/或羧基侧。经独立选择的任选的接头多肽由线段指示，表示为L1至L6。任选的接头多肽可以出现在T细胞-MP多肽的末端处或连接指示的多肽序列。尽管用于偶联表位的化学缀合位点可以位于T细胞-MP上的任何位置处，但关于化学缀合位点的β2M多肽序列和MHC-H多肽序列中的潜在位置用星号表示。尽管未展示，但化学缀合位点也可位于连接β2M多肽序列和MHC-H多肽序列的L3接头中。
图6提供与图5中的实施方案平行的未缀合T细胞-MP的六个实施方案，标记为A至F。在所展示的实施方案中，化学缀合位点经指示为存在于β2M多肽序列中(例如，包含E44C取代)且支架为免疫球蛋白Fc区，其可为种间的，从而允许两个不同的未缀合T细胞-MP特异性组合以形成异源双链体。
图7提供具有不同MOD取代(例如，结构A中的串连IL-2MOD)的未缀合T细胞-MP的实例。化学缀合位点经指示为存在于β2M多肽序列中(例如，E44C取代)；然而，其可位于MHC-H多肽(α1、α2和α3序列)中，或位于连接β2M和MHC多肽的接头中。Fc支架可经任何其他支架序列置换，诸如可与其对应序列形成异二聚体的种间Fc多肽序列，并且所列出的特异性接头仅为例示性的且可经其他接头多肽序列置换。
图8展示具有附加的顺丁烯二酰亚胺基的表位的一些示意图，该附加的顺丁烯二酰亚胺基与T细胞-MP中存在的游离亲核剂(例如，半胱氨酸)缀合以形成表位缀合物。在“a”中，通过任选的接头(例如，肽接头序列)将顺丁烯二酰亚胺基连接至表位。在“b”至“e”中，接头为重复n次的甘氨酸丝氨酸多肽GGGGS(SEQ ID NO:139)，其中在存在时，n为1至5，并且在接头不存在时n为0。在“c”至“e”中，经由(GGGGS)n接头的末端上的赖氨酸(K)，诸如经由赖氨酸的ε氨基连接顺丁烯二酰亚胺基。在“d”和“e”中，经由与赖氨酸(K)残基的ε氨基形成的烷基酰胺将顺丁烯二酰亚胺基连接至肽，其中m为1至7。
图9描绘由具有(A)处所展示的支架(此情况下为Ig Fc支架)的未缀合T细胞-MP形成缀合T细胞-MP同源双链体。来自(A)的缀合T细胞-MP多肽经由支架序列之间的相互作用形成如(B)中所展示的同源双链体。未缀合同源双链体可自稳定或瞬时表达T细胞-MP蛋白的细胞分离。通常为纯化形式的未缀合同源双链体通过将表位偶联至缀合位点而经历化学缀合，其通过β2M多肽序列(例如，包含E44C取代)中的半胱氨酸与经顺丁烯二标记的肽之间的反应例示，以产生(C)中所展示的T细胞-MP-表位缀合物。可移除过量反应性肽或可使用次化学计量量的反应性表位(相对于缀合位点的量)来产生缀合T细胞-MP同源双链体。构建体不限于所展示的接头序列，所述所展示的接头序列为可采用的接头的例示。
图10描绘由未缀合T细胞-MP形成缀合T细胞-MP异源双链体，所述未缀合T细胞-MP具有(A)处所展示的选择性形成异源双链体的支架(在此情况下，种间杵臼结构(knob-in-hole)Ig Fc支架)。缀合T细胞-MP多肽经由种间支架序列之间的相互作用形成如(B)中所展示的异源双链体。未缀合异源双链体可自稳定或瞬时表达蛋白的细胞分离。一般经纯化形式的未缀合异源双链体通过将表位偶联至缀合位点而经历化学缀合，此通过以下来例示：β2M多肽序列(例如，E44C取代)中的半胱氨酸与顺丁烯二酰亚胺标记的肽之间发生反应，产生(C)中所展示的T细胞-MP-表位缀合物。可移除过量反应性肽或可使用次化学计量量的反应表位(相对于缀合位点的量)来产生缀合T细胞-MP异源双链体，如所展示，其在各T细胞-MP多肽上可包含不同MOD。构建体不限于所展示的接头序列，所述所展示的接头序列为可采用的接头的例示。
图11展示三种异二聚体T细胞-MP-表位缀合物双链体。各双链体具有包含种间IgFc多肽对的支架；然而，支架多肽可经任何其他种间多肽对置换。构建体不限于所展示的接头序列，所述所展示的接头序列为可采用的接头的例示。
图12展示包括T细胞-MP的一系列分子在经培养CHO细胞中的表达的比较结果，如实施例1所述，其中所述分子(构建体)在L3接头中和其他位置处具有不同取代。A、B和C处提供分子的整体结构。直方图D和E中分别提供未聚集(例如，以可溶性双链体形式存在)的分子的效价(蛋白质的量)和所述分子的分率。
图13展示历时数天在32和28°两者下每毫升2百万、4百万和6百万个细胞的未缀合T细胞-MP(构建体3861，其具有由重复三次的Gly4Ser组成的L3接头)的培养中的产量和稳定性(A和B)。色谱图展示(C)之前和(D)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化之后的自培养物的蛋白A纯化的材料。考马斯蓝(coomassie blue)凝胶(E)展示材料电泳与分子量标准物(Mw)相比，还原(R)样本为103128道尔顿，并且非还原样本为206213道尔顿。详情参见实施例2。
图14在A处展示T细胞-MP-表位缀合物对于对缀合表位具有特异性的T细胞的特异性。在B处，图14展示表位缀合物的非还原和还原样本的电泳凝胶。详情参见实施例3。
图15和图16展示如实施例4中所述的存在于来自CMV和MART-1反应性供体的Leukopak样本中的CD8+T细胞对T细胞-MP表位缀合物和对照处理的反应。
图17展示L3接头长度对两个系列的未缀合T细胞-MP的CHO细胞表达的影响，在A处通过Octet分析提供培养基中的效价，以及在B处提供在蛋白A磁珠上纯化后存在于样本中的未聚集(双链体)分子的分率。
图18描绘将T细胞(例如CD 8+细胞毒性T细胞)导引至目标细胞(例如，如所展示的癌细胞)且将T细胞的反应导向目标细胞的方法。
图19提供本发明中所讨论的某些构建体的氨基酸序列。接头序列(例如，AAAGG和GGGGS)可用粗体、斜体和下划线显示以允许其标识。I类MHC重链中的指示的单一氨基酸取代以加下划线的粗体显示。人IL2序列由hIL2指示，β-2-微球蛋白序列由β2M指示，并且HLA-A02序列由HLA-A*0201指示，各自均带有指示的aa取代。
定义
术语T细胞-MP泛指且包括未缀合T细胞-MP和T细胞-MP-表位缀合物两者。术语“未缀合T细胞-MP(或复数时，“MPs”)是指未与表位和/或有效负载(例如，非表位分子，诸如标记)缀合(共价连接)的T细胞-MP，并且因此包含至少一个化学缀合位点。未缀合T细胞-MP多肽也不包含融合肽表位，该融合肽表位可定位于MHC-H结合槽内且与β2M多肽序列缀合并呈递至TCR。术语“T细胞-MP-表位缀合物(T-Cell-MP-epitope conjugate)”(或当复数时，“缀合物(conjugates)”)是指已在化学缀合位点处与表位缀合(共价连接)的T细胞-MP，该化学缀合位点允许共价连接的表位存在于MHC结合槽中，并呈递至对T细胞(表位特异性T细胞)上表达的表位具有特异性的TCR异。“T细胞-MP-有效负载缀合物(T-Cell-MP-payloadconjugate/T-Cell-MP-payload conjugates)”是指已经缀合(共价连接)至一个或多个经独立选择的有效负载的T细胞-MP。术语“T细胞-MP”还包括未缀合T细胞-MP和T细胞MP-表位缀合物，其包含一个或多个经独立选择的MOD或不含MOD。在本发明特别提及不含有MOD的T细胞-MP的那些情况下，采用诸如“无MOD的T细胞-MP(MOD-less T-Cell-MP)”或“不具有MOD的T细胞-MP(T-Cell-MP without a MOD)”等的术语。术语“T细胞-MP”还包括未缀合T细胞-MP和T细胞MP-表位缀合物，其包含一个或多个经独立选择的靶向序列(下文论述)。
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，所述术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、经化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
本文中可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指聚合形式的氨基酸，除非另有说明，否则其为在哺乳动物细胞的翻译期间以生物合成方式并入蛋白质中的天然存在的蛋白质原L-氨基酸。
核酸或多肽与另一核酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，意谓在比对时，碱基或氨基酸的百分比相同，并且在比较两种序列时处于相同的相对位置。可以多种不同方式测定序列同一性。为了测定序列同一性，可使用各种方便的方法和计算机程序(例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)来比对序列，所述计算机程序可获自在包括以下的网址下的万维网(world wide web)：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，BLAST+2.10.0；ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/和mafft.cbrc.jp/alignment/software/。参见例如，Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-10。
如本文所用，氨基酸(“aa”单数或“aas”复数)意谓在哺乳动物细胞翻译中并入多肽和蛋白质中的天然存在的蛋白质原氨基酸。除非另有说明，否则所述蛋白质氨基酸为：L(Leu，亮氨酸)，A(Ala，丙氨酸)、G(Gly，甘氨酸)、S(Ser，丝氨酸)、V(Val，缬氨酸)、F(Phe，苯丙氨酸)、Y(Tyr，酪氨酸)、H(His，组氨酸)、R(Arg，精氨酸)、N(Asn，天冬酰胺)、E(Glu，谷氨酸)、D(Asp，天冬氨酸)、C(Cys，半胱氨酸)、Q(Gln，谷氨酰胺)、I(Ile，异亮氨酸)、M(Met，甲硫氨酸)、P(Pro，脯氨酸)、T(Thr，苏氨酸)、K(Lys，赖氨酸)和W(Trp，色氨酸)。氨基酸还包括氨基酸羟脯氨酸和硒代半胱氨酸，其出现在哺乳动物细胞中发现的一些蛋白质中；然而，除非明确指出其存在，否则不应理解为包括其。
术语“保守氨基酸取代”是指具有类似侧链的aa残基的蛋白质中的互换性。举例而言，具有脂族侧链的aa组由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；具有脂族羟基侧链的aa组由丝氨酸和苏氨酸组成；具有含酰胺的侧链的aa组由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；具有芳香侧链的aa组由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；具有碱性侧链的aa组由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；具有酸性侧链的aa组由谷氨酸和天冬氨酸组成；和具有含硫侧链的aa组由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。例示性保守aa取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语“结合(binding/bound)”一般指分子和/或原子之间的直接缔合，其为例如由于共价、静电、疏水、离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用。
如参考结合于多肽(例如，T细胞上的T细胞受体)的T细胞-MP所使用的术语“结合(binding/bound)”是指两个分子之间的非共价相互作用。非共价相互作用是指两个分子之间的直接缔合，其为例如由于静电、疏水、离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用。非共价结合相互作用的特征通常在于小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10- 9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10-14M或小于10-15M的解离常数(KD)。如本文所用，“共价结合(Covalent bonding/covalent binding)”是指在两个不同分子之间形成一个或多个共价化学键。
如本文所用，“亲和力”通常指非共价结合的强度，结合亲和力的增加与较低KD相关。如本文所用，术语“亲和力”可通过两种药剂(例如，抗体和抗原)的可逆结合的解离常数(KD)来描述。亲和力相较于抗体或受体对非相关aa序列(例如配体)的亲和力可提高至至少1倍至至少1,000倍(例如，至少2倍至至少5倍、至少3倍至至少6倍、至少4倍至至少8倍、至少5倍至至少10倍、至少6倍至至少15倍、至少7倍至至少20倍、至少8倍至至少30倍、至少9倍至至少35倍、至少10倍至至少40倍、至少20倍至至少60倍、至少40倍至至少80倍、至少60倍至至少180倍、至少80倍至至少240倍、至少100倍至至少1,000倍或至少1,000倍)。抗体对目标蛋白的亲和力可为例如约100奈摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更大。如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种药剂的复合物在稀释后对解离的抵抗力。
如本文所用，术语“免疫突触(immunological synapse/immune synapse)”通常指适应性免疫反应的两个相互作用免疫细胞之间的天然界面，包括例如抗原呈递细胞(APC)或目标细胞与效应细胞，例如淋巴细胞、效应T细胞、自然杀手细胞等之间的界面。APC与T细胞之间的免疫突触通常由T细胞抗原受体与MHC分子的相互作用引发，例如如Bromley等人，Ann.Rev.Immunol.2001；19:375-96中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、调节T细胞(T reg)和NK-T细胞。
如本文所用，术语“免疫调节多肽”(也称为“共刺激多肽”或如上所提及的“MOD”)包括APC(例如，树突细胞、B细胞等)上的多肽或其部分(例如，胞外结构域)，或另外可获得以与存在于T细胞上的同源共免疫调节多肽(“Co-MOD”)特异性结合的T细胞相互作用，从而提供信号。除通过例如TCR/CD3复合物与携载有肽表位的MHC多肽结合提供的初级信号以外，通过MOD接合其Co-MOD提供的信号介导(例如，引导)T细胞反应。反应包括但不限于增殖、活化、分化等。MOD可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配体(FasL)、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合类铎受体(Toll-LikeReceptor；TLR)的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。MOD尤其还涵盖与存在于T细胞上的Co-MOD分子特异性结合且活化该分子的抗体或抗体片段，诸如但不限于针对以下中的任一种的受体的抗体：IL-2、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、LIGHT(也已知为肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14))、NKG2C、B7-DC、B7-H2、B7-H3和CD83。
如本文所用，“重组”意谓特定核酸(DNA或RNA)为克隆、限制、聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)和/或产生构建体的接合步骤的各种组合的产物，该构建体具有与天然系统中发现的内源性核酸不同的结构编码或非编码序列。编码多肽的DNA序列可由cDNA片段或由一系列合成寡核苷酸组装，以提供能够自包含于细胞中或无细胞转录和翻译系统中的重组转录单元表达的合成核酸。
本文中可互换使用的术语“重组表达载体”或“DNA构建体”是指包含载体和至少一个插入物的DNA分子。通常出于表达和/或繁殖插入物或出于构建其他重组核苷酸序列的目的而产生重组表达载体。插入物可以或可以不与启动子序列可操作地连接，并且可以或可以与不DNA调节序列可操作地连接。
术语“治疗(treatment/treating等)”在本文中用于一般意谓获得所需药理学和/或生理效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，效果可为预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病所致的不良反应而言，可为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病或症状的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病或症状但尚未诊断为患病的受试者出现疾病或症状；(b)抑制疾病或症状，即遏制其发展；和/或(c)缓解疾病，即使疾病消退。治疗剂可以在疾病或伤害发作之前、期间或之后施用。特别关注正在进行的疾病的治疗，其中治疗稳定或减轻患者的非所需临床症状。此类治疗宜在受影响组织的功能完全丧失之前执行。将宜在疾病的症状阶段期间且在一些情况下，在疾病的症状阶段之后施用主题疗法。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用且指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。哺乳动物包括人和非人灵长类动物，并且另外包括啮齿类动物(例如大鼠；小鼠)、兔类动物(例如兔子)、有蹄类动物(例如牛、绵羊、猪、马、山羊等)、猫科动物、犬科动物等。
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范畴。
在提供值范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限至该范围的下限的十分之一之间的各中间值以及该范围内的任何其他规定或中间值均涵盖于本发明中。上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，所述范围也涵盖于本发明内，但受所述范围内的任何具体排除的限制。在所述范围具有值(例如，上限或下限)的情况下，排除那些值的范围还包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中也可使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但现将描述优选方法和材料。本文提及的所有公布均通过引用的方式并入本文中以公开和描述与引用公布有关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“该(the)”包括复数个提及物。因此，例如，提及“T reg”包括复数个此类Treg，并且提及“I类MHC重链”包括提及一个或多个I类MHC重链和本领域技术人员已知的等效物等。应进一步注意，权利要求书可经起草以排除任何任选的要素。因此，此表述意图作为与权利要求书要素的叙述相关联的诸如“仅仅”、“仅”等专有术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
应理解，为清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可在单一实施方案中组合提供。相反，为简洁起见，在单一实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可单独提供或以任何适合的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合均由本发明特定地包括且在本文中公开，如同各个和每个组合经单个地且明确地公开一般。此外，各种实施方案和其要素的所有子组合也经本发明特定地包括且公开于本文中，如同各个和每个此类子组合在本文中经单个且明确地公开一般。
仅提供本文讨论的公布在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公布。此外，所提供的公布日期可能与实际公布日期不同，可能需要单独确认。
具体实施方式
I.具有用于表位结合的化学缀合位点的T细胞调节多肽(T细胞-MP)
本发明包括且提供T细胞-MP(具有适合于连接表位的化学缀合位点的未缀合T细胞-MP和已缀合表位的T细胞-MP-表位缀合物两者)。此类T细胞-MP可用于调节T细胞的活性，以例如体外、离体或体内调节免疫反应且因此实现治疗性治疗。本发明特定提供T细胞MP-表位缀合物的制备和用于体外、离体或体内调节个体的免疫反应的方法，该个体可为人或非人测试受试者或患者。人或非人测试受试者或患者可罹患一种或多种肿瘤、一种或多种癌症和/或一种或多种感染(例如，细菌和病毒感染)。除存在的其他元件之外，T细胞-MP可包含一个或多个经独立选择的野生型和/或变体MOD多肽，其对其Co-MOD和一种或多种有效负载展现降低的结合亲和力。
本发明中包括呈同二聚体的T细胞-MP，其包含相同的第一和第二T细胞-MP多肽。本发明中还包括呈异二聚体的T细胞-MP，其包含第一和第二T细胞-MP多肽)，其中那些多肽中的至少一种包含用于连接表位的化学缀合位点。任选地，至少一种异二聚体可包含有效负载，诸如化学治疗剂和/或靶向序列。本发明中包括已与表位化学缀合以形成T细胞-MP-表位缀合物且任选地包含靶向序列和/或有效负载的T细胞-MP。
视存在于T细胞-MP-表位缀合物中的MOD的类型而定，携载对T细胞-MP上存在的表位具有特异性的TCR的T细胞可通过经历活化来反应，包括例如，克隆扩增(例如，当将诸如野生型和/或变体IL-2、4-1BBL和/或CD80的活化性MOD并入T细胞-MP中时)。另选地，当将诸如野生型和/或变体FASL和/或PD-L1的MOD并入T细胞-MP中时，T细胞可经历下调T细胞活性的抑制。将诸如野生型和/或变体IL-2与CD80或IL2与PD-L1的MOD组合并入T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)中可引起协同效应，其中T细胞反应超过T细胞对于缺少MOD中的一种的其他相同的T细胞-MP的反应的总和。由于MOD对任何表位均不具有特异性，因此T细胞的活化或抑制可通过将对其Co-MOD具有降低的亲和力的变体MOD并入T细胞-MP中，使得T细胞-MP与T-细胞的结合受MHC-表位-TCR相互作用强烈影响，甚至受其支配来偏向表位特异性相互作用。
携载MOD的T细胞-MP-表位缀合物可认为用作替代APC，并且通过与T细胞相互作用模拟表位在适应性免疫反应中的呈递。T细胞-MP-表位缀合物通过与共价结合的表位(例如，呈递表位的肽)接合且呈递至存在于具有该表位的T细胞表面上的TCR来实现。此接合为T细胞-MP-表位缀合物提供达成表位特异性细胞靶向的能力。在本文所述的实施方案中，T细胞-MP-表位缀合物也具有接合T细胞上的对应共刺激蛋白(Co-MOD)的至少一个MOD。两种信号—表位/MHC结合于TCR和MOD结合于Co-MOD—接着驱动所需T细胞特异性和抑制/细胞凋亡或活化/增殖两者。
具有化学缀合位点的未缀合T细胞-MP可用作平台，可将不同表位单独或与添加至T细胞-MP的一种或多种其他有效负载组合引入该平台中，以便制备用于治疗、诊断和研究应用的材料。由于包括由同二聚体和更高级的同源复合物构成的双链体的T细胞-MP仅需要单一多肽序列，因此其可有利地使用具有单一表达盒的单一载体引入细胞且由细胞表达。类似地，异二聚体双链体T细胞-MP可使用具有两个单独表达盒或一个双顺反子表达盒(例如，具有由2A蛋白质序列或内部核糖体进入序列(internal ribosome entry sequence；IRES)分开的蛋白质)的单一载体，或者通过使用各自携载编码一个异二聚体亚基的盒的两个载体来引入细胞中。在双链体或更高级T细胞-MP含有种间支架序列的情况下，不同T细胞-MP可携载不同MOD，从而允许双链体或更高级结构含有不同MOD或在异二聚体的各多肽上的不同位置处含有MOD。T细胞-MP的模组化特性使得能够通过将含有表位的分子(例如肽)偶联至所制备的T细胞-MP多肽中而快速制备和测试诊断和治疗候选物，所述T细胞-MP多肽接着可经测试其对于携载对表位具有特异性的TCR的T细胞的活化或抑制。构建未缀合T细胞-MP，并且特定来说具有不同MOD的异二聚体T细胞-MP双链体的能力允许快速组装和评定MOD与一种或多种与疾病状态或病状相关的表位的不同组合。除上述之外，快速连接各种有效负载，诸如抗病毒剂、化学治疗剂和/或靶向序列且获取其对T细胞-MP的有效性的能力有助于制备用于筛选和用作治疗剂两者的T细胞-MP。
在将一个或多个活化性野生型MOD或变体MOD多肽序列并入T细胞-MP-表位缀合物中的情况下，使具有对表位具有特异性的TCR的T细胞与至少一种浓度的T细胞-MP-表位缀合物接触可引起T细胞活化。T细胞活化可引起以下中的一种或多种：增加ZAP-70蛋白激酶活性的活性、诱导T细胞增殖、颗粒依赖性效应作用(例如，自细胞毒性T细胞中释放颗粒酶、穿孔蛋白和/或颗粒溶素)和/或释放T细胞细胞因子(例如，来自CD8+细胞释放干扰素γ)。在MOD多肽序列诱导T细胞增殖时，相较于与不具有对表位具有特异性的TCR的相同浓度的T细胞-MP-表位缀合物接触的T细胞，T细胞-MP表位缀合物在活化具有对表位具有特异性的TCR的T细胞方面可诱导至少两倍(例如，至少2、3、4、5、10、20、30、50、75或100倍)差异(参见图1)。T细胞活化可通过例如ZAP-70活性或T细胞增殖，参见例如，Wang等人，Cold SpringHarbor perspectives in biology 2.5(2010):a002279，或细胞因子释放来测量。在将抑制T细胞活化的一个或多个野生型或变体MOD多肽序列并入T细胞-MP-表位缀合物中的情况下，使具有对表位具有特异性的TCR的T细胞与至少一种浓度的T细胞-MP-表位缀合物接触可引起以下中的一种或多种：阻止或抑制T细胞活化、减小经活化T细胞的反应和/或下调表位特异性T细胞。在一些情况下，存在于T细胞-MP-表位缀合物中的抑制性MOD可引起具有对表位具有特异性的TCR的T细胞凋亡。抑制性MOD序列的效果可通过例如以下中的一种或多种来测量：对T细胞增殖、ZAP-70活性、颗粒依赖性效应作用的减少和/细胞死亡的影响。
T细胞-MP-表位缀合物的特异性视表位和其MOD对结合的相对贡献而定。在MOD对Co-MOD的亲和力相对较高，使得在结合相互作用中MOD支配T细胞-MP的情况下，T细胞-MP表位缀合物的特异性相对于T细胞-MP复合物而减小，其中表位通过比MOD对总结合能贡献更大而在结合相互作用中占主导地位。表位与对表位具有特异性的TCR之间的结合能的贡献越大，则T细胞-MP对携载该类型的TCR的T细胞的特异性将越大。在表位MHC复合物对其TCR具有强亲和力的情况下，使用对其Co-MOD具有相对较低亲和力的野生型MOD和/或具有降低亲和力的变体MOD将有利于T细胞-MP-表位缀合物与特异性T细胞的表位选择性相互作用，并且也有助于将可缀合于T细胞-MP-表位的任何有效负载选择性递送至T细胞和/或T细胞所处位置。
本发明提供呈递癌症和/或感染因子(例如，病毒、细菌)表位的T细胞-MP表位缀合物，其可用于以表位特异性方式调节T细胞活性且因此用于调节对个体的那些疾病状态的免疫反应。T细胞-MP包含一个或多个MOD，该一个或多个MOD为野生型且/或对Co-MOD展现降低的结合亲和力。
A.未缀合T细胞-MP和T细胞-MP-表位缀合物
1未缀合T细胞-MP和T细胞-MP-表位缀合物组分的结构和组成
本文所述的未缀合T细胞-MP包含用于直接或经由接头间接偶联表位的化学缀合位点。化学缀合位点可位于T细胞-MP上的任何位置处。本发明的一个方面涉及T细胞-MP，其包含：用于连接支架(例如，Ig Fc)、β2M或MHC-H多肽序列内，或在接合β2M和MHC-H多肽序列的接头(L3)内以及那些T细胞-MP的高级复合物内的肽表位的化学缀合位点。本发明的另一方面涉及T细胞-MP，其包含：用于连接β2M或MHC-H多肽序列内，或在接合β2M和MHC-H多肽序列的接头(L3)内，以及那些T细胞-MP的高级复合物内的肽表位的化学缀合位点。用于直接或经由接头间接偶联表位的化学缀合位点可位于β2M多肽序列中。用于直接或经由接头间接偶联表位的化学缀合位点可位于MHC-H多肽序列中。用于直接或通过接头间接偶联表位的化学缀合位点可位于接合β2M多肽序列和MHC-H多肽序列的接头(L3)中。用于直接或通过接头间接偶联表位的化学缀合位点可位于支架(例如，Ig Fc)内。在用于将表位偶联至未缀合T细胞-MP的化学缀合位点出现在支架(例如，Ig Fc)、β2M或MHC-H多肽序列中的情况下，化学缀合位点可限于并非天然出现在任何那些序列中的氨基酸或氨基酸序列，并且可涉及引入至那些序列中的一种中的一个或多个氨基酸(例如，引入一个或多个aa不出现在天然存在序列中的aa序列位置中的所述一个或多个aa)。另外，尽管可利用T细胞-MP多肽的N端氨基或C端羧基作为用于表位连接的化学缀合位点，但可自本文所述的任何T细胞-MP或其高级复合物中排除那些位点作为缀合位点。事实上，T细胞-MP的化学缀合位点可自N端10或20个aa和/或C端10或20个aa中排除。
T细胞-MP可形成高级复合物(例如，双链体、三链体等)。高级复合物可为同聚的(例如，同二聚体或同源双链体)或异聚的(例如异二聚体或异源双链体)。可将种间序列对用作支架序列，其中复合物意图为异二聚体，因为其允许两个不同T细胞-MP形成特异性异源双链体，而不为可在不具有一对种间结合序列的两个T细胞-MP经混合情况下形成的同源双链体和异源双链体的混合物。
本文所述的第一组T细胞-MP分子广泛关于可形成双链体的T细胞-MP，该双链体经由其支架序列中的相互作用而缔合。此类T细胞-MP可至少具有第一T细胞-MP多肽序列(例如，双链化为同二聚体)或不同的第一和第二T细胞-MP多肽序列(例如，双链化为异二聚体)，其中T细胞-MP中的一种或两种包含(例如，自N端至C端)：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2接头多肽序列，其将一个或多个MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；
(v)I类MHC-H多肽序列；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中未缀合T细胞-MP包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含至少一个化学缀合位点。
本文所述的第二组未缀合T细胞-MP可在第一T细胞-MP与第二T细胞-MP之间形成双链体，该第一T细胞-MP和该第二T细胞-MP经由其支架序列中的相互作用而缀合。此类未缀合双链体T细胞-MP可具有经双链体化为同二聚体的相同的第一和第二T细胞-MP多肽序列，或经双链体化为异二聚体的不相同的第一和第二T细胞-MP多肽序列，其中T细胞-MP多肽中的一种或两种自N端至C端包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2接头多肽序列，其将一个或多个任选的MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；
(v)I类MHC-H多肽序列；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中未缀合T细胞调节多肽包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含例如用于表位缀合和/或有效负载缀合的至少一个化学缀合位点。
本文所述的第三组未缀合T细胞-MP以双链体形式出现于第一T细胞-MP与第二T细胞-MP之间，该第一T细胞-MP和该第二T细胞-MP经由其支架序列中的相互作用而缀合。此类未缀合双链体T细胞-MP可具有经双链体化为同二聚体的相同的第一和第二T细胞-MP多肽序列，或经双链体化为异二聚体的不相同的第一和第二T细胞-MP多肽序列，其中T细胞-MP多肽中的一种或两种自N端至C端包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2多肽序列，其将一个或多个任选的MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其包含10至50个氨基酸；
(v)I类MHC-H多肽序列，其包含在位置84和139处经取代的半胱氨酸(参见图3E至图3H，例如Y84C和A139C取代)且形成二硫键；
(vi)L4接头多肽序列；
(vii)种间或非种间免疫球蛋白Fc支架序列；
(viii)L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含例如用于表位缀合和/或有效负载缀合的至少一个化学缀合位点，其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列或MHC-H多肽序列中的至少一种包含未出现于野生型序列中的化学缀合位点；并且
其中所述第一和第二T细胞-MP任选地通过其Ig Fc支架序列之间的至少一个二硫键来共价连接。所述化学缀合位点应适用于表位缀合，原因在于其不会干扰T细胞-MP与TCR的相互作用且优选为溶剂可接触的，从而允许其缀合于表位。
用于表位缀合于T细胞-MP的化学缀合位点，包括上述第一组、第二组和第三组未缀合T细胞-MP的化学缀合位点，允许表位呈递分子(例如，肽表位)共价连接至T细胞-MP，使得其可由MHC-H多肽结合(位于结合槽中)且呈递至TCR。未缀合T细胞-MP的化学缀合位点可为不出现在野生型序列中的位点(例如，其是使用基于生物化学和/或分子生物学的蛋白质工程改造技术产生的)。化学缀合位点也应适用于表位缀合，原因在于其不会干扰T细胞-MP与TCR的相互作用，并且优选为溶剂可接触的，从而允许其缀合于表位。
应理解，未缀合T细胞-MP不包含可位于MHC-H/β2M多肽序列的结合槽中且呈递至TCR的肽表位(共价连接至T细胞-MP多肽或作为与T细胞-MP多肽的融合物)。然而，本发明确实包括且提供T细胞-MP-表位缀合物，其进一步包含呈递直接或间接(例如，经由肽或非肽接头)共价连接至T细胞-MP的化学缀合位点处的表位的分子；其中表位也可与T细胞-MPMHC-H多肽序列的结合槽连接(位于或定位于其中)，并且官能性呈递至携载对表位具有特异性的TCR的T细胞，引起TCR介导的T细胞的活化或抑制。
本发明还提供T细胞-MP，其中存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的表位可以至少100微摩尔(μM)(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合于(例如，T细胞上的)TCR。
T细胞-MP-表位缀合物可以较T细胞-MP-表位缀合物结合于第二T细胞的亲和力更高的亲和力结合于第一T细胞；其中第一T细胞在其表面上表达Co-MOD和缀合表位的TCR，并且其中第二T细胞在其表面上表达与第一个T细胞上存在的相同的Co-MOD，但不在其表面上表达结合表位的TCR(例如，若其最终结合，则与第一细胞的TCR一样紧密)。参见图1，增加的亲和力可以在结合试验中测量或根据相较于第二T细胞刺激第一T细胞所需的T细胞-MP表位缀合物的浓度推断。对表位特异性T细胞的增加的亲和力允许使用表位缀合物作为临床测试、诊断的药剂且作为能够指导表位特异性T细胞作用的治疗剂。
存在于T细胞-MP中的MOD为经独立选择的野生型MOD和/或变体MOD。在T细胞-MP诸如经由使用种间支架多肽序列形成异聚体复合物的情况下，存在于异聚体的至少一个T细胞-MP中的MOD可独立地选自异聚体复合物的其他T细胞-MP。因此，异二聚体双链体T细胞-MP可具有经独立选择的MOD，双链体的第一和第二T细胞-MP中的MOD不同。在一个方面中，MOD经选择为能够刺激表位特异性T细胞活化/增殖的一个或多个活化性野生型MOD/或变体MOD(例如，野生型和/或变体IL-2、4-1BBL和/或CD80)。在另一实施方案中，MOD为能够抑制T细胞活化/增殖的一个或多个抑制性野生型MOD和/或变体MOD(例如，FAS-L和/或PD-L1)。当与携载适合表位的T细胞-MP组合使用时，此类活化性或抑制性MOD能够进行表位特异性T细胞作用，特别是在MOD为变体MOD且MHC-表位-TCR相互作用足够强以主导T细胞-MP与T细胞的相互作用的情况下。
2未缀合T细胞-MP的化学缀合位点
术语“化学缀合位点”意谓T细胞-MP的任何适合位点，其允许在T细胞-MP与含表位或有效负载的分子之间选择性地形成直接或间接(经由插入的接头或间隔子)共价键。未缀合T细胞-MP的化学缀合位点可为(i)活性的，即能够在T细胞-MP与表位或有效负载之间形成直接或间接(经由插入的接头或间隔子)共价键，而无需化学缀合位点(例如，溶剂可及半胱氨酸巯基)的额外化学反应或转化；或(ii)初生的，即需要化学缀合位点的另一化学反应或酶促转化以成为活性化学缀合位点(例如，尚未经fGly酶活化的硫酸酯酶序列)。
术语“选择性形成”意谓当含有表位或有效负载的分子携载与T细胞-MP的活性化学缀合位点具有反应性的部分时，含表位或有效负载的分子将以高于T细胞-MP中的任何其他位点的量共价结合于化学缀合位点。
可使用蛋白质工程改造技术(例如，通过使用适当核酸序列)将化学缀合位点引入T细胞-MP中，以获得具有所需aa序列的T细胞-MP。化学缀合位点可为T细胞-MP的蛋白质或多肽序列中的个别aa(例如，半胱氨酸或赖氨酸)或aa序列(例如，硫酸酯酶、分选酶或转谷氨酰胺酶序列)。
在T细胞-MP的蛋白质或多肽序列源自天然存在的蛋白质(例如，B2M、MHC-H或IgG支架)的情况下，化学缀合位点可为未出现于天然存在的序列中的位点，诸如由氨基酸取代(例如，半胱氨酸取代)、插入和/或缺失产生的位点。化学缀合位点也可为非源自天然存在的蛋白质的序列或序列的一部分，诸如接头序列(例如，连接T细胞-MP的β2M和MHC-H多肽序列的T细胞-MP的L3接头)。
在一些实施方案中，在各未缀合T细胞-MP多肽中仅存在一个化学缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造添加的一个化学缀合位点)，其允许共价连接表位，使得其可位于MHC多肽中结合槽中且呈递至TCR。各单独未缀合T细胞-MP可包含超过一个化学缀合位点，所述化学缀合位点经选择为相同或不同类型的化学缀合位点，从而允许相同或不同分子(例如，表位和一种或多种有效负载)选择性地缀合于各化学缀合位点。因此，各单独或双链体未缀合T细胞-MP可包含一个或多个化学缀合位点，所述化学缀合位点经选择为相同或不同类型的化学缀合位点，从而允许相同或不同分子选择性地缀合于各化学缀合位点。化学缀合位点(例如，用于缀合表位)通常将为相同的(例如，相同类型的)，使得可使用单一反应将表位呈递分子共价连接至例如双链体未缀合T细胞-MP中的所有期望位点。T细胞-MP也可含有除用于缀合于表位的那些位点之外的化学缀合位点，包括用于并入例如靶向序列和/或诸如标记的有效负载的缀合位点。
在大多数情况下，用于并入除表位呈递分子以外的分子的化学缀合位点将具有与用于并入表位的位点的不同类型(例如，利用不同化学反应)且位于不同位置中，从而允许不同分子选择性地缀合于各多肽。在T细胞-MP将包含靶向序列和/或一种或多种有效负载分子的情况下，未缀合T细胞-MP可包含超过一个的化学缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造添加的化学缀合位点)复本，以允许连接至靶向序列和/或有效负载的多个分子。
可并入未缀合T细胞-MP多肽中的化学缀合位点包括但不限于：
a)充当酶修饰序列的肽序列(例如，硫酸酯酶、分选酶和/或转谷氨酰胺酶序列)；
b)非天然aa和/或硒代半胱氨酸；
c)包含个别氨基酸的化学缀合位点；
d)碳水化合物或寡糖部分；和
e)IgG核苷酸结合位点。
a.硫酸酯酶模体
在选择酶促修饰作为化学缀合手段的那些实施方案中，化学缀合位点可包含硫酸酯酶模体。硫酸酯酶模体的长度通常为5或6个aa，并且例如描述于美国专利第9,540,438号和美国专利公布第2017/0166639Al号中，所述专利以引用的方式并入。插入模体引起蛋白质或多肽的形成，其有时被称为经醛标记或具有醛标签。模体可通过甲酰甘氨酸生成酶(“FGE”)作用，以将模体中的半胱氨酸或丝氨酸转化为甲酰甘氨酸残基(“fGly”，尽管有时表示为“FGly”)，其为含aa的醛，有时称为氧代丙氨酸，可用于选择性(例如位点特异性)化学缀合反应。因此，如本文所用，“醛标签”或“经醛标记”的多肽是指包含未转化硫酸酯酶模体的aa序列，以及包含硫酸酯酶模体的aa序列，其中模体的半胱氨酸或丝氨酸残基已通过FGE作用转化为fGly。在术语硫酸酯酶模体用于aa序列的上下文中的情况下，公开初生化学缀合序列(例如，含有未转化模体的多肽)以及其含有活性化学缀合位点对应物的fGly。一旦存在于(例如，T细胞-MP的)多肽中，fGly残基可与包含多种反应性基团的分子(例如，具有或不具有中间接头的肽表位)反应，所述反应性基团包括但不限于氨基硫脲、氨基氧基、酰肼和肼基以形成经由fGly残基在肽与分子之间具有共价键的缀合物(例如，T细胞-MP-表位缀合物)。硫酸酯酶模体可不仅用于并入表位(例如，表位呈递肽)，并且还用于并入靶向序列和/或有效负载(例如，在与药物和诊断分子形成缀合物中)。
在实施方案中，硫酸酯酶模体的长度为至少5或6个aa残基，但可为例如5至16个(例如，6至16个、5至14个、6至14个、5至12个、6至12个、5至10个、6至10个、5至8个或6至8个)aa。硫酸酯酶模体的长可限于小于16、14、12、10或8个aa残基度。
在一实施方案中，硫酸酯酶模体包含式(I)：X1Z1X2Z2X3Z3(SEQ ID NO:66)中的序列，其中
Z1为半胱氨酸或丝氨酸；
Z2为脯氨酸或丙氨酸残基(其也可表示为“P/A”)；
Z3为碱性aa(精氨酸、赖氨酸或组氨酸，通常为赖氨酸)或脂族aa(丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，通常为A、G、L、V或I)；
X1存在或不存在，当存在时，可为任何aa，但通常为脂族aa、含硫aa或极性不带电aa(例如，除芳族aa或带电aa之外)，通常为L、M、V、S或T，更通常为L、M、S或V，条件为当硫酸酯酶模体位于目标多肽的N末端时，X1存在；并且
X2和X3可独立地为任何aa，但通常为脂族aa、极性不带电aa或含硫aa(例如，除芳族aa或带电aa之外)，通常为S、T、A、V、G或C，更通常为S、T、A、V或G。
如上所述，醛标签的硫酸酯酶模体的长度为至少5或6个aa残基，但可为例如5至16个aa。模体可包含在N端和C端的一个或两个处的额外残基，使得醛标签包括硫酸酯酶模体和“辅助模体”两者。在一实施方案中，硫酸酯酶模体包括C端辅助模体(即，在模体的Z3位置之后)。
多种FGE可用于将硫酸酯酶模体中的半胱氨酸或丝氨酸转化(氧化)为fGly。如本文所用，术语甲酰甘氨酸生成酶或FGE是指催化硫酸酯酶模体的半胱氨酸或丝氨酸转化为fGly的fGly生成酶。如美国专利第9,540,438号中所讨论，文献通常对将模体的半胱氨酸转化为fGly的那些酶使用术语甲酰甘氨酸生成酶，而将硫酸酯酶模体中的丝氨酸转化为fGly的酶被称为类Ats-B(Ats-B-like)。
适合由原核FGE转化的式(I)的硫酸酯酶模体通常在Z1处含有半胱氨酸或丝氨酸且在Z2处含有脯氨酸，其可分别由“SUMP I型”FGE或“Ats-B样”FGE修饰。可使用的原核FGE酶包括来自产气荚膜梭孢杆菌(Clostridium perfringens)(半胱氨酸型酶)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)(丝氨酸型酶)的酶或结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的FGE。在例如通过使用真核FGE在真核细胞或无细胞系统中表达和肽转化而制备含有硫酸酯酶模体的肽以通过真核FGE转化为含fGly的肽的情况下，可有利地采用适合于通过真核FGE转化的硫酸酯酶模体。
用于产生具有未转化硫酸酯酶模体的多肽或其中细胞表达适用于转化含fGly的多肽序列的FGE的宿主细胞包括原核生物和真核生物细胞。非限制性实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、杆菌属(Bacillus spp.)(例如，枯草杆菌(B.subtilis)等)、酵母或真菌(例如，酿酒酵母菌(S.cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia spp)等)。其他宿主细胞，包括源自高等生物，诸如昆虫和脊椎动物，特定来说哺乳动物的宿主细胞的实例包括但不限于：HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)第CCL-2号)、CHO细胞(例如，ATCC第CRL9618号和第CRL9096号)、CHO DG44细胞、CHO-Kl细胞(ATCC CCL-61)、293细胞(例如，ATCC第CRL-1573号)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC第CRL-1658号)、Hnh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC第CCLlO号)、PC12细胞(ATCC第CRL1721号)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC第CCLI.3号)、人胚胎肾(HEK)细胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2细胞等。
可将硫酸酯酶模体并入T细胞-MP的任何所需位置中。在一实施方案中，其可自氨基或羧基端的10或20个氨基酸中排除。在一实施方案中，可将硫酸酯酶模体添加至任何T细胞-MP元件中(例如，末端处或末端附近)，包括MHC-H或β2M多肽序列或接合其的任何接头序列(L3接头)。也可将硫酸脂肪酶模体添加至支架多肽(例如，Ig Fc)或存在于T细胞-MP中的任何接头(例如，L1至L6)中。
可将硫酸酯酶模体并入或连接至(例如，经由肽接头)T细胞-MP中的β2M多肽，该多肽β2M序列与图4中所展示的成熟β2M多肽序列的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa(例如，图4中所展示的自aa 21开始且在其C端结束的序列)具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。图4中的成熟人β2M多肽序列可经选择以用于并入硫酸酯酶模体。与β2M多肽的序列同一性是相对于图4中的β2M多肽的对应部分测定，不考虑所添加硫酸酯酶模体或任何接头或其他存在序列。
在一实施方案中，可将硫酸酯酶模体并入与图4中所展示的序列(图4中所展示的完整序列或自aa 21开始且在其C端结束的成熟多肽的序列)相比具有1至15个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)aa缺失、插入和/或变化的β2M多肽序列。评定变化，不考虑硫酸酯酶模体的aa和任何存在的接头序列。在一个此类实施方案中，可将硫酸酯酶模体置放和/或插入于成熟β2M序列的aa 1至15、15至35、35至55、40至50或50至70，诸如图4中所展示的那些aa内。在一个实施方案中，硫酸酯酶模体可位于图4的人成熟β2M多肽序列的aa 35至55之间(例如，aa 40至50之间)且与图4所展示的序列(图4中所展示的完整序列，或自aa 21开始且在其C端结束的成熟多肽的序列)相比可具有0至15个aa取代。
可将硫酸酯酶模体并入或连接至(例如，经由肽接头)I类MHC重链多肽序列，在添加硫酸酯酶模体之前，该序列与图3A至图3I中所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
在一实施方案中，所添加硫酸酯酶模体连接至T细胞-MP的N端或C端，或若存在，连接至位于T细胞-MP的N端或C端处的接头或在位于该接头内。
美国专利第9,540,438号论述将硫酸酯酶模体并入各种免疫球蛋白序列中，包括Fc区多肽，并且其通过引用将关于硫酸酯酶模体和修饰Fc多肽和其他多肽的教导并入本文中。也通过引用将其对FGE酶的指南以及其在形成fGly残基中的用途，以及与将诸如表位和有效负载的分子与fGly残基的偶联相关的化学并入该专利。
并入硫酸酯酶模体可通过在编码T细胞-MP的核酸中的所需位置处并入编码模体的核酸序列来实现。如下所述，可将核酸序列置于转录调控序列(启动子)的控制下且提供有导引其表达的调控元件。所表达蛋白质可在表达和部分或完全纯化后用一种或多种FGE进行处理。另选地，核酸在表达识别硫酸酯酶模体的FGE的细胞中的表达使得模体的半胱氨酸或丝氨酸转化为fGly。
鉴于上述，本发明提供T细胞-MP，其包含并入如上文所讨论的T细胞-MP多肽链中的一个或多个fGly残基。fGly残基可例如在序列X1(fGly)X2Z2X3Z3的上下文中，其中：fGly为甲酰甘氨酸残基；并且Z2、Z3、X1、X2和X3如上式(I)中所定义。可直接或经由肽或化学接头将表位和/或有效负载直接或间接缀合至硫酸酯酶模体的反应性甲酰基甘氨酸。化学缀合后，T细胞-MP包含并入序列X1(fGly’)X2Z2X3Z3的上下文中的一个或多个fGly'残基，其中fGly'残基为已经历化学反应且现具有共价连接的表位或有效负载的甲酰甘氨酸。
多种化学物质和市售试剂可用于将分子(例如，表位或有效负载)缀合至fGly残基，包括但不限于使用氨基硫脲、氨基氧基、酰肼或所述分子的肼衍生物以在含fGly的化学缀合位点处进行偶联。举例而言，携载氨基硫脲、氨基氧基、酰肼、肼基(hydrazino)或肼基(hydrazinyl)官能团(例如，直接或经由诸如PEG的接头连接至肽的aa)的表位(例如，肽表位)和/或有效负载可与含fGly的T细胞-MP多肽反应，以形成共价连接的表位。类似地，可使用例如生物素酰肼作为连接剂并入靶向序列和/或诸如药物和治疗剂的有效负载。
本发明提供制备包括T细胞-MP-表位缀合物和/或T细胞-MP-有效负载缀合物的缀合T细胞-MP的方法，该方法包括：
a)将编码包括丝氨酸或半胱氨酸的硫酸酯酶模体(例如，式(I)或(II)的硫酸酯酶模体，诸如上文所论述的X1CX2PX3Z3(SEQ ID NO:67)；CX1PX2Z3(SEQ ID NO:68))的核苷酸序列并入编码未缀合T细胞-MP的核酸中；
b)在细胞中表达含硫酸酯酶模体的未缀合T细胞-MP多肽，该细胞
i)表达FGE且将硫酸酯酶模体的丝氨酸或半胱氨酸转化为fGly，并且部分或完全纯化含fGly的未缀合T细胞-MP，或
ii)不表达将硫酸酯酶模体的丝氨酸或半胱氨酸转化为fGly的FGE，并且纯化或部分纯化含有硫酸酯酶模体的T细胞-MP，并且使经纯化或部分纯化的T细胞-MP与将硫酸酯酶模体的丝氨酸或半胱氨酸转化为fGly残基的FGE接触；和
c)使含fGly的多肽与表位和/或有效负载接触，该表位和/或有效负载已用在fGly的醛与表位和/或有效负载之间形成共价键的基团进行官能化；
从而形成T细胞-MP-表位缀合物和/或T细胞-MP有效负载缀合物。
在此类方法中，表位(含表位的分子)和/或有效负载可通过任何适合的官能团官能化，该官能团选择性地与醛基反应。举例而言，此类基团可选自由以下组成的组：氨基硫脲、氨基氧基、酰肼和肼基。在一实施方案中，将硫酸酯酶模体并入包含β2M aa序列的第二T细胞-MP中，该β2M aa序列与图4所展示的β2M序列的至少60、70、80或90个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)序列同一性(例如，具有在不包括硫酸酯酶模体序列的情况下或在添加硫酸酯酶模体序列之前计算的同一性的成熟β2M多肽)。
在制备T细胞-MP-表位缀合物和/或T细胞-MP有效负载缀合物的方法的一实施方案中，将硫酸酯酶模体并入包含如下序列的多肽中：与图3A至图3I所展示的序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性，其中在不包括添加硫酸酯酶模体序列的情况下计算序列同一性)。
b.分选酶A酶位点
可通过在那些位置处并入用于分选酶A缀合的位点而将表位(例如，包含表位的序列的肽)和有效负载连接于N端和/或C端T细胞-MP处。
分选酶A识别C端五肽序列LP(X5)TG/A(SEQ ID NO:69，其中X5为任何单一氨基酸且G/A为甘氨酸或丙氨酸)，并且在序列内的苏氨酸与缀合配偶体的N端中的甘氨酸或丙氨酸之间形成酰胺键。
为了将表位或有效负载连接至T细胞-MP多肽的C端部分，在所需多肽的羧基端部分中，诸如在暴露的L5接头中(参见图5结构A)提供LP(X5)TG/A。在包含表位(例如，在连接至表位的接头中)、肽有效负载(或连接至其的接头)或共价连接至非肽表位或有效负载的肽的N端提供一段暴露的甘氨酸或丙氨酸(例如，在使用来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的分选酶A时，(G)3-5SEQ ID NO:70和71；或在使用来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的分选酶A时，丙氨酸(A)3-5，SEQ ID NO:72和73)。
为了将表位或有效负载连接至T细胞-MP多肽的氨基端，在N端处提供包含一段暴露的甘氨酸(例如，(G)2、3、4或5)或丙氨酸(例如，(A)2、3、4或5)的aa序列，并且在包含表位(或连接至其的接头)的肽、肽有效负载(或连接至其的接头)或共价连接至非肽表位或有效负载的肽的羧基端部分中提供LP(X5)TG/A。
将分选酶A与上述氨基和羧基修饰的肽组合导致在LP(X5)TG/A序列中的Thr残基与Gly/Ala残基之间形成裂解且形成以下形式的共价偶联复合物：羧基修饰的多肽-LP(X5)T*G/A-氨基修饰的多肽，其中“*”表示形成于LP(X5)TG/A模体的苏氨酸与N端修饰的肽的甘氨酸或丙氨酸之间的键。
代替LP(X5)TG/A，LPETGG(SEQ ID NO:74)肽可用于金黄色葡萄球菌分选酶A偶联，或LPETAA(SEQ ID NO:75)肽可用于酿脓链球菌分选酶A偶联。缀合反应仍出现在苏氨酸与氨基末端寡甘氨酸或寡丙氨酸肽之间，以产生羧基修饰的肽-LP(X5)T*G/A-氨基修饰的肽，其中“*”表示形成于苏氨酸与N端修饰的肽的甘氨酸或丙氨酸之间的键。
c.转谷氨酰胺酶位点
转谷氨酰胺酶(mTG)催化在谷氨酰胺残基的侧链上的酰胺基与伯胺供体(例如，伯烷基胺，诸如发现于多肽的赖氨酸残基的侧链上)之间形成共价键。转谷氨酰胺酶可用于经由游离胺直接或经由包含游离胺的接头间接将表位和有效负载缀合至T细胞-MP。因此，在化学缀合位点可通过酶，诸如茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)转谷氨酰胺酶获取时，在转谷氨酰胺酶位点的上下文中添加至T细胞-MP的谷氨酰胺残基可以被视为化学缀合位点。该酶(EC 2.3.2.13)为稳定的非钙依赖性酶，其催化谷氨酰胺的γ-酰基转移至赖氨酸的ε-氨基。然而，序列中出现的谷氨酰胺残基并不总为可用于酶促修饰。有限的可用性可为有利的，此因为其限制了可能出现修饰的位置的数目。举例而言，细菌mTG通常无法修饰天然IgG1中的谷氨酰胺残基；然而，Schibli和其同事(Jeger,S.等人Angew Chem(Int Engl).2010；49:99957和Dennler P等人，Bioconjug Chem.2014；25(3):569–78)发现在N297处去糖基化IgG1使谷氨酰胺残基Q295变得可用，并且允许酶促接合以产生抗体药物缀合物。此外，通过产生N297至Q297IgG1突变体，其引入用于通过转谷氨酰胺酶进行酶促标记的两个位点。N297处的修饰还提供减少IgG Fc反应与补体C1q蛋白的相互作用的潜力。
在T细胞-MP不含有可用作化学缀合位点的谷氨酰胺(例如，转谷氨酰胺酶不可用或未置放于所需位置处)的情况下，可将谷氨酰胺残基添加至序列中以形成转谷氨酰胺酶位点，或可经由蛋白质工程改造将包含转谷氨酰胺酶可用的谷氨酰胺(有时称为“谷氨酰胺标签”或“Q-标签”)的序列并入多肽中。所添加谷氨酰胺或Q标签可用作表位或有效负载的化学缀合位点。美国专利公布第2017/0043033A1号描述并入谷氨酰胺残基以及Q标签和转谷氨酰胺酶对于修饰多肽的用途，并且就那些教导而言并入本文中。
并入谷氨酰胺残基和Q标签可在合成肽的情况下以化学方式完成，或通过修饰编码多肽的核酸且在细胞或无细胞系统中表达经修饰核酸来完成。在实施方案中，含谷氨酰胺的Q标签包含选自由以下组成的组的aa序列：LQG、LLQGG(SEQ ID NO:76)、LLQG(SEQ IDNO:77)、LSLSQG(SEQ ID NO:78)和LLQLQG(SEQ ID NO:79)(可获得多种其他序列)。
可将谷氨酰胺残基和Q标签并入T细胞-MP的任何所需位置中。在一实施方案中，可将谷氨酰胺残基和Q标签添加于任何T细胞-MP元件的(例如，末端处或其附近)，该元件包括MHC-H或β2M多肽序列或接合其的任何接头序列(L3接头)。也可将谷氨酰胺残基和Q标签添加至支架多肽(例如，Ig Fc)或存在于T细胞-MP中的任何接头(例如，L1至L6)。
可将谷氨酰胺残基和Q标签并入或连接至(例如，经由肽接头)T细胞-MP中的β2M多肽，该β2M多肽的序列与图4所展示的成熟β2M多肽序列(例如图4所展示的自aa 21开始且在其C端处结束的序列)的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。图4中的成熟人β2M多肽序列可经选择以用于并入谷氨酰胺残基或Q标签。与β2M多肽的序列同一性是相对于图4中的β2M多肽的对应部分测定，不考虑所添加谷氨酰胺残基、Q标签或任何接头或其他存在序列。
在一实施方案中，可将谷氨酰胺残基或Q标签并入β2M多肽序列中，该β2M多肽序列与图4所展示的序列(图4所展示的完整序列或自aa 21开始且在其C端处结束的成熟多肽的序列)相比具有1至15个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)aa缺失、插入和/或变化。评估变化，不考虑谷氨酰胺残基、Q标签和任何存在的接头序列的aa。在一个此类实施方案中，可将谷氨酰胺残基或Q标签置放和/或插入于成熟β2M序列的aa 1至15、15至35、35至55、40至50或50至70，诸如图4所展示的那些aa内。在一个实施方案中，谷氨酰胺残基或Q标签可位于图4的人成熟β2M多肽序列的aa 35至55(例如，40至50)之间且可有0至15个aa取代。
可将谷氨酰胺残基或Q标签并入或连接至(例如，经由肽接头)I类MHC重链多肽序列，在添加谷氨酰胺残基或Q标签之前，该I类MHC重链多肽序列与图3A至图3I所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
在一实施方案中，所添加谷氨酰胺残基或Q标签连接至T细胞-MP的N端或C端，或若存在，连接至位于T细胞-MP的N端或C端处的接头或在该接头内。
含有或已经修饰以含有伯胺基团的有效负载和表位可用作转谷氨酰胺酶催化反应中的胺供体，在谷氨酰胺残基(例如，Q标签中的谷氨酰胺残基)与表位或有效负载之间形成共价键。
在表位或有效负载不包含适用于使其其充当胺供体的伯胺的情况下，表位或有效负载可经化学修饰以并入氨基(例如，经修饰以通过连接至赖氨酸、氨基己酸、戊二胺等来并入伯胺)。在表位或有效负载包含肽且需要伯胺充当胺供体的情况下，可将转谷氨酰胺酶可对其起作用的赖氨酸或另一伯胺并入肽中。可提供伯胺基团且可并入α氨基酸链中或在其末端处的其他含胺化合物包括但不限于高赖氨酸、2,7-二氨基庚酸和氨基庚酸。另选地，可将表位或有效负载连接至包含适合氨基的肽或非肽接头。适合非肽接头的实例包括烷基接头和PEG(聚乙二醇)接头。
转谷氨酰胺酶可获自多种来源，包括来自以下的酶：哺乳动物肝脏(例如天竺鼠肝脏)；真菌(例如，卵菌类(Oomycetes)、放线菌属(Actinomycetes)、酵母菌属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、红曲菌属(Monascus)或根霉菌属(Rhizopus)转谷氨酰胺酶)；变形粘液菌属(myxomycetes)(例如，多头绒泡菌(Physarum polycephalum)转谷氨酰胺酶)和/或细菌，包括各种链轮丝菌属(Streptoverticillium)、链霉菌属(Streptomyces)、马杜拉放线菌属(Actinomadurasp.)、杆菌属(Bacillus)等。
Q标签可通过插入谷氨酰胺或通过修饰出现在Ig Fc、β2M中的谷氨酰胺残基和/或出现在T细胞-MP中的MHC-H链序列周围的aa序列而产生且用作用于添加表位或有效负载的化学缀合位点。类似地，可将Q标签并入Ig Fc区中作为化学缀合位点，所述化学缀合位点用于直接或经由携载伯胺的肽或化学接头间接缀合例如表位和/或有效负载。
d.硒代半胱氨酸和非天然氨基酸作为化学缀合位点
同于将位点特异性化学缀合位点提供至T细胞-MP多肽中的一种策略为插入反应性不同于多肽中所存在的天然存在的蛋白质原L-氨基酸的aa。此类aa包括但不限于硒代半胱氨酸(Sec)和非天然aa：乙酰苯丙氨酸(p-乙酰基-L-苯丙氨酸，pAcPhe)；对乙酰胺基苯丙氨酸和丙炔基-酪氨酸。Thanos等人在美国专利公布第20140051836A1号中论述一些其他非天然aa，包括O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸和对炔丙氧基-苯丙氨酸。其他非天然aa包括反应性基团，诸如氨基、羧基、乙酰基、肼基、酰肼基、半卡肼基、氢硫基、叠氮基和炔基。参见例如，美国专利公布第20140046030A1号。
除在实验室中直接合成多肽以外，已研发出两种利用终止密码子的方法以利用转录-翻译系统将非天然aa并入蛋白质和多肽中。第一方法通过将蛋白石终止密码子UGA与Sec插入序列进行配对来并入硒代半胱氨酸(Sec)。第二方法通常经由使用琥珀、赭石或蛋白石终止密码子将非天然aa并入至多肽中。还已报道使用其他类型的密码子，诸如独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子，以及使用无义和框移抑制。参见例如，美国专利公布第20140046030A1号和Rodriguez等人，PNAS 103(23)8650-8655(2006)。举例而言，可在体内或无细胞转录-翻译系统中使用含tRNA/胺酰tRNA合成酶对将非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸并入琥珀密码子处。
并入硒代半胱氨酸和非天然aa两者需要将必要终止密码子工程改造至T-细胞MP多肽的核酸编码序列中的所需位置处，此后编码序列用于在体内或无细胞转录-翻译系统中表达T细胞-MP。
体内系统通常依赖于经工程改造细胞系以将充当生物正交化学缀合位点的非天然aa并入多肽和蛋白质中。参见例如，标题为“In vivo incorporation of unnaturalamino acids.”的国际公布申请第2002/085923号。体内非天然aa并入依赖于与宿主细胞中的所有内源性tRNA和合成酶正交的tRNA和胺酰tRNA合成酶对。在细胞培养或发酵期间将所选择非天然aa补充至培养基中，使得细胞渗透性和稳定性成为重要考虑因素。
具备带电tRNA的各种无细胞合成系统也可用于并入非天然aa。此类系统包括描述于以下中的那些系统：美国专利公布第20160115487A1号；Gubens等人，RNA.2010年8月；16(8):1660–1672；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol Bioeng.66:180-8(1999)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Prog.16:385-90(2000)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.74:309-16(2001)；Swartz等人，Methods Mol.Biol.267:169-82(2004)；Kim,D.M.和Swartz,J.R.Biotechnol.Bioeng.85:122-29(2004)；Jewett,M.C.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:19-26(2004)；Yin,G.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.86:188-95(2004)；Jewett,M.C.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.87:465-72(2004)；Voloshin,A.M.和Swartz,J.R.,Biotechnol.Bioeng.91:516-21(2005)。
一旦并入T细胞-MP，携载与所并入硒代半胱氨酸或非天然aa具有反应性的基团的表位和/或有效负载在适合条件下与T细胞-MP接触以形成共价键。举例而言，pAcPhe的酮基对烷氧基胺具有反应性，并且经由肟偶联可直接缀合于含烷氧基胺的表位和/或有效负载或经由含烷氧基胺的接头间接缀合于表位和有效负载。硒代半胱氨酸与例如伯烷基碘(例如，可用作接头的碘乙酰胺)、顺丁烯二酰亚胺和甲基砜苯基噁二唑基团反应。因此，携载那些基团或结合至携载那些基团的接头的表位和/或有效负载可共价结合于携载硒代半胱氨酸的多肽链。
如上文关于其他化学缀合位点所述，可将硒代半胱氨酸和/或非天然aa并入T细胞-MP中的任何所需位置中。在一实施方案中，可将硒代半胱氨酸和/或非天然aa添加至任何T细胞-MP元件的(例如，末端处或其附近)，该T细胞-MP元件包括MHC-H或β2M多肽序列或接合其的任何接头序列(L3接头)。也可将硒代半胱氨酸和/或非天然aa添加至支架多肽(例如，Ig Fc)或存在于T细胞-MP中的任何接头(例如，L1至L6)。
可将硒代半胱氨酸和非天然aa并入或连接至(例如经由肽接头)T细胞-MP中的β2M多肽，该多肽β2M序列与图4中所展示的成熟β2M多肽序列(例如，图4中所展示的自aa 21开始且在其C端结束的序列)的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。图4中的成熟人β2M多肽序列可经选择以用于并入硒代半胱氨酸和非天然aa。与β2M多肽的序列同一性是相对于图4中的β2M多肽的对应部分测定，不考虑所添加硒代半胱氨酸、非天然aa或任何接头或其他存在序列。
在一实施方案中，可将硒代半胱氨酸或非天然aa并入β2M多肽序列中，该β2M多肽序列与图4中所展示的序列(图4中所展示的完整序列或自aa 21开始且在其C端结束的成熟多肽的序列)相比具有1至15个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)aa缺失、插入和/或变化。评估变化，不考虑硒代半胱氨酸、非天然aa和任何存在的接头序列。在一个此类实施方案中，可将硒代半胱氨酸或非天然aa置放和/或插入成熟β2M序列的aa 1至15、15至35、35至55、40至50或50至70，诸如图4中所展示的那些aa中。在一个实施方案中，硒代半胱氨酸或非天然aa可位于图4的人成熟β2M多肽序列的aa 35至55(例如，40至50)之间且可具有0至15个aa取代。
可将硒代半胱氨酸或非天然aa并入I类MHC重链多肽序列中或连接至(例如，经由肽接头)I类MHC重链多肽序列，在添加硒代半胱氨酸或非天然aa之前，该序列与图3A至图3I中所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
在一实施方案中，将所添加硒代半胱氨酸或非天然aa连接至T细胞-MP的N端或C端，或若存在，连接至位于T细胞-MP的N端或C端处的接头或在位于该接头内。在一个此类实施方案中，其可用作用于缀合例如表位、靶向序列和/或直接或经由肽或化学接头间接缀合于T细胞-MP的有效负载的位点。
e.氨基酸化学缀合位点
存在于天然存在的氨基酸侧链中或多肽末端处的各种官能团(例如，-SH、-NH3、-OH、-COOH等)中的任一种可用作化学缀合位点。此包括赖氨酸和半胱氨酸的侧链，所述侧链可分别容易地经包括N-羟基琥珀酰亚胺和顺丁烯二酰亚胺官能团的试剂修饰。利用此类氨基酸残基的主要缺点为产物的潜在可变性和异质性。举例而言，IgG具有超过80个赖氨酸，其中超过20个位于溶剂可及位点处。参见例如，McComb和Owen,AAPS J.117(2):339-351。半胱氨酸的分布倾向于较不广泛；其倾向于与二硫键接合，并且可能无法用(例如，溶剂或用于修饰半胱氨酸的分子不可及，并且不位于需要置放化学缀合位点的位置处。然而，可选择性地修饰T细胞-MP多肽以在用于置放化学缀合位点的所需位置处提供天然存在和如上所述的非天然存在的氨基酸。修饰可采取多肽的直接化学合成的形式(例如，通过偶联适当阻断的氨基酸)和/或通过修饰编码多肽的核酸序列，随后在细胞或无细胞系统中表达。因此，本发明包括且提供通过转录/翻译系统制备T细胞-MP多肽，该转录/翻译系统能够并入非天然aa或天然aa(包括硒代半胱氨酸)以用作用于表位或有效负载缀合的化学缀合位点。
本发明包括且提供通过以下制备T细胞-MP的一部分：转录/翻译系统和将携载非天然aa或天然aa(包括硒代半胱氨酸)的多肽接合至其C端或N端，该多肽例如通过化学合成制备。可通过任何适合方法接合可包括接头的多肽，该方法包括使用如上文针对肽表位所述的分选酶。在一实施方案中，多肽可包含可用于分选酶缀合和/或用作接头序列的一部分的具有2、3、4或5个丙氨酸或甘氨酸的序列。
待用作化学缀合位点的天然存在的aa(例如，半胱氨酸)可提供于T细胞-MP的任何所需位置处。在一实施方案中，天然存在的aa可提供于任何T细胞-MP元件(例如，末端处或其附近)，该T细胞-MP元件包括MHC-H或β2M多肽序列或接合其的任何接头序列(L3接头)。天然存在的aa也可提供于支架多肽(例如，Ig Fc)或存在于T细胞-MP中的任何接头(例如，L1至L6)中。
也可将天然存在的aa(例如，半胱氨酸)提供于T细胞-MP的β2M多肽中(例如经由蛋白质工程改造)或连接至β2M多肽(例如，经由肽接头)，该多肽β2M序列与图4中所展示的成熟β2M多肽序列(例如，图4中所展示的自aa 21开始且在其C端结束的序列)的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％，或甚至100％)aa序列同一性。图4中的成熟人β2M多肽序列可经选择以用于并入天然存在的aa。与β2M多肽的序列同一性是相对于图4中的β2M多肽的对应部分测定，不考虑所添加天然存在的aa、任何接头或其他存在序列。
在一实施方案中，可例如经由蛋白质工程改造将天然存在的aa(例如，半胱氨酸)提供于β2M多肽序列中，该β2M多肽序列与图4中所展示的序列(图4中所展示的完整序列或自aa 21开始且在其C端结束的成熟多肽的序列)相比具有1至15个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)aa缺失、插入和/或变化。评定变化，不考虑天然存在的aa、任何接头或其他存在的序列。在一个此类实施方案中，天然存在的aa(例如，半胱氨酸)可经工程改造(例如，使用分子生物学技术)于成熟β2M序列的aa 1至15、15至35、35至55、40至50或50至70，诸如图4中所展示的那些aa内。在一个实施方案中，天然存在的aa(例如，半胱氨酸)可提供于图4的人成熟β2M多肽序列的aa 35至55之间(例如，40与50之间、42与48之间、43与45之间或在aa 44处)且可具有0至15个aa取代。
可将天然存在的aa(例如，半胱氨酸)提供于I类MHC重链多肽序列中或连接至(例如，经由肽接头)I类MHC重链多肽序列，在添加天然存在的aa之前，该序列与图3A至图3I中所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
在一个实施方案中，可将天然存在的aa(例如，半胱氨酸)连接至T细胞-MP的N端或C端，或若存在，连接至位于T细胞-MP的N端或C端处的接头或位于该接头内。
在一个实施方案中，T细胞-MP含有至少一个天然存在的aa(例如，半胱氨酸)以用作例如经由蛋白质工程改造在如图4所展示的β2M序列、如图2A至图2G所展示的Ig Fc序列或如图3A至图3I所展示的I类MHC重链多肽中提供的化学缀合位点。在一个实施方案中，将待用作化学缀合位点的至少一个天然存在的氨基酸提供于多肽中，该多肽与如图4所展示的成熟β2M序列的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa、如图2所展示的Ig Fc序列具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性，或与图3A至图3I中的任一者所展示的I类MHC重链多肽的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。可提供至少一个天然存在的aa(例如，半胱氨酸)作为T细胞-MPβ2M aa序列中的化学缀合位点，该β2M aa序列与如图4中所展示的成熟β2M序列的至少氨基端10、20、30、40、50、60或70个aa具有至少90％(例如，至少93％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。可提供至少一个天然存在的aa(例如，半胱氨酸)作为T细胞-MP Ig Fc序列(例如，如图2A至图2G中的任一者所展示)中的化学缀合位点。可提供至少一个天然存在的aa(例如，半胱氨酸)作为T细胞-MP I类MHC重链多肽序列中的化学缀合位点，该I类MHC重链多肽序列与图3A至图3I中的任一者提供的MHC H多肽序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。在另一实施方案中，将待用作化学缀合位点的至少一个天然存在的aa提供于T细胞-MP多肽中，该T细胞-MP多肽包含与如图3A至图3I中的任一者所展示的I类MHC重链序列或如图4所展示的成熟β2M序列具有100％aa序列同一性的至少30、40、50、60、70、80、90或100个连续aa。
在其中例如经由蛋白质工程改造在多肽中提供天然存在的aa的任何上述实施方案中，aa可选自由以下组成的组：精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺。另选地，经提供作为缀合位点的aa选自由以下组成的组：赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺。经提供作为缀合位点的aa也可选自由以下组成的组：赖氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸。在一种情况下，所提供aa为半胱氨酸。在另一情况下，所提供aa为赖氨酸。在又另一情况下，所提供aa为谷氨酰胺。
可使用本领域已知的任何方法将有效负载或表位偶联至提供于未缀合T细胞-MP中的氨基酸。举例而言，顺丁烯二酰亚胺可用于偶联巯基，N-羟基琥珀酰亚胺可用于偶联氨基、酸酐，或氯可用于偶联醇或胺，并且脱水剂可用于将醇或胺偶联至羧酸基团。因此，使用此类化学物质，可将表位或有效负载直接或经由接头(例如，同或异双官能交联剂)间接偶联至未接合T细胞-MP多肽上的位置。可使用多种双官能交联剂，包括但不限于关于本文下文所述将有效负载连接至的T细胞-MP所描述的那些。举例而言，包括借助于同或异双官能接头(参见例如，图9)连接的顺丁烯二酰亚胺基的肽表位(或含肽的有效负载)或顺丁烯二酰亚胺氨基酸可缀合于天然存在或提供于T细胞-MP中的化学缀合位点(例如，半胱氨酸残基)的巯基。
可使用Diels-Alder/retro-Diels-Alder保护流程将顺丁烯二酰亚胺氨基酸直接并入肽(例如，肽表位)中作为固相肽合成的一部分。参见例如，Koehler,KennethChristopher(2012),“Development and Implementation of Clickable Amino Acids,”Chemical&Biological Engineering Graduate Theses&Dissertations,31,https://scholar.colorado.edu/chbe_gradetds/31。
也可使用同或异双官能接头(有时称为交联剂)将顺丁烯二酰亚胺基附加至表位(例如，肽表位)，该接头将顺丁烯二酰亚胺直接(或例如经由可包含结合于表位的额外aa的插入接头间接地)连接至表位(例如，肽表位)。举例而言，异双官能N-羟基琥珀酰亚胺-顺丁烯二酰亚胺交联剂可将顺丁烯二酰亚胺连接至肽赖氨酸的氨基上。一些特定交联剂包括可将顺丁烯二酰亚胺连接至胺(例如赖氨酸的ε氨基)的具有顺丁烯二酰亚胺官能性和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)或N-琥珀酰亚胺基的分子。此类交联剂的实例包括但不限于：NHS-PEG4-顺丁烯二酰亚胺、γ-顺丁烯二酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)；ε-顺丁烯二酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)；间顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-(α-顺丁烯二酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)，其为肽固定提供不同长度和特性。并入顺丁烯二酰亚胺基的其他胺反应性交联剂包括4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)。下文列举其他交联剂(双官能剂)。在一实施方案中，偶联至T细胞-MP的表位具有通过任选的接头偶联至肽的顺丁烯二酰亚胺烷基羧酸(参见例如图9)，该接头例如通过与赖氨酸的ε氨基形成的酰胺偶联。顺丁烯二酰亚胺基羧酸可为例如顺丁烯二酰亚胺基乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸或辛酸。
可经由包含并入肽中的顺丁烯二酰亚胺或顺丁烯二酰亚胺氨基酸的双官能接头将肽表位偶联至存在或提供于(例如工程改造化至)例如T细胞-MP的缀合袋中的天然存在的半胱氨酸，从而形成T细胞-MP表位缀合物。可将肽表位缀合(例如，通过一个或两个顺丁烯二酰亚胺氨基酸或含至少一个顺丁烯二酰亚胺的双官能接头)于具有半胱氨酸残基的MHC重链中的MHC-H缀合袋内或其附近的任何一个或多个位置处。举例而言，包含顺丁烯二酰亚胺氨基酸或携载顺丁烯二酰亚胺基作为连接至肽的交联剂的一部分的肽表位可共价连接于具有如同图3D至图3I中所编号的MHC-H位置2、5、7、59、84、116、139、167、168、170和/或171(例如，Y7C、Y59C、Y116C、A139C、W167C、L168C、R170C和Y171C取代)的1或2个aa(例如，半胱氨酸)处。也可将肽表位偶联(例如，通过一个或两个顺丁烯二酰亚胺氨基酸或含至少一个顺丁烯二酰亚胺的双官能接头)至具有半胱氨酸残基的MHC重链中的选自具有如图3D至图3H中所编号的位置7和/或116(例如，Y7C和Y116C取代)的任何一个或多个(例如，1或2个)aa位置处。位于具有如图3D至图3H中所编号的位置116(例如，Y116C)和/或167(例如，W167C)处的半胱氨酸取代可单独或组合用于利用一或两个通过顺丁烯二酰亚胺基形成的键锚定表位(例如，肽表位)(例如，在含有表位的肽的一端或两端处)。
也可将肽表位偶联至存在或提供于(例如，工程改造化至)β2M多肽序列中的天然存在的半胱氨酸，该序列与图4所阐述的成熟β2M多肽序列的至少60个连续氨基酸(例如，至少70、80、90个或所有连续aa)具有至少85％(例如，至少90％、95％、97％或100％)序列同一性。可经半胱氨酸取代以产生化学缀合位点的成熟β2M多肽的一些溶剂可及位置包括：来自NP_004039.1的成熟多肽的2、14、16、34、36、44、45、47、48、50、58、74、77、85、88、89、91、94和98(Gln 2、Pro 14、Glu 16、Asp 34、Glu 36、Glu 44、Arg 45、Glu 47、Arg 48、Glu 50、Lys58、Glu 74、Glu 77、Val 85、Ser 88、Gln 89、Lys 91、Lys 94和Asp 98)，或其在其他β2M序列中的对应氨基酸(参见图4中的序列比对)。举例而言，可将表位缀合于成熟β2M多肽的位置2、44、50、77、85、88、91或98(如图4所展示的成熟β2M多肽的aa 22、64、70、97、105、108、111或118)。因此，T细胞-MP的β2M序列可含有选自Q2C、E44C、E50C、E77C、V85V、S88C、K91C和D98C的成熟β2M序列中提供(例如，通过蛋白质工程改造)的半胱氨酸化学缀合位点。β2M序列中的半胱氨酸化学缀合位点也可与MHC-H Y84C和A139C取代组合，进行所述取代以通过在MHC-H序列之间形成链内二硫键来使MHC H稳定。在一种情况下，提供于成熟β2M中的半胱氨酸化学缀合位点位于E44处(E44C取代)。在另一情况下，提供于成熟β2M中的半胱氨酸化学缀合位点位于E44处(E44C取代)，并且β2M序列还包含形成链内二硫键的MHC-H Y84C和A139C取代。
在待经由存在于未缀合T细胞-MP中的半胱氨酸化学缀合位点缀合表位、靶向序列和/或有效负载(例如，使用顺丁烯二酰亚胺修饰的表位或有效负载)的情况下，各种工艺条件可影响由缀合反应产生的缀合T细胞-MP的缀合效率和质量(例如，由反应产生的未聚集双链体T细胞-MP表位缀合物的量/分率)。可经单独最优化的缀合工艺条件包括但不限于：(i)在缀合前，解阻断半胱氨酸巯基(例如，可存在和移除潜在的阻断基)；(ii)T细胞-MP与表位或有效负载的比；(iii)反应pH；(iv)所使用缓冲液；(v)存在于反应中的添加剂；(vi)反应温度；和(vii)反应时间。
在缀合之前，T细胞-MP可用二硫化物还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)、巯乙醇或三(2-羧乙基)膦(TCEP)来处理，以还原和释放可经阻断的半胱氨酸巯基。可使用相对少量的还原剂，例如约0.5至2.0还原当量/半胱氨酸缀合位点进行处理，持续相对较短时段，并且未缀合T细胞MP的半胱氨酸化学缀合位点可用作反应性亲核剂用于缀合约10分钟至约1小时或约1小时至5小时。
未缀合T细胞-MP与经缀合表位或有效负载的比可介于约1:2至约1:100，诸如约1:2至约1:3、约1:3至约1:10、约1:10至约1:20、约1:20至约1:40或约1:40至约1:100。可使用连续添加反应性表位或有效负载来驱动偶联反应完成(例如，可添加多剂量的顺丁烯二酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺修饰的表位以与T细胞-MP反应)。
如先前所指示，缀合反应可能会受缓冲液、其pH和可能存在的添加剂影响。对于将顺丁烯二酰亚胺偶联至存在于T细胞-MP中的反应性半胱氨酸而言，反应通常在约pH 6.5至约pH 8.5(例如，约pH 6.5至约pH 7.0、约pH 7.0至约pH 7.5、约pH 7.5至约pH 8.0或约pH8.0至约pH 8.5之间进行。不含活性亲核剂(例如，反应性硫醇)且优选地经脱气以避免巯基再氧化的任何适合缓冲液均可用于该反应。一些适合的传统缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris-HCl和(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)HEPES。作为传统缓冲液的替代，顺丁烯二酰亚胺缀合反应可在包含氨基酸，诸如精氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨酸的缓冲液/反应混合物中进行。使用高浓度氨基酸，例如约0.1M(摩尔)至约1.5M(例如，约0.1至约0.25、约0.25至约0.5、约0.3至约0.6、约0.4至约0.7、约0.5至约0.75、约0.75至约1.0、约1.0至约1.25M或约1.25至约1.5M)可使缀合和/或未缀合T细胞-MP稳定。
可用于顺丁烯二酰亚胺和其他缀合反应的添加剂包括但不限于：蛋白酶抑制剂；金属螯合剂(例如EDTA)，其可阻断非所需副反应且抑制金属依赖性蛋白酶(若存在)；清洁剂(例如，以TWEEN
Figure BDA0004113828220000501
出售的聚山梨醇酯80，或以名称NP40和TergitolTM NP出售的壬基苯氧基聚乙氧乙醇)；和多元醇，诸如蔗糖或甘油，其可增强蛋白质稳定性。
T细胞-MP与表位、靶向序列和/或有效负载的缀合，并且特定来说使用顺丁烯二酰亚胺化学物质在半胱氨酸处的缀合，可在一个温度范围内进行，诸如0°至40℃。举例而言，缀合反应，包括半胱氨酸-顺丁烯二酰亚胺反应，可在约0°至约10℃、约10°至约20℃、约20°至约30℃、约25°至约37℃或约30°至约40℃下(例如，在约20℃下、在约30℃或在约37℃下)进行。
在存在一对巯基的情况下，其可以同时用于化学缀合于T细胞-MP。在此类实施方案中，具有二硫键或具有提供于彼此邻近的位置处的两个半胱氨酸(或硒代半胱氨酸)的未缀合T细胞-MP可通过并入双硫醇接头而用作化学缀合位点。由Godwin和其同事描述的双硫醇接头通过在其位置中形成桥接基团来避免与还原二硫键相关的不稳定性，并且同时允许并入另一分子，该分子可为表位或有效负载。参见例如，Badescu G等人，(2014),BioconjugChem.,25(6):1124–36,标题为Bridging disulfides for stable and defined antibodydrug conjugates，其描述使用并入亲水接头(例如，PEG(聚乙二醇)接头)的双砜试剂。
一般而言，使用化学计量或接近化学计量的二硫醇还原剂(例如，二硫苏糖醇)来还原二硫键且允许双硫醇接头与半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸残基两者反应。在存在多个二硫键的情况下，使用化学计量或接近化学计量的还原剂可允许在一个位点处进行选择性修饰。参见例如，Brocchini等人，Adv.Drug.Delivery Rev.(2008)60:3-12。在T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸(例如，硒代半胱氨酸和半胱氨酸)时，其可经提供于多肽中(通过引入半胱氨酸或硒代半胱氨酸中的一种或两种)，以提供可与双硫醇接头相互作用的一对残基。半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸的定位应使得双硫醇接头可将其桥接(例如，位于两个半胱氨酸可形成二硫键的位置处)。可使用半胱氨酸和硒代半胱氨酸的任何组合(以及，两个半胱氨酸、两个硒代半胱氨酸或一个硒代半胱氨酸和一个半胱氨酸)。半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸可均存在于T细胞-MP上。另选地，在双链体T细胞-MP中，第一半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸存在于双链体的第一T细胞-MP中；并且第二半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸存在于双链体的第二T细胞-MP中，其中双硫醇接头充当双链体T细胞-MP之间的共价桥。
在一实施方案中，将一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸残基并入T细胞-MP的β2M序列中，在添加一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸对，和/或并入连接至那些序列中的一种的L2或L3肽接头中之前，该β2M序列与如图4所展示的成熟β2M多肽序列的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。在一个此类实施方案中，该对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸可用作双硫醇接头偶联位点，以经由连接至双硫醇基团的肽或化学接头缀合表位和/或有效负载。
在另一实施方案中，将一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸并入T细胞-MP的MHC-H多肽序列中作为化学缀合位点。在一实施方案中，将一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸并入包含如下序列的多肽中：在添加该对半胱氨酸或硒代半胱氨酸或添加并入至连接至那些序列中的一种的肽接头中之前，该序列与图3A至图3I中的任一者所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。在一个此类实施方案中，该对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸可用作双硫醇接头偶联位点，以经由连接至双硫醇接头的肽或化学接头缀合表位和/或有效负载。在MHC-H序列包括Y84C和A139C取代的情况下，双硫醇接头可用于在用于共价偶联表位(例如，肽表位)的那些位点之间形成共价桥。
在另一实施方案中，将一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸并入T细胞-MP的Ig Fc序列中，以提供化学缀合位点。在一实施方案中，将一对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸并入包含Ig Fc序列的多肽中，在添加该对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸之前，该Ig Fc序列与图2A至图2G中的任一Fc序列所展示的序列具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。在一个此类实施方案中，该对半胱氨酸和/或硒代半胱氨酸用作双硫醇接头偶联位点，以经由连接至双硫醇基团的肽或化学接头缀合表位和/或有效负载。双硫醇接头可用于在双链体T细胞-MP的支架多肽之间形成共价桥。在此类情况下，形成链间二硫键的下部铰链区的半胱氨酸(若存在于Ig Fc支架多肽序列中)可用于插入双硫醇接头。
f.其他化学缀合位点
(i)碳水化合物化学缀合位点
通过细胞表达制备的许多蛋白质含有添加的碳水化合物(例如，添加至哺乳动物细胞中所表达的抗体中的寡糖类型)。因此，在通过细胞表达制备T细胞-MP的情况下，碳水化合物可存在且例如在乙二醇缀合反应中，特定来说在T细胞-MP包含Ig Fc支架的情况下可用作选择性化学缀合位点。McCombs和Owen,AAPS Journal,(2015)17(2):339-351，以及其中引用的参考文献描述将碳水化合物残余物用于分子与抗体的乙二醇缀合。
碳水化合物残余物的添加和修饰也可通过使用改变碳水化合物的化学物质(例如，引入醛基的高碘酸盐)，或通过可并入化学反应性碳水化合物或碳水化合物类似物以用作化学缀合位点的酶(例如，岩藻糖基转移酶)的作用来离体进行。在一实施方案中，通过已知糖基化位点并入Ig Fc支架可用于引入位点特异性化学缀合位点。
本发明包括且提供具有作为化学缀合(例如，乙二醇缀合)位点的碳水化合物的T细胞-MP。
本发明还包括且提供此类分子在形成具有表位和具有其他分子，诸如靶向序列、药物和诊断剂有效负载的缀合物中的用途。
(ii)核苷酸结合位点
核苷酸结合位点经由使用可共价连接至结合位点的UV反应性部分来提供位点特异性官能化。Bilgicer等人，Bioconjug Chem.(2014)25(7):1198–202报道可在核苷酸结合位点处共价连接至IgG的吲哚-3-丁酸(IBA)部分的使用。通过并入形成核苷酸结合位点所需的序列，T细胞-MP与经适当修饰的表位和/或携载反应性核苷酸的其他分子(例如，有效负载药物或诊断剂)的化学缀合物可用于制备T细胞-MP-表位缀合物。可经由反应性实体(例如，IBA部分)直接或经由插入的接头间接将表位或有效负载偶联至核苷酸结合位点。
本发明包括且提供具有作为化学缀合位点的核苷酸结合位点的T细胞-MP。本发明还包括且提供此类分子在形成与表位和其他分子，诸如药物和诊断剂形成缀合物中的用途，以及那些分子在治疗和诊断方法中的用途。
3T细胞-MP的MHC多肽
如上所述，T细胞-MP包括MHC多肽。出于本发明的目的，术语“主要组织相容性复合体(MHC)多肽”意谓包括各种物种的I类MHC多肽，包括人MHC(也称为人白细胞抗原(HLA))多肽、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)MHC多肽和其他哺乳动物物种(例如，兔类动物、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、山羊等)等的MHC多肽。术语“MHC多肽”意谓包括I类MHC多肽(例如，β-2微球蛋白和I类MHC重链和/或其部分)。T细胞-MP中的β2M和MHC-H链序列两者(可能来自人。除非另有明确说明，否则本文所述的T细胞-MP和T细胞-MP-表位缀合物不意图包括MHC-H链的膜锚定结构域(跨膜区)，或该分子中足以将T细胞-MP或其肽锚定至表达其的细胞(例如，真核细胞，诸如哺乳动物细胞)的部分。另外，存在于T细胞-MP中的MHC-H链不包括与天然I类MHC重链相关的信号肽、跨膜结构域或细胞内结构域(胞质尾)。因此，例如，在一些情况下，存在于T细胞-MP中的MHC-H链仅包括I类MHC重链的α1、α2和α3结构域。存在于T细胞-MP中的I类MHC重链的长度可为约270个氨基酸(aa)至约290个aa。存在于T细胞-MP中的I类MHC重链的长度可为270个aa、271个aa、272个aa、273个aa、274个aa、275个aa、276个aa、277个aa、278个aa、279个aa、280个aa、281个aa、282个aa、283个aa、284个aa、285个aa、286个aa、287个aa、288个aa、289个aa或290个aa。
在某些情况下，T细胞-MP的MHC-H和/或β2M多肽为人源化或人MHC多肽，其中人MHC多肽也称为“人白细胞抗原”(“HLA”)多肽，更具体来说I类HLA多肽，例如，β2M多肽，或I类HLA重链多肽。可包括于T细胞-MP中的I类HLA重链多肽包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和/或HLA-G重链多肽。T细胞-MP的I类HLA重链多肽可包含与图3A至图3I中所描绘的任何人HLA重链多肽的aa序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的多肽序列(例如，涵盖α1、α2和α3结构域的序列)。举例而言，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代(除经指示为在图3E至图3I的重链共有序列中可变的那些位置以外)。
举例而言，多聚体多肽的I类MHC重链多肽可包含与图3A、图3B和/或图3C中所描绘的人HLA-A重链多肽的aa 25至300(缺少所有或实质上所有前导、跨膜和细胞质序列)或25至365(缺少前导序列)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列。
a.I类MHC重链
I类人MHC多肽可来自经典HLA等位基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)或非经典HLA等位基因(例如HLA-E、HLA-F和HLA-G)。以下为可并入T细胞-MP和其表位缀合物中的MHC-H等位基因和那些等位基因的变体的非限制性实例。
(i)HLA-A重链
可并入T细胞-MP中的HLA-A重链肽序列或其部分包括但不限于等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303和A*3401，其在无图3E中的所有或实质上所有前导序列、跨膜序列和细胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一种可包含在一个或多个位置84和/或139(如图3E所展示)处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。另外，也可将与那些HLA-A等位基因的序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的HLA-A序列并入T细胞-MP中(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。T细胞-MP的HLA-A重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(a)HLA-A*0101(HLA-A*01:01:01:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含HLA-A*01:01:01:01(在图3D(SEQ ID NO:24)和图3E中列出作为HLA-A的HLA-A*0101或HLA-A*01:01)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-A重链多肽与图3D中标记为HLA-A的序列具有小于100％的同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-A*0101重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(b)HLA-A*0201(HLA-A*02:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的MHC I重链多肽可包含提供于图3D或图3E中的HLA-A*0201(SEQ ID NO:27)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-A*0201重链多肽与图3D或图3E中标记为HLA-A*0201的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-A*0201重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(c)HLA-A*1101(HLA-A*11:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含提供于图3D或图3E中的HLA-A*1101(SEQ ID NO:32)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。HLA-A*1101重链等位基因可在亚洲人群中很突出，包括亚裔人群。
在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-A*1101重链多肽与图3D或图3E中标记为HLA-A*1101的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-A*1101重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(d)HLA-A*2402(HLA-A*24:02)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含提供于图3D或图3E中的HLA-A*2402(SEQ ID NO:33)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。HLA-A*2402重链等位基因可在亚洲人群中很突出，包括亚裔人群。
在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-A*2402重链多肽与图3D或图3E中标记为HLA-A*2402的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-A*2402重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(e)HLA-A*3303(HLA-A*33:03)或HLA-A*3401(HLA-A*34:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含提供于图3D或图3E中的HLA-A*3303(SEQ ID NO:34)或HLA-A*3401(SEQ ID NO:38)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。HLA-A*3303重链等位基因可在亚洲人群中很突出，包括亚裔人群。
在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-A*3303或HLA-A*3401重链多肽与图3D中标记为HLA-A*3303的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-A*3303或HLA-A*3401重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(ii)HLA-B重链。
可并入T细胞-MP中的HLA-B重链肽序列或其部分包括但不限于等位基因：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601和B*5301，其在不具有图3F中的所有或实质上所有前导序列、跨膜序列和细胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一种可包含在一个或多个位置84和/或139(如图3F所展示)处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。另外，也可将与那些HLA-B等位基因的序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的HLA-B序列并入T细胞-MP中(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。T细胞-MP的HLA-B重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(a)HLA-B*0702(HLA-B*07:02)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含图3D中的HLA-B*0702(SEQ ID NO:25)(图3D中标记为HLA-B)、HLA-B*03501、HLA-B*4402、HLA-B*4403、HLA-B*5801的aa序列或与那些序列中的任一种的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-B重链多肽与图3D中标记为HLA-B的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-B*0702重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(b)HLA-B*3501(HLA-B*35:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含HLA-B*3501：GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQF VRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRESLRNLRGYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP的aa序列(经展示缺少其信号序列和跨膜/细胞内区域SEQ ID NO:80)或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，序列可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-B*3501重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(c)HLA-B*4402(HLA-B*44:02)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含HLA-B*4402：GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFITVGYVDDTLF VRFDSDATSPRKEPRAPWIEQEGPEYWDRETQISKTNTQTYRENLRTALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGYDQDAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQDRAYLEGLCVESLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEVTLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP的aa序列(经展示缺少其信号序列和跨膜/细胞内区域SEQ ID NO:81)或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，序列可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-B*4402重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(d)HLA-B*4403(HLA-B*44:03)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含HLA-B*4403：GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFITVGYVDDTLF VRFDSDATSPRKEPRAPWIEQEGPEYWDRETQISKTNTQTYRENLRTALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGYDQDAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVESLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEVTLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP的aa序列(经展示缺少其信号序列和跨膜/细胞内区域SEQ ID NO:82)或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，序列可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-B*4403重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(e)HLA-B*5801(HLA-B*58:01)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含HLA-B*58:01：GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQF VRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP的aa序列(经展示缺少其信号序列和跨膜/细胞内区域SEQ ID NO:83)或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，序列可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-B*5901重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(iii)HLA-C重链
可并入T细胞-MP中的HLA-C重链多肽序列或其部分可包括但不限于等位基因：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0702、C*0801和C*1502，其在不具有图3G中的所有或实质上所有前导、跨膜或细胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一种可包含在一个或多个位置84、139和/或236(如图3G所展示)处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。另外，也可将与那些HLA-C等位基因的序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的HLA-C序列并入T细胞-MP中(例如，其可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。T细胞-MP的HLA-C重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(a)HLA-C*701(HLA-C*07:01)和HLA-C*702(HLA-C*07:02)
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含图3G中的HLA-C*701(SEQ ID NO:23)或HLA-C*702(SEQ ID NO:54)的aa序列(图3D中标记为HLA-C)或与那些序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的序列(例如，其相对于那些序列可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，在T细胞-MP的HLA-C重链多肽与图3D中标记为HLA-C的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的HLA-C*701或HLA-C*0702重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(iv)非经典HLA-E、HLA-F和HLA-G重链
可并入T细胞-MP中的非经典HLA重链肽序列或其部分包括但不限于HLA-E、HLA-F和/或HLA-G等位基因的那些。那些等位基因(以及HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)的序列可见于万维网的例如hla.alleles.org/nomenclature/index.html处、欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(www.ebi.ac.uk)，其为欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory；EMBL)的一部分；和美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov)。
一些适合HLA-E等位基因包括但不限于：HLA-E*0101(HLA-E*01:01:01:01)、HLA-E*01:03(HLA-E*01:03:01:01)、HLA-E*01:04、HLA-E*01:05、HLA-E*01:06、HLA-E*01:07、HLA-E*01:09和HLA-E*01:10。一些适合HLA-F等位基因包括但不限于：HLA-F*0101(HLA-F*01:01:01:01)、HLA-F*01:02、HLA-F*01:03(HLA-F*01:03:01:01)、HLA-F*01:04、HLA-F*01:05和HLA-F*01:06。一些适合HLA-G等位基因包括但不限于：HLA-G*0101(HLA-G*01:01:01:01)、HLA-G*01:02、HLA-G*01:03(HLA-G*01:03:01:01)、HLA-G*01:04(HLA-G*01:04:01:01)、HLA-G*01:06、HLA-G*01:07、HLA-G*01:08、HLA-G*01:09:HLA-G*01:10、HLA-G*01:11、HLA-G*01:12、HLA-G*01:14、HLA-G*01:15、HLA-G*01:16、HLA-G*01:17、HLA-G*01:18:HLA-G*01:19、HLA-G*01:20和HLA-G*01:22。不具有所有或实质上所有前导序列、跨膜序列和细胞质序列的那些HLA-E、HLA-F和HLA-G等位基因的共有序列提供于图3H中，并且与提供于图3E至图3G和图3I中的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的共有序列进行比对。
任何上述HLA-E、HLA-F和/或HLA-G等位基因可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，如图3I关于共有序列所展示。在一实施方案中，取代可以选自：位置84酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)或半胱氨酸(Y84C)，或在HLA-F的情况下，R84A或R84C取代；和/或位置139丙氨酸到半胱氨酸(A139C)，或在HLA-F的情况下，V139C取代。另外，也可使用与图3I中所阐述的任何共有序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％aa序列同一性的HLA-E、HLA-F和/或HLA-G序列(例如，除其中所列出的可变残基处的变化之外，序列可包含1至25、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。T细胞-MP的HLA-E、HLA-F或HLA-G重链多肽序列可包含在位置84和139处的半胱氨酸。
(v)小鼠H2K
T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的I类MHC重链多肽可包含小鼠H2K(SEQ ID NO:28)(图3D中的小鼠H2K)的aa序列或与该序列的所有或部分(例如，50、75、100、150、200、225、250或260个连续aa)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的序列(例如，其可包含1至30、1至5、5至10、10至15、15至20、20至25或25至30个aa插入、缺失和/或取代)。在一实施方案中，在T细胞-MP的小鼠H2K重链多肽与图3D中标记为小鼠H2K的序列具有小于100％同一性的情况下，其可包含在一个或多个位置84和/或139处的取代，该取代选自：位置84处的酪氨酸取代为丙氨酸(Y84A)；位置84处的酪氨酸取代为半胱氨酸(Y84C)；和位置139处的丙氨酸取代为半胱氨酸(A139C)。T细胞-MP的小鼠H2K重链多肽序列可包含Y84C和A139C取代。
(vi)MHC多肽中的氨基酸取代对T细胞-MP的影响
(a)位置84和139处的取代
特定来说在MHC H链的位置84(参见图3I)为酪氨酸残基时，用诸如丙氨酸的小氨基酸取代(Y84A)倾向于打开MHC结合袋的一端，允许接头(例如，连接至肽表位)“穿过”袋的该端，并且因此允许可嵌入MHC袋中且由T细胞-MP呈递的表位的大小的更大变化(例如，携载表位序列的更长的肽)。另选地，T细胞-MP的MHC-H(例如，HLA-重链)可经半胱氨酸取代以在经取代至α1螺旋中的羧基末端部分中的半胱氨酸与α2-1螺旋的氨基末端部分中的半胱氨酸(例如，氨基酸84与139)之间形成链内二硫键。此类二硫键使T细胞-MP的MHC-H多肽序列稳定，并且允许其在不存在结合肽表位(或无效肽)下翻译、细胞处理和自真核细胞分泌。下表中所提供的残基84和130处提供的取代的任何组合可与表位结合槽中的取代，诸如位置116和167处所描述的那些取代的任何组合进行组合。
(b)位置116和167处的取代
任何I类MHC重链序列(包括上文针对以下所公开的那些序列：HLA-A*0101；HLA-A*0201；HLA-A*1101；HLA-A*2402；HLA-A*3303；HLA-B；HLA-C；小鼠H2K或本文所公开的任何其他HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和/或HLA-G序列)也可在位置116(例如，Y116C)或位置167处进一步包含半胱氨酸取代。
与打开MHC-H结合袋的一端(例如，Y84A或其等效物)的aa位置84取代一样，位置167处的丙氨酸或甘氨酸的取代(例如，W167A取代或其等效物)打开MHC结合袋的另一端，产生沟槽，该沟槽允许可由T细胞-MP-表位缀合物呈递的肽表位的更大变化(例如，更长的长度)。位置84和/或167处的取代或其等效物(例如，Y84A与W167A或W167G的组合)可组合使用以修饰MHC-H链的结合袋。位置116(例如，Y116C)和/或167(例如，W167C)处的半胱氨酸取代可单独或组合使用以将表位(例如，肽表位)锚定于一个或两个位置(例如，含表位的肽的末端)中。位置116和/或位置167处的取代可与包括上文所述的位置84和/或139处的那些的取代组合。
下表列出可并入T细胞-MP中的一些MHC重链序列修饰。
可并入T细胞-MP或其表位缀合物中的1类MHC重链序列修饰的一些组合
Figure BDA0004113828220000671
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Figure BDA0004113828220000681
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Figure BDA0004113828220000691
Figure BDA0004113828220000692
序列同一性范围为相对于图3D至图3H中所列序列的对应部分的并入T细胞-MP中的MHC-H多肽序列的序列同一性的允许范围，当共有序列用于比较时，不计入可变残基。
b.I类MHCβ2-微球蛋白和与MHC-H多肽的组合
T细胞-MP的β2M多肽可为人β2M多肽、非人灵长类β2M多肽、鼠β2M多肽等。在一些情况下，β2M多肽包含与图4所描绘的β2Maa序列(例如成熟β2M序列)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列。T细胞-MP的β2M多肽可包含与图4所描绘的β2M aa序列的aa 21至119具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列的aa序列，当同一性小于100％时，其可包括半胱氨酸或其他aa取代或插入作为用于表位连接(例如，和E44C取代)的化学缀合位点。化学缀合位点可位于例如β2M多肽序列中的溶剂可及位置处。
T细胞-MP的β2M多肽序列可与成熟人β2M多肽的至少70个(例如，至少80、90、96、97、98个或所有)连续aa(例如，提供于图4中的NCBI登录号NP_004039.1的aa 21至119)具有至少90％(例如，至少95％或98％)或100％序列同一性。举例而言，T细胞-MP的β2M多肽序列可在成熟人β2M多肽的至少70个(例如，至少80、90、96、97或98个或所有)连续aa(例如，提供于图4中的NCBI登录号NP_004039.1的aa 21至119)的aa区段中具有至多六个(例如，1、2、3、4、5或6个)aa取代，并且可包含用于连接表位(例如，成熟肽中的E44C取代)的化学缀合位点。如上所述，在此类β2M多肽序列中，表位的化学缀合位点可位于多个位置，包括溶剂可及aa位置处。举例而言，溶剂可及氨基酸位置处的半胱氨酸或其他氨基酸取代或插入可提供用于直接或间接(例如，通过肽接头)连接表位的化学缀合位点。
缺乏其前导序列的成熟β2M多肽的一些溶剂可及位置包括来自NP_004039.1的成熟肽的aa位置2、14、16、34、36、44、45、47、48、50、58、74、77、85、88、89、91、94和98(Gln 2、Pro 14、Glu 16、Asp 34、Glu 36、Glu 44、Arg 45、Glu 47、Arg 48、Glu 50、Lys 58、Glu 74、Glu 77、Val 85、Ser 88、Gln 89、Lys 91、Lys 94和Asp 98)或其他β2M序列中的其对应氨基酸(参见图4中的序列比对)。用于化学缀合位点(例如，半胱氨酸或其他反应性aa取代)的溶剂可及位置可选自诸如NP_004039.1的成熟β2M多肽序列的位置2、44、50、77、85、88、91或98，或诸如图4中的那些的其他β2M序列中的对应aa位置。用于化学缀合位点(例如，半胱氨酸或另一反应性aa取代)的溶剂可及位置也可选自诸如NP_004039.1的成熟β2M多肽序列的位置2、44、50或98，或诸如图4中的那些的其他β2M序列中的对应aa位置。用于化学缀合位点(例如，半胱氨酸或另一反应性aa取代)的溶剂可及位置可选自诸如NP_004039.1的成熟β2M多肽序列的位置2或44(Glu 2或Glu 44)，或诸如图4中的那些的其他β2M序列中的对应aa位置。
β2M多肽序列可包含取代至野生型β2M多肽(例如，图4中的β2M序列)中的单一半胱氨酸。当存在于T细胞-MP多肽中时，此类半胱氨酸残基可充当用于共价偶联表位的化学缀合位点(直接或经由接头间接)。共价连接可呈与表位中或连接至表位的反应性基团形成的键形式，诸如并入表位的顺丁烯二酰亚胺基团或连接至肽表位的接头，或呈二硫键形式。举例而言，在一些情况下，缺少其信号序列的成熟β2M的氨基酸43、44或45中的一者(如图4中所展示的具有其信号序列的未处理蛋白质的残基63、64和65)可经半胱氨酸残基取代。经半胱氨酸取代的aa位置可为位置44(例如，成熟人蛋白质NP_004039.1的E44C取代或诸如图4中的那些的β2M序列中的对应aa取代)。另选地，经半胱氨酸取代的aa位置可为位置2(例如，成熟人蛋白质NP_004039.1的Q44C取代或诸如图4中的那些的β2M序列中的对应aa取代)。
c.MHC-H和β2M多肽序列中的取代的一些组合
单独地或除插入至T细胞-MP的MHC-H或β2M多肽序列中的可用作表位或有效负载的化学缀合位点(例如，提供表位的化学缀合位点的β2M多肽序列中的E44C取代)的任何半胱氨酸残基以外，T细胞-MP可包含取代至α1螺旋的羧基端部分中的半胱氨酸与α2-1螺旋的氨基端部分中的半胱氨酸之间(例如，aa位置84和139处的氨基酸，诸如Y84C和A139C)的链内二硫键。α1螺旋的羧基端部分为约aa位置79至约aa位置89，并且α2-1螺旋的氨基端部分为MHC-H链的约aa位置134至约aa位置144(aa位置是基于无前导序列的重链序列测定(参见例如，图3D至图3H)。因此，二硫键可在位于MHC-H多肽序列的位置83、84或85处的半胱氨酸与位于位置138、139或140中任一者处的半胱氨酸之间。举例而言，在T细胞-MP中，二硫键可形成于插入MHC-H多肽序列的位置84处的半胱氨酸与插入位置138、139或140中的任一者处的半胱氨酸之间。在一个方面中，MHC-H链内二硫键位于图3D至图3H中所阐述的任何重链序列的位置84和139处取代的半胱氨酸之间。
T细胞-MP可包含以下的组合：(i)成熟β2M多肽序列，其与NP_004039.1的aa 21至119中的至少70个(例如，至少80、90、96、97、98个或所有)具有至少90％(例如，至少95％或98％)序列同一性，其中E44C(或另一半胱氨酸取代)作为表位的化学缀合位点；和(ii)I类HLA重链多肽序列，其与以下具有至少90％序列同一性(例如，至少95％、98％或100％序列同一性)，不包括可变aa团簇1至4：GSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWD GETRKVKAHSQTHRVDL(aa团簇1){C}(aa团簇2)AGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSW(aa团簇3){C}(aa团簇4)(2xhIL2(F42A、H16A)-(G4S)-GMGGSGGGGS-(G4S)-β2M(E44C)-(G4S)3-HLA-A02(Y84C、A139C)-AAAGG-hIgG1(L234A、L235A)HKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEP(SEQ ID NO:84)；
其中表示为{C}的半胱氨酸残基在α1螺旋与α2-1螺旋之间形成二硫键。
aa团簇1、aa团簇2、aa团簇3、aa团簇4、aa团簇5和aa团簇6在每次出现时经独立地选择为1至5个aa残基，其中aa残基各自独立地选自i)任何天然存在的(蛋白原)aa或ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的aa。MHC-H多肽序列可为HLA-A链，其中：
aa团簇1可为氨基酸序列GTLRG(SEQ ID NO:85)或其中一个或两个aa缺失或经其他天然存在的aa取代(例如，L经I、V、A或F置换)的该序列；
aa团簇2可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:86)或其中一个或两个aa缺失或经其他天然存在的aa取代(例如，N经Q置换、Q经N置换和/或E经D置换)的该序列；
aa团簇3可为氨基酸序列TAADM(SEQ ID NO:87)或其中一个或两个aa缺失或经其他天然存在的aa取代(例如，T经S置换、A经G置换、D经E置换和/或M经L、V或I置换)的该序列；和/或aa团簇4可为氨基酸序列AQTTK(SEQ ID NO:88)或其中一个或两个aa缺失或经其他天然存在的aa取代(例如，A经G置换、Q经N置换或T经S置换和或K经R或Q置换)的该序列。
如上所述，任何MHC-H链内二硫键，包括84和139处的半胱氨酸之间的二硫键(Y84C-A139C二硫键)，均可与允许将肽表位并入T细胞-MP的取代组合。因此，本发明包括且提供T细胞-MP和包含一个或多个T细胞-MP多肽的其高级复合物(例如双链体)，该一个或多个T细胞-MP多肽具有带链内Y84C A139C二硫键的MHC-H多肽序列和含E44C取代的β2M多肽序列。T细胞-MP和其高级复合物(例如，双链体)可包含：(i)带E44C取代的成熟β2M多肽序列，其与NP_004039.1、NP_001009066.1、NP_001040602.1、NP_776318.1或NP_033865.2(SEQID NO:61至65，参见图4)中的任一种的aa 21至119中的至少70个(例如，至少80、90、96、97、98个或所有)具有至少90％(例如，至少95％或98％)序列同一性；和(ii)带Y84C和A139C取代(其形成二硫键)的MHC-H序列，其可与图3D至图3H中的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G序列的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。MHC-H多肽序列可为具有Y84C和A139C取代的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3303或HLA-A*3401多肽序列(参见图3E)。MHC-H多肽序列可为具有Y84C和A139C取代的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、B27(亚型HLA-B*2701-2759)、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301多肽序列(参见例如图3F)。MHC-H多肽序列可为具有Y84C和A139C取代的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502多肽序列(参见例如图3G)。
4支架多肽
T细胞-MP和T细胞-MP-表位缀合物可包含免疫球蛋白重链恒定区(“Ig Fc”或“Fc”)多肽，或可包含另一适合支架多肽。在支架多肽序列相同且成对或多聚化(例如，一些Ig Fc序列或亮氨酸拉链序列)的情况下，其可形成对称对或多聚体(例如，同二聚体，参见例如具有Fc支架的图9)。相反，在需要两个T细胞-MP分子之间的非对称配对(例如，以产生各自携载一个或多个不同MOD的双链体T细胞-MP)的情况下，存在于T细胞-MP中的支架多肽可包含种间结合序列。种间结合序列为不相同的多肽序列，其选择性地与其特异性互补对应序列相互作用以形成非对称对(异二聚体，参见例如具有种间Fc支架的图10)。在一些情况下，种间结合序列可形成一定量的同二聚体，但优选地通过与其对应种间结合序列更强烈地结合)进行二聚化。因此，当将种间二聚化序列和其对应种间结合序列并入一对多肽中时，倾向于形成特异性异二聚体。举例而言，在将种间二聚化序列和其对应物并入一对多肽中的情况下，在将各多肽的等摩尔混合物组合时，其可选择性地形成大于70％、80％、90％、95％、98％或99％异二聚体。其余的多肽可作为单体或同二聚体存在，此可与异二聚体分开。此外，由于种间序列对其对应序列具有选择性，因此其可限制与细胞(例如，在培养物或受试者中)表达的其他蛋白质的相互作用，特别是在种间序列不为天然存在的序列或为天然存在的蛋白序列的变体的情况下。
支架多肽序列通常可小于300个aa(例如，约100至约300个aa)。支架多肽序列可小于250个aa(例如，约75至约250个aa)。支架多肽序列可小于200个aa(例如，约60至约200个aa)。支架多肽序列可小于150个aa(例如，约50至约150个aa)。
支架多肽序列包括但不限于种间和非种间Ig Fc多肽序列，然而，除Ig Fc多肽序列以外的多肽序列(非免疫球蛋白序列)可用作支架。
a.非免疫球蛋白Fc支架多肽
非免疫球蛋白Fc支架多肽包括但不限于：白蛋白、XTEN(延伸重组体)；转铁蛋白；Fc受体、类弹性蛋白；白蛋白缀合；类丝状物(参见例如，Valluzzi等人(2002)Philos TransR Soc Lond B Biol Sci.357:165)；类丝弹性蛋白(silk-elastin-like；SELP；参见例如，Megeed等人(2002)Adv Drug Deliv Rev.54:1075)多肽等。适合XTEN多肽包括例如公开于WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682和US 2009/0092582；还参见，Schellenberger等人(2009)Nat Biotechnol.27:1186)中的那些多肽。适合白蛋白多肽包括例如人血清白蛋白。适合类弹性蛋白多肽描述于例如Hassouneh等人(2012)Methods Enzymol.502:215中。
其他非免疫球蛋白Fc支架多肽序列包括但不限于：胶原凝集素家族的多肽(例如，ACRP30或类ACRP30蛋白)，其含有由胶原重复Gly-Xaa-Yaa和/或Gly-Xaa-Pro组成的胶原结构域(可重复10至40次)；卷曲螺旋结构域；亮氨酸拉链结构域；Fos/Jun缀合对；Ig CH1和轻链恒定区CL序列(Ig CH1/CL对，诸如与Ig CLκ或CLλ轻链恒定区序列成对的Ig CH1序列)。
非免疫球蛋白Fc支架多肽在性质上可为种间或非种间的。举例而言，Fos/Jun缀合对和Ig CH1多肽序列和轻链恒定区CL序列两者形成种间结合对。包括亮氨酸拉链序列的卷曲螺旋序列可为种间亮氨酸拉链或非种间亮氨酸拉链序列。参见例如，Zeng等人，(1997)PNAS(USA)94:3673-3678；和Li等人，(2012),Nature Comms.3:662。
双链体T细胞-MP的支架多肽可各自包含亮氨酸拉链多肽序列。亮氨酸拉链多肽彼此结合以形成二聚体。亮氨酸拉链多肽的非限制性实例包括包含以下任一aa序列的肽：RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER(SEQ ID NO:89)；LSSIEKKQEEQTSWLIWISNELTLIRNELAQS(SEQ ID NO:90)；LSSIEKKLEEITSQLIQISNELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:91；LSSIEKKLEEITSQLIQIRNELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:92)；LSSIEKKLEEITSQLQQIRNELTLIRNELAQ(SEQ ID NO:93)；LSSLEKKLEELTSQLIQLRNELTLLRNELAQ(SEQ ID NO:94)；ISSLEKKIEELTSQIQQLRNEITLLRNEIAQ(SEQ ID NO:95)。在一些情况下，亮氨酸拉链多肽包含以下aa序列：LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK(SEQ ID NO:96)。其他亮氨酸拉链多肽为本领域已知的，其中多种适合用作支架多肽序列。
T细胞-MP的支架多肽可包含形成二聚体的卷曲螺旋多肽序列。卷曲螺旋多肽的非限制性实例包括例如以下任一aa序列的肽：LKSVENRLAVVENQLKTVIEELKTVKDLLSN(SEQ IDNO:97)；LARIEEKLKTIKAQLSEIASTLNMIREQLAQ(SEQ ID NO:98)；VSRLEEKVKTLKSQVTELASTVSLLREQVAQ(SEQ ID NO:99)；IQSEKKIEDISSLIGQIQSEITLIRNEIAQ(SEQ ID NO:100)；和LMSLEKKLEELTQTLMQLQNELSMLKNELAQ(SEQ ID NO:101)。
T细胞MP双链体的T细胞-MP可包含一对支架多肽序列，其各自包含至少一个半胱氨酸残基，该残基可形成允许通过半胱氨酸残基之间的链间二硫键稳定的那些多肽的同二聚化或异二聚化的二硫键。此类aa序列的实例包括：VDLEGSTSNGRQCAGIRL(SEQ ID NO:102)；EDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMA(SEQ ID NO:103)；和GHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGQMA(SEQ ID NO:104)，
一些支架多肽序列允许形成较双链体更高级的T细胞-MP复合物，诸如三链体、四链体、五链体或六链体。此类aa序列包括但不限于IgM恒定区(下文论述)。也可使用形成三聚体的胶原结构域。胶原结构域可包含三aa序列Gly-Xaa-Xaa和/或GlyXaaYaa，其中Xaa和Yaa独立地为任何aa，其中序列出现或重复多次(例如，10至40次)。在Gly-Xaa-Yaa序列中，Xaa和Yaa通常分别以大于25％、50％、75％、80％、90％或95％ Gly-Xaa-Yaa出现或每次Gly-Xaa-Yaa出现中为脯氨酸和羟脯氨酸。在一些情况下，胶原结构域包含重复10至40次的序列Gly-Xaa-Pro。胶原寡聚化肽可包含以下aa序列：VTAFSNMDDMLQKAHLVIEGTFIYLRDSTEFFIRVRDGWKKLQLGELIPIPADSPPPPALSSNP(SEQ ID NO:105)。
b.免疫球蛋白Fc支架多肽
(i)非种间免疫球蛋白Fc支架多肽
T细胞-MP或其对应T细胞-MP-表位缀合物的支架多肽序列可包含Fc多肽。T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物的Fc多肽可例如来自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，其中任一种均可为人多肽序列、人源化多肽序列、合成重链恒定区的Fc区多肽或共有重链恒定区。在实施方案中，Fc多肽可来自人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc、人IgA Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc等。在一些情况下，Fc多肽包含与图2A至图2H所描绘的Fc区的aa序列的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性。此类免疫球蛋白序列可相互作用，以自T细胞-MP分子形成双链体或更高级结构。在一些情况下，Fc支架多肽序列包括能够形成将两个T细胞-MP多肽共价连接在一起的链间二硫键的天然存在的半胱氨酸残基(或通过蛋白质工程改造提供的非天然存在的半胱氨酸残基)。除非另有说明，否则T细胞-MP和其表位缀合物中使用的Fc多肽不包含足以将T细胞-MP锚定至细胞膜的跨膜锚定结构域或其部分。
大多数免疫球蛋白Fc支架多肽，特定来说仅或主要包含野生型序列的那些多肽，可经由二硫键自发地连接在一起以形成同二聚体，产生双链T细胞-MP。在IgM重链恒定区的情况下，在J链存在下，可形成高级复合物。支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1Fc多肽具有100％aa序列同一性的aa序列。支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。此类支架序列可包括经除天冬酰胺以外的aa取代N297(如图2D中编号的N77，SEQID NO:4)的取代。在一种情况下，N297经丙氨酸取代(N297A)。N297处的取代导致移除碳水化合物修饰且产生与野生型蛋白质相比具有减小的补体组分1q(“C1q”)结合的抗体序列，并且因此降低补体依赖性细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity；CDC)。K322(例如，K322A)取代展示FcγR结合亲和力和ADCC的减小的显著减少，以及C1q结合和CDC功能实质上或完全消除。Hezareh等人，(2001)J.Virol.75:12161-168。
下部铰链区中对应于IgG的SEQ ID NO:8)的aa 14至19的氨基酸L234和其他aa(例如，aa 234至239，诸如L235、G236、G237、P238、S239)参与缀合于Fcγ受体(FcγR)，并且因此该位置处的突变降低与受体的结合(相对于野生型蛋白质)，并且引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)降低。Hezareh等人，(2001)已证实双重突变(L234A、L235A)不能有效地结合FcγR或C1q，并且ADCC和CDC功能两者均实质上或完全消除。在下部铰链区具有取代的支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列，其包括经除亮氨酸以外的aa取代L234(图2D所描绘的aa序列的L14)的取代。
在下部铰链区具有取代的支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列，其包括经除亮氨酸以外的aa取代L235(图22D所描绘的aa序列的L15)的取代。在一些情况下，存在于T细胞-MP中在下部铰链区具有取代的支架多肽包括L234A和L235A(“LALA”)取代(对应于图2D所描绘的野生型aa序列的位置14和15的位置；参见例如SEQ ID NO:8)。
在下部铰链区具有取代的支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列，其包括经除脯氨酸以外的aa取代P331(图2D所描绘的aa序列的P111)的取代。P331处的取代，如N297处的那些取代，导致相对于野生型蛋白质降低与C1q的结合，并且因此减低补体依赖性细胞毒性。在一个实施方案中，取代为P331S取代。在另一实施方案中，取代为P331A取代。
支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列，并且包括相对于野生型蛋白质降低与C1q蛋白的结合的D270、K322和/或P329(对应于图2D中的SEQ ID NO:4的D50、K102和P109)的取代。
支架多肽可包含与图2D所描绘的野生型人IgG1 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约80％、90％、95％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列，其包括在L234和/或L235(图2D所描绘的aa序列的L14和/或L15)处经除亮氨酸以外的aa取代的取代(诸如L234A和L235A取代)以及经除脯氨酸以外的aa取代P331(图2D所描绘的aa序列的P111)的取代，诸如P331S。在一种情况下，存在于T细胞-MP中的支架多肽包含图2D所描绘的“三重突变体”aa序列(SEQID NO:6)(人IgG1 Fc)，其具有L234F、L235E和P331S取代(对应于图2D所描绘的aa序列的aa位置14、15和111)。
T细胞-MP的支架Fc多肽可包含与图2E所描绘的人IgG2 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。T细胞-MP的支架Fc多肽可包含与图2F所描绘的人IgG3 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。T细胞-MP的支架Fc多肽可包含与图2G所描绘的人IgG4 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。T细胞-MP的支架Fc多肽可包含与图2G所描绘的GenBank P01861人IgG4 Fc多肽的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa，例如aa 99至327或111至327)或所有具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。
T细胞-MP的支架Fc多肽可包含IgM重链恒定区(参见例如图2H)，其形成六聚体或五聚体(尤其在与缺乏信号序列的成熟j链肽组合时，例如提供于图2I中的该j链。
(ii)种间免疫球蛋白Fc支架多肽
在需要两个T细胞-MP分子之间的非对称配对(例如，以产生具有不同MOD的双链体T细胞-MP)的情况下，存在于T细胞-MP中的支架多肽可包含种间Ig Fc多肽序列变体、基本上由其组成或由其组成。此类种间多肽序列包括但不限于不具有稳定性二硫键(KiH)或具有稳定性二硫键(KiHs-s)的杵臼结构、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s和A107序列。一个种间结合对包含IgG1的CH3结构域界面中的T366Y和Y407T突变体对或其他免疫球蛋白的对应残基。参见Ridgway等人，Protein Engineering 9:7,617-621(1996)。第二种间结合对涉及在互补Ig Fc序列上通过T366W取代形成杵，以及通过三重取代T366S、L368A和Y407V形成臼。参见Xu等人mAbs 7:1,231-242(2015)。另一种间结合对具有带Y349C、T366S、L368A和Y407V取代的第一Ig Fc多肽和带S354C和T366W取代的第二Ig Fc多肽(可在Y349C与S354C之间形成二硫键)。参见例如，Brinkmann和Konthermann,mAbs 9:2,182–212(2015)。具有或不具有杵臼结构修饰的Ig Fc多肽序列均可通过在Ig Fc多肽之间形成二硫键(例如，铰链区二硫键)来稳定。下表总结基于免疫球蛋白序列的数个种间结合序列，其中交叉参考其出现于图2D中所阐述的以“{}”形式展示的野生型IgG1序列(SEQ IDNO:4)的aa位置的编号。
表1.种间免疫球蛋白序列和其同源对应种间序列
Figure BDA0004113828220000811
表1是根据Ha等人，Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)进行修改。
*aa形成稳定性二硫键。
除表1中的种间序列对之外，支架多肽可包括种间“SEED”序列，所述序列具有源自种间序列的IgG1 CH3结构域中的IgA的45个残基和源自其对应种间序列中的IgA CH3中的IgG1的57个残基。参见Ha等人，Frontiers in Immunol.7:1-16(2016)。
种间免疫球蛋白序列可包括上文针对非种间免疫球蛋白序列所述的取代，所述取代抑制结合FcγR或C1q中的任一种或两种，并且减小或消除ADCC和CDC功能。
在一实施方案中，发现于T细胞-MP中的支架多肽可包含选自由以下组成的组的种间结合序列或其对应种间结合序列：杵臼结构(KiH)；具有稳定性二硫键的杵臼结构(KiHs-s)；HA-TF；ZW-1；7.8.60；DD-KK；EW-RVT；EW-RVTs-s；A107；或SEED序列。
在一实施方案中，T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有T146W KiH序列取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T146W、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性。支架多肽任选地包含以下中的一种或多种处的取代：L234和L235(例如，L234A/L235A“LALA”或L234F/L235E)；N297(例如，N297A)；P331(例如，P331S)；L351(例如，L351K)；T366(例如，T366S)；P395(例如，P395V)；F405(例如，F405R)；Y407(例如，Y407A)；和K409(例如，K409Y)。那些取代出现在：图2D的野生型IgG1序列中的L14和L15(例如，L14A/L15A“LALA”或L14F/L15E)；N77(例如，N77A)；P111(例如，P111S)；L131(例如，L131K)；T146(例如，T146S)；P175(例如，P175V)；F185(例如，F185R)；Y187(例如，Y187A)；和K189(例如，K189Y)处。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有T146W KiH序列取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T146S、L148A和Y187V KiH序列取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有T146W和S134C KiHs-s取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T146S、L148A、Y187V和Y129C KiHs-s取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外序列，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有S144H和F185AHA-TF取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有Y129T和T174F HA-TF取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有T130V、L131Y、F185A和Y187V ZW1取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130V、T146L、K172L和T174W ZW1取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有K140D、D179M和Y187A 7.8.60取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130V E125R、Q127R、T146V和K189V 7.8.60取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有K189D和K172D DD-KK取代的IgG1序列，并且其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130VD179K和E136KDD-KK取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有K140E和K189W EW-RVT取代的IgG1序列，其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130VQ127R、D179V和F185TEW-RVT取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有K140E、K189W和Y129C EW-RVTs-s取代的IgG1序列，其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130V Q127R、D179V、F185T和S134C EW-RVTs-s取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
在一实施方案中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含支架多肽，该支架多肽包含具有K150E和K189W A107取代的IgG1序列，其对应种间结合配偶体多肽包含具有T130VE137N、D179V和F185TA107取代的IgG1序列，其中支架多肽包含与图2D的野生型IgG1的至少100个(例如，至少125、150、170、180、190、200、210、220或所有227个)连续aa具有至少80％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的序列；其中一个或两个(在双链体T细胞-MP的情况下)支架多肽序列可包含额外取代，诸如L14和/或L15取代(例如，“LALA”取代L234A和L235A)和/或N77(N297，例如N297A或N297G)。
作为使用免疫球蛋白CH2和CH3重链恒定区作为支架序列的替代方案，免疫球蛋白轻链恒定区(参见图2K)可与Ig CH1序列(参见，例如，图2J)配对作为种间支架序列。
在一实施方案中，T细胞-MP支架多肽包含Ig CH1结构域(例如，图2J的多肽)，并且将与其一起形成复合物的序列(其对应结合配偶体)包含Igκ链恒定区序列，其中支架多肽包含分别与SEQ ID NO:16和/或17的至少70、至少80、至少90、至少100或至少110个连续aa具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列。参见图2K。Ig CH1和Igκ序列可经修饰以增加其对于彼此的亲和力，并且因此增加利用其形成的任何异二聚体的稳定性。在增加CH1-Igκ异二聚体稳定性的取代中为Chen等人，MAbs,8(4):761-774(2016)中鉴别为MD13组合的那些取代。在MD13组合中，将两个取代引入IgCH1和Igκ序列中的每一种中。Ig CH1序列经修饰以含有S64E和S66V取代(图2J所展示的序列的S70E和S72V)。Igκ序列经修饰以含有S69L和T71S取代(图2K所展示的序列的S68L和T70S)。
在另一实施方案中，T细胞-MP的支架多肽包含Ig CH1结构域(例如，图2J的多肽，SEQ ID NO:15)，并且其对应序列包含诸如图2K所展示的Igλ链恒定区序列(SEQ ID NO:17)，其中支架多肽包含与图2K所展示的序列的至少70个(例如，至少80、至少90或至少100个)连续aa具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
c.对稳定性和半衰期的影响
适合支架多肽(例如，具有Ig Fc支架序列的那些多肽)在一些情况下将延长T细胞-MP多肽和其高级复合物的半衰期。在一些情况下，与缺少支架多肽或包含对照支架多肽的对照T细胞-MP或双链体T细胞-MP相比，适合支架多肽增加T细胞-MP或双链体T细胞-MP的体内半衰期(例如，血清半衰期)。举例而言，在一些情况下，与缺少支架多肽或具有对照支架多肽的其他相同的对照相比，支架多肽使缀合或未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或超过100倍。
5免疫调节多肽(“MOD”)
适合于包括于本发明的T细胞-MP中的MOD包括但不限于以下免疫调节多肽的野生型和变体：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD80、(B7-1)、CD83、CD86(B7-2)、HVEM(CD270)、ILT3(免疫球蛋白样转录物3)、ILT4(免疫球蛋白样转录物4)、Fas配体(FasL)、ICAM(细胞间粘附分子)、ICOS-L(诱导型共刺激配体)、JAG1(CD339)、淋巴毒素β受体、3/TR6、OX40L(CD252)、PD-L1、PD-L2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、4-1BBL和能够经由其同源受体)接合且信号传导的其任何片段，诸如胞外结构域片段。除非另有说明，否则应理解，用于本发明的T细胞-MP中的MOD可为野生型变体免疫调节多肽和/或其变体，例如选择性结合于特定Co-MOD和/或对特定Co-MOD的亲和力降低的变体。适合于包括于本发明的T细胞-MP中的一些MOD多肽和其一种或多种Co-MOD(“共免疫调节多肽”或同源共刺激受体)包括来自下表中所列举的蛋白质对的具有T细胞调节活性的多肽序列：
MOD和Co-MOD的例示性对
Figure BDA0004113828220000881
在一些情况下，MOD选自以下的野生型或变体：IL-2多肽、4-1BBL多肽、B7-1多肽；B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、TGFβ多肽和PD-L2多肽。在一些情况下，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含两个不同MOD，诸如IL-2MOD或IL-2变体MOD多肽以及CD80或CD86MOD多肽的野生型或变体。在另一例子中，T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含IL-2MOD或IL-2变体MOD多肽和PD-L1 MOD多肽的野生型或变体。在一些情况下，可相同或不同的MOD串连存在于T细胞-MP或双链体T细胞-MP中。当MOD串连存在时，其序列在单一多肽上彼此直接相邻，或无任何插入序列或仅通过接头多肽分开(例如，不插入MHC序列或表位序列)。MOD多肽可包含全长MOD的细胞外部分的所有或部分。因此，例如在一些情况下，MOD可不包括通常在天然存在的MOD中发现的信号肽、跨膜结构域和细胞内结构域中的一种或多种。除非另有说明，否则存在于T细胞-MP或双链体T细胞-MP中的MOD不包含信号肽、细胞内结构域或足够部分的跨膜结构域以将大量(例如，超过5％或10％)T细胞-MP或双链体T细胞-MP锚定至哺乳动物细胞膜中。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的MOD包含天然存在的MOD的aa序列的所有或部分(例如，其细胞外部分)。在其他情况下，适合包括于T细胞-MP中的MOD为变体MOD，与天然存在的MOD的aa序列相比，该变体MOD包含至少一个aa取代。在一些情况下，变体MOD对Co-MOD的结合亲和力低于对应天然存在的MOD(例如，不包含存在于变体中的aa取代的MOD)对Co-MOD的亲和力。改变亲和力的MOD多肽序列中的适合变化可通过沿肽的长度扫描(进行aa取代，例如丙氨酸取代或“丙氨酸扫描”或带电残基变化)且测试其亲和力来鉴别。一旦鉴别出改变亲和力的关键aa位置，则可对那些位置进行竖直扫描，其中测试除丙氨酸以外的一种或多种aa取代的影响。亲和力可通过如下文所描述的BLI来测定。
a.亲和力降低的MOD和变体MOD
对共免疫调节结构域展现出降低的亲和力的适合免疫调节结构域可与野生型免疫调节结构域相差1个aa至20个aa。举例而言，在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD在aa序列上与对应野生型MOD相差1个aa至10个aa，或相差11个aa至20个aa。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括单一aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括2个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括3个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括4个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括5个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括6个aa或7个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括8个aa、9个aa或10个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括11、12、13、14或15个aa取代。与对应参考(例如，野生型)MOD相比，存在于T细胞-MP中的变体MOD可包括16、17、18、19或20个aa取代。
如上所述，与对应野生型MOD对于同源Co-MOD的亲和力相比，适合包括于本发明的T细胞-MP中的变体MOD对同源Co-MOD的亲和力可降低。在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD对同源Co-MOD的结合亲和力为100nM至100μM。举例而言，在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD对同源Co-MOD的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约50μM、约50μM至约75μM或约75μM至约100μM。
另选地或除降低的亲和力结合之外，MOD可为展现选择性结合于Co-MOD的变体。在一个方面中，在MOD可缀合于超过一种Co-MOD的情况下，可选择选择性结合于至少一种Co-MOD的变体。举例而言，野生型PD-L1结合于PD-1和CD80(也称为B7-1)两者。在此类情况下，可选择选择性(优先)结合于PD-1或CD80的变体PD-L1 MOD。同样，在野生型MOD可结合于Co-MOD内的多个多肽的情况下，变体可经选择以仅选择性结合于所需多肽与Co-MOD。举例而言，IL-2结合于IL-2R的α、β和γ链。IL-2变体可经选择以降低的亲和力结合或不结合于多肽中的一种，例如IL-2R的α链，或甚至两条链。
(i)测定结合亲和力
MOD与其同源Co-MOD之间的结合亲和力可通过生物层干涉术(BLI)使用经纯化MOD和经纯化同源Co-MOD来测定。T细胞-MP与其同源Co-MOD之间的结合亲和力也可通过BLI使用经纯化T细胞-MP和同源Co-MOD来测定。BLI方法为本领域技术人员所熟知的。参见例如，Lad等人(2015)J.Biomol.Screen.20(4):498-507；以及Shah和Duncan(2014)J.Vis.Exp.18:e51383。本发明中所描述的MOD与其同源Co-MOD之间或具有MOD的T细胞-MP与其同源Co-MOD之间的特定和相对结合亲和力可使用以下程序测定。
为测定T细胞-MP与其同源Co-MOD之间的结合亲和力，可使用Octet RED 96(PalFortéBio)仪器或类似仪器如下来进行BLI分析。将T细胞-MP(例如，包含野生型MOD的对照T细胞-MP))固定至不可溶支撑物(“生物传感器”)上。经固定T细胞-MP为“目标”。固定可通过将捕获抗体固定至不可溶支撑物上来实现，其中捕获抗体固定T细胞-MP。举例而言，固定可通过将抗Fc(例如抗人IgG Fc)抗体固定至不可溶支撑物上来实现，其中经固定抗Fc抗体结合且固定T细胞-MP(其中T细胞-MP包含Ig Fc多肽)。将几种不同浓度下的Co-MOD施加至经固定T细胞-MP，并且记录仪器的反应。在包含25mM HEPES pH 6.8、5％聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1％牛血清白蛋白和0.02％ Tween 20非离子清洁剂的液体培养基中进行分析。在30℃下进行Co-MOD与经固定T细胞-MP的结合。可视T细胞-MP中MHC多肽的类别而定，使用抗I类MHC单克隆抗体作为结合亲和力的阳性对照。举例而言，KD为7nM的抗I类HLA单克隆抗体(mAb)W6/32(美国典型培养物保藏中心第HB-95号；Parham等人(1979)J.Immunol.123:342)，或抗HLD-DR3单克隆抗体，诸如16-23抗体(Sigma；也称为“16.23”；参见例如，Pious等人(1985)J.Exp.Med.162:1193；Mellins等人(1991)J.Exp.Med.174:1607；ECACC杂交瘤集合16-23，ECACC 99043001)可用作结合亲和力的阳性对照。可使用抗I类MHC单克隆抗体的连续稀释液来生成标准曲线。Co-MOD或抗MHC mAb为“分析物”。BLI分析自以下两个表面反射的白光的干涉图：i)经固定多肽(“目标”)；和ii)内部参考层。结合于生物传感器尖端的分子(“分析物”；例如Co-MOD；抗HLA抗体)数量的变化引起干涉图的偏移；可即时测量干涉图的此偏移。描述目标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语为缔合常数(ka)和解离常数(kd)。所述两个术语的比(kd/ka)产生亲和力常数KD。
如上文所提及，测定MOD(例如，IL-2或IL-2变体)与其同源Co-MOD(例如，IL-2R)之间的结合亲和力也可通过BLI来测定。该分析类似于上文针对T细胞-MP所述的分析。BLI分析可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)仪器或类似仪器如下来进行。将T细胞-MP的组分MOD(例如，本发明的变体IL-2多肽)；和对照MOD(其中对照MOD包括野生型MOD，例如野生型IL-2))固定至不可溶支撑物(每个为“生物传感器”)上。MOD为“目标”。固定可通过将捕获抗体固定至不可溶支撑物上来实现，其中捕获抗体固定MOD。举例而言，若目标与免疫亲和力标签(例如，FLAG、人IgG Fc)融合，则固定可通过将针对免疫亲和力标签(例如，抗人IgGFc)的适当抗体固定至不可溶支撑物上来实现，其中经固定抗体结合且固定MOD(其中MOD包含Ig Fc多肽)。将几种浓度下的Co-MOD(或多肽)施加至经固定MOD且记录仪器的反应。另选地，将Co-MOD(或多肽)固定至生物传感器(例如，对于IL-2受体异三聚体，作为单体亚基、异二聚体次复合物或完整的异三聚体)，并且将几种浓度下的MOD施加至经固定Co-MOD，并且记录仪器的反应。在包含25mM HEPES pH 6.8、5％聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1％牛血清白蛋白和0.02％ Tween 20非离子清洁剂的液体培养基中进行分析。在30℃下进行Co-MOD与经固定MOD的结合。BLI分析自以下两个表面反射的白光的干涉图：i)经固定多肽(“目标”)；和ii)内部参考层。结合于生物传感器尖端的分子(“分析物”；例如Co-MOD)数量的变化引起干涉图的偏移；可即时测量干涉图的此偏移。描述目标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语为缔合常数(ka)和解离常数(kd)。所述两个术语的比(kd/a)产生亲和力常数KD。测定野生型MOD(例如，IL-2)对于其受体(例如，IL-2R)和变体MOD(例如，如本文公开的IL-2变体)对于其同源Co-MOD(例如其受体；(例如IL-2R)的结合亲和力，因此允许人们测定与野生型Co-MOD相比的变体Co-MOD对于同源Co-MOD的相对结合亲和力。即，人们可测定变体MOD对于其受体(其同源Co-MOD)的结合亲和力与野生型MOD对于相同同源Co-MOD的结合亲和力相比是否降低，并且若降低，则野生型Co-MOD的结合亲和力的降低百分比为多少。
BLI分析可在多孔盘中进行。为执行分析，限定培养盘布局，限定分析步骤，以及将生物传感器分配于Octet Data Acquisition软件中。生物传感器组件为水合的。将水合生物传感器组件和分析盘在Octet仪上平衡10分钟。一旦获得资料，则将所获资料负载至Octet Data Analysis软件中。通过指定参考减法、y轴比对、步间校正和Savitzky-Golay过滤的方法，在处理窗口中处理资料。通过指定分析(缔合和解离)的步骤、选择曲线拟合模型(1:1)、拟合方法(全域)和所关注窗(以秒为单位)，在分析窗中分析资料。评估拟合质量。若在3倍范围内，则可对各资料轨迹(分析物浓度)的KD值取平均值。KD误差值应在亲和力常数值的一个数量级内；R2值应高于0.95。参见例如，Abdiche等人(2008)J.Anal.Biochem.377:209。
除非本文另有说明，否则本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于Co-MOD的亲和力或对照T细胞-MP-表位缀合物(其中对照T细胞-MP-表位缀合物包含野生型MOD)对于Co-MOD的亲和力是使用BLI，如上所述来测定。同样，MOD和其Co-MOD多肽的亲和力可使用BLI如上所述来测定。
存在于本发明的T细胞-MP中的变体MOD可以比对应野生型MOD对于Co-MOD的亲和力低至少10％、低至少15％、低至少20％、低至少25％、低至少30％、低至少35％、低至少40％、低至少45％、低至少50％、低至少55％、低至少60％、低至少65％、低至少70％、低至少75％、低至少80％、低至少85％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的亲和力结合于其Co-MOD。
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的变体MOD对Co-MOD的结合亲和力为1nM至100nM或100nM至100μM。举例而言，在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD对Co-MOD的结合亲和力为约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约100nM至约150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM或约75μM至约100μM。在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD对Co-MOD的结合亲和力为约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM或约50nM至约100nM。
本发明的T细胞-MP-表位缀合物对目标T细胞的结合亲和力可通过以下方式测量：A)使本发明的T细胞-MP-表位缀合物与在其表面上表达以下的目标T细胞接触：i)结合于亲本野生型MOD的Co-MOD；和ii)结合于表位的TCR，其中T细胞-MP-表位缀合物包含表位标签或荧光标记(例如，作为T-细胞-MP的一部分的荧光有效负载或荧光蛋白标记，例如绿色荧光蛋白)，使得T细胞-MP-表位缀合物结合于目标T细胞；B)若T细胞-MP-表位缀合物未经标记，则使目标T细胞缀合的T细胞-MP-表位缀合物与结合表位标签的荧光标记结合剂(例如，荧光标记抗体)接触，产生T细胞-MP-表位缀合物/目标T细胞/缀合剂复合物；和C)使用流式细胞术测量T细胞-MP-表位缀合物/目标T细胞/缀合剂复合物的平均荧光强度(meanfluorescence intensity；MFI)。表位标签可为例如，FLAG标签、血球凝集素标签、c-myc标签、聚(组氨酸)标签等。在一系列浓度的T细胞-MP-表位缀合物(文库成员)内测量的MFI提供亲和力的测量。在一系列浓度的T细胞-MP-表位缀合物(文库成员)内测量的MFI提供T细胞-MP-表位缀合物的半最大有效浓度(EC50)。在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于目标T细胞的EC50在nM范围内；并且T细胞-MP-表位缀合物对于对照T细胞的EC50在μM范围内(其中对照T细胞在其表面上表达：i)结合亲本野生型MOD的Co-MOD；和ii)不结合于T细胞-MP-表位缀合物中存在的表位的T细胞受体)。本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于对照T细胞的EC50与T细胞-MP-表位缀合物对于目标T细胞的EC50的比可为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于对照T细胞的EC50与T细胞-MP-表位缀合物对于目标T细胞的EC50的比为T细胞-MP-表位缀合物的选择性的表达。
在一些情况下，当如前一段落所述进行测量时，与T细胞-MP-表位缀合物(文库成员)与对照T细胞的结合相比，本发明的T细胞-MP-表位缀合物展现选择性结合于目标T细胞，该对照T细胞包含：i)结合亲本野生型MOD的Co-MOD；和ii)结合于除存在于T细胞-MP-表位缀合物(文库成员)中的表位以外的表位的TCR。
在通过BLI测量(如上文所述)时，i)对照T细胞-MP(其中对照T细胞-MP包含野生型MOD)对于同源Co-MOD的结合亲和力与ii)包含野生型MOD的变体的T细胞-MP对于同源Co-MOD的结合亲和力的比可为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。当通过BLI测量时，i)对照T细胞-MP(其中对照T细胞-MP包含野生型MOD)对于同源Co-MOD的结合亲和力与ii)包含野生型MOD的变体的T细胞-MP对于同源Co-MOD的结合亲和力的比可在1.5:1至106:1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1或105:1至106:1范围内。
举例而言，在对照T细胞-MP-表位缀合物包含野生型IL-2多肽的情况下且在本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的aa序列包含1至10个aa取代)作为MOD的情况下，在通过BLI测量时，i)对照T细胞-MP-表位缀合物对于IL-2受体(Co-MOD)的结合亲和力与ii)本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于IL-2受体(Co-MOD)的结合亲和力的比为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。在对照T细胞-MP-表位缀合物包含野生型IL-2多肽的情况下且在本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的aa序列包含1至10个aa取代)作为MOD的情况下，在通过BLI测量时，i)对照T细胞-MP-表位缀合物对于IL-2受体(Co-MOD)的结合亲和力与ii)本发明的T细胞-MP-表位缀合物对于IL-2受体的结合亲和力的比可在1.5:1至106:1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1或105:1至106:1的范围内。可具有相同结合亲和力比的其他实例包括携载野生型MOD的T细胞-MP和携载变体MOD的T细胞-MP，其中野生型和变体MOD选自：野生型CD80和变体CD80；野生型CD86和变体CD86；野生型PD-L1和变体PD-L1；野生型CTLA4和变体CTLA4或野生型4-1BBL和变体4-1BBL。
存在于本发明的T细胞-MP中的变体MOD对于同源Co-MOD的结合亲和力可为1nM至100nM或100nM至250μM。举例而言，存在于T细胞-MP中的变体MOD对同源Co-MOD的结合亲和力可为约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、约100nM至约500nM、约500nM至约750nM、约750nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约100μM或约100μM至约250μM。存在于T细胞-MP中的变体MOD对于同源Co-MOD的结合亲和力可为约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM或约50nM至约100nM。
MOD对于其Co-MOD的降低的亲和力和表位对于TCR的亲和力的组合提供本发明的T细胞-MP-表位缀合物的增强的选择性，同时仍允许MOD的活性。因此，与结合于第二T细胞相比，本发明的T细胞-MP-表位缀合物可选择性地结合于第一T细胞，该第一T细胞展示以下两种：i)对存在于T细胞-MP-表位缀合物中的表位具有特异性的TCR；和ii)结合于T细胞-MP-表位缀合物中存在的MOD的Co-MOD，该第二T细胞展示：i)对除存在于T细胞-MP-表位中的表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)缀合于T细胞-MP-表位缀合物中存在的MOD缀合的Co-MOD。举例而言，本发明的T细胞-MP-表位缀合物可以较其结合第二T细胞的亲和力高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少200％(2倍)、至少250％(2.5倍)、至少500％(5倍)、至少1,000％(10倍)、至少1,500％(15倍)、至少2,000％(20倍)、至少2,500％(25倍)、至少5,000％(50倍)、至少10,000％(100倍)或超过100倍的亲和力结合于第一T细胞。参见例如图1
b.IL-2和其变体
作为一个非限制性实例，存在于T细胞-MP中的野生型MOD或变体MOD为IL-2或变体IL-2多肽。在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD为变体IL-2多肽。野生型IL-2结合于IL-2受体(IL-2R)。野生型IL-2aa序列可为如下：
Figure BDA0004113828220000971
Figure BDA0004113828220000972
(UniProt p60568之aa 21至153，SEQ ID NO：106)。
野生型IL2结合于细胞表面上的IL2受体(IL2R)。在一些情况下，IL2受体为异三聚多肽，其包含α链(IL-2Rα；也称为CD25)、β链(IL-2Rβ；也称为CD122)和γ链(IL-2Rγ；也称为称为CD132)。人IL-2Rα、IL2Rβ和IL-2Rγ的氨基酸序列可为如下。
人IL-2Rα：
Figure BDA0004113828220000981
Figure BDA0004113828220000982
人IL-2Rβ：
Figure BDA0004113828220000983
Figure BDA0004113828220000984
人IL-2Rγ：
Figure BDA0004113828220000985
Figure BDA0004113828220000986
在一些情况下，在T细胞-MP包含变体IL-2多肽的情况下，同源Co-MOD为包含多肽的IL-2R，所述多肽包含SEQ ID NO:107、SEQID:108和SEQ ID NO:109中的任一种的aa序列。
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:106中所阐述的aa序列的IL-2多肽的结合亲和力相比，变体IL-2多肽展现对IL-2R的降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，当在相同条件下分析时，变体IL-2多肽以较包含SEQ ID NO:106中所阐述的aa序列的IL-2多肽对于IL-2R(例如，包含含有SEQ ID NO:107-109中所阐述的aa序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合IL-2R。
在一些情况下，变体IL-2多肽(例如，SEQ ID NO:106的变体)对IL-2R(例如，SEQID NO:107-109)的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一实例，在一些情况下，变体IL-2多肽(例如，SEQ ID NO:106的变体)对于IL-2R(例如，包含含有SEQ ID NO:107-109中所阐述的aa序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有2至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有3个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有5个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有6或7个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:106中所阐述的IL-2aa序列相比，变体IL-2多肽具有8、9或10个aa取代。
适合的变体IL-2多肽序列包括多肽序列，所述多肽序列包含与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，90、100、110、120、130或133个)连续aa具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的aa序列。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置15处的aa为除E以外的aa。在一种情况下，H16的位置经Ala取代(H16A)。在一种情况下，E15的位置经Ala取代(E15A)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的aa。在一种情况下，H16的位置经Asn、Cys、Gln、Met、Val或Trp取代。在一种情况下，H16的位置经Ala取代。在另一情况下，H16的位置经Thr取代。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置20处的aa为除D以外的aa。在一种情况下，D20的位置经Ala取代。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置42处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，F42的位置经Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或His取代。在一种情况下，F42的位置经Ala取代。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置45处的aa为除Y以外的aa。在一种情况下，Y45的位置经Ala取代。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置88处的aa为除N以外的aa。在一种情况下，N88的位置经Ala取代。在另一情况下，N88的位置经Arg取代。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少90、100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置126处的aa为除Q以外的aa。在一种情况下，Q126的位置经Ala取代(Q126A)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的aa，并且位置42处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，H16的位置经Ala或Thr取代且F42的位置经Ala或Thr取代。在一种情况下，H16的位置经Ala取代且F42的位置经Ala取代(H16A和F42A变体)。在一种情况下，H16的位置经Thr取代且F42的位置经Ala取代(H16T和F42A变体)。
IL-2变体可包含与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％aa序列同一性的aa序列：
Figure BDA0004113828220001011
Figure BDA0004113828220001012
其中位置16和42如下经取代：X1为除His以外的任何aa；并且X2为除Phe以外的任何aa。第二IL-2变体包含取代，X1为Ala且X2为Ala(H16A和F42A变体)。第三IL-2变体包含取代，X1为Thr且X2为Ala(H16T和F42A变体)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置20处的aa为除D以外的aa且位置42处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，D20的位置经Ala取代且F42的位置经Ala取代(D20A和F42A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置15处的aa为除E以外的，位置20处的aa为除D以外的aa和位置42处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，E15的位置经Ala取代，D20的位置经Ala取代且F42的位置经Ala取代(E15A、D20A和dF42A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的，位置20处的aa为除D以外的aa和位置42处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，H16的位置经Ala取代，D20的位置经Ala取代且F42的位置经Ala(H16A、D20A和F42A取代)。在另一情况下，H16的位置经Thr取代，D20的位置经Ala取代且F42的位置经Ala取代(H16T、D20A和F42A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的，位置42处的aa为除F以外的且位置88处的aa为除R以外的。在一种情况下，H16的位置经Ala或Thr取代，F42的位置经Ala取代且N88的位置经Arg取代(H16A、F42A和N88R取代或H16T、F42A和N88R取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的，位置42处的aa为除F以外的且位置126处的aa为除Q以外的。此类IL-2变体包括如下那些变体，其中，H16的位置经Ala或Thr取代，F42的位置经Ala取代且Q126的位置经Ala取代(H16A、F42A和Q126A取代或H16T、F42A和Q126A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置20处的aa处的aa为除D以外的，位置42处的aa为除F以外的且位置126处的aa为除Q以外的。在一种情况下，D20的位置经Ala取代，F42的位置经Ala取代且Q126的位置经Ala取代(D20A、F42A和Q126A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置20处的aa处的aa为除D以外的，位置42处的aa为除F以外的且位置45处的aa为除Y以外的。在一种情况下，D20的位置经Ala取代，F42的位置经Ala取代且Y45的位置经Ala取代(D20A、F42A和Y45A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的，位置20处的aa为除D以外的，位置42处的aa为除F以外的且位置45处的aa为除Y以外的。此类IL-2变体包括如下那些变体，其中H16的位置经Ala或Thr取代，D20的位置经Ala取代，F42的位置经Ala取代且Y45的位置经Ala取代(H16A、D20A、F42A和Y45A取代或H16T、D20A、F42A和Y45A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置20处的aa为除D以外的，位置42处的aa为除F以外的，位置45处的aa为除Y以外的且位置126处的aa为除Q以外的。在一种情况下，D20的位置经Ala取代，F42的位置经Ala取代，Y45的位置经Ala取代且Q126的位置经Ala取代(D20A、F42A、Y45A、Q126A取代)。
IL-2变体包括与SEQ ID NO:106的至少80个(例如，至少100、110、120或130)个连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置16处的aa为除H以外的，位置20处的aa为除D以外的，位置42处的aa为除F以外的，位置45处的aa为除Y以外的且位置126处的aa为除Q以外的。在一种情况下，H16的位置经Ala或Thr取代，D20的位置经Ala取代，F42的位置经Ala取代，Y45的位置经Ala取代且Q126的位置经Ala取代(H16A、D20A、F42A、Y45A和Q126A取代或H16T、D20A、F42A、Y45A和Q126A取代)。
c.Fas配体(FasL)和其变体
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的MOD为Fas配体(FasL)。FasL为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor；TNF)家族中的同聚II型跨膜蛋白。FasL通过目标细胞中Fas受体的三聚化来信号传导，其形成导致目标细胞凋亡的死亡诱导复合物。可溶性FasL源自基质金属蛋白酶-7(MMP-7)在保守位点处对膜缀合的FasL的裂解。
在一实施方案中，野生型智人FasL蛋白具有以下序列
Figure BDA0004113828220001041
NCBI Ref.Seq.NP_000630.1、UniProtKB-P48023，其中残基1至80为细胞质，810102为跨膜结构域且aa 103至281为胞外的(胞外结构域)。
适合的FasL多肽包含FasL的所有或部分胞外结构域：
Figure BDA0004113828220001054
Figure BDA0004113828220001051
Fas受体可具有以下序列
Figure BDA0004113828220001052
Figure BDA0004113828220001053
NCBI参考序列：NP_000034.1、UniProtKB-P25445，其中aa 26至173形成胞外结构域(ectodomain/extracellular domain)，aa 174至190形成跨膜结构域且191至335形成细胞质结构域。胞外结构域可用于测定与FasL的结合亲和力。
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:112中所阐述的aa序列的FasL多肽的结合亲和力相比，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:112的变体)展现对成熟Fas受体序列(例如，包含SEQ ID NO:113中所阐述的所有或部分多肽，诸如其胞外结构域的FasL受体)降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:112的变体)以较包含SEQ ID NO:111或112中所阐述的aa序列的FasL多肽的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合Fas受体(例如，包含SEQ ID NO:102中所阐述的所有或部分多肽，诸如其胞外结构域)。
在一些情况下，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:112的变体)对Fas受体(例如，包含SEQ ID NO:113中所阐述的所有或部分多肽，诸如其胞外结构域)的结合亲和力为1nM至1mM(例如，1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM或100μM至1mM)。作为另一实例，在一些情况下，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:101的变体)对成熟Fas受体(例如，包含SEQ ID NO:113中所阐述的所有或部分多肽，诸如其胞外结构域)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:112的变体)具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽(例如，包含SEQ ID NO:112的变体))具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽具有5个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽具有6个aa或7个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:112)中所阐述的FasL多肽序列相比，变体FasL多肽具有8个aa、9个aa或10个aa取代。
适合的变体FasL多肽序列包括与SEQ ID NO:112的至少140个连续aa(例如，至少150、至少160、至少170或至少175个连续aa)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的多肽序列(例如，其具有至少一个aa取代、缺失或插入)。
FasL变体包括与SEQ ID NO:112)的至少80个(例如，至少100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽且在aa 1至aa 50携载一个或多个aa取代。此类FasL变体可包含通过Ala或Gly取代至少一个、至少两个或至少三个aa的取代。
FasL变体包括与SEQ ID NO:112)的至少80个(例如，至少100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽且在aa 51至100携载一个或多个aa取代。此类Fas L变体可包含通过Ala或Gly取代至少一个、至少两个或至少三个aa的取代。
FasL变体包括与SEQ ID NO:112)的至少80个(例如，至少100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽且在aa 101至150携载一个或多个aa取代。此类Fas L变体可包含通过Ala或Gly取代至少一个、至少两个或至少三个aa的取代。
FasL变体包括与SEQ ID NO:112)的至少80个(例如，至少100、110、120或130个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽且在aa 151至170携载一个或多个aa取代。此类Fas L变体可包含通过Ala或Gly取代至少一个、至少两个或至少三个aa的取代。
独立地或除任何Ala或Gly取代之外，任一上述Fas L变体可包含通过Asp(D)或Glu(E)取代至少一个、至少两个或至少三个带正电aa的取代和/或通过Arg(R)或Lys(K)残基取代至少一个、至少两个或至少三个带负电aa的取代。
d.PD-L1和其变体
作为一个非限制性实例，存在于T细胞-MP中的野生型MOD或变体MOD为PD-L1或变体PD-L1多肽。野生型PD-L1结合于PD1和CD80(也称为B7-1)。野生型人PD-L1多肽可包含以下aa序列：
Figure BDA0004113828220001081
其中aa 1至18形成信号序列，aa 19至127形成V型类Ig结构域或IgV结构域且133至225形成C2型类Ig结构域。
野生型人PD-L1胞外结构域可包含以下aa序列：
Figure BDA0004113828220001082
Figure BDA0004113828220001083
Figure BDA0004113828220001084
其中aa 1至109形成V型类Ig结构域或“IgV”结构域且aa 115至207形成C2型类Ig结构域。
适合用作MOD的野生型PD-L1 IgV结构域可包含SEQ D No.114的aa 18至127或aa19至127和羧基末端稳定序列，诸如例如以下序列的最后七个aa(粗体和斜体)：
Figure BDA0004113828220001085
Figure BDA0004113828220001086
在羧基稳定序列包含组氨酸(例如，Tyr(Y)的C端侧约5个残基的组氨酸出现为SEQ ID NO:116的aa 117)至约aa 122的情况下，组氨酸可与主链酰胺在aa 82和83(SEQ ID NO:116中以粗体和斜体表示(SEQ ID NO:114的Q107和L106)处形成稳定性静电键。作为一替代方案，可通过取代aa82或83)(SEQ ID NO:114的Q107和L106)中的一种和aa残基121、122或123(等效于SEQ IDNO:114的aa位置139至141)中的一种来形成稳定性二硫键。
野生型PD-1多肽可包含以下aa序列：
Figure BDA0004113828220001091
Figure BDA0004113828220001092
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115中所阐述的aa序列的PD-L1多肽的结合亲和力相比，变体PD-L1多肽(例如，SEQ ID NO:115的变体或PD-L1的IgV结构域)展现对于PD-1(例如，包含SEQ ID NO:117中所阐述的aa序列的PD-1多肽)的降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，变体PD-L1多肽以较包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115中所阐述的aa序列的PD-L1多肽的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合PD-1(例如，包含SEQ ID NO:117中所阐述的aa序列的PD-1多肽)。
在一些情况下，变体PD-L1多肽(例如，SEQ ID NO:115的变体或其IgV结构域)对于PD-1(例如，SEQ ID NO:117)的结合亲和力为1nM至1mM(例如，1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1μM、1μM至10μM、10μM至100μM或100μM至1mM)。作为另一实例，在一些情况下，变体PD-L1多肽(例如，SEQ ID NO:115的变体)对PD1(例如，包含SEQ ID NO:117中所阐述的aa序列的PD1多肽)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
可在用作MOD的PD-L1胞外结构域序列中进行多个aa取代，包括对与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:114的aa 19至127(IgV结构域)和SEQ ID NO:116中的任一种的至少85个连续aa(例如，至少90、至少95、至少100或至少105个连续aa)具有大于90％(95％、98％或99％)序列同一性的序列进行取代。取代可包括二硫键取代对D103C和G33C，或对V104和S34C(基于SEQ ID NO:114)。取代还包括形成盐桥的取代对Q107D和K62R或对Q107D和S80R(基于SEQ ID NO:114)。另外，取代包括Pi堆积取代M36Y或M36F(基于SEQ IDNO:114)。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:115的至少85个连续aa(例如，至少90、至少95、至少100或至少105个连续aa)和至少一个(例如，至少两个或至少三个)二硫键、盐桥和/或Pi堆积取代的序列。PD-L1 MOD序列可包含具有SEQ ID NO:114的aa 19至127(IgV结构域)的至少85个连续aa(例如，至少90、至少95、至少100或至少105个连续aa)和至少一个(例如，至少两个或至少三个)二硫键、盐桥和/或Pi堆积取代的序列。PD-L1MOD序列可包含具有aa SEQ ID NO:116的至少85个连续aa(例如，至少90、至少95、至少100或至少105个连续aa)和至少一个(例如，至少两个或至少三个)二硫键、盐桥和/或Pi堆积取代的序列。
在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有2个aa至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有3个aa或4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有5个aa或6个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有7个aa或8个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中所阐述的PD-L1 aa序列或PD-L1的IgV结构域相比，变体PD-L1多肽具有9个aa或10个aa取代。
适合的变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:115的至少170个连续aa(例如，至少180、190或200个连续aa)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的多肽序列(例如，其具有至少一个aa插入、缺失或取代)。适合的变体PD-L1 IgV多肽序列包括与SEQ ID NO:115的aa 1至109的至少70个连续aa(例如，至少80、90、100或105个连续aa)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的多肽序列(例如，其具有至少一个aa插入、缺失或取代)。
变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:115的至少80个(例如，至少90、100或109、110、120、150、180、190、200、210或219个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽序列，其包含aa 8处的Asp、aa 36处的Ile和/或aa 54处的Glu中的一种或多种(两种或更多种或所有三种)的取代。
变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:115的至少80个(例如，至少90、100或109、110、120、150、180、190、200、210或219个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽序列，其中位置8处的aa为除D以外的aa。在一种情况下，D8的位置经Ala取代。在另一此类实施方案中，D8的位置经Arg取代。
变体PD-L1多肽序列包括与SEQ ID NO:115的至少80个(例如，至少90、100或109、110、120、150、180、190、200、210或219个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽序列，其中位置36的aa为除I以外的aa。在一种情况下，I36的位置经Ala取代。在另一此类实施方案中，I36的位置经Asp取代。
变体PD-L1多肽序列还包括与SEQ ID NO:115的至少80个(例如，至少90、100或109、110、120、150、180、190、200、210或219个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽序列，其中位置54的aa为除E以外的aa。在一种情况下，E54的位置经Ala取代。在另一此类实施方案中，E54经Arg取代。
e.CD80和其变体
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD为变体CD80多肽。野生型CD80结合于CD28。
人CD80的胞外结构域的野生型aa序列可为如下：VIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEK KMVLTMMSGDMNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DN(SEQ ID NO:118)。参见NCBI参考序列：NP_005182.1。野生型人CD80的IgV结构域的aa序列可为如下：VIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSDEGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSV，(SEQ ID NO:119)，其为SEQ ID NO:118的aa 1至104。
野生型CD28 aa序列可为如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSCKYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHLCPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS(SEQ ID NO:120)。
野生型CD28 aa序列可为如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSWKHLCPSPLFP GPSKPFWVLV VVGGVLACYS LLVTVAFIIF WVRSKRSRLL HSDYMNMTPR RPGPTRKHYQPYAPPRDFAA YRS(SEQ ID NO:121)
野生型CD28 aa序列可为如下：MLRLLLALNL FPSIQVTGKH LCPSPLFPGP SKPFWVLVVVGGVLACYSLL VTVAFIIFWV RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S(SEQ IDNO:122)。
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:118中所阐述的aa序列或IgV结构域序列SEQ IDNO:119的CD80多肽对于CD28的结合亲和力相比，变体CD80多肽展现对于CD28的降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，变体CD80多肽以较包含SEQ ID NO:118中所阐述的aa序列的CD80多肽对于CD28(例如，包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:122中的一种中所阐述的aa序列的CD28多肽)的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合CD28。
在一些情况下，变体CD80多肽对于CD28的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一实例，在一些情况下，本发明的变体CD80多肽对于CD28(例如，包含SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:121或SEQ ID NO:122中所阐述的aa序列的CD28多肽)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有1至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80aa序列相比，变体CD80多肽具有1个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有3个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有5个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80aa序列相比，变体CD80多肽具有6或7个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:118或119中所阐述的CD80 aa序列相比，变体CD80多肽具有8、9或10个aa取代。
具有至少一个aa取代的一些CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的那些。
一些适合的CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ IDNO:119具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自约残基19至约残基67具有至少一个(例如，至少两个或至少三个)aa取代的多肽，包括其后的那些。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置19处的aa为除N以外的aa。在一种情况下，N19的位置经Ala取代。在另一此类实施方案中，N19经Arg取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置25处的aa为除L以外的aa。在一种情况下，L25的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置31处的aa为除Y以外的aa。在一种情况下，Y31的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置33处的aa为除Q以外的aa。在一种情况下，Q33的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置38处的aa为除M以外的aa。在一个此类实施方案中，M38的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置39处的aa为除V以外的aa。在一种情况下，V39的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置49处的aa为除I以外的aa。在一种情况下，I49的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置53处的aa为除Y以外的aa。在一种情况下，Y53的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置60处的aa为除D以外的aa。在一些情况下，D60的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置63处的aa为除N以外的aa。在一种情况下，N63的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置67处的aa为除I以外的aa。在一种情况下，I67的位置经Ala取代。
一些适合的CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ IDNO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自约残基86至约残基118具有至少一个(例如，至少两个或至少三个)aa取代的多肽，包括其后的那些。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置86处的aa为除K以外的aa。在一种情况下，K86的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置119处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，F119的位置经Ala取代。CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置118处的aa为除P以外的aa。在一种情况下，P118的位置经Ala取代。
一些适合的CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ IDNO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自约残基156至约残基158具有至少一个(例如，至少两个或至少三个)aa取代的多肽，包括其后的那些。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置156处的aa为除S以外的aa。在一种情况下，aa156的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置157处的aa为除Q以外的aa。在一种情况下，aa157的位置经Ala取代。
CD80胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，至少90、100或104、120、150、180、200或208个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置158处的aa为除D以外的aa。在一些情况下，aa158的位置经Ala取代。
CD80变体包括包含与SEQ ID NO:118或IgV结构域序列SEQ ID NO:119的至少80个(例如，90、100、110、120、130或133个)连续aa具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)aa序列同一性的多肽，并且包含CD80变体MOD表中所阐述的CD80序列变化中的至少一种。
f.CD86和其变体
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD为变体CD86多肽。野生型CD86结合于CD28。
野生型人CD86的完整胞外结构域的aa序列可为如下：
Figure BDA0004113828220001181
野生型人CD86的IgV结构域的aa序列可为如下：
Figure BDA0004113828220001191
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:124中所阐述的aa序列的CD86多肽对于CD28的结合亲和力相比，变体CD86多肽展现对于CD28的降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，变体CD86多肽以较包含SEQ ID NO:123或SEQ ID NO:124中所阐述的aa序列的CD86多肽对于CD28(例如，包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:122中的一种中所阐述的aa序列的CD28多肽)的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合CD28。
在一些情况下，变体CD86多肽对于CD28的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一实例，在一些情况下，本发明的变体CD86多肽对于CD28(例如，包含SEQ ID NO:120、SEQ IDNO:121或SEQ ID NO:122中的一种中所阐述的aa序列的CD28多肽)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有2至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有3个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有5个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有6或7个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:123或124中所阐述的CD86 aa序列相比，变体CD86多肽具有8、9或10个aa取代。
具有至少一个aa取代的一些CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或IgV结构域序列SEQ ID NO:124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的那些。适合的CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO 8123或124具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自约残基33至约残基110具有至少一个(例如，至少两个或至少三个)aa取代的多肽，包括其后的那些。
CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置33处的aa为除F以外的aa。在一种情况下，F33的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置35处的aa为除Q以外的aa。在一种情况下，Q35的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置41处的aa为除V以外的aa。在一种情况下，V41的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置59处的aa为除Y以外的aa。在一种情况下，Y59的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置61处的aa为除N以外的aa。在一种情况下，N61的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置66处的aa为除D以外的aa。在一种情况下，D66的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置70处的aa为除W以外的aa。在一种情况下，W70的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置72处的aa为除L以外的aa。在一种情况下，L72的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置91处的aa为除H以外的aa。在一种情况下，H91的位置经Ala取代。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中位置110处的aa为除L以外的aa。在一种情况下，L110的位置经Ala取代。
CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中N61为除Asn以外的aa且其中H91为除His以外的aa。在一实施方案中，通过Ala取代Asn61和His91两者的位置(N61A和H91A取代)。CD86胞外结构域变体包括与SEQID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中D66为除Asp以外的aa且其中H91为除His以外的aa。在一实施方案中，通过Ala取代Asp66和His91两者的位置(D66A和H91A取代)。CD86胞外结构域变体包括与SEQ ID NO:123或124的至少80个(例如，至少90、100或109、120、150、180、200或224个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中N61为除Asn以外的aa，D66为除Asp以外的aa且其中H91为除His以外的aa。在一种情况下，通过Ala取代Asn61、Asp66和His91的位置(N61A、D66A和H91A取代)。
g.4-1BBL和其变体
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的变体MOD为变体4-1BBL多肽。野生型4-1BBL结合于4-1BB(CD137)。
野生型4-1BBL aa序列可为如下：MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWALVAGLLLLLL LAAACAVFLACPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRV TPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:125)。NCBI参考序列：NP_003802.1，其中aa 29至49为跨膜区，
在一些情况下，变体4-1BBL多肽为人4-1BBL的肿瘤坏死因子(TNF)同源结构域(THD)的变体。人4-1BBL的THD的野生型aa序列可包含例如如下的SEQ ID NO:126-128中的一种：
PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSLTGGLSYKEDT KELVVAKAGVYYVFFQLELR RVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRVTPEIPAGLPS PRSE(SEQ ID NO:126)；
D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE(SEQ ID NO:127)；和
D PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWYSDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEA RARHAWQLTQGATVLGLFRV TPEIPA(SEQ ID NO:128)。
野生型4-1BB aa序列可为如下：MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSNCPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQRTCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCSLDGKSVLVNG TKERDVVCGPSPADLSPGAS SVTPPAPAREPGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL(SEQ ID NO:129)。
在一些情况下，与包含SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的aa序列的4-1BBL多肽的结合亲和力相比，变体4-1BBL多肽展现对于4-1BB的降低的结合亲和力。举例而言，在一些情况下，当在相同条件下分析时，本发明的变体4-1BBL多肽以较包含SEQ ID NO:125-128中的一种中所阐述的aa序列的4-1BBL多肽对于4-1BB多肽(例如，包含SEQ ID NO:129中所阐述的aa序列的4-1BB多肽)的结合亲和力低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少95％或低超过95％的结合亲和力结合4-1BB。
在一些情况下，变体4-1BBL多肽对于4-1BB的结合亲和力为100nM至100μM。作为另一实例，在一些情况下，变体4-1BBL多肽对于4-1BB(例如，包含SEQ ID NO:129中所阐述的aa序列的4-1BB多肽)的结合亲和力为约100nM至约200nM、约200nM至约400nM、约400nM至约600nM、约600nM至约800nM、约800nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约75μM或约75μM至约100μM。
在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有单一aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有2至10个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:125-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有2个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有3个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有4个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有5个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:125-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有6或7个aa取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:126-128中的一种中所阐述的4-1BBL aa序列相比，变体4-1BBL多肽具有7、8或9个aa取代。
具有至少一个aa取代的一些4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性的那些。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自残基11至残基30具有至少一个aa取代的多肽。自残基11至残基30具有取代的一些4-1BBl变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中：位置11处的aa为除M以外的aa，位置12处的aa为除F处的aa，位置14处的aa为除Q以外的aa，位置15处的aa为除L以外的aa，位置16处的aa为除V以外的aa，位置18处的aa为除Q以外的aa，位置19处的aa为除N以外的aa，位置20处的aa为除V以外的aa，位置21处的aa为除L以外的aa，位置22处的aa为除L以外的aa，位置23处的aa为除I以外的aa，位置24处的aa为除D以外的aa，位置25处的aa为除G以外的aa，位置26处的aa为除P以外的aa，位置27处的aa为除L以外的aa，位置28处的aa为除S以外的aa，位置29处的aa为除W以外的aa，或位置30处的aa为除Y以外的aa。4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中aa 11、12、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的一种经Ala取代。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自残基31至残基50具有至少一个aa取代的多肽。自残基31至残基50具有取代的一些4-1BBl变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中：位置31处的aa为除S以外的aa，位置32处的aa为除D以外的aa，位置33处的aa为除P以外的aa，位置34处的aa为除G以外的aa，位置35处的aa为除L以外的aa，位置37处的aa为除G以外的aa，位置38处的aa为除V以外的aa，位置39处的aa为除S以外的aa，位置40处的aa为除L以外的aa，位置41处的aa为除T以外的aa，位置42处的aa为除G以外的aa，位置43处的aa为除G以外的aa，位置44处的aa为除L以外的aa，位置45处的aa为除S以外的aa，位置46处的aa为除Y以外的aa，位置47处的aa为除K以外的aa，位置48处的aa为除E以外的aa，位置49处的aa为除D以外的aa，或位置50处的aa为除T以外的aa。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％aa序列同一性且在该序列自残基51至残基78中具有至少一个aa取代的多肽。自残基51至残基78具有取代的一些4-1BBl变体包括以下变体。4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中aa 31、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中的一种经Ala取代。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自残基51至残基100具有至少一个aa取代的多肽。自残基51至残基100具有取代的一些4-1BBl变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中其中位置51处的aa为除K以外的aa，位置52处的aa为除E以外的aa，位置65处的aa为除F以外的aa，位置66处的aa为除Q以外的aa，位置67处的aa为除以外的aa，位置68处的aa为除E以外的aa，位置69处的aa为除L以外的aa，位置70处的aa为除R以外的aa，位置71处的aa为除R以外的aa，位置72处的aa为除V以外的aa，位置73处的aa为除V以外的aa，位置75处的aa为除G以外的aa，位置76处的aa为除E以外的aa，位置77处的aa为除G以外的aa，或位置78处的aa为除S以外的aa。4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中aa 51、52、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77或78中的一种经Ala取代。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自残基103至残基117具有至少一个aa取代的多肽。自残基103至残基117具有取代的一些4-1BBl变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中：位置103处的aa为除V以外的aa，位置104处的aa为除D以外的aa，位置105处的aa为除L以外的aa，位置106处的aa为除P以外的aa，位置109处的aa为除S以外的aa，位置110处的aa为除S以外的aa，位置111处的aa为除E以外的aa，位置113处的aa为除R以外的aa，位置125处的aa为除N以外的aa，或位置115处的aa为除S以外的aa。在一种情况下，S115的位置经Ala取代或位置117处的aa为除F以外的aa。
4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中aa 103、104、105、106、109、110、111、113、114、115或117中的一种经Ala取代。
适合的4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％aa序列同一性且在该序列中自残基130至残基154具有至少一个aa取代的多肽。自残基130至残基154具有取代的一些4-1BBl变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中：位置130处的aa为除Q以外的aa，位置131处的aa为除R以外的aa，位置132处的aa为除L以外的aa，位置133处的aa为除G以外的aa，位置134处的aa为除V以外的aa，位置135处的aa为除H以外的aa，位置136处的aa为除L以外的aa，位置137处的aa为除H以外的aa，位置138处的aa为除T以外的aa，位置139处的aa为除E以外的aa，位置141处的aa为除R以外的aa，位置143处的aa为除R以外的aa，位置144处的aa为除H以外的aa，位置146处的aa为除W以外的aa，位置147处的aa为除Q以外的aa，位置148处的aa为除L以外的aa，位置149处的aa为除T以外的aa，位置150处的aa为除Q以外的aa，位置151处的aa为除G以外的aa，位置153处的aa为除T以外的aa，或位置154处的aa为除V以外的aa。4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、98％或99％)aa序列同一性的多肽，其中aa 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、141、143、144、146、147、148、149、150、151、153或154中的一种经Ala取代。
4-1BBL变体包括与SEQ ID NO:126的至少140个(例如，至少160、175、180或181个)连续aa具有至少90％(例如，至少95％、至少98％或者至少99％)aa序列同一性的多肽，并且包含通过除Lys以外的aa取代K47(SEQ ID NO:125的K127)的取代。在一实施方案中，K47经Ala取代以形成K47A取代(SEQ ID NO:126中的K127A取代)。在一实施方案中，Asp66和His91两者的位置经Ala取代(例如，SEQ ID NO:126中的D66A和H91A取代)。
h.抗CD28
在一些情况下，针对CD28的抗体或抗体序列(例如，抗CD28抗体、结合CD28的抗体片段或结合于CD28的scFv、纳米抗体或双功能抗体)可用作T细胞-MP中的MOD。已描述抗CD28抗体充当CD28活性的超激动剂、激动剂或拮抗剂的能力。参见例如，Poirier等人，(2012)Amer.J.of Transplantation,“CD28-Specific Immunomodulating Antibodies:What Can Be Learned From Experimental Models？”12:1682-1690。特别关注充当激动剂或超激动剂的抗CD28抗体。
在不存在任何其他MOD序列下，抗CD28抗体或抗CD28序列可包括于T细胞-MP中。另选地，可将针对CD28的抗体或抗体序列与一个或多个额外MOD或变体MOD一起并入T细胞-MP中。在一实施方案中，T细胞-MP包含一个或多个(例如，两个)抗CD28抗体或抗CD28序列以及一个或多个(例如，两个)4-1BBL MOD或变体MOD，诸如上文描述的那些MOD。在一实施方案中，T细胞-MP包含一个或多个(例如，两个)抗CD28抗体或抗CD28序列以及一个或多个(例如，两个)IL-2MOD或变体IL-2MOD，诸如上文描述的那些MOD。举例而言，变体IL-2MOD中的取代可包括H16A或H16T以及F42A或F42T取代。举例而言，T细胞-MP可包含一个或多个(例如，两个)抗CD28抗体或抗CD28序列(例如，抗CD28 scFv)以及一个或多个包含H16A和/或F42A取代的变体IL-2MOD。
在一些情况下，适用于包括于T细胞-MP中的抗CD28抗体包含：a)存在于轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，该VL包含以下氨基酸序列：QWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPV DEDDVA MYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:559)；和b)存在于重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3，该VH包含以下氨基酸序列：QVKLQQSGPGL VTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGG GTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDK GYSYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:560)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表；和Kabat1991)。在一些情况下，VH和VLCDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表；和Chothia 1987)。在一些情况下，VH CDR为：DYGVH(VH CDR1)(SEQ ID NO:561)；VIWAGGGT NYNSALMS(VH CDR2)(SEQ ID NO:562)和DKGYSYYYSMDY(VH CDR3)(SEQ ID NO:563)。
在一些情况下，适用于包括于T细胞-MP中的抗CD28抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QWYQQ KPGQPPKLLIF AASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:559)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVKLQQSGPG LVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGG GTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDK GYSYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:560)。
在以下情况下，适用于包括于T细胞-MP中的抗CD28抗体为scFv，以自N端至C端的顺序其包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV PARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTK LEIKR(SEQ ID NO:559)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVKLQQSGPGLVTPSQ SLSITCT VSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSR KSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDY WGQGTTVTVSS(SEQ IDNO:560)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适用于包括于T细胞-MP中的抗CD28抗体为scFv，以自N端至C端的顺序其包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列：QVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGL EWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQAD DTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:560)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列：QWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARF SGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIK R(SEQ ID NO:559)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
6接头
T细胞-MP(和其T细胞-MP-表位缀合物)可包括一个或多个经独立选择的接头多肽序列，其插入例如以下中的任何一种或多种之间：
(i)两个MOD多肽，其位于β2M多肽序列的N端侧上(称为L1接头或位置)；
(ii)MOD与β2M多肽序列之间(称为L2接头或位置)；
(iii)β2M多肽序列与MHC-H多肽序列之间(称为L3接头或位置)；
(iv)MHC-H多肽序列与支架多肽序列之间(称为L4接头或位置)；
(iv)支架的羧基端或支架多肽序列与置于其羧基端的MOD多肽序列之间(称为L5接头或位置)；或
(vi)置放于支架的羧基侧的两个MOD多肽序列之间(称为L6接头或位置)。
参见例如，图5。
可将用于偶联表位(例如，肽表位)的化学缀合位点并入接头(例如，L1至L6接头)中，包括MHC-H多肽序列与β2M多肽序列之间的L3。因此，可将包括但不限于硫酸酯酶、分选酶、转谷胺酰胺酸酶、硒代半胱氨酸、非天然氨基酸和天然存在的蛋白质氨基酸(例如，半胱氨酸残基)等的化学缀合位点并入接头中，包括L3接头。置放于N端或C端的多肽接头提供偶联额外多肽(例如，组氨酸标签)、有效负载等且保护多肽免受外切蛋白酶影响的位置。
也可在肽表位与用于将肽表位偶联至未缀合T细胞-MP的化学偶联位点的任何反应性化学部分(基团)之间使用接头(参见例如，图10)。在表位(例如，肽表位)与反应性化学部分之间所使用的接头可为肽/多肽接头和/或其他化学接头(例如，呈包含烷基作为间隔子的同或异双官能接头形式的非肽接头，参见例如图10的在条目d和e处)。
适合的多肽接头(也称为“间隔子”)可容易地选择且可具有多种适合长度中的任一种，诸如1个aa至50个aa、1个aa至5个aa、1个aa至15个aa、2个aa至15个aa、2个aa至25个aa、3个aa至12个aa、4个aa至10个aa、4个aa至35个aa、5个aa至35个aa、5个aa至10个aa、5个aa至20个aa、6个aa至25个aa、7个aa至35个aa、8个aa至40个aa、9个aa至45个aa、10至15个aa、10个aa至50个aa、15至20个aa、20至40个aa或40至50个aa。长度为10至50个aa的适合的多肽接头可为10至20、10至25、15至25、20至30、25至35、25至50、30至35、35至45或40至50)。在实施方案中，适合的接头的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个aa。多肽接头的长度可为15个aa至50个aa，例如长度为20至35、25至30、25至45、30至35、35至40、40至45或45至50个aa。
T细胞-MP中的多肽接头可包括例如包含、基本上由以下组成或由以下组成的多肽：i)Gly和/或Ser；ii)Ala和Ser；iii)Gly、Ala和Ser；iv)Gly、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)；v)Ala、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)；和vi)Gly、Ala、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)。例示性接头可包括甘氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如包含序列GA、AG、AS、SA、GS、GSGGS(SEQ ID NO:130)或GGGS(SEQ IDNO:131)的聚合物，其中的任一种可重复1至10次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)；和本领域已知的其他柔韧性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物均可使用，此因为Gly和Ser均为相对非结构化的且因此可用作组分之间的中性系链。甘氨酸聚合物较平均丙氨酸聚合物获得显著更多的phi-psi空间，并且较具有更长侧链的残基更少受限制(参见，Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。例示性接头也可包含aa序列，该aa序列包含但不限于GGSG(SEQ ID NO:132)、GGSGG(SEQ ID NO:133)、GSGSG(SEQ ID NO:134)、GSGGG(SEQ ID NO:135)、GGGSG(SEQ ID NO:136)、GSSSG(SEQ ID NO:137)，其中的任一种均可重复1至15次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次)，或其组合等。接头也可包含序列Gly(Ser)4(SEQ ID NO:138)或(Gly)4Ser(SEQ ID NO:139)，其中的任一种可重复1至10次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。在一实施方案中，接头包含X1-X2-X3-X4-X5，其中X1-X5选自甘氨酸和丝氨酸，并且其中的一种可为亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸(SEQ ID NO:140)。在一个实施方案中，接头包含aa序列AAAGG(SEQ ID NO:532)，其可重复1至10次。
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的接头多肽包括一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基可与存在于另一T细胞-MP中的半胱氨酸残基形成二硫键或充当用于偶联表位(例如，经由与顺丁烯二酰亚胺反应)的化学缀合位点。在一些情况下，例如，接头包含Gly、Ser和单一Cys，诸如在以下aa序列中：
Figure BDA0004113828220001341
其中G4S单元可重复1至10次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)；/>
Figure BDA0004113828220001342
Figure BDA0004113828220001343
或/>
Figure BDA0004113828220001344
接头可包含aa序列(GGGGS)(SEQ ID NO:139，也可表示为Gly4Ser或G4S)，其可重复1至10次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。在一些实施方案中，包含G4S重复的接头具有经亮氨酸或甲硫氨酸置换的一个甘氨酸或丝氨酸残基。当与第二T细胞-MP进行双链化时，包含含Gly4Ser的接头多肽的第一T细胞-MP可与存在于双链体T细胞-MP的第二T细胞-MP中的半胱氨酸残基形成二硫键，该接头多肽包括半胱氨酸残基。存在于接头(特定来说，L3接头)中的此类半胱氨酸残基也可用作连接表位(例如，肽表位)的化学缀合位点，诸如通过与作为表位的部分或通过接头间接连接至表位的顺丁烯二酰亚胺官能性反应。在一些情况下，例如，接头包含aa序列GCGGS(G4S)(SEQ ID NO:141)，其中G4S单元可重重1至10次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)；
Figure BDA0004113828220001345
Figure BDA0004113828220001346
序列/>
Figure BDA0004113828220001347
Figure BDA0004113828220001348
或序列/>
Figure BDA0004113828220001349
可用于将表位、靶向序列和/或有效负载(例如，药物或标记剂)共价连接至T细胞-MP的非肽接头(包括其肽接头)可采用多种形式，包括但不限于烷基、聚(乙二醇)、二硫基、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。非肽接头(或“交联剂”)也可为例如包含反应性端基，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酸酯等的同双官能或异双官能接头。适合的交联剂的实例包括：N-琥珀酰亚胺基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-顺丁烯二酰亚胺)；4-(2-吡啶基二硫)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)；4-(2-吡啶基二硫)2-磺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺-SPDB)；4-(2-吡啶基二硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)(LC-SMCC)；κ-顺丁烯二酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)；γ-顺丁烯二酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)；ε-顺丁烯二酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)；间顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)；N-(α-顺丁烯二酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)；琥珀酰亚胺基-6-(β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺)己酸酯(SMPH)；4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)；N-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)；4(2-吡啶基硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基(MC)；顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(MP)；对氨基苯甲氧基羰基(PAB)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)、SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC)；3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(BMPS)；碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)；溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)；和3-(溴乙酰胺)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。
7额外多肽序列
除上述那些之外，T细胞-MP的多肽链可包括一个或多个多肽。适合的额外多肽包括表位标签、亲和性结构域和荧光蛋白序列(例如，绿色荧光蛋白)。可包括一个或多个额外多肽作为由细胞或无细胞系统在多聚体多肽的多肽链的N端、在多聚体多肽的多肽链的C端或在多聚体多肽的多肽链内部处翻译的多肽的部分。
a.表位标签和亲和性结构域
适合的表位标签包括但不限于血球凝集素(HA；例如，YPYDVPDYA(SEQ ID NO:145))；c-myc(例如，EQKLISEEDL；SEQ ID NO:146))等。
亲和性结构域包括可与结合配偶体相互作用的肽序列，诸如固定于固体支撑物上的肽序列，可用于鉴别或纯化。当与所表达蛋白质融合时，编码多个连续单一氨基酸，诸如组氨酸的DNA序列可通过高亲和力结合于树脂柱，诸如镍
Figure BDA0004113828220001361
来一步纯化重组蛋白。例示性亲和性结构域包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO:147)、HisX6(HHHHHH)(SEQ IDNO:148)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:146)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:149、StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO:150)、血球凝集素(例如，HA标签(YPYDVPDYA)(SEQ IDNO:145))、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫固氮铁氧还原蛋白、纤维素结合结构域、RYIRS(SEQID NO:151)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:152)、甲壳素缀合结构域、S-肽、T7肽、SH2结构域、C端RNA标签、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO:153)、金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合结构域，诸如来自钙缀合蛋白的那些，例如调钙蛋白、肌钙蛋白C、神经钙蛋白B、肌凝蛋白轻链、恢复蛋白(recoverin)、S-调控蛋白、视锥蛋白(visinin)、VILIP、神经钙蛋白、海马钙蛋白、频蛋白(frequenin)、钙牵蛋白、钙蛋白酶大亚基、S100蛋白质、小清蛋白(parvalbumin)、钙缀合蛋白D9K、钙缀合蛋白D28K和钙网膜蛋白、内含肽、生物素、链霉抗生物素蛋白、MyoD、Id、亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白。
b.靶向序列
本发明的T细胞-MP可包括一个或多个靶向多肽序列或“靶向序列”。靶向序列可位于T细胞-MP多肽内的任何位置处，诸如支架肽的羧基端内、处或其附近(例如，代替图5或图6中的C端MOD与支架一起翻译或连接至L5接头)。另选地，诸如抗体抗原结合片段(Fab)的靶向序列可共价或非共价连接至T细胞-MP。靶向序列的共价连接可在化学缀合位点(例如，支架多肽中的化学缀合位点)处进行，其中靶向序列有效地变成连接至T细胞-MP的类有效负载分子。靶向序列也可非共价结合于T细胞-MP(例如，具有生物素标记的支架的T细胞-MP可非共价连接至针对癌抗原的抗生物素蛋白标记的靶向抗体或Fab)。也可使用具有针对T细胞-MP的一部分(例如，支架)的第一抗原结合位点的双特异性抗体(例如，双特异性IgG或人源化抗体)以将T细胞-MP非共价连接至针对目标(例如，癌症抗原)的靶向序列(第二双特异性抗体结合位点)。靶向序列用于将T细胞-MP结合或“定位”至展示结合靶向序列的蛋白质(或其他分子)的细胞和/或组织。靶向序列可为抗体或其抗原结合片段。靶向序列也可为单链T细胞受体(scTCR)。
(i)目标
存在于本发明的T细胞-MP中的靶向序列可靶向感染生物体的抗原和/或受感染的细胞。在一种情况下，靶向序列可为抗体或涵盖抗体的抗原结合片段的多肽。靶向序列可例如针对感染因子，诸如病毒、细菌、真菌、原生动物和蠕虫的蛋白质/表位，包括表达于细胞表面上的感染因子的那些蛋白质/表位。举例而言，感染HPV的细胞可表达靶向序列可针对的E6或E7蛋白或其部分。靶向序列也可为对癌症相关抗原(“cancer associated antigen；CAA”)，诸如与非实体癌(例如，白血病)相关的抗原和/或实体瘤相关抗原具有特异性的癌症靶向多肽(Cancer Targeting Polypeptide)或“CTP”。在一种情况下，靶向序列对癌细胞表面上的癌症相关肽/HLA(pHLA)复合物具有特异性，其中肽可为癌症相关肽(例如，癌症相关抗原的肽片段)。本发明的T细胞-MP可使用结合存在于癌细胞上或在HLA蛋白的情形下作为肽存在的CAA的靶向序列靶向癌细胞
(a)癌症相关抗原(CAA)
可用存在于本发明的T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物，诸如双链体T细胞-MP中的CTP靶向的CAA包括例如：NY-ESO(纽约食管鳞状细胞癌1(New York Esophageal SquamousCell Carcinoma1))、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(melanoma antigen recognized by Tcells 1，MART-1，也称为Melan-A)、人乳突状瘤病毒(human papilloma virus；HPV)E6、B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen；BCMA)、CD123、CD133、CD171、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CEA(癌胚抗原)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；EGFR)、表皮生长因子受体变体III(epidermal growth factor receptor variant III；EGFRvIII)、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、EphA2(ephrinA型受体2)、二唾液酸神经节苷脂GD2、GPC3(glypican-3)、HER2、IL13Rα2(白介素13受体亚基α-2)、LeY(二岩藻糖基化2型血型相关抗原)、黑色素瘤相关抗原(也称为黑色素瘤相关抗原基因产物或MAGE)A3(MAGEA3)、黑色素瘤糖蛋白、间皮素(mesothelin)、MUC1(粘蛋白1)、MUC16(粘蛋白16)、髓磷脂、NKG2D(自然杀手群组2D)配体、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membraneantigen；PSMA)和ROR1(类I型受体酪氨酸激酶孤儿受体)。
可用存在于T细胞-MP中的CTP靶向的CAA还包括但不限于：17-1A-抗原、甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、bcl-2、bcl-6、BCMA、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX(CAIX)、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD171、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CEA、CEACAM5、CEACAM6、密连蛋白(例如，密连蛋白1、密连蛋白10、密连蛋白18(例如密连蛋白18，异型体2))、补体因子(诸如，C3、C3a、C3b、C5a和C5)、结肠特异性抗原-p(CSAp)、c-Met、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、DAM、Dickkopf相关蛋白(DKK)、ED-B纤连蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、EphA2、EphA3、纤维母细胞活化蛋白(FAP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸结合蛋白、叶酸受体、G250抗原、神经节苷脂(诸如，GC2、GD3和GM2)、GAGE、GD2、gp100、GPC3、GRO-13、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚基、HER2、HER3、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HIF-1a、HSP70-2M、HST-2、Ia、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-X、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL13Rα2、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、ILGF、ILGF-1R、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、IGF-1R、整合素αVβ3、整合素α5β1、KC4-抗原、杀手细胞类免疫球蛋白受体(KIR)、Kras、KS-1-抗原、KS1-4、LDR/FUT、Leγ、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、mCRP、MCP-1、黑色素瘤糖蛋白、间皮素、MIP-1A、MIP-1B、MIF、粘蛋白(诸如，MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2和MUM-3)、NCA66、NCA95、NCA90、结合素-4、NY-ESO-1、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD-1、PD-L1、PD-1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、RSS、RANTES、SAGE、5100、生存素、生存素-2B、T101、TAC、TAG-72、肌腱蛋白、Thomson-Friedenreich抗原、Tn抗原、TNF-α、肿瘤坏死抗原、TRAG-3、TRAIL受体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)、VEGF受体(VEGFR)和WT-1。
用T细胞-MP的CTP靶向的CAA可为与血液癌相关的抗原。此类抗原的实例包括但不限于BCMA、C5、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD56、CD66、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD138、CTLA-4、CXCR4、DKK、EphA3、GM2、HLA-DRβ、整合素αVβ3、IGF-R1、IL6、KIR、PD-1、PD-L1、TRAILR1、TRAILR2、转铁蛋白受体和VEGF。在一些情况下，CAA为由恶性B细胞表达的抗原，诸如CD19、CD20、CD22、CD25、CD38、CD40、CD45、CD74、CD80、CTLA-4、IGF-R1、IL6、PD-1、TRAILR2或VEGF。
用T细胞-MP的CTP靶向的CAA可与实体瘤相关。此类抗原的实例包括但不限于：CAIX、钙粘蛋白、CEA、c-MET、CTLA-4、EGFR家族成员、EpCAM、EphA3、FAP、叶酸结合蛋白、FR-α、神经节苷脂(诸如，GC2、GD3和GM2)、HER2、HER3、IGF-1R、整合素αVβ3、整合素α5β1、Leγ、Liv1、间皮素、粘蛋白、NaPi2b、PD-1、PD-L1、PD-1受体、pgA33、PSMA、RANKL、ROR1、TAG-72、肌腱蛋白、TRAILR1、TRAILR2、VEGF、VEGFR和上文列出的其他物质。
(b)肽/HLA复合物
在一些情况下，T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物，诸如双链体T细胞-MP的CTP靶向癌细胞表面上的肽/HLA(pHLA)复合物，其中肽为癌症相关肽(例如，癌症相关抗原的肽片段)。癌症相关肽抗原为本领域已知的。在一些情况下，癌症相关肽结合于HLA复合物，该HLA复合物包含HLA-A*0201重链和β2M多肽。
在一些情况下，存在于癌细胞表面上的pHLA中的CAA肽表位结合于包含HLA重链的HLA复合物，该HLA重链诸如HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303和/或HLA-A*3401。在一些情况下，存在于癌细胞表面上的pHLA中的肽表位结合于包含HLA重链的HLA复合物，该HLA重链诸如HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601和/或HLA-B*5301。在一些情况下，存在于癌细胞表面上的pHLA中的肽表位结合于包含HLA重链的HLA复合物，该HLA重链诸如C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*702、C*0801和/或C*1502。
在一些情况下，CAA肽为以下癌症相关抗原中的任一种的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa至5个aa、6个aa至8个aa、9个aa至11个aa、12个aa至16个aa或16个aa至20个aa)的肽：CD28多肽、MUC1多肽、LMP2多肽、表皮生长因子受体(EGFR)vIII多肽、HER-2/neu多肽、黑色素瘤抗原家族A、3(MAGE A3)多肽、p53多肽、突变体p53多肽、NY-ESO-1多肽、叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原；PSMA)多肽、癌胚抗原(CEA)多肽、密连蛋白多肽(例如，密连蛋白-1、密连蛋白-10、密连蛋白-18(例如，密连蛋白-18，异型体2))、Nectin-4多肽、由T细胞识别的黑色素瘤抗原(melanA/MART1)多肽、Ras多肽、gp100多肽、蛋白酶3(PR1)多肽、bcr-abl多肽、酪氨酸酶多肽、生存素多肽、前列腺特异性抗原(PSA)多肽、hTERT多肽、肉瘤易位断点多肽、滑膜肉瘤X(SSX)断点多肽、EphA2多肽、酸性磷酸酶前列腺(PAP)多肽、黑色素瘤凋亡抑制(ML-IAP)多肽、上皮细胞粘附分子(EpCAM)多肽、ERG(TMPRSS2ETS融合)多肽、NA17多肽、成对-盒-3(PAX3)多肽、间变性淋巴瘤激酶(ALK)多肽、雄激素受体多肽、周期蛋白B1多肽、N-myc原癌(MYCN)多肽、Ras同系基因家族成员C(RhoC)多肽、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)多肽、间皮素多肽、前列腺干细胞抗原(PSCA)多肽、黑色素瘤相关抗原-1(MAGE A1)多肽、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)多肽、胎盘特异性蛋白1(PLAC1)多肽、BORIS多肽(也称为CCCTC缀合因子或CTCF)、ETV6-AML多肽、乳腺癌抗原NY-BR-1多肽(也称为含锚蛋白重复结构域的蛋白质30A)、G蛋白信号调节(RGS5)多肽、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)多肽、碳酸酐酶IX多肽、成对盒-5(PAX5)多肽、OY-TES1(睾丸抗原；也称为顶体结合蛋白)多肽、精子蛋白17多肽、淋巴细胞特异性蛋白-酪氨酸激酶(LCK)多肽、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、A-激酶锚定抗原-4(AKAP-4)、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽、X抗原家族成员1(XAGE1)多肽、B7同系3(B7H3；也称为CD276)多肽、豆荚蛋白多肽(LGMN1；也称为天冬酰胺内肽酶)、具有Ig和EGF同系与-2的酪氨酸激酶(Tie-2；也称为血管生成素-1受体)多肽、P抗原家族成员4(PAGE4)多肽、血管内皮生长因子受体2(VEGF2)多肽、MAD-CT-1多肽、纤维母细胞活化蛋白(FAP)多肽、血小板衍生的生长因子受体β(PDGFβ)多肽、黑色素瘤睾丸抗原-2(MAD-CT-2)多肽、Fos相关抗原-1(FOSL)多肽；人乳头状瘤病毒(HPV)抗原；甲胎蛋白(AFP)抗原和威尔姆氏瘤-1(Wilms tumor 1；WT1)抗原。
举例而言，存在于T细胞-MP中的CTP可结合于：a)WT-1肽，其结合于包含HLA重链(例如，HLA-A*0201重链或HLA-A*2402重链)和β2M多肽的HLA复合物；b)HPV肽，其结合于包含I类HLA重链和β2M多肽的HLA复合物；c)间皮素肽，其结合于包含I类HLA重链和β2M多肽的HLA复合物；d)Her2肽，其结合于包含I类HLA重链和β2M多肽的HLA复合物；或e)BCMA肽，其结合于包含I类HLA重链和β2M多肽的HLA复合物。
CAA肽可包含间皮素多肽的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽，该间皮素多肽与以下间皮素aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性：LAGE TGQEAAPLDG VLANPPNISSLSPRQLLGFP CAEVSGLSTE RVRELAVALA QKNVKLSTEQ LRCLAHRLSE PPEDLDALPL DLLLFLNPDAFSGPQACTRF FSRITKANVD LLPRGAPERQ RLLPAALACW GVRGSLLSEA DVRALGGLAC DLPGRFVAESAEVLLPRLVS CPGPLDQDQQ EAARAALQGG GPPYGPPSTW SVSTMDALRG LLPVLGQPII RSIPQGIVAAWRQRSSRDPS WRQPERTILR PRFRREVEKT ACPSGKKARE IDESLIFYKK WELEACVDAA LLATQMDRVNAIPFTYEQLD VLKHKLDELY PQGYPESVIQ HLGYLFLKMS PEDIRKWNVT SLETLKALLE VNKGHEMSPQVATLIDRFVK GRGQLDKDTL DTLTAFYPGY LCSLSPEELS SVPPSSIWAV RPQDLDTCDP RQLDVLYPKARLAFQNMNGS EYFVKIQSFL GGAPTEDLKA LSQQNVSMDL ATFMKLRTDA VLPLTVAEVQ KLLGPHVEGLKAEERHRPVR DWILRQRQDD LDTLGLGLQG GIPNGYLVLD LSMQEALSGT PCLLGPGPVL TVLALLLASTLA(SEQ ID NO:154)。举例而言，存在于pHLA复合物中的间皮素肽可为：i)KLLGPHVEGL(SEQID NO:155)；ii)AFYPGYLCSL(SEQ ID NO:156)，其可结合HLA-A*2402/β2M；iii)VLPLTVAEV(SEQ ID NO:157)；iv)ELAVALAQK(SEQ ID NO:158)；v)ALQGGGPPY(SEQ ID NO:159)；vi)FYPGYLCSL(SEQ ID NO:160)；vii)LYPKARLAF(SEQ ID NO:161)；viii)LLFLLFSLGWVGPSR(SEQ ID NO:162)；ix)VNKGHEMSPQAPRRP(SEQ ID NO:163)；x)FMKLRTDAVLPLTVA(SEQ IDNO:164)；或xi)DAALLATQMD(SEQ ID NO:165)。
CAA肽可包含间皮素多肽的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽，该间皮素多肽与以下Her2(受体酪氨酸蛋白激酶erbB2)aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性：MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNASLSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLRELQLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSEDCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFESMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHLREVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLPDLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGISWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVNCSQFLRGQEC VEECRVLQGLPREYVNARHC LPCHPECQPQNGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASPLTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGAFGTVYKGIWI PDGENVKIPVAIKVLRENTS PKANKEILDEAYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARNVLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPAREIPDLLEKGER LPQPPICTIDVYMIMVKCWM IDSECRPRFRELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSSSTRNM(SEQ ID NO:166)。
CAA肽可包含B细胞成熟蛋白(BCMP)多肽的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽，该B细胞成熟蛋白多肽与以下BCMAaa序列的一部分具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性：MLQMAGQCSQ NEYFDSLLHA CIPCQLRCSS NTPPLTCQRY CNASVTNSVKGTNAILWTCL GLSLIISLAVFVLMFLLRKI SSEPLKDEFKNTGSGLLGMA NIDLEKSRTG DEIILPRGLE YTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAME EGATILVTTK TNDYCKSLPAALSATEIEKS ISAR(SEQ ID NO:167)。
CAA肽可包含间皮素多肽的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽，该间皮素多肽与以下WT-1氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性：MDFLLLQDPA STCVPEPASQHTLRSGPGCL QQPEQQGVRD PGGIWAKLGA AEASAERLQG RRSRGASGSEPQQMGSDVRD LNALLPAVPSLGGGGGCALP VSGAAQWAPVLDFAPPGASA YGSLGGPAPP PAPPPPPPPP PHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFS GQFTGTAGAC RYGPFGPPPPSQASSGQARM FPNAPYLPSC LESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHH AAQFPNHSFK HEDPMGQQGS LGEQQYSVPPPVYGCHTPTD SCTGSQALLLRTPYSSDNLY QMTSQLECMTWNQMNLGATL KGHSTGYESD NHTTPILCGA QYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSA SETSEKRPFM CAYPGCNKRYFKLSHLQMHS RKHTGEKPYQ CDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQ CKTCQRKFSR SDHLKTHTRT HTGEKPFSCRWPSCQKKFAR SDELVRHHNMHQRNMTKLQL AL(SEQ ID NO:168)。
WT-1肽的非限制性实例包括RMFPNAPYL(SEQ ID NO:397)、CMTWNQMN(SEQ ID NO:403)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO:400)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:361)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:362)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:363)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:364)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:534)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:366)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:367)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:368)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:369)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:370)、MNLGATLK(SEQ ID NO:371)、MTWNYMNLGATLKGV(SEQ ID NO:372)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:373)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:374)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:375)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:376)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:377)、GALRNPTAL(SEQ IDNO:378)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:379)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:380)、RYRPHPGAL(SEQ IDNO:381)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:382)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:383)、RIRPHPGAL(SEQ IDNO:384)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO:385)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:386)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:387)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO:388)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:389)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:390)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:391)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:392)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:393)、SEKRPFMCAY PGCNK(SEQ ID NO:394)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:395)、NLMNLGATL(SEQ ID NO:359)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:360)和第I.A.8.d.i.(b)章中列举的那些WT-1肽。
在一些情况下，CAA肽为HPV多肽的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽，该HPV多肽与人乳突状瘤病毒(HPV)肽具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性。HPV肽可为HPV E6多肽或HPVE7多肽的肽。HPV表位可为多种基因型中的任一种的HPV的表位，包括例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73或HPV82。HPV肽的非限制性实例包括：E6 18-26(KLPQLCTEL；SEQ ID NO:274)；E6 26-34(LQTTIHDII；SEQ ID NO:404)；E6 49-57(VYDFAFRDL；SEQ ID NO:405)；E6 52-60(FAFRDLCIV；SEQ ID NO:406)；E6 75-83(KFYSKISEY；SEQ ID NO:407)；E6 80-88(ISEYRHYCY；SEQ ID NO:408)；E7 7-15(TLHEYMLDL；SEQ ID NO:409)；E7 11-19(YMLDLQPET；SEQ ID NO:276)；E7 44-52(QAEPDRAHY；SEQ ID NO:410)；E7 49-57(RAHYNIVTF(SEQ ID NO:411)；E7 61-69(CDSTLRLCV；SEQ ID NO:412)和E7 67-76(LCVQSTHVDI；SEQ ID NO:413)；E7 82-90(LLMGTLGIV；SEQ ID NO:414)；E7 86-93(TLGIVCPI；SEQ ID NO:277)；E7 92-93(LLMGTLGIVCPI；SEQ ID NO:415)；以及第I.A.8.d.i.(c)章中的那些HPV肽。
在一些情况下，CAA肽为密连蛋白多肽的肽，该密连蛋白多肽与以下密连接蛋白18(异型体2)(CLDN 18.2)氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性：MAVTACQGLG FVVSLIGIAG IIAATCMDQW STQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGF TECRGYFTLL GLPAMLQAVRALMIVGIVLG AIGLLVSIFA LKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGL CAIAGVSVFA NMLVTNFWMS TANMYTGMGGMVQTVQTRYT FGAALFVGWVAGGLTLIGGV MMCIACRGLAPEETNYKAVS YHASGHSVAY KPGGFKASTG FGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDY V(SEQ ID NO:169)。在一些情况下，癌症相关肽为密连蛋白多肽的肽，该密连蛋白多肽具有氨基酸序列TEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO:170)(且长度为约15个氨基酸)或EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO:171)(且长度为约12个氨基酸。
在一些情况下，CAA肽为滋胚层细胞表面抗原2(Trop-2)多肽的肽。Trop-2(也称为上皮糖蛋白-1、胃肠道肿瘤相关抗原GA733-1、膜组成染色体1表面标记-1和肿瘤相关钙信号转导物-2)为在多种癌症类型中上调的跨膜糖蛋白且为TACSTD2基因的蛋白质产物。在一些情况下，癌症相关肽为TROP-2多肽的肽，该TROP-2多肽与以下TROP-2氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性：QDNCTCPTNKMTVCSPDGPG GRCQCRALGS GMAVDCSTLT SKCLLLKARM SAPKNARTLVRPSEHALVDN DGLYDPDCDPEGRFKARQCN QTSVCWCVNSVGVRRTDKGD LSLRCDELVR THHILIDLRH RPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKF VAAVHYEQPT IQIELRQNTSQKAAGDVDIG DAAYYFERDI KGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYY LDEIPPKFSM KRLTAGLIAV IVVVVVALVAGMAVLVITNR RKSGKYKKVEIKELGELRKE PSL(SEQ ID NO:535)。
(ii)抗体
如上所述，在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物，诸如双链体T细胞-MP中的CTP为抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，CTP为对CAA具有特异性的抗体。在一些情况下，CTP为对受感染细胞(例如，病毒性、细菌性或霉浆菌性)表面上的肽具有特异性的抗体。在一些情况下，CTP为对癌细胞表面上的肽/HLA复合物具有特异性的抗体，其中肽可为癌症相关肽(例如，癌症相关抗原的肽片段)。
免疫球蛋白有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且几种所述类别可进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。子类可进一步分为例如IgG2a和IgG2b的类型。
如本文所用，术语“人源化免疫球蛋白”是指包含不同来源的免疫球蛋白的部分的免疫球蛋白，其中至少一个部分包含人来源的氨基酸序列。术语人源化免疫球蛋白也涵盖嵌合或CDR移植的单链抗体。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保留特异性结合于抗原的抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scAb)、单结构域抗体(dAb)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、纳米抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和包含抗体和非抗体蛋白的抗原结合(antigen-binding)(本文也称为抗原结合(antigen binding))部分的融合蛋白。
如本文所用，术语“纳米抗体”(Nb)是指源自天然存在的重链抗体的最小抗原结合片段或单一可变结构域(VHH)，并且为本领域技术人员已知的。其源自仅重链抗体，见于骆驼科动物(Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363:446；Desmyter等人(1996)NatureStructural Biol.3:803和Desmyter等人(2015)Curr.Opin.Struct.Biol.32:1)。
“Fv”为含有完整抗原识别和缀合位点的最小抗体片段。此区域由呈紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中所述结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接至同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)(VH-VL)。通过使用过短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意图指在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由以下描述：Kabat等人(1977)J.Biol.Chem.252:6609；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteinsof immunological interest”(1991)(本文中也称为Kabat 1991)；Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901(本文中也称为Chothia 1987)和MacCallum等人(1996)J.Mol.Biol.262:732，其中定义包括在相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来提及抗体或移植抗体或其变体的CDR意图在如本文定义和使用的术语的范畴内。涵盖如上文引用的参考文献中的每一个所定义的CDR的氨基酸残基在下文CDR表中阐述作为比较。
CDR表
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR-1 31-35 26-32 30-35
VH CDR-2 50-65 53-55 47-58
VH CDR-3 95-102 96-101 93-101
VL CDR-1 24-34 26-32 30-36
VL CDR-2 50-56 50-52 46-55
VL CDR-3 89-97 91-96 89-96
1残基编号遵循Kabat等人，1991,同上的命名法
2残基编号遵循Chothia等人，同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人，同上的命名法
如本文所用，术语“CDR-L1”、“CDR-L2”和“CDR-L3”分别指轻链可变区中的第一、第二和第三CDR。术语“CDR-L1”、“CDR-L2”和“CDR-L3”可分别与“VL CDR1”、“VL CDR2”和“VLCDR3”互换使用。如本文所用，术语“CDR-H1”、“CDR-H2”和“CDR-H3”分别指重链可变区中的第一、第二和第三CDR。术语“CDR-H1”、“CDR-H2”和“CDR-H3”可分别与“VH CDR1”、“VH CDR2”和“VH CDR3”互换使用。如本文所用，术语“CDR-1”、“CDR-2”和“CDR-3”分别指任一链的可变区的第一、第二和第三CDR。
可包括于T细胞-MP中的CAA靶向抗体(或其抗原结合片段)的非限制性实例包括但不限于：阿比妥珠单抗(abituzumab)(抗CD51)、LL1(抗CD74)、LL2或RFB4(抗CD22)、维妥珠单抗(veltuzumab)(hA20、抗CD20)、利妥昔单抗(rituxumab)(抗CD20)、奥托珠单抗(obinutuzumab)(GA101、抗CD20)、达雷木单抗(daratumumab)(抗CD38)、兰布鲁珠单抗(lambrolizumab)(抗PD-1受体)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1受体)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4)、RS7(抗TROP-2)、PAM4或KC4(均为抗粘蛋白)、MN-14(抗CEA)、MN-15或MN-3(抗CEACAM6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu 31(抗甲胎蛋白)、R1(抗IGF-1R)、A19(抗CD19)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA)、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、L243(抗HLA-DR)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、莫奥珠单抗(oportuzumab)(抗EpCAM)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)、吉妥单抗(gemtuzumab)(抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)；帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR)；托西莫单抗(tositumomab)(抗CD20)；PAM4(也称为克利妥珠单抗(clivatuzumab)；抗粘蛋白)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗HER2)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗HER2)、波妥珠单抗(polatuzumab)(抗CD79b)和阿奈妥单抗(anetumab)(抗间皮素)。
在一些情况下，可包括于T细胞-MP中的CAA靶向抗体(或其抗原结合片段)为单链抗体。在一些情况下，可包括于T细胞-MP中的CAA靶向抗体(或其抗原结合片段)为scFv。在一些情况下，肿瘤靶向多肽为纳米抗体(也称为单结构域抗体(sdAb))。在一些情况下，肿瘤靶向多肽为重链纳米抗体。在一些情况下，肿瘤靶向多肽为轻链纳米抗体。
各种肿瘤抗原结合抗体的VH和VL aa序列为本领域已知的，此类抗体的轻链和重链CDR也是如此。参见例如，Ling等人(2018)Frontiers Immunol.9:469；WO 2005/012493；US 2019/0119375；US 2013/0066055。以下为肿瘤抗原结合抗体的非限制性实例。
(a)抗Her2
可用作CTP的抗Her2抗体(或其抗原结合片段)可包含：a)轻链，其包含与以下aa酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVN TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:172)；和b)重链，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:173)。
抗Her2抗体(或其抗原结合片段)可包含存在于上文提供的轻链aa序列中的轻链可变区(VL)；和存在于上文提供的重链aa序列中的重链可变区(VH)。举例而言，抗Her2抗体可包含：a)VL，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:174)；b)VH，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGG LVQPGGSLR LSCAASGFNI KDTYIHWVRQ APGKGLEWVARIYPTNGYTR YADSVKGRFT ISADTSKNTA YLQMNSLRAE DTAVYYCSRW GGDGFYAMDY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:175)。抗Her2抗体以自N端至C端的顺序可包含：a)VH，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAYLQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO:176)；b)接头；和c)VL，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:177)。本文别处描述的适合接头序列包括例如(GGGGS)(SEQ ID NO:139)，其可重复1至10次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。
在一些情况下，抗Her2抗体(或其抗原结合片段)包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，VH和VL CDR如由以下定义：Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteinsof immunological interest”(1991)(本文中也称为Kabat 1991。在一些情况下，VH和VLCDR如由Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)(本文中也称为Chothia 1987)定义。举例而言，抗Her2抗体(或其抗原结合片段)可包含具有aa序列RASQDVNTAVA(SEQ IDNO:179)的VL CDR1；具有aa序列SASFLY(SEQ ID NO:180)的VL CDR2；具有aa序列QQHYTTPP(SEQ ID NO:181)的VL CDR3；具有aa序列GFNIKDTY(SEQ ID NO182)的VH CDR1；具有aa序列IYPTNGYT(SEQ ID NO:183)的VH CDR2；和具有aa序列SRWGGDGFYAMDY(SEQ ID NO:184)的VHCDR3。
在一些情况下，抗Her2抗体(或其抗原结合片段)为scFv抗体。举例而言，抗Her2scFv可包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPG GSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:185)。
作为另一实例，在一些情况下，抗Her2抗体(或其抗原结合片段)包含：a)轻链可变区(VL)，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:186)；和b)重链可变区(VH)，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:187)。
在一些情况下，可用作CTP的抗Her2抗体(或其抗原结合片段)包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH。举例而言，抗Her2抗体可包含：a)VL，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:188)；和b)VH，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:189)。
在一些情况下，适用作CTP的抗Her2抗体(或其抗原结合片段)包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和存在于上文提供的重链aa序列中的VHCDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，Chothia 1987)。举例而言，抗HER2抗体可包含具有aa序列KASQDVSIGVA(SEQ ID NO:190)的VL CDR1；具有aa序列SASYRY(SEQ ID NO:191)的VL CDR2；具有aa序列QQYYIYPY(SEQ ID NO:192)的VL CDR3；具有aa序列GFTFTDYTMD(SEQ ID NO:193)的VH CDR1；具有aa序列ADVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO:194)的VH CDR2；和具有aa序列ARNLGPSFYFDY(SEQ ID NO:195)的VH CDR3。
在一些情况下，抗Her2抗体(或其抗原结合片段)为scFv。举例而言，在一些情况下，抗Her2 scFv包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:196)。
(b)抗CD19
可用作CTP的抗CD19抗体(和其抗原结合片段)为本领域已知的；并且任何抗CD19抗体的VH和VL或VH和VL CDR可用于T细胞-MP。参见例如，WO 2005/012493。
抗CD19抗体(或其抗原结合片段)可包括：包含aa序列KASQSVDYDGDSYLN(SEQ IDNO:197)的VL CDR1；包含aa序列DASNLVS(SEQ ID NO:198)的VL CDR2；和包含aa序列QQSTEDPWT(SEQ ID NO:199)的VL CDR3。抗CD19抗体(或其抗原结合片段)可包括：包含aa序列SYWMN(SEQ ID NO:200)的VH CDR1；包含aa序列QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:201)的VH CDR2；和包含aa序列RETTTVGRYYYAMDY(SEQ ID NO:202)的VH CDR3。抗CD19抗体可包括：包含aa序列KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID NO:197)的VL CDR1；包含aa序列DASNLVS(SEQ IDNO:198)的VL CDR2；包含aa序列QQSTEDPWT(SEQ ID NO:199)的VL CDR3；包含aa序列SYWMN(SEQ ID NO:200)的VH CDR1；包含aa序列QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:201)的VH CDR2；和包含aa序列RETTTVGRYYYAMDY(SEQ ID NO:202)的VH CDR3。
抗CD19抗体(或其抗原结合片段)可为scFv。举例而言，抗CD19scFv可包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIQLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD YDGDSYLNWY QQIPGQPPKLLIYDASNLVS GIPPRFSGSGSGTDFTLNIH PVEKVDAATYHCQQSTEDPW TFGGGTKLEI KGGGGSGGGG SGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKA SGYAFSSYWM NWVKQRPGQGLEWIGQIWPG DGDTNYNGKF KGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVY FCARRETTTV GRYYYAMDYW GQGTTVTVS(SEQ ID NO:203)。
(c)抗间皮素
可用作CTP的抗间皮素抗体(或其抗原结合片段)为本领域已知的；并且任何抗间皮素抗体的VH和VL或VH和VL CDR可在T细胞-MP中用作靶向序列。参见例如，U.S.2019/0000944；WO 2009/045957；WO 2014/031476；USPN 8,460,660；US 2013/0066055和WO2009/068204。
抗间皮素抗体(或其抗原结合片段)可包含：a)轻链，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIALTQPASVSGSPGQSITI SCTGTSSDIG GYNSVSWYQQ HPGKAPKLMI YGVNNRPSGV SNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYDIESATP VFGGGTKLTVLGQPKAAPSV TLFPPSSEEL QANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPV KAGVETTTPS KQSNNKYAAS SYLSLTPEQWKSHRSYSCQVT HEGSTVEKTVAPTESS(SEQ ID NO:204)；和b)重链，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：QVELVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFTSYWIGWVRQA PGKGLEWMGIIDPGDSRTRY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVE WESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:205)。
抗间皮素抗体(或其抗原结合片段)可包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH。举例而言，抗间皮素抗体可包含：a)VL，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAP KLMIYGVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCS SYDIESATPVFGGGTK(SEQ ID NO:206)；和b)VH，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：QVELVQSGAEVKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYWIGWVRQ APGKGLEWMG IIDPGDSRTR YSPSFQGQV TISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCA RGQLYGGTYM DGWGQGTLV TVSS(SEQ ID NO:207)。
抗间皮素抗体(或其抗原结合片段)可包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH CDR1、CDR2和CDR3。VH和VL CDR可如由Kabat所定义(参见例如，Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，Chothia 1987)。举例而言，抗间皮素抗体(或其抗原结合片段)可包含具有aa序列TGTSSDIGGYNSVS(SEQ ID NO:208)的VL CDR1；具有aa序列LMIYGVNNRPS(SEQ ID NO:209)的VL CDR2；具有aa序列SSYDIESATP(SEQ ID NO:210)的VL CDR3；具有aa序列GYSFTSYWIG(SEQ ID NO:211)的VH CDR1；具有aa序列WMGIIDPGDSRTRYSP(SEQ ID NO:212)的VH CDR2；和具有aa序列GQLYGGTYMDG(SEQ ID NO:213)的VH CDR3。抗间皮素抗体可为scFv。作为一个非限制性实例，抗间皮素scFv可包含以下aa序列：
Figure BDA0004113828220001591
Figure BDA0004113828220001592
/>
Figure BDA0004113828220001593
其中VH CDR1、CDR2和CDR3为加下划线的；并且VLCDR1、CDR2和CDR3为粗体且加下划线。
作为一个非限制性实例，抗间皮素scFv可包含以下aa序列：
Figure BDA0004113828220001594
Figure BDA0004113828220001595
其中VH CDR1、CDR2和CDR3为加下划线的；并且VL CDR1、CDR2和CDR3为粗体且加下划线。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPIFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:536)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3：QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCT ASGFTFSNNGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGMNKFYVDSVK GRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAIYYCAREGDGSGIYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:537)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表和Chothia 1987)。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQ APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ QYGSSPIFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:536)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QMQLVESGGGVVQPGR SLRLSCTASGFTFSNNGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGMNKF YVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAIYYCAREGDGSGIYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:537)。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFTF SNNGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGMNK FYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAIYYCAREGDGS GIYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:537)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：EIVLTQS PGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPIFTF GPGTKVDIK(SEQ ID NO:536)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPIFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:536)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFT FSNNGM HWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGMNKFYVDSVKGRFTI SRDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAIYYCAREGDGSGIYYYYGMDV WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:537)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：DIELTQSPAIMSASPGEKVTMT CSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGS GNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:539)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3：QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNG ASSYNQKFRGKA TLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSG TPVTVSS(SEQ ID NO:540)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表和Chot hia 1987)。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASG VPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYC QQWSKHPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:539)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGPE LEKPGA SVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYN QKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS(SEQ ID NO:540)。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKR WIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:539)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKS LEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSE DSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS(SEQ ID NO:540)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSS(SEQ ID NO:540)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:539)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAPKLMIYGVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDIESATPVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:541)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3：QVELVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQAPGKGLEWMGIIDPG DSRTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:542)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表和Chothia 1987)。
在一些情况下，适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAPKLMIYGVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDIESATPVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:541)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVELVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQAPGKGLEWMGIIDPGDSRTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSS(SEQID NO:542)。
适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体scFv，其以自N端至C端的顺序可包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAP KLMIYGVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCS SYDIESATPVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:541)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVELVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQAPGKG LEWMGIIDPGDSRTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:542)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
适合作为靶向序列包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序可包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVELVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGY SFTSYWIGWVRQAPGKGLEWMGIIDPGDSRTRYSPSFQGQVTISA DKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTL VTVSS(SEQ ID NO:542)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIALTQPASVSGSPGQSITISCTG TSSDIGGYNSVSWYQQHPGKAPKLMIYGVNNR PSGVSNRFSGSK SGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDIESATPVFGGGTKLTVLG(SEQ ID NO:541)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGG GGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSY MHWYQQKSGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQWSKHPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:543)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLITPYN GASSYNQKFRGKATMTVDTS TSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGRGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:544)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表和Chothia 1987)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQ SPSSLSA SVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKSGKAPKLLIYDTS KLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSKHPLTF GQGTKLEIK(SEQ ID NO:543)；b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGA SVKVSCKASGY SFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLITPYNGASSYNQKFRGKATM TVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGRGFDYWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO:544)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKSGKAPKL LIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWS KHPLTFGQGTKLEIK(SEQID NO:543)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQ GLEWMGLITPYNGASSYNQKFRGKATMTVDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARGGYDGRGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:544)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗间皮素抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQ GLEWMGLITPYNGASSYNQKFRGKATMTVDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARGGYDGRGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:544)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSV SYMHWYQQKSGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSKHPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:543)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
(d)抗TROP-2
滋胚层细胞表面抗原2(Trop-2)(也称为上皮糖蛋白-1、胃肠道肿瘤相关抗原GA733-1、膜组成染色体1表面标记-1和肿瘤相关钙信号转导物-2)为在多种癌症类型中上调的跨膜糖蛋白且为TACSTD2基因的蛋白质产物。
在一些情况下，T细胞-MP的CTP为抗TROP-2scFv或抗TROP-2纳米抗体，其包含存在于图23A至图23D所阐述的任一氨基酸序列中的VH和VL CDR。在一些情况下，TTP为包含如图23A至图23D中的任一者所阐述的氨基酸序列的抗TROP-2scFv。
抗TROP-2抗体为本领域已知的；并且任何抗TROP-2抗体的VH和VL或VH和VL CDR可作为目标序列用于本发明的T细胞-MP中。参见例如，美国专利第7,238,785号)。在一些情况下，抗TROP-2抗体包含：i)轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA；SEQ ID NO:545)、CDR2(SASYRYT；SEQ ID NO:546)和CDR3(QQHYITPLT；SEQ ID NO:547)；和ii)重链CDR序列CDR1(NYGMN；SEQ ID NO:548)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG；SEQ ID NO:549)和CDR3(GGFGSSYWYFDV；SEQ ID NO:550)。
在一些情况下，抗TROP-2抗体包含：i)重链CDR序列CDR1(TAGMQ；SEQ ID NO:551)、CDR2(WINTHSGVPKYAEDFKG(SEQ ID NO:552)和CDR3(SGFGSSYWYFDV；SEQ ID NO:553)；和ii)轻链CDR序列CDR1(KASQDVSTAVA；SEQ ID NO:554)、CDR2(SASYRYT；SEQ ID NO:546)和CDR3(QQHYITPLT；SEQ ID NO:547)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP2抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3：DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIA VAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIK(SEQ ID NO:555)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR 2和CDR3：QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMN WVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVST AYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO:556)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表；和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表；和Chothia 1987)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQLTQS PSSLSASVGD RVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSAS YRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTF GAGTKVEIK(SEQ ID NO:555)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGR FAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVW GQGSLVTVSS(SEQ ID NO:556)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPK LLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQH YITPLTFGAGTKVEIK(SEQID NO:555)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQ GLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKA DDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO:556)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCK ASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFK GRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO:556)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQLTQSPSSLSASVGDR VSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIK(SEQ ID NO:555)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGG GGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP2抗体包含：a)存在于包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)中的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVST AVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:557)；和b)存在于包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)中的VH CDR1、CDR2和CDR3：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAG MQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTST STAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO:558)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，上文CDR表；和Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，上文CDR表；和Chothi a 1987)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQ HYITPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:557)；和b)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQ GLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKS EDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:558)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQ HYITPLTFGQGTKLEIK(SEQID NO:557)；b)肽接头；和c)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQ GLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKS EDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:558)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP中的抗TROP-2抗体为scFv，其以自N端至C端的顺序包含：a)VH区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQ GLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKS EDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:558)；b)肽接头；和c)VL区，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQ HYITPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:557)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为1至10的整数(例如，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:538)且长度为15个氨基酸。
(e)抗BCMA
抗BCMA(B细胞成熟抗原)抗体(或其抗原结合片段)为本领域已知的；并且任何抗BCMA抗体的VH和VL或VH和VL CDR可用于靶向T细胞-MP。参见例如，WO 2014/089335和US2019/0153061。
抗BCMA抗体(或其抗原结合片段)可包含：a)轻链，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：QSVLTQPPSASGTPGQRVTI SCSGSSSNIGSNTVNWYQQL PGTAPKLLIF NYHQRPSGVPDRFSGSKSGS SASLAISGLQSEDEADYYCA AWDDSLNGWVFGGGTKLTVL GQPKAAPSVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVK AGVETTTPDS KQSNNKYAASSYLSLTPEQW KSHRSYSCQV THEGSTVEKT VAPTECS(SEQID NO:216)；和b)重链，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFG DYALSWFRQAPGKGLEWVGVSRSKAYGG TTDYAASVKG RFTISRDDS KSTAYLQMNSLKTEDTAVY YCASSGYSSGWTPFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:217)。
抗BCMA(或其抗原结合片段)可包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH。举例而言，抗BCMA抗体可包含：a)VL，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNTVNWYQQL PGTAPKLLIF NYHQRPSGVP DRFSGSKSGSSASLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGWV FGGGTKLTVL G(SEQ ID NO:218)；和b)VH，其包含与如下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：EVQLVESGGG LVKPGGSLR LSCAASGFTF GDYALSWFRQ APGKGLEWVGVSRSKAYGGT TDYAASVKGRFTISRDDSKST AYLQMNSLKTEDTAVYYCAS SGYSSGWTPF DYWGQGTLVT VSSASTKGPSV(SEQ ID NO:219)。
在一些情况下，抗BCMA抗体(或其抗原结合片段)包含存在于上文提供的轻链aa序列中的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；和存在于上文提供的重链aa序列中的VH CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，VH和VL CDR如由Kabat所定义(参见例如，Kabat 1991)。在一些情况下，VH和VL CDR如由Chothia所定义(参见例如，Chothia1987)。
举例而言，抗BCMA抗体(或其抗原结合片段)可包含具有aa序列SSNIGSNT(SEQ IDNO:220)的VL CDR1、具有aa序列NYH的VL CDR2、具有aa序列AAWDDSLNGWV(SEQ ID NO:221))的VL CDR3、具有aa序列GFTFGDYA(SEQ ID NO:222)的VH CDR1、具有aa序列SRSKAYGGTT(SEQID NO:223)的VH CDR2和具有aa序列ASSGYSSGWTPFDY(SEQ ID NO:224)的VH CDR3。
抗BCMA抗体可为scFv。作为一个非限制性实例，抗BCMA scFv可包含以下aa序列：QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS NYWMHWVRQA PGQGLEWMGA TYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARGA IYNGYDVLDNWGQGTLVTVS SGGGGSGGGGSDIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQQ YRKLPWTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:225)或序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:564)。
作为另一实例，抗BCMA scFv可包含以下aa序列：DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKLLIYY TSNLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQ GTKLEIKRGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSQV QLVQSGAEVK KPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPG QGLEWMGA TYRGHSDTYY NQKFKGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARGA IYNGYDVLDNWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO:226)。
在一些情况下，抗BCMA抗体可包含：具有氨基酸序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO:565)的VL CDR1；具有氨基酸序列YTSNLHS(SEQ ID NO:566)的VL CDR2；具有氨基酸序列QQYRKLPWT(SEQ ID NO:567)的VL CDR3；具有氨基酸序列NYWMH(SEQ ID NO:568)的VHCDR1；具有氨基酸序列ATYRGHSDTYYNQKFKG(SEQ ID NO:569)的VH CDR2；和具有氨基酸序列GAIYNGYDVLDN(SEQ ID NO:570)的VH CDR3。
在一些情况下，抗BCMA抗体包含：a)轻链，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPK LLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYR KLPWTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:571)。
在一些情况下，抗BCMA抗体包含：a)重链，其包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPG QGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:572)。
在一些情况下，抗BCMA抗体(例如，在文献中称为贝兰单抗(belantamab)的抗体)包含：包含以下氨基酸序列的轻链：DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNL HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQ GTKLEIKR(SEQ ID NO:571)；和包含以下氨基酸序列的重链：QV QLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGL EWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSE DTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:572)。
在一些情况下，抗BCMA抗体具有连接至抗体的癌症化学治疗剂。举例而言，在一些情况下，抗BCMA抗体为GSK2857916(贝兰单抗莫福汀(belantamab-mafodotin))，其中单甲基澳瑞他汀F(monomethyl auristatin F；MMAF)经由顺丁烯二酰亚胺己酰基接头连接至抗BCMA抗体贝兰单抗。
(f)抗MUC1
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的靶向序列为对MUC1具有特异性的抗体。举例而言，靶向序列可对存在于癌细胞上的MUC1多肽具有特异性。在一些情况下，靶向序列对MUC1的裂解形式具有特异性；参见例如，Fessler等人(2009)Breast CancerRes.Treat.118:113。在一些情况下，靶向序列为对糖基化MUC1肽具有特异性的抗体；参见例如，Naito等人(2017)ACS Omega 2:7493和US 10,017,580。
作为一个非限制性实例，靶向序列可为对MUC1具有特异性的单链Fv。参见例如，Singh等人(2007)Mol.Cancer Ther.6:562；Thie等人(2011)PLoSOne 6:e15921；Imai等人(2004)Leukemia 18:676；Posey等人(2016)Immunity 44:1444；EP3130607；EP3164418；WO2002/044217和US 2018/0112007。在一些情况下，靶向序列为对MUC1肽VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG(SEQ ID NO:227)具有特异性的scFv。在一些情况下，靶向序列为对MUC1肽：SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:228)具有特异性的scFv。在一些情况下，靶向序列为对MUC1肽SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQ YKTEAASRY(SEQID NO:229)具有特异性的scFv。在一些情况下，靶向序列为对MUC1肽：LAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:230)具有特异性的scFv。在一些情况下，靶向序列为对MUC1肽：SNIKFRPGSVVVQLTLAAFREGTIN(SEQ ID NO:231)具有特异性的scFv。
举例而言，抗MUC1抗体可包含：具有氨基酸序列RYGMS(SEQ ID NO:232)的VHCDR1；具有氨基酸序列TISGGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:233)的VH CDR2；具有氨基酸序列DNYGRNYDYGMDY(SEQ ID NO:234)的VH CDR3；具有氨基酸序列SATSSVSYIH(SEQ ID NO:235)的VL CDR1；具有氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO:236)的VL CDR2；和具有氨基酸序列QQRSSSPFT(SEQ ID NO:237)的VL CDR3。参见例如，US 2018/0112007。
作为另一实例，抗MUC1抗体可包含：具有氨基酸序列GYAMS(SEQ ID NO:238)的VHCDR1；具有氨基酸序列TISSGGTYIYYPD SVKG(SEQ ID NO:239)的VH CDR2；具有氨基酸序列LGGDNYYEYFDV(SEQ ID NO:240)的VH CDR3；具有氨基酸序列RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:241)的VL CDR1；具有氨基酸序列LASNLES(SEQ ID NO:242)的VL CDR2；和具有氨基酸序列QHSRELPFT(SEQ ID NO:243)的VL CDR3。参见例如，US 2018/0112007。
作为另一实例，抗MUC1抗体可包含：具有氨基酸序列DYAMN(SEQ ID NO:244)的VHCDR1；具有氨基酸序列VISTFSGNINFN QKFKG(SEQ ID NO:245)的VH CDR2；具有氨基酸序列SDYYGPYFDY(SEQ ID NO:246)的VH CDR3；具有氨基酸序列RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:247)的VL CDR1；具有氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:248)的VL CDR2；和具有氨基酸序列FQGSHVPFT(SEQ ID NO:249)的VL CDR3。参见例如，US 2018/0112007。
作为另一实例，抗MUC1抗体可包含：具有氨基酸序列GYAMS(SEQ ID NO:238)的VHCDR1；具有氨基酸序列TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:239)的VH CDR2；具有氨基酸序列LGGDNYYEY(SEQ ID NO:250)的VH CDR3；具有氨基酸序列TASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:251)的VL CDR1；具有氨基酸序列LVSNLES(SEQ ID NO:252)的VL CDR2；和具有氨基酸序列QHIRELTRSE(SEQ ID NO:253)的VL CDR3。参见例如，US 2018/0112007。
(g)抗MUC16
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的靶向序列为对MUC16(也称为CA125)具有特异性的抗体。参见例如，Yin等人(2002)Int.J.Cancer 98:737。举例而言，靶向序列可对存在于癌细胞上的MUC16多肽具有特异性。参见例如，US 2018/0118848和US 2018/0112008。在一些情况下，MUC16特异性靶向序列为scFv。在一些情况下，MUC16特异性靶向序列为纳米抗体。
作为一个实例，抗MUC16抗体可包含：具有氨基酸序列GFTFSNYY(SEQ ID NO:254)的VH CDR1；具有氨基酸序列ISGRGSTI(SEQ ID NO:255)的VH CDR2；具有氨基酸序列VKDRGGYSPY(SEQ ID NO:256)的VH CDR3；具有氨基酸序列QSISTY(SEQ ID NO:257)的VLCDR1；具有氨基酸序列TAS的VL CDR2；和具有氨基酸序列QQSYSTPPIT(SEQ ID NO:258)的VLCDR3。参见例如，US 2018/0118848。
(h)抗密连蛋白-18.2
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的靶向序列为对密连蛋白-18异型体2(“密连蛋白-18.2”)具有特异性的抗体。参见例如，WO 2013/167259。在一些情况下，密连蛋白-18.2特异性靶向序列为scFv。在一些情况下，密连蛋白-18.2特异性靶向序列为纳米抗体。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的CTP为对TEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO:170)或EVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO:171)具有特异性的抗体。
作为一个实例，抗密连蛋白-18.2抗体可包含：具有氨基酸序列GYTFTDYS(SEQ IDNO:259)的VH CDR1；具有氨基酸序列INTETGVP(SEQ ID NO:260)的VH CDR2；具有氨基酸序列ARRTGFDY(SEQ ID NO:261)的VH CDR3；具有氨基酸序列KNLLHSDGITY(SEQ ID NO:262)的VL CDR1；具有氨基酸序列RVS的VL CDR2；和具有氨基酸序列VQVLELPFT(SEQ ID NO:263)的VL CDR3。
作为另一实例，抗密蛋白-s抗体可包含：具有氨基酸序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:264)的VH CDR1；具有氨基酸序列ISDGGSYS(SEQ ID NO:265)的VH CDR2；具有氨基酸序列ARDSYYDNSYVRDY(SEQ ID NO:266)的VH CDR3；具有氨基酸序列QDINTF(SEQ ID NO:267)的VL CDR1；具有氨基酸序列RTN的VL CDR2；和具有氨基酸序列LQYDEFPLT(SEQ ID NO:268)的VL CDR3。
(iii)单链T细胞受体
在一些情况下，存在于T细胞-MP中的CTP为scTCR。CTP可为对癌细胞表面上的肽/HLA复合物具有特异性的scTCR，其中肽可为癌症相关肽(例如，癌症相关抗原的肽片段)。对结合于HLA复合物的癌症相关肽具有特异性的scTCR的氨基酸序列为本领域已知的。参见例如，US 2019/0135914、US 2019/0062398和US 2018/0371049。
scTCR包括经由适合的肽接头序列共价连接的α链可变区(Vα)和β链可变区(Vβ)。举例而言，可经由与Vα的C端和Vβ的N端融合的适合的肽接头(L)序列将Vα共价连接至Vβ。scTCR可具有结构Vα-L-Vβ。scTCR可具有结构Vβ-L-Vα。scTCR也可包含恒定结构域(也称为恒定区)。在一些情况下，scTCR以自N端至C端的顺序包含：i)TCRα链可变结构域多肽；ii)肽接头；iii)TCRβ链可变结构域多肽；和iv)TCRβ链恒定区胞外结构域多肽。在一些情况下，scTCR以自N端至C端的顺序包含：i)TCRβ链可变结构域多肽；ii)肽接头；iii)TCRα链可变结构域多肽；和iv)TCRα链恒定区胞外结构域多肽。
对肽/HLA复合物具有特异性的scTCR的氨基酸序列为本领域已知的，其中肽为癌症相关肽。参见例如，US 2019/0135914；US 2019/0062398；US 2018/0371049；US 2019/0144563和US 2019/0119350。举例而言，scTCR可对NY-ESO表位，诸如结合至HLA复合物的SLLMWITQC(SEQ ID NO:178)肽具有特异性，该HLA复合物包含HLA-A*0201重链和β2M多肽。作为一实例，此类scTCR可包含：i)TCRα链可变区，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：MQEVTQIPAA LSVPEGENLVLNCSFTDSA IYNLQWFRQD PGKGLTSLLL IQSSQREQTS GRLNASLDKS SGRSTLYIAA SQPGDSATYLCAVRPTSGGS YIPTFGRGTS LIVHPY(SEQ ID NO:269)，其中aa 20可为V或A；aa 51可为Q、P、S、T或M；aa52可为S、P、F或G；aa 53可为S、W、H或T；aa 94可为P、H或A；aa 95可为T、L、M、A、Q、Y、E、I、F、V、N、G、S、D或R；aa 96可为S、L、T、Y、I、Q、V、E、A、W、R、G、H、D或K；aa 97可为G、D、N、V、S、T或A；aa 98可为G、P、H、S、T、W或A；aa 99可为S、T、Y、D、H、V、N、E、G、Q、K、A、I或R；aa 100可为Y、F、M或D；aa 101可为I、P、T或M；并且aa 103可为T或A；和ii)TCRβ链可变区，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：MGVTQTPKFQVLKT GQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQG EVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFF GEGSR LTVL(SEQ ID NO:270)，其中aa 18可为M或V；aa50可为G、V或I；aa 52可为G或Q；aa 53可为I、T或M；aa 55可为D或R；aa 56可为Q或R；aa 70可为T或I；aa 94可为Y、N或F；aa 95可为V或L；并且aa 97可为N、G或D。举例而言，在一些情况下，scTCR可包含：i)TCRα链可变区，其包含aa序列：MQEVTQIPAA LSVPEGENL VLNCSFTDSAIYNLQWFRQ DPGKGLTSL LLIMSHQREQ TSGRLNASLD KSSGRSTLYI AASQPGDSAT YLCAVRPTSGGSYIPTFGRG TSLIVHPY(SEQ ID NO:271)；和TCRβ链可变区，其包含aa序列：MGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGL RLIHYSVSAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSR LTVL(SEQ ID NO:272)。
作为另一实例，scTCR可对结合于HLA复合物的HPV肽表位(例如，aa序列YIIFVYIPL(HPV 16E563-71；SEQ ID NO:273)、KLPQLCTEL(HPV 16E611-19；SEQ ID NO:274)、TIHEIILECV(HPV 16E6；SEQ ID NO:275)、YMLDLQPET(HPV 16E711-19；SEQ ID NO:276)、TLGIVCPI(HPV 16E786-93；SEQ ID NO:277)、KCIDFYSRI(HPV 18E667-75；SEQ ID NO:278)或FQQLFLNTL(HPV 18E786-94；SEQ ID NO:279)的HPV肽)具有特异性，该HLA复合物包含HL重链和β2M多肽。作为一实例，此类scTCR可包含：i)TCRα链可变区，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：METLLGLLILQLQLQWVSSKQ EVTQIPAALS VPEGENLVLN CSFTDSAIYNLQWFRQDPG KGLTSLLLIQ SSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQ PGDSATYLCA VRETSGSRLT FGEGTQLTVN PD(SEQ ID NO:280)；和ii)TCRβ链可变区，其包含与以下aa序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％aa序列同一性的aa序列：MGIRLLCRVA FCFLAVGLVD VKVTQSSRYL VKRTGEKVFL ECVQDMDHENMFWYRQDPGL GLRLIYFSYD VKMKEKGDIP EGYSVSREKK ERFSLILESA STNQTSMYLC ASSFWGRSTDTQYFGPGTRL TVL(SEQ ID NO:281)。
8表位和其评估
本发明的未缀合T细胞-MP可在化学缀合位点处缀合于呈递抗原决定簇的多种分子以形成T细胞-MP-表位缀合物。呈递可与未缀合T细胞-MP缀合的表位的分子包括呈递非肽表位(例如，碳水化合物表位)和肽表位、磷酸肽表位、糖基化肽(糖肽)表位、碳水化合物和脂肽表位(例如，经脂肪酸、类异戊二烯、甾醇、磷脂或糖基磷脂酰肌醇修饰的肽)，统称为“表位(epitope/epitopes)”的那些分子。存在于T细胞-MP-表位缀合物中的肽、磷酸肽、脂肽或糖肽)的表位呈递序列可为具有4至25个连续aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa、20个aa、21个aa、22个aa、23个aa、24个aa或25个aa或7个aa至25个aa、7个aa至12个aa、7个aa至25个aa、10个aa至15个aa、15个aa至20个aa或20个aa至25个aa)的肽。
T细胞-MP-表位缀合物的表位不为如自mRNA翻译的T细胞-MP的一部分，但如上文所指示，将其添加至T细胞-MP的化学缀合位点处。选择候选MHC等位基因和肽(例如，磷酸肽、脂肽或糖肽)表位组合以通过T细胞-MP-表位缀合物有效呈递至TCR可使用多种已知方法中的任一种来完成，以测定游离肽对用于构建T细胞-MP的特定HLA等位基因是否具有亲和力，其中其将作为表位缀合物的一部分呈递。
可测定肽与特定重链等位基因和β2M的组合是否可以所需方式(例如，诱导增殖、无反应性或细胞凋亡)影响T细胞。适用的方法包括结合分析和T细胞活化分析，包括用于评估上文所论述的具有野生型和变体MOD的T细胞-MP的结合亲和力的BLI分析。将用于制备本发明的T细胞-MP-表位缀合物的表位(例如，肽表位)可以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合于T细胞上的T细胞受体(TCR)。在一些情况下，表位以如下亲和力结合于T细胞上的TCR：10-4M至约10-5M、约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M或约10-8M至约10-9M。以另一方式表述，在一些情况下，存在于T细胞-MP中的表位以如下亲和力结合于T细胞上的TCR：约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM或约75μM至约100μM。
a.基于细胞的结合分析
作为一个实例，基于细胞的肽诱导稳定分析可用于测定候选肽是否结合既定用于T细胞-MP-表位缀合物的I类HLA等位基因。结合分析可用于选择肽以使用既定等位基因并入T细胞-MP-表位缀合物中。在此分析中，使所关注肽结合于TAP缺陷细胞，即具有与抗原处理(TAP)机制相关的缺陷型转运蛋白且因此很少有表面I类分子的细胞。此类细胞包括，例如，人T2细胞系(T2(174x CEM.T2；美国典型培养物保藏中心(ATCC)第CRL-1992号))。Henderson等人(1992)Science 255:1264。在无有效的TAP介导的将胞质肽转运至内质网中的情况下，组装的I类复合物在结构上不稳定且只能暂时保留在细胞表面。然而，当将T2细胞与能够结合I类的外源肽一起孵育时，表面肽-I类HLA复合物经稳定且可通过流式细胞术使用例如pan抗I类单克隆抗体，或在肽经荧光标记的情况下直接进行检测。通过添加肽使细胞表面上的肽-HLA复合物稳定和所得增加的寿命确认其属性(identity)。因此，可通过遗传修饰T2或类似TAP缺陷细胞以表达所关注HLA H等位基因来测试由各种I类HLA重链等位基因呈递的候选肽的结合。
在使用T2分析评估肽与HLA A*0201结合的一非限制性实例中，将T2细胞在细胞培养基中洗涤，并且以106个细胞/毫升悬浮。所关注肽在细胞培养基中制备且连续稀释，从而得到200μM、100μM、20μM和2μM的浓度。将细胞与各肽稀释液以1:1混合，以得到最终体积200μL和最终肽浓度100μM、50μM、10μM和1μM。包括HLA A*0201结合肽GILGFVFTL(SEQ ID NO:282)和非HLA A*0201限制肽HPVGEADYF(HLA-B*3501；SEQ ID NO:283)以分别作为阳性对照和阴性对照。将细胞/肽混合物保持在37℃下5％ CO2中十分钟；接着在室温下孵育过夜。接着在37℃下孵育细胞2小时，并且用荧光标记的抗人HLA抗体染色。细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并且使用流式细胞术进行分析。使用抗HLA抗体染色的平均平均荧光强度(MFI)来测量结合强度。
包括无MOD的T细胞-MP-表位缀合物，特定来说呈高级复合物(例如，双链体、四聚体或五聚体)形式的经标记(例如，放射性或荧光标记的有效负载)T细胞-MP-表位缀合物可体外用于在T细胞-MP-表位缀合物与T细胞之间建立表位特异性结合。然而，通过T-MP-表位缀合物和/或无MOD的T-细胞-表位缀合物的T细胞结合不限于体外应用。特定来说通过T细胞-MP-表位缀合物的高级复合物的结合可体内或离体进行，以例如追踪表位特异性T细胞运动和定位。使用不含MOD的分子为有利的，此因为其限制由于T细胞-MP表位缀合物上的MOD与非关注细胞上的Co-MOD之间的相互作用造成的可能干扰。在此类体内或离体结合评估中，将可为无MOD的经标记(例如，荧光或放射性标记)T细胞-MP-表位缀合物体内施用至受试者或与离体组织接触。一旦T细胞-MP-表位缀合物结合受试者或组织中的T-细胞，则其将有效地标记T细胞，该T细胞可循环或经定位，如通过标记的定位所证明。因此，此类经标记T细胞-MP-表位缀合物，包括其无MOD变体，可用于研究和用作伴随诊断两者。该标记允许评估T细胞-MP-表位缀合物与目标T细胞之间的表位特异性结合且追踪表位特异性T细胞以判定其命运。该标记也允许体内和/或离体判定T细胞-MP-表位缀合物的定位，其可用于判定T细胞-MP-表位缀合物是否定位于组织，包括需要医学治疗的组织(例如，肿瘤组织)。
b.生化结合分析
可在无细胞体外分析系统中测试包含与意图用于构建T细胞-MP的特定等位基因的HLA重链多肽复合的β2M多肽的I类MHC复合物与所关注多肽的结合。举例而言，允许经标记参考肽(例如，荧光标记的)结合MHC-I类复合物以形成MHC-参考肽复合物。测试所关注测试肽取代复合物的经标记参考肽的能力。相对结合亲和力计算为取代经结合参考肽所需的测试肽的量。参见例如，van der Burg等人(1995)Human Immunol.44:189。
作为另一实例，可将所关注肽与I类MHC复合物(含有HLA重链肽和β2M)一起孵育，并且可以免疫分析形式测量通过经结合肽的MHC复合物的稳定性。将所关注肽使MHC复合物稳定的能力与呈递已知T细胞表位的对照肽的该能力进行比较。稳定性的检测是基于是否存在使用抗HLA抗体结合于肽的MHC复合物的天然构形。参见例如，Westrop等人(2009)J.Immunol.Methods 341:76；Steinitz等人(2012)Blood 119:4073；和美国专利第9,205,144号。
c.T细胞活化分析
可通过评估对肽-HLA复合物的T细胞反应来测定给定肽是否结合I类MHC复合物(包含HLA重链和β2M多肽)，并且在结合于HLA复合物时，是否可将表位有效地呈递至TCR。可测量的T细胞反应包括例如干扰素-γ(IFNγ)产生、细胞毒性活性等。
(i)ELISPOT分析
适合的T细胞活化分析包括例如酶联免疫斑点(ELISPOT)分析，其中在目标与呈递与I类MHC(例如，HLA)复合的所关注肽的抗原呈递细胞(APC)接触后测量目标细胞产生的产物(例如目标CD8+T产生的IFNγ)。将针对目标细胞产生的因子(例如，IFNγ)的抗体固定在多孔盘的各孔中。将APC添加至各孔中，并且将培养盘与所关注肽一起孵育一段时间，使得肽结合APC表面上的I类HLA。将对肽具有特异性的CD8+T细胞添加至各孔中且将培养盘孵育约24小时。接着洗涤各孔，并且使用可检测标记的抗体检测结合于已固定抗体的任何释放因子(例如，IFNγ)。可使用比色分析。举例而言，在测量IFNγ释放的情况下，可检测标记的抗IFNγ抗体可为生物素标记的抗IFNγ抗体，其可使用例如缀合至碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白以及所添加BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四氮唑)溶液进行检测，以进行分析。通过有色斑点来鉴别分泌IFNγ的T细胞的存在。阴性对照包括未与肽接触的APC。表达各种HLA重链等位基因的APC可用于测定所关注肽是否有效结合于包含特定HLAH链的I类HLA分子。
(ii)细胞毒性分析
也可使用细胞毒性测定来测定给定表位(例如，肽)是否结合于与β2M复合的特定I类MHC重链等位基因，并且在结合时，是否可将表位有效地呈递至TCR。细胞毒性分析涉及将目标细胞与细胞毒性CD8+T细胞一起孵育。目标细胞在其表面上展示I类MHC复合物，其包含β2M以及待测试的表位和MHC重链等位基因组合。目标细胞可例如经51Cr放射性标记。若目标细胞将表位有效地呈递至细胞毒性CD8+T细胞上的TCR，则其通过CD8+T细胞诱导针对目标细胞的细胞毒性活性，该细胞毒性活性通过测量自已溶解目标细胞释放51Cr来测定。比细胞毒性可计算为肽存在下细胞毒性活性量减去肽不存在下的细胞毒性活性量。
(iii)用肽-HLA四聚体检测抗原特异性T细胞
作为另一实例，产生具有标记或标签(例如，荧光或重金属标签)的肽-MHC复合物的多聚体(例如，二聚体、四聚体或五聚体)。接着多聚体可用于经由流式细胞术(FACS)或质谱流式细胞术(CyTOF)来鉴别且量化特异性T细胞。表位特异性T细胞的检测提供肽缀合的HLA分子能够结合于抗原特异性T细胞子集上的特异性TCR的直接证据。参见例如，Klenerman等人(2002)Nature Reviews Immunol.2:263。
d.表位
存在于T细胞-MP-表位缀合物中的表位可以表位特异性方式由T细胞结合(即，表位由其TCR识别肽的表位特异性T细胞特异性结合)。表位特异性T细胞结合特异性MHC-H等位基因多肽/β2M复合物的上下文中具有参考aa序列的表位，但实质上不结合与相同上下文中存在的参考aa序列不同的表位。举例而言，表位特异性T细胞可结合特异性MHC-H等位基因多肽/β2M复合物的上下文中具有参考aa序列的表位，并且可结合与相同的上下文中存在的参考aa序列不同的表位，若如此，其亲和力小于10-6M、小于10-5M或小于10-4M。表位特异性T细胞可以如下的亲和力结合对其具有特异性的表位(例如，呈递所关注表位的肽)：至少10-7M、小于10-8M、小于10-9M或小于10-10M。
在一些情况下，存在于T细胞-MP-表位缀合物中的肽表位呈递对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G等位基因具有特异性的表位。在一实施方案中，存在于T细胞-MP中的肽表位呈递受限于HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303和/或HLA-A*3401的表位。在一实施方案中，存在于T细胞-MP中的肽表位呈递受限于HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601和/或HLA-B*5301的表位。在一个实施方案中，存在于T细胞-MP中的肽表位呈递受限于C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*702、C*0801和/或C*1502的表位。
可由具有I类MHC-H和β2M多肽序列的T细胞-MP结合且将其呈递至TCR的表位中包括癌抗原和来自感染因子(例如，病毒或细菌病原)的抗原。在T细胞失调(例如，CD8+T细胞失调)导致对过敏原的过度反应的情况下，可呈递的表位包括具有自身抗原(自身表位)和过敏原的表位。举例而言，过敏原可选自以下的蛋白质或非蛋白质组分：坚果(例如，树和/或花生)、麸质、花粉、蛋(例如，鸡蛋、家鸡蛋)、贝类、大豆、鱼和昆虫毒液(例如蜜蜂和/或黄蜂毒液抗原)。类似地，在CD8+T reg细胞和自身反应性CD8+效应T细胞的失调导致自身免疫疾病的情况下，所呈递表位可来自与例如多发性硬化症、Rasmussen氏脑炎、伴肿瘤症候群、乳糜泻、全身性硬化症(SSc)、1型糖尿病(T1D)、格雷氏病(Grave’s disease；GD)、全身性红斑狼疮(SLE)、再生不良性贫血(AA)或白斑病相关的蛋白质。
(i)存在于癌症中的表位-癌症相关抗原(“CAA”)
包括于T细胞-MP-表位缀合物或T细胞-MP-表位缀合物的高级复合物中的适合表位包括但不限于存在于癌症相关抗原中的表位。癌症相关抗原为本领域已知的；参见例如，Cheever等人(2009)Clin.Cancer Res.15:5323。癌症相关抗原包括但不限于：α-叶酸受体；碳酸酐酶IX(CAIX)；CD19；CD20；CD22；CD30；CD33；CD44v7/8；癌胚抗原(CEA)；上皮糖蛋白-2(EGP-2)；上皮糖蛋白-40(EGP-40)；叶酸结合蛋白(FBP)；胎儿乙酰胆碱受体；神经节苷脂抗原GD2；Her2/neu；IL-13R-a2；κ轻链；LeY；L1细胞粘附分子；黑色素瘤相关抗原(MAGE)；MAGE-A1；间皮素；MUC1；NKG2D配体；癌胚胎抗原(h5T4)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)；血管内皮生长因子受体-2(VEGF-R2)(参见例如，Vigneron等人(2013)Cancer Immunity 13:15；和Vigneron(2015)BioMedRes.Int’l Article ID 948501)；和表皮生长因子受体(EGFR)vIII多肽(参见例如，Wong等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2965；和Miao等人(2014)PLoSOne 9:e94281)。
在一些情况下，适用于并入T细胞-MP-表位缀合物中的肽表位为以下物质的长度为约4个aa(aas/aa)至约20个aa(例如，4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa或20个aa)的肽片段：MUC1多肽、LMP2多肽、表皮生长因子受体(EGFR)vIII多肽、HER-2/neu多肽、黑色素瘤抗原(例如，MAGE A3)多肽、p53多肽、突变体p53多肽、NY-ESO-1多肽、叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原；PSMA)多肽、CEA多肽、由T细胞识别的黑色素瘤抗原(melanA/MART1)多肽、Ras多肽(包括KRAS多肽)、gp100多肽、蛋白酶3(PR1)多肽、bcr-abl多肽、酪氨酸酶多肽、生存素多肽、前列腺特异性抗原(PSA)多肽、hTERT多肽、肉瘤易位断点多肽、滑膜肉瘤X(SSX)断点多肽、EphA2多肽、酸性磷酸酶前列腺(PAP)多肽、黑色素瘤凋亡抑制(ML-IAP)多肽、甲胎蛋白(AFP)多肽、上皮细胞粘附分子(EpCAM)多肽、ERG(TMPRSS2 ETS融合)多肽、NA17多肽、配对盒-3(PAX3)多肽、间变性淋巴瘤激酶(ALK)多肽、雄激素受体多肽、周期蛋白B1多肽、N-myc原癌基因(MYCN)多肽、Ras同源基因家族成员C(RhoC)多肽、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)多肽、间皮素多肽、前列腺干细胞抗原(PSCA)多肽、黑色素瘤相关抗原-1(MAGE A1)多肽、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)多肽、胎盘特异性蛋白1(PLAC1)多肽、BORIS多肽(也称为CCCTC缀合因子或CTCF)、ETV6-AML多肽、乳腺癌抗原NY-BR-1多肽(也称为含锚蛋白重复结构域的蛋白30A)、G蛋白信号调节子(RGS5)多肽、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)多肽、碳酸酐酶IX多肽、成对盒-5(PAX5)多肽、OY-TES1(睾丸抗原；也称为顶体结合蛋白)多肽、精子蛋白17多肽、淋巴细胞特异性蛋白-酪氨酸激酶(LCK)多肽、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、A-激酶锚定蛋白-4(AKAP-4)、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)多肽、X抗原家族成员1(XAGE1)多肽、B7同系3(B7H3；也称为CD276)多肽、豆荚蛋白多肽(LGMN1；也称为天冬酰胺内肽酶)、具有Ig和EGF同系结构域-2的酪氨酸激酶(Tie-2；也称为血管生成素-1受体)多肽、P抗原家族成员4(PAGE4)多肽、血管内皮生长因子受体2(VEGF2)多肽、MAD-CT-1多肽、纤维母细胞活化蛋白(FAP)多肽、血小板衍生的生长因子受体β(PDGFβ)多肽、MAD-CT-2多肽、Fos相关抗原-1(FOSL)多肽或密连蛋白(例如，密连蛋白18.2)多肽。在一些情况下，人乳突状瘤病毒(HPV)抗原明确排除在外。在一些情况下，甲胎蛋白(AFP)抗原经明确排除在外。在一些情况下，威尔姆氏瘤-1(WT1)抗原明确排除在外。
可并入T细胞-MP-表位缀合物中的癌症相关抗原的氨基酸序列为本领域已知的；参见例如，MUC1(GenBank CAA56734)；LMP2(GenBank CAA47024)；EGFRvIII(GenBank NP_001333870)；HER-2/neu(GenBank AAI67147)；MAGE-A3(GenBank AAH11744)；p53(GenBankBAC16799)；NY-ESO-1(GenBank CAA05908)；PSMA(GenBank AAH25672)；CEA(GenBankAAA51967)；melan/MART1(GenBank NP_005502)；Ras(GenBank NP_001123914)；gp100(GenBank AAC60634)；bcr-abl(GenBank AAB60388)；酪氨酸酶(GenBank AAB60319)；生存素(GenBank AAC51660)；PSA(GenBank CAD54617)；hTERT(GenBank BAC11010)；SSX(GenBank NP_001265620)；Eph2A(GenBank NP_004422)；PAP(GenBank AAH16344)；ML-IAP(GenBank AAH14475)；EpCAM(GenBank NP_002345)；ERG(TMPRSS2 ETS融合)(GenBankACA81385)；PAX3(GenBank AAI01301)；ALK(GenBank NP_004295)；雄激素受体(GenBankNP_000035)；周期蛋白B1(GenBank CAO99273)；MYCN(GenBank NP_001280157)；RhoC(GenBank AAH52808)；TRP-2(GenBank AAC60627)；间皮素(GenBank AAH09272)；PSCA(GenBank AAH65183)；MAGE A1(GenBank NP_004979)；CYP1B1(GenBank AAM50512)；PLAC1(GenBank AAG22596)；BORIS(GenBank NP_001255969)；ETV6(GenBank NP_001978)；NY-BR1(GenBank NP_443723)；SART3(GenBank NP_055521)；碳酸酐酶IX(GenBank EAW58359)；PAX5(GenBank NP_057953)；OY-TES1(GenBank NP_115878)；精子蛋白17(GenBankAAK20878)；LCK(GenBank NP_001036236)；HMW-MAA(GenBank NP_001888)；AKAP-4(GenBankNP_003877)；SSX2(GenBank CAA60111)；XAGE1(GenBank NP_001091073；XP_001125834；XP_001125856；和XP_001125872)；B7H3(GenBank NP_001019907；XP_947368；XP_950958；XP_950960；XP_950962；XP_950963；XP_950965；和XP_950967)；LGMN1(GenBank NP_001008530)；TIE-2(GenBank NP_000450)；PAGE4(GenBank NP_001305806)；VEGFR2(GenBank NP_002244)；MAD-CT-1(GenBank NP_005893NP_056215)；FAP(GenBank NP_004451)；PDGFβ(GenBank NP_002600)；MAD-CT-2(GenBank NP_001138574)；和FOSL(GenBank NP_005429)。所述多肽也论述于例如Cheever等人(2009)Clin.Cancer Res.15:5323和其中引用的参考文献；Wagner等人(2003)J.Cell.Sci.116:1653；Matsui等人(1990)Oncogene 5:249；Zhang等人(1996)Nature 383:168中。
(a)甲胎蛋白(AFP)
T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)可包含呈递甲胎蛋白(AFP)的表位的肽，其与肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝胚细胞瘤和卵巢卵黄囊肿瘤相关。在I类MHC多肽序列的上下文中可呈递AFP表位，该I类MHC多肽序列可具有：a)与图3A至图3G中所描绘的以下序列具有至少95％aa(例如，至少97％、98％或99％)序列同一性的aa序列：HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401；b)与以下序列具有至少95％aa(例如，至少97％、98％或99％)序列同一性的aa序列：HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301；或c)与以下序列具有至少95％aa(例如，至少97％、98％或99％)序列同一性的aa序列：HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502。
可包括于T细胞-MP-表位缀合物中的AFP肽包括但不限于：AITRKMAAT(SEQ ID NO:284)；AYTKKAPQL(SEQ ID NO:285)；LLNQHACAV(SEQ ID NO:286)；KLVLDVAHV(SEQ ID NO:287)；FMNKFIYEI(SEQ ID NO:288)；SIPLFQVPE(SEQ ID NO:289)；LLNFTESRT(SEQ ID NO:290)；FVQEATYKF(SEQ ID NO:291)；ATYKEVSKM(SEQ ID NO:292)；KEVSKMVKD(SEQ ID NO:293)；RHNCFLAHK(SEQ ID NO:294)；ATAATCCQL(SEQ ID NO:295)；YIQESQALA(SEQ ID NO:296)；QLTSSELMAI(SEQ ID NO:297)；KLSQKFTKV(SEQ ID NO:298)；KELRESSLL(SEQ ID NO:299)；SLVVDETYV(SEQ ID NO:300)；ILLWAARYD(SEQ ID NO:301)；KIIPSCCKA(SEQ ID NO:302)；CRGDVLDCL(SEQ ID NO:303)；QQDTLSNKI(SEQ ID NO:304)；TMKQEFLINL(SEQ ID NO:305)；NLVKQKPQI(SEQ ID NO:306)；AVIADFSGL(SEQ ID NO:307)；LLACGEGAA(SEQ ID NO:308)；LACGEGAAD(SEQ ID NO:309)；KAPQLTSSEL(SEQ ID NO:310)；YICSQQDTL(SEQ ID NO:311)；TECCKLTTL(SEQ ID NO:312)；CTAEISLADL(SEQ ID NO:313)；VTKELRESSL(SEQ ID NO:314)；IMSYICSQQD(SEQ ID NO:315)；TRTFQAITV(SEQ ID NO:316)；FQKLGEYYL(SEQ ID NO:317)；RVAKGYQEL(SEQ ID NO:318)；SYQCTAEISL(SEQ ID NO:319)；KQEFLINLV(SEQ ID NO:320)；MKWVESIFL(SEQ ID NO:321)；PVNPGVGQC(SEQ ID NO:322)；AADIIIGHL(SEQ ID NO:323)；QVPEPVTSC(SEQ ID NO:324)；TTLERGQCII(SEQ ID NO:325)；KMAATAATC(SEQ ID NO:326)；QAQGVALQTM(SEQ ID NO:327)；FQAITVTKL(SEQ ID NO:328)；LLEKCFQTE(SEQ ID NO:329)；VAYTKKAPQ(SEQ ID NO:330)；KYIQESQAL(SEQ ID NO:331)；GVALQTMKQ(SEQ ID NO:332)；GQEQEVCFA(SEQ ID NO:333)；SEEGRHNCFL(SEQ ID NO:334)；RHPFLYAPTI(SEQ ID NO:335)；TEIQKLVLDV(SEQ ID NO:336)；RRHPQLAVSV(SEQ ID NO:337)；GEYYLQNAFL(SEQ IDNO:338)；NRRPCFSSLV(SEQ ID NO:339)；LQTMKQEFLI(SEQ ID NO:340)；IADFSGLLEK(SEQ IDNO:341)；GLLEKCCQGQ(SEQ ID NO:342)；TLSNKITEC(SEQ ID NO:343)；LQDGEKIMSY(SEQ IDNO:344)；GLFQKLGBY(SEQ ID NO:345)；NEYGIASILD(SEQ ID NO:346)；KMVKDALTAI(SEQ IDNO:347)；FLASFVHEY(SEQ ID NO:348)；AQFVQEATY(SEQ ID NO:349)；EYSRRHPQL(SEQ IDNO:350)；AYEEDRETF(SEQ ID NO:351；SYANRRPCF(SEQ ID NO:352)；CFAEEGQKL(SEQ ID NO:353)；RSCGLFQKL(SEQ ID NO:354)；IFLIFLLNF(SEQ IDNO:355)；KPEGLSPNL(SEQ ID NO:356)；和GLSPNLNRFL(SEQ ID NO:357)。
在一些情况下，存在于T细胞-MP-表位缀合物中的AFP肽呈递HLA-A*2402限制表位。呈递HLA-A*2402限制表位的AFP肽的非限制性实例包括：KYIQESQAL(SEQ ID NO:331)；EYYLQNAFL(SEQ ID NO:358)；AYTKKAPQL(SEQ ID NO:285)；EYSRRHPQL(SEQ ID NO:350)；RSCGLFQKL(SEQ ID NO:354)；和AYEEDRETF(SEQ ID NO:351)。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物中存在的AFP肽为KYIQESQAL(SEQID NO:331)。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的AFP肽为EYYLQNAFL(SEQ ID NO:358)。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的AFP肽为AYTKKAPQL(SEQ ID NO:285)。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的AFP肽为EYSRRHPQL(SEQ ID NO:350)。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的AFP为RSCGLFQKL(SEQ ID NO:354)。
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP中的AFP肽呈递HLA-A*0201限制表位。呈递HLA-A*0201限制表位的AFP肽的非限制性实例为：FMNKFIYEI(SEQ ID NO:288)和GLSPNLNRFL(SEQ ID NO:357)。
(b)威尔姆氏瘤抗原(WT-1)
T细胞-MP-表位缀合物和其高级复合物(例如，双链体)可包含呈递威尔姆氏瘤-1蛋白的表位的肽，该蛋白与骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、威尔姆氏瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、神经母细胞瘤和肾胚细胞瘤有关。在I类MHC呈递序列的上下文中可呈递WT-1表位。在I类MHC呈递复合物的上下文中可呈递WT-1表位，其与图3A至图3G所描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401具有至少95％(例如，至少97％、98％或99％)aa序列同一性；b)与HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301具有至少95％aa序列同一性的aa序列；或c)与HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95％aa序列同一性的aa序列。
可包括于T细胞-MP-表位缀合物中的WT-1肽可包括但不限于：NLMNLGATL(SEQ IDNO:359)、NYMNLGATL(SEQ ID NO:360)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:361)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:362)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO:363)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:364)、TWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO:365)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:366)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO:367)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO:368)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:369)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO:370)、MNLGATLK(SEQ ID NO:371)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO:372)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:373)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:374)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:375)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO:376)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO:377)、GALRNPTAL(SEQ IDNO:378)、YALRNPTAC(SEQ ID NO:379)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO:380)、RYRPHPGAL(SEQ IDNO:381)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO:382)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO:383)、RIRPHPGAL(SEQ IDNO:384)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO:385)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO:386)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO:387)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ IDNO:388)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:389)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO:390)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO:391)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO:392)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO:393)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO:394)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO:395)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO:396)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO:397)；YMFPNAPYL(SEQ ID NO:398)；SLGEQQYSV(SEQ ID NO:399)；CYTWNQMNL(SEQ ID NO:400)；CMTWNQMNL(SEQ ID NO:401)；和NQMNLGATL(SEQ ID NO:402)。
在一些情况下，存在于T细胞-MP-表位缀合物中的WT-1呈递HLA-A*2402限制表位。呈递HLA-A*2402限制表位的WT-1肽包括例如CMTWNQMN(SEQ ID NO:403)；NYMNLGATL(SEQID NO:360)(WT-1 239-247；Q240Y)；CYTWNQMNL(SEQ ID NO:400)(WT-1 235-243)；CMTWNQMNL(SEQ ID NO:401)(WT-1 235-243)；NQMNLGATL(SEQ ID NO:402)(WT-1 239-247)；和NLMNLGATL(SEQ ID NO:359)(WT-1239-247；Q240L)。
在一些情况下，存在于T细胞-MP-表位缀合物中的WT-1呈递HLA-A*0201限制表位。呈递HLA-A*0201限制表位的WT-1肽包括例如VLDFAPPGA(SEQ ID NO:396)(WT-1 37-45)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO:397)(WT-1 126-134)；YMFPNAPYL(SEQ ID NO:398)(WT-1 126-134；R126Y)；SLGEQQYSV(SEQ ID NO:399)(WT-1187-195)；和NLMNLGATL(SEQ ID NO:359)(WT-1239-247；Q240L)。
(c)人乳突状瘤病毒I(HPV)
T细胞-MP-表位缀合物和其高级复合物(例如双链体)可包含呈递人乳突状瘤病毒(HPV)的表位的肽，该肽与宫颈癌、前列腺癌或卵巢癌相关。在I类MHC呈递序列的上下文中可呈递HPV表位。在I类MHC呈递复合物的上下文中可呈递HPV表位，其与图3A至图3G中所描绘的以下序列具有至少95％aa序列同一性：HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401；b)具有与以下序列具有至少95％(例如，至少97％、98％或99％)aa序列同一性的aa序列：HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301；或c)与以下序列具有至少95％aa序列同一性的aa序列：HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502。HPV也为一种感染因子且其表位可用于改变对HPV的免疫反应，以预防或治疗感染。
HPV肽表位包括但不限于来自E6和E7基因产物的那些HPV肽表位：E6 18-26(KLPQLCTEL；SEQ ID NO:274)；E6 26-34(LQTTIHDII；SEQ ID NO:404)；E6 49-57(VYDFAFRDL；SEQ ID NO:405)；E6 52-60(FAFRDLCIV；SEQ ID NO:406)；E6 75-83(KFYSKISEY；SEQ ID NO:407)；E6 80-88(ISEYRHYCY；SEQ ID NO:408)；E7 7-15(TLHEYMLDL；SEQ ID NO:409)；E7 11-19(YMLDLQPET；SEQ ID NO:276)；E7 44-52(QAEPDRAHY；SEQ ID NO:410)；E7 49-57(RAHYNIVTF(SEQ ID NO:411)；E7 61-69(CDSTLRLCV；SEQ ID NO:412)；E7 67-76(LCVQSTHVDI；SEQ ID NO:413)；E7 82-90(LLMGTLGIV；SEQ ID NO:414)；E7 86-93(TLGIVCPI；SEQ ID NO:277)；或E7 92-93(LLMGTLGIVCPI；SEQ ID NO:415)。
在一些情况下，表位为HPV16E7/82-90(LLMGTLGIV；SEQ ID NO:414)。在一些情况下，表位为HPV16E7/86-93(TLGIVCPI；SEQ ID NO:277)。在一些情况下，表位为HPV16E7/11-20(YMLDLQPETT；SEQ ID NO:416)。在一些情况下，表位为HPV16E7/11-19(YMLDLQPET；SEQID NO:276)。关于其他适合的HPV表位，参见例如，Ressing等人((1995)J.Immunol.154:5934)。
适合包括于T细胞-MP-表位缀合物中的HPV肽包括结合HLA-A24的HPV E6肽(例如，其为HLA-A2401限制表位)。此类肽的非限制性实例包括：VYDFAFRDL(SEQ ID NO:405)；CYSLYGTTL(SEQ ID NO:417)；EYRHYCYSL(SEQ ID NO:418)；KLPQLCTEL(SEQ ID NO:274)；DPQERPRKL(SEQ ID NO:419)；HYCYSLYGT(SEQ ID NO:420)；DFAFRDLCI(SEQ ID NO:421)；LYGTTLEQQY(SEQ ID NO:422)；HYCYSLYGTT(SEQ ID NO:423)；EVYDFAFRDL(SEQ ID NO:424)；EYRHYCYSLY(SEQ ID NO:425)；VYDFAFRDLC(SEQ ID NO:426)；YCYSIYGTTL(SEQ IDNO:427)；VYCKTVLEL(SEQ ID NO:428)；VYGDTLEKL(SEQ ID NO:429)；和LTNTGLYNLL(SEQ IDNO:430)。
在一些情况下，适合包括于T细胞-MP-表位缀合物中的HPV肽选自由以下组成的组：DLQPETTDL(SEQ ID NO:431)；TLHEYMLDL(SEQ ID NO:409)；TPTLHEYML(SEQ ID NO:432)；RAHYNIVTF(SEQ ID NO:411)；GTLGIVCPI(SEQ ID NO:433)；EPDRAHYNI(SEQ ID NO:434)；QLFLNTLSF(SEQ ID NO:435)；FQQLFLNTL(SEQ ID NO:279)；和AFQQLFLNTL(SEQ IDNO:436)。
在一些情况下，适合的HPV肽呈递HLA-A*2401限制表位。呈递HLA-A*2401限制表位的HPV肽的非限制性实例为：VYDFAFRDL(SEQ ID NO:405)；RAHYNIVTF(SEQ ID NO:411)；CDSTLRLCV(SEQ ID NO:412)；和LCVQSTHVDI(SEQ ID NO:413)。在一些情况下，适合包括于本发明的T细胞-MP中的HPV肽为VYDFAFRDL(SEQ ID NO:405)。在一些情况下，适合包括于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的HPV肽为RAHYNIVTF(SEQ ID NO:411)。在一些情况下，适合包括于本发明的T细胞-MP中的HPV肽为CDSTLRLCV(SEQ ID NO:412)。在一些情况下，适合包括于本发明的T细胞-MP中的HPV肽为LCVQSTHVDI(SEQ ID NO:413)。
(d)B型肝炎病毒(HBV)
T细胞-MP-表位缀合物和其高级复合物(例如，双链体)可包含呈递B型肝炎病毒(HBV)的表位的肽，该肽与肝细胞癌相关。在I类MHC呈递复合物的上下文中可呈递HBV表位。I类MHC可为：a)与图3A至图3G中所描绘的以下序列具有至少95％aa序列同一性的aa序列：HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401；b)与以下序列具有至少95％aa序列同一性的aa序列：HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301；或c)与以下序列具有至少95％aa序列同一性的aa序列：HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502。HBV也为感染因子且其表位可用于改变对于HBV的免疫反应以预防或治疗感染。
适合包括于T细胞-MP-表位缀合物中的HBV肽包括但不限于FLPSDFFPSV(SEQ IDNO:437)、GLSRYVARLG(SEQ ID NO:438)、KLHLYSHPI(SEQ ID NO:439)、FLLSLGIHL(SEQ IDNO:440)、ALMPLYACI(SEQ ID NO:441)、SLYADSPSV(SEQ ID NO:442)、STLPETTVV(SEQ IDNO:443)、LIMPARFYPK(SEQ ID NO:444)、AIMPARFYPK(SEQ ID NO:445)、YVNVNMGLK(SEQ IDNO:446)、MQWNSTALHQALQDP(SEQ ID NO:447)、LLDPRVRGL(SEQ ID NO:448)、SILSKTGDPV(SEQ ID NO:449)、VLQAGFFLL(SEQ ID NO:450)、FLLTRILTI(SEQ ID NO:451)、FLGGTPVCL(SEQ ID NO:452)、LLCLIFLLV(SEQ ID NO:453)、LVLLDYQGML(SEQ ID NO:454)、LLDYQGMLPV(SEQ ID NO:455)、IPIPSSWAF(SEQ ID NO:456)、WLSLLVPFV(SEQ ID NO:457)、GLSPTVWLSV(SEQ ID NO:458)、SIVSPFIPLL(SEQ ID NO:459)、ILSPFLPLL(SEQ ID NO:460)、ATVELLSFLPSDFFPSV(SEQ ID NO:461)、LPSDFFPSV(SEQ ID NO:462)、CLTFGRETV(SEQ IDNO:463)、VLEYLVSFGV(SEQ ID NO:464)、EYLVSFGVW(SEQ ID NO:465)、ILSTLPETTV(SEQ IDNO:466)、STLPETTVVRR(SEQ ID NO:467)、NVSIPWTHK(SEQ ID NO:468)、KVGNFTGLY(SEQ IDNO:469)、GLYSSTVPV(SEQ ID NO:470)、TLWKAGILYK(SEQ ID NO:471)、TPARVTGGVF(SEQ IDNO:472)、LVVDFSQFSR(SEQ ID NO:473)、GLSRYVARL(SEQ ID NO:474)、SIACSVVRR(SEQ IDNO:475)、YMDDVVLGA(SEQ ID NO:476)、PLGFFPDH(SEQ ID NO:477)、QAFTFSPTYK(SEQ IDNO:478)、KYTSFPWLL(SEQ ID NO:479)、ILRGTSFVYV(SEQ ID NO:480)、HLSLRGLFV(SEQ IDNO:481)、VLHKRTLGL(SEQ ID NO:482)、GLSAMSTTDL(SEQ ID NO:483)、CLFKDWEEL(SEQ IDNO:484)和VLGGCRHKL(SEQ ID NO:485)。
(ii)感染因子
可包括于T细胞-MP-表位缀合物或其或高级复合物(例如双链体)T细胞-MP中的感染因子的适合表位包括但不限于存在于感染性病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫致病原中的表位，例如由病毒编码的多肽呈递的表位。
病毒性感染性疾病因子的实例包括例如，腺病毒、腺相关病毒、甲病毒(Alphavirus)(披膜病毒科(Togavirus))、东部马脑炎病毒(Eastern equineencephalitis virus)、东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitisvirus)、委内瑞拉脑脊髓炎疫苗毒株(Venezuelan equine encephalomyelitis vaccinestrain)TC-83、西部马脑脊髓炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus)、沙粒病毒(Arenavirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitisvirus)(非亲神经性病毒毒株)、塔卡里伯病毒复合物(Tacaribe virus complex)、布尼亚病毒(Bunyavirus)、布尼亚韦拉病毒(Bunyamwera virus)、裂谷热病毒疫苗毒株(RiftValley fever virus vaccine strain)MP-12、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、钙病毒(Calcivirus)、冠状病毒(Coronavirus)、牛痘病毒、黄病毒(披膜病毒科)-B族虫媒病毒(Flavivirus(Togavirus)-Group B Arbovirus)、登革热病毒(Dengue virus)血清型1、2、3和4、黄热病病毒疫苗毒株(Yellow fever virus vaccine strain)17D、Hepatitis A、B、C、D和E型肝炎病毒、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、艾斯坦氏-巴尔氏病毒(Epstein Barrvirus)、东部马脑炎病毒、1和2型单纯疱疹、带状疱疹、人疱疹病毒第6和7型、C型肝炎病毒(HVC)、B型肝炎病毒(HBV)、A、B和C型流感病毒、乳突多瘤空泡病毒(Papovavirus)、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、第1、2、3和4型副流行性感冒病毒(Parainfluenza virus)、多瘤病毒(JC病毒、BK病毒)、呼吸道融合细胞病毒(Respiratory syncytial virus)、人小病毒(B 19)、A和B型柯萨奇氏病毒(Coxsackievirus)、ECHO病毒(Echovirus)、脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、小型天花(小型天花病毒)(Alastrim(Variola minor virus))、天花(大型天花病毒)(Smallpox(Variola major virus))、白痘呼肠孤病毒(Whitepox Reovirus)、科罗拉多壁虱热病毒(Coltivirus)、人轮状病毒(human Rotavirus)和环状病毒(科罗拉多壁虱热病毒)(Orbivirus(Colorado tick fever virus))、狂犬病病毒(Rabies virus)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、风疹病毒(风疹)(Rubivirus(rubella))、Semliki森林病毒(Semliki Forest virus)、圣路易脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、委内瑞拉脑脊髓炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelitis virus)、沙粒状病毒(Arenavirus)(又名南美出血热病毒(South American Hemorrhagic Fever virus))、Flexal、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)(亲神经性毒株)、汉坦病毒(Hantavirus)，包括汉江病毒(Hantaan virus)、裂谷热病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、黄热病病毒、猴痘病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)1和2型、第1和2型人嗜T细胞淋巴球性病毒(HTLV)、猴类免疫缺陷病毒(SIV)、水泡性口炎病毒、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)、拉沙热病毒(Lassa fever virus)、Junin病毒(Junin virus)、马秋波病毒(Machupo virus)、Sabia病毒(Sabia)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、伊波拉病毒(Ebola virus)、马堡病毒(Marburg virus)、蜱传脑炎病毒复合体(Tick-borne encephalitis viruscomplex)(flavi)，包括中欧蜱传脑炎(Central European tick-borne encephalitis)、远东蜱传脑炎(Far Eastern tick-borne encephalitis)、汉扎洛瓦病毒(Hanzalova)、Hypr病毒(Hypr)、Kumlinge病毒(Kumlinge)、科萨努尔森林病(Kyasanur Forest disease)、鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)和俄罗斯春夏脑炎病毒(Russian SpringSummer encephalitis virus)、猿猴疱疹病毒(Herpesvirus simiae)(疱疹B或猴B病毒)、蛇毒疱疹病毒(Cercopithecine herpesvirus)1(疱疹B病毒)、马麻疹病毒(Equinemorbillivirus)(Hendra和类Hendra病毒)、尼帕病毒(Nipah virus)、重型天花病毒(Variola major virus)(天花病毒)、类天花病毒(类天花)、非洲猪瘟病毒(African swinefever virus)、非洲马疫病毒(African horse sickness virus)、赤羽病毒(Akabanevirus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)(高致病性)、蓝舌病毒(Blue tonguevirus)、骆驼痘病毒(Camel pox virus)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus)、可厥氏体(Cowdria ruminantium)(水胸病(heartwater))、手足口病病毒(Foot and mouthdisease virus)、山羊痘病毒(Goat pox virus)、日本脑炎病毒、块状皮肤病病毒(Lumpyskin disease virus)、恶性卡他热病毒(Malignant catarrhal fever virus)、门格尔病毒(Menangle virus)、新城鸡瘟病毒(VVND)、水泡性口炎病毒(外来)和寨卡病毒(Zikavirus)。由此类病毒编码的抗原为本领域已知的；适用于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的肽表位可包括来自任何已知病毒抗原的肽。
在T细胞-MP-表位缀合物包括将T细胞-MP-表位缀合物导引至预定的目标细胞或组织(例如，癌细胞或组织)的靶向序列(例如，针对癌症相关多肽的靶向序列)的实施方案中，表位有利地为例如由于暴露于诸如病毒或细菌的外来物或由于疫苗接种而结合已经存在于患者中的T细胞的表位。举例而言，表位可为存在于由感染大多数人群的病毒编码的病毒抗原中的表位，该病毒例如巨细胞病毒(CMV)、艾斯坦氏-巴尔氏病毒(EBV)、人乳突状瘤病毒、腺病毒等，或在用T细胞-MP表位缀合治疗之前，大多数人群经由疫苗接种(例如破伤风)对于其具有免疫力，或患者已针对其而专门接种CMV、破伤风或HPV疫苗。结果为存在于患者体内的T细胞经有效地重新定向，自对呈递表位的细胞采取行动转向对靶向序列识别的目标细胞或组织采取行动。参见例如图18。
(a)CMV肽表位
如上文所提及，在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含CMV肽表位，即当处于MHC/肽复合物(例如，HLA/肽复合物)中时将CMV表位(即，存在于CMV抗原中的表位)呈递至T细胞的肽。与本发明的其他肽表位一样，CMV肽表位的长度为至少4个氨基酸，例如4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，长度为4个氨基酸(aa)、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa、20个aa、21个aa、22个aa、23个aa、24个aa或25个aa，包括在4至20个aa.、6至18个aa.、8至15个aa.、8至12个aa.、5至10个aa.、10至15个aa.、15至20个aa.、10至20个aa.或15至25个aa.范围内)。
给定CMV表位特异性T细胞结合具有给定CMV表位的参考氨基酸序列的表位，但实质上不结合与参考氨基酸序列不同的表位。举例而言，给定CMV表位特异性T细胞结合具有参考氨基酸序列的CMV表位并且结合与参考氨基酸序列不同的表位，若如此，其亲和力小于10-6M、小于10-5M或小于10-4M。给定CMV表位特异性T细胞可以至少10-7M、至少10-8M、至少10-9M或至少10-10M的亲和力结合对其具有其特异性的表位。
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV肽表位为来自CMVpp65的肽。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV肽表位为来自CMVgB(糖蛋白B)的肽。
举例而言，在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV肽表位为CMV多肽的肽，其长度为至少4个氨基酸，例如4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，程度为4个氨基酸(aa)、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa、20个aa、21个aa、22个aa、23个aa、24个aa或25个aa，包括在4至20个aa.、6至18个aa.、8至15个aa.、8至12个aa.、5至10个aa.、10至15个aa.、15至20个aa.、10至20个aa.或15至25个aa.范围内)且包含与以下CMV pp65氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
MESRGRRCPE MISVLGPISG HVLKAVFSRG DTPVLPHETRLLQTGIHVRV SQPSLILVSQYTPDSTPCHR GDNQLQVQHTYFTGSEVENV SVNVHNPTGR SICPSQEPMS IYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHR HLPVADAVIH ASGKQMWQARLTVSGLAWTR QQNQWKEPDV YYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMEN TRATKMQVIG DQYVKVYLES FCEDVPSGKLFMHVTLGSDV EEDLTMTRNPQPFMRPHERN GFTVLCPKNMIIKPGKISHI MLDVAFTSHE HFGLLCPKSI PGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELR QYDPVAALFF FDIDLLLQRGPQYSEHPTFT SQYRIQGKLE YRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEEL VTTERKTPRV TGGGAMAGAS TSAGRKRKSASSATACTSGV MTRGRLKAESTVAPEEDTDE DSDNEIHNPAVFTWPPWQAG ILARNLVPMV ATVQGQNLKY QEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRR RHRQDALPGP CIASTPKKHR G(SEQ ID NO:486)。
作为一个非限制性实例，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV肽表位为CMV多肽的肽，其长度为至少4个氨基酸，例如4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，长度为4个氨基酸(aa)、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、10个aa、11个aa、12个aa、13个aa、14个aa、15个aa、16个aa、17个aa、18个aa、19个aa、20个aa、21个aa、22个aa、23个aa、24个aa或25个aa，包括4至20个aa.、6至18个aa.、8至15个aa.、8至12个aa.、5至10个aa.、10至15个aa.、15至20个aa.、10至20个aa.或15至25个aa.范围内)，该CMV多肽包含与以下CMV gB氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
Figure BDA0004113828220002041
Figure BDA0004113828220002051
在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV表位呈递对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G等位基因具有特异性的表位。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的肽表位呈递受限于HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303和/或HLA-A*3401的表位。在一些情况下，存在于本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV表位呈递受限于HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601和/或HLA-B*5301的表位。在一些情况下，存在本发明的T细胞-MP-表位缀合物中的CMV表位呈递受限于C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*702、C*0801和/或C*1502的表位。作为一个实例，在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含：a)具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸的CMV肽表位；b)I类HLA-A*0201重链多肽；和c)β2M多肽。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的Her2多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为癌症靶向多肽(cancer-targetingpolypeptide；CTP)；并且包含CMV肽表位作为表位。在一些情况下，CMV肽为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的MUC1多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV多肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的WT1多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV多肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的间皮素多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的CD19多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的BCMA多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
在一些情况下，本发明的T细胞-MP-表位缀合物包含对存在于癌细胞表面上的MUC16多肽具有特异性的scFv或纳米抗体作为CTP且包含CMV肽表位作为表位。在一些情况下，CMV多肽表位为CMV pp65多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位为CMV gB多肽的肽。在一些情况下，CMV肽表位具有氨基酸序列NLVPMVATV(SEQ ID NO:487)且长度为9个氨基酸。
9有效负载--药物和其他缀合物
T细胞-MP的多肽链可包含连接的有效负载，诸如治疗剂(例如，小分子药物或治疗剂)、标记(例如荧光标记或放射性标记)或连接(例如，共价连接)至多肽链的化学缀合位点处的其他生物活性剂。举例而言，在T细胞-MP包含Fc多肽的情况下，Fc多肽可包含共价连接的有效负载分子，该有效负载分子治疗癌症、传染病或自身免疫疾病或为缓解此类疾病的症状的药剂。
有效负载可以直接或间接连接至作为本发明的T细胞-MP的多肽链的一部分的化学缀合位点(例如，连接至支架，诸如Ig Fc多肽)。直接连接可涉及直接连接至aa侧链。间接连接可为经由交联剂，例如双官能交联剂连接。有效负载可通过任何可接受的化学键连接至T细胞-MP，该化学键包括但不限于硫醚键、酰胺键、氨基甲酸酯键、二硫键或通过与交联剂反应形成的醚键。
包括可裂解交联剂和不可裂解交联剂的交联剂(Crosslinker/crosslinkingagent)可用于将有效负载和/或靶向序列连接至T细胞-MP多肽。交联剂可包含反应性NHS、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酸酯、溴乙酸酯和/或羧基基团。在一些情况下，交联剂为蛋白酶可裂解交联剂。适合的交联剂可包括例如肽(例如，长度为2至10个aa；例如长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个aa)、烷基链、聚(乙二醇)、二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。适合的交联剂的非限制性实例为：N-琥珀酰亚胺基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-顺丁烯二酰亚胺)；4-(2-吡啶基二硫)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)；4-(2-吡啶基二硫)2-磺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(磺-SPDB)；4-(2-吡啶基二硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)(LC-SMCC)；κ-顺丁烯二酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)；γ-顺丁烯二酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)；ε-顺丁烯二酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)；间顺丁烯二酰亚胺苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)；N-(α-顺丁烯二酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)；琥珀酰亚胺基-6-(β-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺)己酸酯(SMPH)；4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)；N-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)；4(2-吡啶基硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基(MC)；顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(MP)；对氨基苯甲氧基羰基(PAB)；4-(顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)、SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC)；3-顺丁烯二酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(BMPS)；碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)；溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBA)；和3-(溴乙酰胺)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)。
T细胞-MP-有效负载缀合物可通过T细胞-MP多肽(例如，T细胞-MP的Ig Fc多肽)与交联剂反应以引入1-10个反应基团而形成。接着使多肽与待缀合分子(例如，含硫醇的有效负载药物、标记或药剂)反应以产生T细胞-MP-有效负载缀合物。举例而言，在本发明的T细胞-MP包含Ig Fc多肽的情况下，缀合物可为(A)-(L)-(C)形式，其中(A)为包含Ig Fc多肽的多肽链；其中若存在，(L)为交联剂；并且其中(C)为有效负载。若存在，(L)将(A)连接至(C)。在一些情况下，T细胞-MP包括Ig Fc多肽序列，该序列包含一个或多个(例如，2、3、4、5或超过5个)分子的有效负载。使用过量交联剂将有效负载引入T细胞-MP中可导致将多个分子的有效负载并入T细胞-MP中。
适合的有效负载(例如，药物)实际上包括美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)批准和/或2020年美国药典或国家处方集(U.S.Pharmacopeia orNational Formulary)列出的任何小分子(例如，分子量小于2,000道尔顿)。在一实施方案中，那些药物的分子量小于1,000。适合的药物包括抗生素、化学治疗剂(抗肿瘤剂)、抗真菌剂或抗蠕虫剂等(例如，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤、环磷酰胺、来氟米特(leflunomide)；胺甲蝶呤、抗疟药、D-青霉胺、环孢素)。适合的化学治疗剂可为烷化剂、细胞骨架干扰物(紫杉烷类)、埃坡霉素(epothilone)、组织蛋白去乙酰化酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前驱物类似物、肽类抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素(bleomycin)或放线菌素(actinomycin))，基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱(vinca alkaloid)。适合的药物还包括非甾体抗炎药和糖皮质素等。适合的化学治疗剂还包括烷化剂、细胞骨架干扰物(紫杉烷类)、埃坡霉素、组织蛋白去乙酰化酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前驱物类似物、肽抗癌抗生素(例如，博来霉素或放线菌素)、基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱。
在一实施方案中，有效负载选自由以下组成的组：生物活性剂或药物、诊断剂或标记、核苷酸或核苷类似物、核酸或合成核酸(例如反义核酸、小干扰RNA、双链(ds)DNA、单链(ss)DNA、ssRNA、dsRNA)、毒素、脂质体(例如，并入化学治疗剂，诸如5-氟脱氧尿苷)、纳米粒子(例如，携载金或其他金属的核酸或其他分子、脂质、携载核酸或其他分子的粒子)和其组合。
在一实施方案中，有效负载选自生物活性剂或药物，所述生物活性剂或药物独立地选自由以下组成的组：治疗剂(例如，药物或前药)、化学治疗剂、细胞毒性剂、抗生素、抗病毒剂(例如，瑞德西韦(remdesivir))、细胞周期同步剂、细胞表面受体的配体、免疫调节剂(例如免疫抑制剂，诸如环孢菌素)、促凋亡剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质或多肽、抗体或其抗原结合片段、酶、酶原、激素和其组合。
在一实施方案中，有效负载为独立地选自由以下组成的组的标记：光可检测标记(例如，染料、荧光标记、磷光标记和发光标记)、对比剂(例如，含碘或钡的材料)、放射性标记、成像剂、顺磁性标记/成像剂(含钆磁共振成像标记)、超声标记和其组合。在一些实施方案中，有效负载为作为或包括放射性同位素的标记。放射性同位素或其他标记的实例包括但不限于3H、11C、14C、15N、35S、18F、32P、33P、64Cu、68Ga、89Zr、90Y、99Tc、123I、124I、125I、131I、111In、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212Bi和153Pb。
II.核酸
本发明提供包含编码T细胞-MP或超过一种T细胞-MP(例如，形成种间异二聚体的一对T细胞-MP)的核苷酸序列的核酸。异聚体的个别T细胞-MP(例如，形成异源双链体的种间对)可在单独核酸中编码。另选地，异聚体T细胞-MP的T细胞-MP(例如，种间对)也可以在单一核酸中编码。此类核酸包括包含编码具有化学缀合位点(例如，半胱氨酸残基)的T细胞-MP的核苷酸序列的那些核酸，所述化学缀合位点提供于T细胞-MP的MHC-H、β2M或支架多肽序列中，或接合那些多肽序列的任何接头(例如，L3接头)中。
A.编码未缀合T细胞-MP的核酸
本发明提供包含编码未缀合T细胞-MP的核苷酸序列的核酸，该未缀合T细胞-MP可形成高级复合物(例如，双链体)。编码未缀合T细胞-MP的核苷酸序列可以可操作地连接至转录控制元件，例如启动子，诸如在真核细胞中具有功能性的启动子，其中启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。如上所述，在一些情况下，个别未缀合T细胞-MP形成异聚体复合物(例如，包含种间支架对的异源双链体T细胞-MP)。异聚体未缀合T细胞-MP可在单一多顺反子核酸序列中编码。另选地，异聚体T细胞-MP可在单独的单顺反子核酸序列中编码，其表达由单独转录控制元件驱动。在使用单独单顺反子序列的情况下，其可存在于单一载体或单独载体中。
本发明包括且提供编码未缀合T细胞-MP多肽的核酸序列，该未缀合T细胞-MP多肽包含(例如，自N端至C端)：(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；(ii)任选的L2接头多肽序列，其将一个或多个MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；(iii)β2M多肽序列；(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个氨基酸)；(v)I类MHC-H多肽序列；(vi)任选的L4接头多肽序列；(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；(viii)任选的L5接头多肽序列；和(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；其中未缀合T细胞调节多肽包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点。
本发明包括且提供编码未缀合T细胞-MP多肽的核酸序列，该未缀合T细胞-MP多肽自N端至C端包含：(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中在存在两个或更多个MOD序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；(ii)任选的L2接头多肽序列；(iii)β2M多肽序列；(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；(v)I类MHC-H多肽序列；(vi)任选的L4接头多肽序列；(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；(viii)任选的L5接头多肽序列；和(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中在存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；其中未缀合T细胞调节多肽包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位接合的化学缀合位点。
本发明包括且提供编码未缀合T细胞-MP多肽的核酸序列，该未缀合T细胞-MP多肽自N端至C端包含：(i)一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中在存在两个或更多个MOD序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；(ii)任选的L2接头多肽序列；(iii)β2M多肽序列；(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；(v)I类MHC-H多肽序列；(vi)任选的L4接头多肽序列；(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；(viii)任选的L5接头多肽序列；和(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中在存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；其中未缀合T细胞调节多肽包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)和/或(ix)的MOD)；并且其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位接合的化学缀合位点。
适合的MHC-H、β2-微球蛋白(β2M)多肽和支架多肽如上所述。MHC-H多肽可为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G重链。在一些情况下，MHC-H多肽包含与图3A至图3H中任一者中所描绘的氨基酸序列具有至少85％aa序列同一性的氨基酸序列。在此类实施方案中，I类MHC重链多肽可不包括跨膜锚定结构域和胞内结构域(参见例如，图3D中的MHC-H多肽)。在一些情况下，第一MHC多肽包含β2-微球蛋白(β2M)多肽；并且第二MHC多肽包含I类MHC重链多肽。在一些情况下，β2M多肽包含与图4所描述的β2M氨基酸序列具有至少约85％(例如，至少约90％、95％、98％、99％或甚至100％)aa序列同一性的氨基酸序列。
B.重组表达载体
本发明提供包含编码本发明的T细胞-MP的核酸序列的重组表达载体。在一些情况下，重组表达载体为非病毒载体。在一些实施方案中，重组表达载体为病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体(参见例如，美国专利第7,078,387号)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组反转录病毒构建体、非整合型病毒载体等。
适合的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰白质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如，Ali等人，HumGene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人，InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690,1997，Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591594,1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165和Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺乏病毒(参见例如，Miyoshi等人，PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816,1999)；反转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒和源自逆转录病毒的载体，例如劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈威氏肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽类白血病病毒、慢病毒、人免疫缺失病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳房瘤病毒)等。
许多适合的表达载体为本领域技术人员已知的，并且许多为可商购的。举例而言，对于真核宿主细胞，提供以下载体：pXT1、pSG5
Figure BDA0004113828220002131
pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其他载体，只要其与宿主细胞相容即可。
视所使用的宿主/载体系统而定，多种适合的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强元件、转录终止子等中的任一种可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987),Methods in Enzymology,153:516-544)。
适合的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自反转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I的那些启动子。适合的载体和启动子的选择为本领域技术人员熟知。表达载体也可含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体也可包括用于扩增表达的适当序列。
III.产生和选择T细胞-MP的方法
本发明提供一种获得T细胞-MP(未缀合T细胞-MP和/或T细胞-MP-表位缀合物两者)的方法，所述T细胞-MP包括双链体和其他高级聚集体，其可包括一个或多个野生型MOD多肽序列和/或与对应野生型MOD序列对于Co-MOD的亲和力相比，对Co-MOD展现较低亲和力的一个或多个变体MOD多肽序列，该方法包括：
A)通过将一个或多个核酸引入细胞或无细胞系统中产生T细胞-MP(或高级复合物，诸如双链体)，该一个或多个核酸编码未缀合T细胞-MP或构成异聚体(例如，未缀合T细胞-MP的异二聚体双链体)的各未缀合T细胞-MP；
其中当T细胞-MP包含一个或多个新生化学缀合位点时，该新生化学缀合位点可经活化以产生具有化学缀合位点的未缀合T细胞-MP(例如，若翻译T细胞-MP核酸的细胞不表达甲酰甘氨酸生成酶，则使硫酸酯酶模体与FGE反应以将Cys残基转化为fGly残基)。
产生T细胞-MP的上述方法可进一步包含提供编码未缀合T细胞-MP的一个或多个核酸，包括本发明中具体描述的那些，其可存在于重组表达载体中和/或可操作地连接至转录控制元件，诸如在真核细胞中起作用的那些。该方法可在此时停止且可获得未纯化的未缀合T细胞-MP(例如，未缀合双链体T细胞-MP)(包括细胞溶解物和未纯化培养基)。另选地，可以使用例如盐沉淀(例如硫酸铵)、亲和力色谱和/或尺寸排阻色谱法中的一种或多种进行纯化，以产生按存在于可通过纯化获得的样本中的蛋白质的总重量计的粗制(小于60重量％)、初步精制(至少60重量％)、部分精制(至少80重量％)、实质上精制(至少95重量％)，部分纯或部分纯化(至少98重量％)、实质上纯或实质上纯化(至少99重量％)、基本上纯的或基本上纯化(至少99.5重量％)或纯化(至少99.8重量％)或高度纯化(至少99.9重量％)的未缀合T细胞-MP。在需要T细胞-MP-表位缀合物的情况下，该方法可通过使粗制品至高度纯化制品中任何程度的T细胞-MP与表位呈递分子如步骤B反应来继续：
B)提供适合与存在于步骤A的未缀合T细胞-MP中的化学缀合位点缀合的表位(例如，表位呈递肽)(例如，用于与硫酸酯酶模体的甲酰甘氨酸反应的肼基或肼基吲哚修饰的肽；或用于与半胱氨酸残基反应的含顺丁烯二酰亚胺的肽)，和使表位与T细胞-MP接触(例如，在适合的反应条件下)以产生T细胞-MP-表位缀合物。
何种纯化程度的未缀合材料进入反应的选择需要视许多因素而定，包括缀合反应和条件、副反应的可能性以及最终表位缀合物需要纯化的程度。
T细胞-MP-表位缀合物(例如，呈双链体或高级复合物形式)可通过例如盐沉淀、大小分离和/或亲和力色谱法进行纯化，使得按存在于样本中的蛋白质的总重量计，其为经至少部分精制(样本中至少80重量％蛋白质)、实质上精制(至少95重量％)、部分纯或部分纯化(至少98重量％)、实质上纯或实质上纯化(至少99重量％)、基本纯或基本纯化(至少99.5重量％)、纯化(至少99.8％)或高度纯化(至少99.9重量％)的T细胞-MP-表位缀合物。
在需要T细胞-MP或高级复合物含有有效负载的情况下，有效负载可与未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物反应。可经由使用正交化学和/或控制缀合反应中的化学计量来控制表位和有效负载针对不同缀合位点的选择性。在实施方案中，接头(例如，多肽或其他双官能化学接头)可用于将表位和/或有效负载连接至其缀合位点。有效负载可为选自以下的细胞毒性剂：例如类美登素(maytansinoid)、苯并二氮杂
Figure BDA0004113828220002161
紫杉醇、CC-1065、倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、尾海兔素(dolastatin)、尾海兔素类似物、澳瑞他汀、托马霉素(tomaymycin)和来普霉素(leptomycin)或前述任一种的前药。有效负载可为类视色素。在可能的情况下，采用单一纯化流程自表位的缀合和有效负载的连接中移除存在的试剂和其他材料，以最小化蛋白质损耗。
多种细胞和无细胞系统可用于制备未缀合T细胞-MP。如标题为“基因修饰的宿主细胞”的章节所论述，所述细胞可为真核细胞来源，更具体来说哺乳动物、灵长类动物或甚至人来源。
本发明提供一种获得未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物(或其高级复合物，诸如双链体)的方法，该未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物包含一个或多个野生型MOD和/或变体MOD，该变体MOD与对应亲本野生型MOD对于Co-MOD的亲和力相比展现对于Co-MOD的降低的亲和力。在需要具有降低的亲和力的变体MOD的情况下，该方法可包含制备变体MOD多肽(例如，具有至少一个插入、缺失或取代的变体MOD多肽)文库，和自MOD多肽文库中选择对其Co-MOD展现降低的亲和力的复数个成员(诸如通过如上文所述的BLI)。一旦选择变体MOD，则制备且表达编码包括变体MOD的未缀合T细胞-MP的核酸。在未缀合T细胞-MP已经表达后，其可经纯化，并且视需要缀合于表位以产生经选择的T细胞-MP-表位缀合物。可重复该过程以制备未缀合T细胞-MP或其表位缀合物的文库。
本发明提供一种获得展现选择性结合于T细胞的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(诸如双链体)的方法，该方法包括：
A)产生包含复数个成员的T细胞-MP-表位缀合物(或其高级复合物)的文库，其中各成员包含T细胞-MP-表位缀合物上的不同变体MOD，其中变体MOD与其亲本野生型MOD在氨基酸序列上不同(例如相差1个aa至10个aa)，并且其中T细胞-MP-表位缀合物文库成员进一步包含表位标签或荧光标记)，和
B)使T细胞-MP-表位缀合物文库成员与在其表面表达以下的目标T细胞接触：i)结合亲本野生型MOD的Co-MOD；和ii)结合于表位的TCR；
C)选择相对于其在相同条件下与对照T细胞的结合而选择性结合目标T细胞的T细胞-MP-表位缀合物文库成员，该对照T细胞包含：i)结合亲本野生型MOD的Co-MOD；和ii)结合于除存在于T细胞-MP文库成员中的表位以外的表位的TCR(例如，选择对目标T细胞较对照T细胞具有更高亲合力或亲和力的T细胞-MP-表位缀合物，诸如通过如上文所述的BLI)。
可自文库中分离经鉴别为选择性结合于目标T细胞的T细胞-MP-表位缀合物文库成员。
当T细胞-MP-表位缀合物包含表位标签或标记时，鉴别对目标T细胞具有选择性的T细胞-MP-表位缀合物可包含通过使用例如流式细胞术来检测与目标和对照T细胞相关的表位标签或标记。尽管经标记T细胞-MP(例如荧光标记的)不需要修饰来进行检测，但表位标记的分子可能需要与使表位标签可见的药剂(例如，结合表位标签的荧光剂)接触。T细胞-MP-表位缀合物的亲和力/亲合力可通过在一系列浓度内测量与目标和对照T细胞相关的药剂或标记(例如，通过使用流式细胞术测量平均荧光强度)来测定。相对于对照T细胞，以最高亲和力或亲合力结合于目标T细胞的T细胞-MP-表位缀合物应理解为选择性结合于目标T细胞。
用于获得T细胞-MP的方法和获得展现选择性结合于T细胞的T细胞-MP-表位缀合物的方法中的MOD和Co-MOD对，包括野生型和变体MOD和Co-MOD对可选自：IL-2和IL-2受体；4-1BBL和4-1BB；PD-L1和PD-1；FasL和Fas；TGF-β和TGF-β受体；CD80和CD28；CD86和CD28；OX40L和OX40；ICOS-L和ICOS；ICAM和LFA-1；JAG1和N otch；JAG1和CD46；CD70和CD27；CD80和CTLA4；和CD86和CTLA4。另选地，其可选自：IL-2和IL-2受体；4-1BBL和4-1BB；PD-L1和PD-1；FasL和Fas；CD80和CD28；CD86和CD28；CD80和CTLA4；和CD86和CTLA4。在一些情况下，与对应亲本野生型MOD相比，经独立选择的存在于T细胞-MP中的变体MOD包含1至20个经独立选择的aa序列变体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个aa取代、缺失或插入)。
T细胞-MP(未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物)可包含两个或更多个野生型和/或变体MOD。两个或更多个MOD可包含相同或不同的氨基酸序列。两个或更多个MOD可在T细胞-MP-双链体的同一T细胞-MP上(例如，呈串连形式)。两个或更多个MOD中的第一种可在T细胞-MP双链体的第一T细胞-MP上，并且两个变体MOD中的第二者可在双链体的第二T细胞-MP上。
IV.基因修饰的宿主细胞
本发明提供一种基因修饰的宿主细胞，其中宿主细胞经本发明的核酸(例如，编码未缀合T细胞-MP的核酸，该未缀合T细胞-MP可以可操作地连接至启动子)进行基因修饰。在此类细胞表达T细胞-MP的情况下，其可用于如前一章节所论述的产生和选择T细胞-MP的方法中。
适合的宿主细胞包括真核细胞，诸如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞为哺乳动物细胞系的细胞。适合的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于：HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2TM)、CHO细胞(例如，ATCC号CRL-9618TM、CCL-61TM、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC号CRL-1573TM)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC号CCL-10TM)、PC12细胞(ATCC号CRL-1721TM)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚胎肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些情况下，宿主细胞为已经基因修饰使得其不合成内源性β2M和/或使得其不合成内源性I类MHC重链(MHC-H)的哺乳动物细胞。除上述之外，上文论述表达甲酰甘氨酸生成酶(FGE)活性的宿主细胞以与包含硫酸酯酶模体的T细胞-MP一起使用，并且此类细胞可经有利地修饰，使得其不表达内源性MHCβ2M和MHC-H蛋白质中的至少一种(若非两者)。
V.组合物和配制剂
本发明提供组合物和配制剂，包括药物组合物和配制剂。组合物可包含：a)T细胞-MP和b)赋形剂。在存在于组合物或配制剂中的赋形剂为药学上可接受的赋形剂时，组合物可为药物组合物或配制剂。药物组合物或配制剂也可为无菌的和/或无热原的。下文提供一些药学上可接受的赋形剂。本发明还提供组合物和配制剂，包括药物组合物，其包含核酸或重组表达载体，其中核酸或表达核酸编码所有或部分T细胞-MP或其高级复合物(例如，异二聚体T细胞-MP双链体的一个T细胞-MP)。
A.包含T细胞-MP-表位缀合物的组合物
除T细胞-MP之外，本发明的组合物可包含以下中的一种或多种：盐，例如NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、MgSO4、乙酸钠、乳酸钠等；缓冲剂，(例如，Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等)；增溶剂；清洁剂(表面活性剂)，例如非离子清洁剂，诸如Tween-20等；蛋白酶抑制剂；甘油等；其中的任一种或所有可呈溶剂合物(例如，与水和/或有机溶剂混合的离子盐)、水合物等形式。
除T细胞-MP以外，包含T细胞-MP表位缀合物的药学上可接受的组合物可包含药学上可接受的赋形剂，其中多种为本领域已知的且无需在本文中详细讨论。药学上可接受的组合物(例如，可注射配制剂)可为无菌的和/或无热原的以及不含对向患者或受试者的施用有害的其他材料(例如，脂多糖)。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多个出版物中，包括例如，“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,第19版(1995)或最新版本,Mack Publishing Co；A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice ofPharmacy”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编，第7版，Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编，第3版，Amer Pharmaceutical Assoc。
主题药物组合物可适合施用至受试者，其例如将通常为无菌的。举例而言，在一些实施方案中，主题药物组合物将适合施用至人受试者，例如其中组合物为无菌的且不含可检测热原和/或其他毒素。药物组合物可适用于离体或体外(细胞的离体处理)使用，其中例如其可与细胞接触且接着随后在向受试者施用细胞之前移除。
包括药物组合物的T细胞-MP组合物也可包含各种组分，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、甘油、镁、碳酸盐等，其中的任一种或所有均可为药物级的。
组合物可呈水溶液或其他溶液、粉剂、颗粒、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、混悬液、喷雾剂等形式。组合物可根据下文所述的各种施用途径进行配制。
在本发明的T细胞-MP表位缀合物作为注射剂(例如，皮下、腹膜内、肌内和/或静脉内)直接施用至组织中的情况下，配制剂可作为即用型剂型、非水性形式(例如，可复水的储存稳定的粉剂)或水性形式提供，诸如由药学上可接受的载体和赋形剂构成的液体。也可提供T细胞-MP配制剂以增加施用后主题蛋白质的血清半衰期。举例而言，T细胞-MP可以脂质体配制剂形式提供，制备为胶体，或用于延长血清半衰期的其他习知技术。多种方法可用于制备脂质体，如Szoka等人1980Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467、美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所描述。制剂也可以控释或缓释形式提供。
适用于肠胃外施用的配制剂的其他实例包括包含无菌注射溶液、盐、抗氧化剂、抑菌剂和/或使配制剂与预期接受者的血液等张的溶质的那些配制剂。此类肠胃外配制剂也可包括一种或多种经独立选择的悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
包含T细胞-MP的配制剂或药物组合物可存在于容器中，例如无菌容器，诸如注射器。配制剂也可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶，其中的任一种可为无菌的。配制剂或药物组合物可经储存于无菌冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用前添加无菌液体赋形剂，例如水以用于注射。可自包含T细胞-MP的无菌溶液、粉剂、颗粒和/或片剂制备即时注射溶液和混悬液。
配制剂中的T细胞-MP的浓度可广泛变化(例如，小于约0.1重量％、通常为或至少约2重量％至高达20重量％至50重量％或更大)，并且通常主要基于液体体积、粘度和基于患者的因素根据所选的特定施用模式和患者的需要进行选择。
在一些情况下，T细胞-MP存在于液体组合物中。因此，本发明提供包含本发明的T细胞-MP的组合物(例如，液体组合物，包括药物组合物)。本发明还提供一种组合物，其包含：a)本发明的T细胞-MP；和b)盐水(例如，0.9％或约0.9％ NaCl)。在一些情况下，组合物为无菌的。组合物可适合施用至人受试者，例如其中组合物为无菌的且不含可检测的热原和/或其他毒素。因此，本发明提供一种组合物，其包含：a)T细胞-MP-表位缀合物；和b)盐水(例如，0.9％或约0.9％ NaCl)，其中组合物为无菌的且不含可检测的热原和/或其他毒素。
B.包含核酸或重组表达载体的组合物
本发明提供包含本发明的核酸或重组表达载体的组合物(例如，药物组合物)(参见，例如同上)，该核酸或重组表达载体包含编码任何一个或多个T细胞-MP多肽的一个或多个核酸序列(或诸如异二聚体的双链T细胞-MP多聚体的各多肽)。药学上可接受的赋形剂为本领域已知的且已广泛描述于多个出版物中，包括例如A.Gennaro(2000)“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy”,第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编，第7版，Lippincott,Williams,&Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编，第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
本发明的组合物可包括：a)一个或多个核酸或一个或多个重组表达载体，其包含编码本发明的T细胞-MP多肽(或T细胞-MP的所有多肽)的核苷酸序列；和b)以下中的一种或多种：盐、缓冲剂、表面活性剂、抗氧化剂、亲水聚合物、糊精、螯合剂、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、抑菌剂和防腐剂。适合的缓冲剂包括但不限于(诸如N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'3-丙磺酸(EPPS或HEPPS)、甘胺酰甘氨酸、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢钠、3-(N-三(羟甲基)-甲基-氨基)-2-羟基-丙磺酸)TAPSO、(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)、三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)等)。适合的盐包括例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等。
本发明的药物配制剂可以约0.001％至约90％(w/w)的量包括本发明的核酸或重组表达载体。在以下配制剂的描述中，“主题核酸或重组表达载体”应理解为包括本发明的核酸或重组表达载体。举例而言，配制剂可包含本发明的主题核酸或主题重组表达载体。
主题核酸或重组表达载体可与其他化合物或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合；此类化合物可包含例如脂质体或受体靶向分子。主题核酸或重组表达载体可与有助于摄取、分布和/或吸收的一种或多种成分组合在配制剂中。
主题核酸或重组表达载体组合物可配制成多种可能剂型中的任一种，诸如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。主题核酸或重组表达载体组合物也可配制成于水性、非水性或混合介质中的溶液或混悬液。
包含主题核酸或重组表达载体的配制剂可为脂质体配制剂。如本文所用，术语“脂质体”包括具有水性内部的单层或多层囊泡，其可含有待递送的组合物(例如，主题核酸)。阳离子脂质体包含带正电荷的脂质，其可与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定复合物。相信pH敏感性或带负电荷的脂质体捕获DNA，而不与其复合。可形成脂质体的阳离子和非阳离子脂质两者可用于体外、离体或体内递送主题核酸或重组表达载体。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，如本文所用，该术语是指包含一种或多种特化脂质的脂质体，当并入脂质体中时，引起相对于缺乏此类特化脂质的脂质体延长的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例包括包含一种或多种糖脂的脂质体和包含用一种或多种亲水性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)部分)衍生的脂质的那些脂质体。脂质体和其用途进一步描述于例如美国专利第6,287,860号中。
穿透增强剂可包括于包含主题核酸或表达载体的组合物中以实现其对核酸的有效递送。除帮助诸如核酸的非亲脂性药物扩散跨过细胞膜，穿透增强剂还增强亲脂性药物的穿透性，诸如可与主题核酸共施用的那些药物。穿透增强剂可归类为属五个大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。渗透增强剂和其用途进一步描述于例如美国专利第6,287,860号中。
用于经口施用的组合物和配制剂包括粉剂或颗粒、微粒、纳米粒子、于水或非水介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、药囊、片剂或微型片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。适合的经口配制剂包括其中将主题核酸与一种或多种穿透增强剂、表面活性剂和螯合剂组合施用的配制剂。适合的表面活性剂包括但不限于脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适合的胆汁酸/盐和脂肪酸和其用途进一步描述于美国专利第6,287,860号中。穿透增强剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合也是适合的。例示性适合的组合为月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他穿透增强剂包括但不限于聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-十六烷基醚。适合的穿透增强剂还包括丙二醇、二甲亚砜、三乙醇胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮和其衍生物、四氢糠醇和AZONETM。
VI.调节免疫反应和治疗疾病和病症的方法
本发明的T细胞-MP和高级T细胞-MP复合物(例如，双链体T细胞-MP)可用于调节T细胞的活性，和直接或间接调节免疫系统的其他细胞的活性。本发明提供调节对表位具有选择性的T细胞(例如，“表位特异性T细胞”或“表位选择性T细胞”)的活性的方法，该方法通常涉及使目标T细胞与本发明的T细胞-MP-表位缀合物或T细胞-MP-表位缀合物的高级复合物(例如，双链体T细胞-MP-表位缀合物)接触。T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物可包含一个或多个经独立选择的MOD，其活化识别癌症、肿瘤或病原体特异性抗原(例如，肿瘤、病毒或细菌抗原)的表位特异性T细胞。在一些情况下，经活化T细胞为细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞)。因此，本发明包括且提供一种治疗癌症、肿瘤(例如，非恶性但不能手术的肿瘤)或感染的方法，该方法包括向有需要的个体施用有效量的包含一个或多个经独立选择的MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物，该一个或多个经独立选择的MOD活化识别对癌症、肿瘤或病原体(例如，病毒或细菌)抗原具有特异性的表位的表位特异性T细胞。此类T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的有效量可为活化对缀合的表位具有特异性的CD8+T细胞的量(例如，增强CD8+T细胞的增殖和/或增强相关细胞信号的增殖，增加其细胞毒性剂，诸如颗粒酶的释放和/或诱导或增强其细胞因子(诸如干扰素γ)的释放)。
T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物也可包含抑制表位特异性T细胞的一个或多个经独立选择的MOD。此类T细胞-MP-表位缀合物可用于治疗疾病和病症，其中受试者由于例如可能出现在各种肿瘤中的CD8+T reg细胞抑制而不能产生足够的免疫反应。
除上述内容以外，本发明考虑且提供T细胞-MP用于递送MOD多肽的用途。MOD的递送可使用T细胞-MP表位缀合物以表位选择性方式完成，并且也可使用未缀合T细胞-MP以非特异性方式完成。递送MOD的方法可用于治疗影响哺乳动物受试者(例如，需要治疗的人患者)的疾病或病症。
A.调节T细胞活性的方法
本发明提供一种选择性调节T细胞活性的方法，该方法包括使受试者接触或向受试者施用T细胞-MP或其高级复合物(在一些情况下具有有效负载)。接触或施用可体内、体外或离体发生，其中向动物(例如哺乳动物，诸如人、大鼠、小鼠、狗、猫、猪、马或灵长类动物)体外或离体施用分子；其中其可构成如下文进一步讨论的治疗疾病或病症的方法的所有或部分。经历调节的T细胞可为例如CD8+T细胞、NK-T细胞和/或T reg细胞。在一些情况下，T细胞为CD8+效应T细胞。
本发明提供一种选择性调节表位特异性T细胞活性的方法。该方法包括使T细胞与携载由表位特异性T细胞识别的表位的T细胞-MP-表位缀合物(例如，以双链体形式)接触。接触引起以由表位驱动的选择性和至少部分由T细胞-MP-表位缀合物的MOD多肽序列驱动的所得活动选择性调节表位特异性T细胞的活性。使T细胞与T细胞-MP-表位缀合物或高级T细胞-MP复合物(例如，双链体T细胞-MP-表位缀合物)接触可引起表达对缀合表位具有特异性的TCR的T细胞(表位特异性T细胞)的活化或抑制，包括诱导或抑制颗粒依赖性和非依赖性反应。颗粒非依赖性反应包括但不限于表位特异性CD 8+T细胞的数目或百分比的变化(例如，在细胞群体中，诸如在血液、淋巴管中和/或在目标组织中)、Fas配体(Fas-L，其可导致半胱天冬酶活化和经由细胞凋亡导致目标细胞死亡)表达的变化以及细胞因子/趋化因子产生(例如，干扰素γ(IFN-γ)的产生和释放)。颗粒依赖性效应作用包括释放颗粒酶、穿孔素和/或颗粒溶素。表位特异性CD8+细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞毒性效应T细胞)的活化可引起通过表位特异性T细胞靶向杀死例如癌细胞和/或感染细胞，所述表位特异性T细胞经由颗粒依赖性和/或非依赖性反应识别由T细胞-MP-表位缀合物(或其高级复合物(例如，双链体)呈递的表位)。
在T细胞-MP缀合于由目标T细胞(表位特异性T细胞)的TCR识别的表位的情况下，接触携载经活化性MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)可引起以下中的一种或多种：i)表位特异性T细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)的增殖；ii)表位特异性诱导细胞毒性活性；iii)通过表位特异性细胞毒性(例如CD8+)T细胞释放一种或多种细胞毒性分子(例如，穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)。相比之下，在T细胞-MP缀合于由目标T细胞(表位特异性T细胞)识别的表位的情况下，接触携载抑制性MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)可引起以下中的一种或多种：i)抑制增殖和/或减少表位特异性T细胞(例如，CD8+细胞毒性T细胞)的数目；ii)表位特异性抑制细胞毒性活性；iii)通过表位特异性细胞毒性(例如，CD8+)T细胞抑制一种或多种细胞毒性分子(例如，穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)的产生和/或释放。接触缀合于由T细胞(表位特异性T细胞)的TCR识别的表位并且携载抑制性MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)也可引起以下中的一种或多种：i)表位特异性抑制自身反应性T细胞；或ii)诱导表位特异性CD8+T调节细胞等。
在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物(或其高级复合物(例如，双链体)包含癌症表位并且其诱导CD8+T细胞反应(例如，对于癌细胞的细胞毒性CD8+T细胞反应)。在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物(或其高级复合物(例如，双链体)包含感染因子的表位，并且其活化对表达感染因子/病原体的抗原的细胞的CD8+T细胞反应(例如，CD8+T细胞反应)。
本发明提供一种增加动物或组织中的CD 8+效应T细胞的增殖(例如，增殖率)和/或总数的方法，所述T细胞对由携载经活化性MOD，诸如IL-2的T细胞-MP表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)呈递的表位具有特异性。增加T细胞增殖或数目的方法包括使T细胞与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物接触(例如，体外、体内或离体)。接触可例如通过以一个或多个剂量向受试者施用T细胞-MP-表位缀合物而发生)。相对于存在于组织中的T细胞的数目(例如，总数或百分比)(例如，在细胞群体中，诸如血液、淋巴管中和/或在靶组织(诸如肿瘤)中)，接触或施用可增加具有能够结合存在于T细胞-MP-表位缀合物中的表位的TCR的CD8+效应T细胞的数目。举例而言，在一或多次接触多个剂量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物或施用其后，对由T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)呈递的表位具有特异性的CD 8+效应T细胞的绝对或相对数可增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。可相对于接触或施用前存在的CD8+T细胞数目或相对于未与存在于未接触T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的样本(例如，血液或组织样本)中的T细胞群体来计算增加量。
本发明提供一种增强表位特异性CD 8+T细胞的颗粒依赖性和/或颗粒非依赖性反应的方法，其包括使T细胞与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，与CD80和/或CD86 MOD)接触(例如，体外、体内或离体)或向T细胞施用T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物。接触或施用可引起例如Fas配体表达增加、细胞因子/趋化因子(例如，IL-2、IL-4和/或IL-5)、干扰素(例如，IFN-γ)的释放、颗粒酶的释放、穿孔素的释放和/或颗粒溶素的释放。举例而言，使CD 8+效应细胞与呈递对效应细胞具有表位特异性的T细胞-MP-表位缀合物或其复合物(例如双链体)接触可使Fas配体表达、干扰素γ(IFN-γ)释放、颗粒酶释放、穿孔素释放和/或颗粒溶素释放中的一种或多种增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。可相对于接触或施用之前的表达或释放量或相对于存在于尚未与T细胞-MP-表位缀合物或其复合物的样本(例如，血液或组织样本)中的T细胞群体来计算增加量。
CD8+T reg细胞和自身反应性CD8+效应T细胞的失调与自身免疫性疾病的发病机制有关，所述自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化症、Rasmussen氏脑炎、伴肿瘤症候群、全身性硬化症(SSc)、格雷氏病(GD)、全身性红斑狼疮(SLE)、再生障碍性贫血(AA)和白斑病(参见例如，Pilli等人，Frontiers in Immunology,Article 652,第8卷,2017年6月；Coppieters等人，J.Exp Med.第209卷第1 51-60号(2012)；Han等人，PNAS(USA),110(32):13074-13078(2013)和Pellegrino等人，PLOS ONE,https://doi.org/10.1371/journal.pone.0210839January 16,(2019)。Deng等人已综述CD8+T细胞在自身免疫性疾病中的表观遗传作用(参见，Deng等人，Frontiers in Immunology,Article 856，第10卷，2019年4月)。CD8+效应细胞也可通过炎性细胞因子的分泌失调、不正常分化分布、不适当细胞凋亡或诱导针对目标细胞的效应T细胞功能来促进自身免疫性疾病。在一些情况下，呈递自身表位(例如，自身抗原的抗原决定簇)的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)可通过与细胞直接相互作用而降低自身反应性CD8+效应T细胞的活性。使呈递自身抗原和一个或多个经独立选择的抑制性MOD(例如，PDL1和/或FasL)的此类T细胞-MP-表位缀合物与自身反应性CD8+效应T细胞接触可用作通过调节(例如，减少)此类T细胞释放促炎分子和/或通过消除自身反应细胞来阻断自身免疫疾病的手段。
在需要降低表位特异性T细胞的活性的情况下(例如，在T细胞针对自身抗原的情况下)，可使T细胞与呈递表位并且携载调节其表位特异性反应的MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其复合物(例如双链体)接触。通过T细胞-MP-表位缀合物和其高级复合物调节细胞毒性CD8+T细胞可引起但不限于以下中的一种或多种：i)抑制T细胞的FasL表达；ii)抑制趋化因子和/或细胞因子(例如，IFN-γ)释放；和/或iii)抑制细胞毒素(例如，穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)合成或释放。本发明包括且提供一种以表位特异性方式降低(例如，体内、体外或离体)效应T细胞活性的方法，诸如其中T细胞针对自身抗原。举例而言，在一或多次接触多个剂量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物或施用其之后，对由T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)呈递的表位具有特异性的CD 8+效应T细胞的绝对或相对数可减小至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％。”该方法包括使表位特异性T细胞与一个或多个剂量的呈递表位并且携载MOD(例如，TGF-β)的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物接触(诸如通过向受试者施用)。接触或施用引起(i)T细胞的FasL表达；ii)趋化因子和/或细胞因子释放(例如，IFN-γ)的抑制；和iii)细胞毒素(例如穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)合成或释放的抑制中的一种或多种减小至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。可相对于接触或施用之前的表达或释放量或相对于存在于尚未与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物接触的样本(例如，血液或组织样本)中的T细胞群体来计算变化。
在其他情况下，特定来说在呈递一个或多个IL-6MOD时的T细胞-MP-表位缀合物或呈递抗原(例如，自身抗原的表位)的其高级复合物可与对表位具有特异性的CD8+调节T细胞(CD8+T reg，表征为例如CD8+FOXP3+或CD8+FOXP3+CD25+)相互作用且增加所述CD8+调节T细胞的数目。各种CD8+T reg子集通过例如以下来起作用：分泌细胞因子和趋化因子，包括IL-10、TGF-β、IL-16、IFN-γ和趋化因子(C-C模体)配体4(CCL4)，并且从而抑制效应T细胞的活性和潜在的CD4+T细胞的活性，诸如通过那些细胞因子中的任一种的作用。CD8+T reg也可经由细胞间接触来抑制T细胞功能，其中诸如TGF-β和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表面蛋白作用于T效应细胞。参见例如，Yu等人Oncol.Lett 15(6):8187-8194(2018)。
本发明提供增加针对自身抗原的表位特异性CD8+T reg的数目(增殖)和/或IL-10、TGF-β、IL-16、IFN-γ和CCL4中的一种或多种的释放，并且从而抑制免疫/自身免疫反应的方法。增加自身抗原特异性CD8+T reg(例如，受试者中的)的数目的一种方法包括使表位特异性T细胞与一个或多个剂量的呈递自身表位并且携载对CD8+T reg增殖具有刺激性的MOD(例如IL-6，参见例如，Nakagawa等人，International Immunology，第22卷，第2号，第129–139页,(2009))的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物接触(体外、离体或体内，诸如通过向受试者施用)，其中相对于存在于尚未与T细胞-MP或T细胞-MP复合物接触的样本(例如，血液或组织样本)中的CD8+T reg的数目，该接触使CD8+T reg的增殖增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。
本发明还提供增加IL-10、TGF-β、IL-16、IFN-γ和CCL4中的一种或多种且从而抑制免疫/自身免疫反应的方法。该方法包括使表位特异性T细胞与一个或多个剂量的呈递抗原且携载对CD8+T reg细胞具有刺激性的MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)接触(体外、离体或体内，诸如通过向受试者施用)。相对于接触之前的量或相对于存在与尚未与T细胞-MP或T细胞-MP复合物接触的样本(例如，血液或组织样本)中的T细胞群体，接触使IL-10、TGF-β、IL-16、IFN-γ和CCL4中的至少一种的释放增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或超过10倍。
在需要消除表位特异性CD8+效应细胞的情况下(例如，在其针对自身抗原的情况下)，其可与呈递表位的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)接触。T细胞-MP可包含导致细胞凋亡的一个或多个MOD和/或包含即使在不存在MOD多肽序列的情况下促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Ig Fc区(例如，具有野生型Ig Fc支架的无MOD T细胞-MP)。举例而言，当T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)包含表位(例如，自身抗原)和诱导FAS介导的细胞凋亡的MOD，诸如FasL时，可能发生细胞凋亡。消除表位特异性T细胞也可由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)引起，其中T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)呈递表位并且包含具有野生型或增强型ADCC和/或CDC功能性的免疫球蛋白Fc多肽。因此，本发明包括且提供一种以表位特异性方式消除(例如，体内、体外或离体)效应T细胞的方法，诸如其中T细胞针对自身抗原。该方法包括使表位特异性T细胞与一个或多个剂量的呈递表位并且携载MOD的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)接触(诸如通过体内向受试者施用，或体外或离体向细胞施用)，该MOD可诱导T细胞凋亡，诸如TNF或Fas-L(导致Fas受体(CD95)介导的细胞死亡)和/或具有ADCC或CDC活性的Ig Fc区。接触或施用引起消除至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的CD8+细胞，所述细胞对由T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)呈递的表位具有特异性。可相对于存在于接触(施用)T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)之前的样本(例如，血液或组织的样本)或尚未与T细胞-MP-表位缀合物或其更高级复合物(例如双链体)接触的样本中的T细胞数目来计算变化。
除T细胞的表位限制性调节之外，本发明还提供一种通过以不受特定表位限制的方式提供免疫调节多肽来调节活性T细胞(和免疫系统的其他细胞)的方法。该方法包括向受试者施用未缀合T细胞-MP或其高级复合物(例如，双链体T细胞-MP)或编码此类未缀合T细胞-MP的核酸或以其他方式使免疫系统的细胞与其接触，其中T细胞-MP携载一个或多个MOD。举例而言，携载IL-2和/或CD80 MOD的未缀合T细胞-MP可用于以表位非依赖性方式向有需要的受试者或患者有效地提供那些细胞因子。
B.选择性递送MOD(共刺激多肽)的方法
本发明提供一种将MOD(共刺激多肽)，诸如IL-2、4-1BBL、CD-80、CD-86、Fas-L、PD-L1、或其任何降低亲和力的变体(例如，本文公开的PD-L1和/或IL-2变体)递送至具有对给定表位具有特异性的TCR的所选择T细胞或所选择T细胞群体。该方法包括使T细胞群体与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)接触(例如，通过向受试者施用)。T细胞群体可为包含以下的混合群体：i)具有对目标表位具有特异性的TCR的目标T细胞；ii)对目标表位不具有特异性的非目标T细胞(例如，对除结合表位特异性T细胞的表位以外的表位具有特异性的T细胞)。表位特异性T细胞对存在于T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物中且由其呈递的表位具有特异性且结合于由T细胞-MP表位缀合物提供的肽MHC复合物，从而将存在于T细胞-MP-表位缀合物中的MOD选择性地递送至目标T细胞。接触或施用可以在体外、离体或体内进行，并且可构成治疗方法的全部或部分。因此，举例而言，本发明提供一种将共刺激多肽，例如PD-L1或天然存在的共刺激多肽的亲和力降低的变体，诸如本文公开的PD-L1变体或两者的组合选择性地递送至目标T细胞的方法，其形成治疗疾病或病症的一部分。
举例而言，使T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)与包含以下的T细胞群体接触：i)目标T细胞，其对存在于表位缀合物中的表位具有特异性；和ii)非目标T细胞，例如对不为存在于表位缀合物中的表位的第二表位具有特异性的T细胞。接触该群体导致将MOD或亲和力降低的变体MOD选择性递送至目标T细胞。小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于4％、3％、2％或1％的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体T细胞-MP)可结合于非目标T细胞，并且因此将MOD选择性地递送至目标T细胞(且因此，实质上不递送至非目标T细胞)。
在一些情况下，经递送有MOD和/或变体MODT的T细胞群体体外或离体存在，并且在体外或离体情况下引发目标T细胞群体对T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)的生物反应(例如，T细胞活化、扩增和/或的表型分化)。举例而言，混合的T细胞群体可自个体获得，并且可体外或离体与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)接触。此类接触可包含将T细胞群体单次或多次暴露于规定剂量和/或暴露时间表。在一些情况下，该接触导致选择性地结合/活化和/或扩增T细胞群体内的目标T细胞，并且导致产生活化和/或扩增的目标T细胞群体。举例而言，混合的T细胞群体可为周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)。举例而言，来自患者的PBMC可在标准淋巴细胞培养条件下暴露于0.1至1000nM的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)之前通过标准抽血和PBMC富集技术获得。在以限定剂量和时间表暴露混合T细胞群体之前、期间和之后的时间点，体外培养物中的目标T细胞的丰度可通过特定肽-MHC多聚体、表型标记和/或功能活性(例如，细胞因子ELISpot分析)来监测。在一些情况下，在达成体外抗原特异性细胞的最优丰度和/或表型后，将所有或部分的经活化和/或扩增的目标T细胞群体施用至个体(例如，获得混合T细胞群体作为病症的疾病的治疗的个体)。
举例而言，混合的T细胞群体是自个体获得且与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)体外接触。可包含在体外细胞培养情况下将T细胞单次或多次暴露于限定剂量和/或暴露时间表的此类接触可用于测定混合T细胞群体是否包括对由T细胞-MP-表位缀合物或高级复合物呈递的表位具有特异性的T细胞。对T细胞-MP或高级复合物的表位具有特异性的T细胞的存在可通过分析包含混合T细胞群体的样本来测定，该T细胞群体包含对表位不具有特异性的T细胞(非目标T细胞)且可包含对表位具有特异性的T细胞(目标T细胞)。已知分析可用于检测目标T细胞的活化和/或增殖，从而提供一种离体分析，该分析可测定特定T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物是否拥有结合于个体中存在的T细胞的表位，并且因此测定表位缀合物是否具有用作该个体的治疗组合物的潜能。用于检测目标T细胞的活化/增殖的适合的已知分析包括例如T细胞表型和/或抗原特异性和/或增殖的流式细胞术表征。检测表位特异性T细胞存在的此类分析，例如伴随诊断，可进一步包括额外分析(例如，效应细胞因子ELISpot分析)和/或适当的对照(例如，抗原特异性和抗原非特异性多聚体肽-HLA染色剂)以测定T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)是否选择性结合、调节(活化或抑制)和/或扩增目标T细胞。因此，举例而言，本发明提供一种在自个体获得的混合T细胞群体中检测结合所关注表位的目标T细胞的存在的方法，该方法包括：a)使混合T细胞群体与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)体外接触；和b)检测回应于该接触的T细胞的调节(活化或抑制)和/或增殖，其中T细胞的调节和/或增殖指示存在目标T细胞。另选地或另外，若使用T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)获得所需T细胞群体的活化和/或扩增(增殖)，则可将包含经活化/扩增T细胞的T细胞群体的全部或部分作为疗法投回个体。
在一些情况下，T细胞群体在个体体内。在此类情况下，用于将一个或多个共刺激多肽(例如，IL-2或PD-L1或亲和力降低的IL-2或PD-L1)选择性递送至表位特异性T细胞的本发明的方法包括向个体施用T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)。
在一些情况下，经选择性递送有一个或多个MOD多肽序列(例如，IL-2或PD-L1的野生型或亲和力降低的变体)的表位特异性T细胞为目标T细胞。
C.治疗方法
本发明提供治疗多种疾病和病症的方法。可经治疗的疾病和/或病症包括肿瘤(例如，非恶性肿瘤)、癌症、感染、过敏、移植(transplant/graft)排斥、移植物对抗宿主病和自身免疫疾病或病症。治疗方法可包含向个体施用一定量的以下：(i)至少一个T细胞-MP(未缀合或呈表位缀合物形式)或其高级复合物(例如双链体)；或(ii)一个或多个编码未缀合T细胞-MP(其可组装成高级复合物)的核酸或表达载体。在需要选择性调节个体中表位特异性T细胞的活性且从而实现治疗疾病或疾患的方法的情况下，可向个体施用T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)。用于治疗方法中的未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物可包含一个或多个(例如，两个或更多个)经独立选择的MOD和/或变体MOD多肽序列。
当需要利用不限于目标表位特异性目标细胞群体的免疫调节多肽进行治疗时，可向患者或受试者施用未缀合T细胞-MP或编码未缀合T细胞-MP的核酸。本发明的一种治疗方法包括向有需要的个体施用一个或多个核酸(例如，重组表达载体)，其包含编码未缀合T细胞-MP的核苷酸序列，该未缀合T细胞-MP可组装成高级T细胞-MP复合物。本发明的另一种治疗方法包括向有需要的个体施用一个或多个mRNA分子，其包含编码本发明的未缀合T细胞-MP的核苷酸序列。可利用未缀合T细胞-MP治疗的疾病和/或病症包括其中MOD的免疫调节作用将增强或抑制携载同源co-MOD的细胞的反应且从而产生缓解疾病症状或治愈潜在疾病或病症的免疫反应的疾病或病症。
本发明提供一种选择性调节个体的表位特异性T细胞的活性从而实现治疗的方法，该方法包括向个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)，其中所施用分子选择性地调节个体的表位特异性T细胞的活性，从而治疗个体的疾病或病症。因此，本发明提供一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用足以实现治疗的有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物。施用T细胞-MP-表位缀合物诱导表位特异性T细胞反应且也可诱导表位非特异性T细胞反应，其中表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为2:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为5:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为10:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为25:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为50:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率至少为100:1。在一些情况下，个体为人。在一些情况下，该调节增加对癌症或受感染细胞，例如表达病毒或癌症抗原的细胞的细胞毒性T细胞反应，该病毒或癌症抗原所展现的表位与存在于T细胞-MP-表位缀合物中的肽表位相同。如下文所述，在一些情况下，该施用为静脉内、皮下、肌肉内、全身、淋巴管内、治疗部位远端、局部或在治疗部位处或其附近，下文论述讨论施用有效量的所施用分子所需的剂量。
本发明还包括且提供将针对特定表位(例如，CMV蛋白的特定表位)的T细胞(例如，CD8+效应T细胞)重定向至经选择的细胞或组织的方法。若患者没有(或可能没有)针对特定表位的足够T细胞，则该方法包括使待治疗患者经诱导对特定表位具有特异性的T细胞的抗原(例如巨细胞病毒“CMV”蛋白)免疫的初始步骤(参见图18顶部)。具有对表位具有特异性的足够T细胞的患者用缀合于特定表位的T细胞-MP治疗，该T细胞-MP进一步包含一个或多个(例如，两个或更多个)靶向序列和一个或多个MOD。参见图18中间部分“利用T细胞-MP的治疗”。举例而言，缀合于特定表位的T细胞-MP可包含癌症靶向肽CTP1和/或CTP2作为靶向序列以及MOD(例如，对细胞毒性T细胞具有刺激性，诸如野生型或变体IL-2)。携载靶向序列的T细胞-MP-表位缀合物将定位于目标细胞或组织上(例如，如图18所展示的癌细胞，但可靶向具有特定表面抗原的任何细胞或组织)。缀合于特定表位的T细胞-MP的定位导致对特定表位具有特异性的T细胞定位，而来自MOD的信号与来自现已经由T细胞-MP呈递的特定表位接合的TCR的信号的组合引导T细胞反应(例如，如图18下部所展示的目标细胞的细胞毒性攻击)。整个方法允许将T细胞的作用自表达特定表位的细胞或组织重新定向至表达靶向序列识别的抗原的细胞或组织。在目标为癌细胞或组织的情况下，可有利地使用具有针对癌细胞或组织的不同抗原的超过一个靶向序列(例如，如图18的CTP1和CTP2)的异聚T细胞-MP(例如，异二聚体)以防止癌症通过目标抗原的丢失或突变而逃脱治疗。
以下中的任一种可单独或与一种或多种额外治疗剂或药物一起施用：(i)未缀合T细胞或其高级复合物(例如双链体)；(ii)编码未缀合T-细胞MP或其高级复合物(例如，同源双链体或异源双链体)的一个或多个核酸；或(iii)T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，同源双链体或异源双链体)。治疗剂(例如，针对检查点抑制剂的抗体，诸如：抗PD-1，例如纳武单抗、西米普利单抗(Cemiplimab)和派姆单抗(Pembrolizumab)；抗PDL-1，诸如阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)或德瓦鲁单抗(Durvalumab)；或抗CTLA-4，例如伊匹单抗，其与其他物质一起在下文进一步描述)可在T细胞-MP施用或在编码一个或多个未缀合T细胞-MP分子的核酸施用之前、期间或之后施用。当将额外治疗剂或药物与包含T细胞-MP或其高级复合物(例如双链体)或编码未缀合T细胞-MP的核酸的组合物或配制剂一起施用时，治疗剂或药物可与那些分子中的任一种同时施用。另选地，治疗剂可与T细胞-MP或核酸作为单一配制剂或组合物(例如，药物组合物)的一部分一起共施用。
当表位与过敏原相关时，T细胞-MP-表位缀合物可用于治疗过敏反应的方法中。当表位与感染因子(例如，病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫)相关时，T细胞-MP-表位缀合物可用于治疗或预防病原体感染的方法中。在表位与肿瘤或癌细胞或组织相关时(例如，癌症相关抗原、新抗原或已知与特定癌症相关的病毒抗原，诸如某些HPV和HBV抗原的表位)，T细胞-MP-表位缀合物可用于治疗各种肿瘤或癌症的方法中。
1肿瘤和癌症
可用本发明的方法治疗的癌症(例如，恶性肿瘤)和肿瘤(例如，良性肿瘤(benignneoplasm/benign tumor))包括可用靶向序列靶向的任何肿瘤或癌症，包括通过如上文关于图18所描述的重新定向T细胞作用。可用本发明的方法治疗的癌症包括癌、肉瘤、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。可用本发明的方法治疗的癌症和肿瘤包括实体瘤。可用本发明的方法治疗的癌症包括转移性癌症。
在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)包含：(i)癌症特异性表位(例如，癌症相关抗原)；和(ii)一个或多个经独立选择的活化性MOD多肽序列，其活化表位特异性T细胞(例如，活化效应子功能和/或增殖)。使CD8+T细胞与携载一个或两个IL-2MOD(例如，在双链体中携载H16和/或F42取代，诸如H16A和/或F42A取代的两个或四个IL-2MOD)的T细胞-MP-表位缀合物接触可导致具有对所呈递表位具有特异性的TCR的T细胞扩增。在T细胞为细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞)的情况下，此类T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物可增加对表达表位的癌细胞或病原体感染细胞具有特异性的CD8+效应T细胞的数目和/或活性。CD8+T细胞的活化可导致CD8+T细胞增殖增加和/或诱导或增强CD8+T细胞释放趋化因子和/或细胞因子。因此，本发明提供一种治疗癌症或感染的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)，该T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物包含：(i)癌症表位(例如，癌症相关抗原的表位)；和(ii)一个或多个经独立选择的活化性MOD多肽序列，其活化对缀合表位具有特异性的T细胞。在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)的有效量为增加CD8+效应细胞的数目或活性的量。
CD8+T调节细胞(T reg)已展示抑制抗肿瘤免疫(参见例如，Wang,R-F.HumanImmunity,69(11):811-814(2008))。在T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物包含抑制性MOD(例如，PD-L1、FasL等)和对与癌症或肿瘤具有反应性的T细胞具有特异性的表位的情况下，其可用于治疗(治疗方法)以减少对由T细胞-MP表位缀合物呈递的表位具有特异性的CD8+T reg(例如，FoxP3+、CD8+T细胞)的增殖/活性。增强抗肿瘤免疫的此类治疗可单独或与用于治疗癌症和肿瘤的其他疗法组合使用。因此，本发明提供一种治疗患有癌症或肿瘤的个体的方法，其中个体至少部分地由于CD8+T-reg细胞对反应的抑制而无法产生足够的抗肿瘤免疫反应。治疗涉及过量CD8+T reg活性的疾病或病症的方法包括向有需要的个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)，该T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物包含：(i)对肿瘤或癌症具有特异性的表位(例如，癌症相关抗原的抗原决定簇)；和(ii)一个或多个经独立选择的抑制性MOD多肽序列，其抑制对缀合于T细胞-MP的表位具有特异性的CD8+Treg。此类T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的有效量也可为当以一个或多个剂量施用时，引起CD8+T reg的增殖、绝对数和/或活性(例如，释放IL-10、TGF-β、IL-16、IFN-γ或CCL4中的一种或多种)减小的量，所述CD8+T reg对由T细胞-MP-表位缀合物呈递的肿瘤或癌症表位具有特异性。与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的施用之前的那些细胞的数目相比，对肿瘤或癌症表位具有特异性的CD8+T reg的减小可为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
下文论述提供有效量的T细胞-MP以实现治疗所需的剂量和施用途径。
可通过本文公开的方法治疗的癌包括但不限于食道癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的一种形式)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌，包括移行细胞癌(膀胱的恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓质癌、肾细胞癌、原位乳管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、骨原性癌、上皮癌和鼻咽癌。
可通过本文公开的方法治疗的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、Ewing氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
可通过本文公开的方法治疗的其他实体瘤包括但不限于神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突细胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、神经胚细胞瘤和视网膜胚细胞瘤。
可通过本文公开的方法进行治疗的白血病包括但不限于：a)慢性骨髓增生性症候群(多潜能造血干细胞的肿瘤病症)；b)急性骨髓性白血病(多潜能造血干细胞或受限谱系潜能的造血细胞的肿瘤性转化；c)慢性淋巴细胞白血病(CLL；免疫不成熟和功能不全小淋巴细胞的克隆增殖)，包括B细胞CLL、T细胞CLL前淋巴球性白血病和毛细胞白血病；和d)急性淋巴母细胞白血病(特征在于淋巴母细胞积聚)。可使用主题方法治疗的淋巴瘤包括但不限于B细胞淋巴瘤(例如伯奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤等。
可根据本文公开的方法治疗的其他癌症包括非典型脑膜瘤、胰岛细胞癌、甲状腺髓质癌、间叶瘤、肝细胞癌、肝胚细胞瘤、肾透明细胞癌和纵隔神经纤维瘤。
如上所述，在一些情况下，在进行主题治疗方法时，向有需要的个体施用本发明的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)作为多肽本身。
除施用T细胞-MP-表位缀合物以外，治疗癌症或肿瘤的方法也可进一步包含施用例如增强CD 8+T细胞功能(例如，效应功能)和/或另外治疗癌症或肿瘤或减轻其症状的一种或多种治疗剂。因此，抗TGF-β抗体，诸如针对TGF-β1的美替木单抗(Metelimumab)(CAT192)和针对TGF-β1和TGF-β2或TGF-β阱的非苏木单抗(Fresolimub)可与T细胞-MP-表位缀合物组合施用以用于治疗癌症或肿瘤。用抗TGF-β抗体进行的治疗可受限于以下条件：T细胞-MP不包含与抗体或TGF-β阱结合的aa序列)。
可与T细胞-MP或其高级复合物(例如双链体)组合施用以治疗癌症或肿瘤的增强CD 8+功能的其他治疗剂包括但不限于：检查点抑制剂(下文论述)；针对以下的抗体：B淋巴细胞抗原(例如，针对CD20的替伊莫单抗、奥托珠单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、利妥昔单抗、针对CD30的本妥昔单抗(brentuximab vedotin)和针对CD52的阿仑单抗)；EGFR(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗和耐昔妥珠单抗(necitumumab))；VEGF(例如，贝伐单抗)；VEGFR2(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab))；HER2(例如，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和阿多-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab))；PD-1(例如，靶向检查点抑制的纳武单抗和派姆单抗)；RANKL(例如，地诺单抗(denosumab))；CTLA-4(例如，靶向检查点抑制的伊匹单抗)；IL-6(例如，西妥昔单抗(siltuximab))；二唾液酸神经节苷脂(GD2)，(例如，地妥昔单抗(dinutuximab))二唾液酸神经节苷脂(GD2)；CD38(例如，达雷木单抗)；SLAMF7(埃罗妥珠单抗(Elotuzumab))；EpCAM和CD3两者(例如，卡妥索单抗(catumaxomab))；或CD19和CD3两者(例如博纳吐单抗(blinatumomab))(任选地受制于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含与抗体结合的aa序列)。
可与T细胞-MP-表位缀合物组合施用以治疗癌症和肿瘤的化学治疗剂包括但不限于烷化剂、细胞骨架破坏剂(例如紫杉烷)、埃坡霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前体类似物、肽类抗肿瘤抗生素(例如博来霉素或放线菌素)、基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱，和其衍生物。化学治疗剂可选自由以下组成的组：放线菌素全反式维甲酸、氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、卡铂(carboplatin)、卡培他滨(capecitabine)、顺铂(cisplatin)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃博霉素(epothilone)、依托泊苷(etoposide)、氟脲嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、伊马替尼(imatinib)、伊立替康(irinotecan)、甲氮芥(mechlorethamine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、胺甲蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、拓扑替康(topotecan)、柔比星(valrubicin)、维莫非尼(vemurafenib)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和长春地辛(vindesine)
2.免疫检查点抑制剂
如上所述，可与T细胞-MP或其高级复合物(例如，双链体)组合施用以治疗癌症或肿瘤的一种治疗剂类型为免疫检查点抑制剂。例示性免疫检查点抑制剂包括靶向免疫检查点多肽的抑制剂，诸如CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3KΔ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137(也称为4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1和PD-L2。在一些情况下，免疫检查点多肽为选自CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR、CD122和CD137的刺激性检查点分子。在一些情况下，免疫检查点多肽为选自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、CD96、TIGIT和VISTA的抑制性检查点分子。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂为对免疫检查点具有特异性的抗体，例如单克隆抗体。抗免疫检查点抗体可为完全人、人源化或去免疫化的，使得抗体实质上不会在人体内引发免疫反应。在一些情况下，抗免疫检查点抗体抑制免疫检查点多肽与免疫检查点多肽的配体的结合。在一些情况下，抗免疫检查点抗体抑制免疫检查点多肽与免疫检查点多肽的受体的结合。
对免疫检查点具有特异性且用作免疫检查点抑制剂的抗体，例如单克隆抗体，为本领域已知的。参见例如，Wurz等人(2016)Ther.Adv.Med.Oncol.8:4和Naidoo等人(2015)Ann.Oncol.26:2375。适合的抗免疫检查点抗体包括但不限于纳武单抗(Bristol-MyersSquibb)、派姆单抗(Merck)、匹利珠单抗(pidilizumab)(Curetech)、AMP-224(GlaxoSmithKline/Amplimmune)、MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Medarex、Inc./BristolMyer Squibb)、MEDI-4736(Medimmune/AstraZeneca)、阿雷鲁单抗(arelumab)(MerckSerono)、伊匹单抗(YERVOY、(Bristol-Myers Squibb)、曲美木单抗(tremelimumab)(Pfizer)、匹利珠单抗(CureTech、Ltd.)、IMP321(Immutep S.A.)、MGA271(Macrogenics)、BMS-986016(Bristol-Meyers Squibb)、利瑞鲁单抗(lirilumab)(Bristol-MyersSquibb)、乌瑞芦单抗(urelumab)(Bristol-Meyers Squibb)、PF-05082566(Pfizer)、IPH2101(Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)、MEDI-6469(MedImmune/AZ)、CP-870,893(Genentech)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirin)、伐立鲁单抗(Varlilumab)(CelIDex Therapeutics)、阿维鲁单抗(EMD Serono)、加利昔单抗(Galiximab)(Biogen Idec)、AMP-514(Amplimmune/AZ)、AUNP 12(Aurigene and PierreFabre)、吲哚莫德(Indoximod)(NewLink Genetics)、NLG-919(NewLink Genetics)、INCB024360(Incyte)和其组合。适合的抗LAG3抗体包括例如BMS-986016和LAG525。适合的抗GITR抗体包括例如TRX518、MK-4166、INCAGN01876和MK-1248。适合的抗OX40抗体包括例如MEDI0562、INCAGN01949、GSK2831781、GSK-3174998、MOXR-0916、PF-04518600和LAG525。适合的抗VISTA抗体提供于例如WO 2015/097536中。
抗免疫检查点抗体的适合的剂量为每天约1mg/kg至约2400mg/kg，诸如每天约1mg/kg至约1200mg/kg，包括每天约50mg/kg至约1200mg/kg。此类药剂的其他代表性剂量包括每天约5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg、2000mg/kg、2100mg/kg、2200mg/kg和2300mg/kg。有效剂量的抗体可在一天中以适当的间隔以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用、分开施用。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。适合的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗、派姆单抗(也称为MK-3475)、匹利珠单抗、SHR-1210、PDR001和AMP-224。在一些情况下，抗PD-1单克隆抗体为纳武单抗、派姆单抗或PDR001。适合的抗PD1抗体描述于美国专利公布第2017/0044259号中。对于匹利珠单抗，参见例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunother.34:409-18。
在一些情况下，抗PD1抗体为派姆单抗。在一些情况下，抗PD-1抗体为纳武单抗(也称为MDX-1106或BMS-936558；参见例如，Topalian等人(2012)N.Eng.J.Med.366:2443-2454和美国专利第8,008,449号)。在一些情况下，抗CTLA-4抗体为伊匹单抗或曲美木单抗。对于曲美木单抗，参见例如Ribas等人(2013)J.Clin.Oncol.31:616-22。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂为抗PD-L1单克隆抗体。在一些情况下，抗PD-L1单克隆抗体为BMS-935559、MEDI4736、MPDL3280A(也称为RG7446)或MSB0010718C。在一些实施方案中，抗PD-L1单克隆抗体为MPDL3280A(阿特珠单抗)或MEDI4736(德瓦鲁单抗)。对于德瓦鲁单抗，参见例如WO 2011/066389。对于阿特珠单抗，参见例如美国专利第8,217,149号。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
3自身免疫和过敏反应
在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)包含一个或多个经独立选择的抑制性MOD多肽序列，其抑制表位特异性T细胞的活性(例如，抑制效应功能和/或增殖，包括颗粒依赖性和/或颗粒非依赖性反应)。
因此，本发明提供一种治疗个体的疾病或疾患(例如过敏反应或自身免疫病症)的方法，该疾病或疾患涉及对需要抑制的抗原决定簇(特异性表位)的活性T细胞反应；其中该方法包括向个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)，该T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物与特异性表位缀合且包含一个或多个经独立选择的MOD(例如，野生型和/或变体抑制性MOD)。在表位为自身抗原的决定物时，此类T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物可选择性地抑制自身反应性T细胞的活性。因此，本发明提供一种治疗个体的自身免疫疾病或病症的方法，该方法包括向个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)，其中缀合表位为自身表位(自身抗原的表位)，并且其中T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)包含一个或多个经独立选择的MOD(例如，野生型和/或变体抑制性MOD和/或变体MOD)。
T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的“有效量”也可为与施用前或不存在T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物的施用时个体的自身反应性T细胞的数目相比，在以一个或多个剂量向有需要的个体施用时降低对缀合表位(例如，自身抗原或过敏原的表位)具有特异性的T细胞的数目至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。用于治疗涉及对过敏原(例如，过敏反应)或自身抗原(例如，自身免疫反应)的特异性表位的反应的疾病或病症的“有效量”可为当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，减小个体的Th2细胞因子的产生的量。在一些情况下，用于治疗对抗原的不想要的免疫反应(例如过敏反应或自身免疫反应)的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)的“有效量”为当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，改善与不想要的免疫反应相关的一种或多种症状的量。T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)的有效量可为减小CD8+自反应性T细胞的数目的量。在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)的有效量为增加CD8+T reg的数目的量，该增加转而减小CD8+自身反应性T效应细胞和/或由活化的CD8+效应细胞释放的细胞因子或细胞毒性组分(例如穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)的数目。下文论述提供有效量的T细胞-MP以实现治疗所需的剂量和施用途径。
除施用T细胞-MP-表位缀合物以外，治疗自身免疫疾病或过敏的方法可进一步包含施用抑制炎症和/或免疫反应的一种或多种治疗剂，包括但不限于：环氧化酶抑制剂，诸如NSAID(例如，Cox-1和/或Cox-2抑制剂，诸如塞来昔布(celecoxib)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)和萘普生(naproxen))；皮质类固醇(例如，皮质酮(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化皮质酮(hydrocortisone)、伊塞米松(ethamethasoneb)、氟皮质酮(fludrocortisone)、甲泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)和曲安西龙(triamcinolone))；阻断肿瘤坏死因子α的一种或多种作用的药剂(例如，抗TNFα，诸如戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)或TNFα诱饵受体，诸如依那西普(etanercept))；IL-1竞争性结合于IL-1受体的药剂(例如阿那白滞素(anakinra))；结合于IL-6受体且抑制IL-6经由受体信号传导的药剂(例如托珠单抗(tocilizumab))。此类药剂的使用受制于以下条件：在其为抗体的情况下，T细胞-MP不包含结合抗体的aa序列(例如，野生型MOD或变体MOD)和/或结合抗原的aa序列)。
4病原体感染
在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如双链体)包含(i)病原体特异性表位(例如，病毒或细菌抗原的表位)；和(ii)一个或多个经独立选择的活化性MOD多肽序列，其活化对表位具有特异性的目标T细胞(例如，活化颗粒依赖性或颗粒非依赖性效应功能)。在目标T细胞为细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞)的情况下，此类T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物可增加对由病原体感染细胞或组织表达的表位具有特异性的CD8+效应T细胞的数目和/或活性。活化CD8+T细胞可增加CD8+T细胞的增殖和/或诱导或增强CD8+T细胞的趋化因子和/或细胞因子的释放。在一些情况下，表位特异性T细胞为对肽、磷酸肽或糖肽表位(诸如来自刺突糖蛋白、核蛋白、膜蛋白、复制酶蛋白或病毒、细菌或其他病原体的非结构蛋白的那些)具有特异性的T细胞，并且使表位特异性T细胞与T细胞-MP-表位缀合物接触增加目标T细胞对病原体感染细胞或组织的细胞毒性活性。
表位特异性T细胞可为对病毒表位具有特异性的T细胞，并且使表位特异性T细胞与缀合于病毒表位的T细胞-MP接触增加那些表位特异性T细胞的数目和/或其针对感染病毒的细胞的细胞毒性活性。
因此，本发明提供一种治疗患有病原体感染的个体的方法，该方法包括向有需要的个体施用有效量的T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)，该T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物包含：(i)病原体特异性表位(例如，病毒或细菌抗原的表位)；和(ii)一个或多个经独立选择的活化性MOD多肽序列，其活化对病原体特异性表位具有特异性的T细胞。在一些情况下，T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物(例如，双链体)的有效量为增加针对病原体特异性表位的CD8+效应细胞的数目或活性的量。
除施用T细胞-MP-表位缀合物以外，治疗感染(例如，病原体感染)的方法可进一步包含分开(例如，依序，诸如直接在T细胞-MP施用之前或之后或自T细胞-MP施用后隔数天或数周)或并行(同时或以混合形式)施用一种或多种治疗剂，诸如一种或多种抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂和/或抗蠕虫剂。
5移植排斥和移植物对抗宿主病
正在治疗移植物对抗宿主或移植排斥的患者/受试者可接受除施用T细胞-MP之外的治疗剂以抑制那些免疫反应。此类治疗剂包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松)、抗增殖剂(例如霉酚酸酯)和/或钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢素或他克莫司(tacrolimus))。治疗剂可与T细胞-MP并行(同时或以混合形式)或分开(例如，依序，诸如直接在T细胞-MP施用之前或之后或在T细胞-MP施用后隔数天或数周)施用。
6用于治疗方法的额外治疗剂
可与T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物或编码未缀合T细胞-MP的核酸一起施用的适合的治疗剂或药物实际上包括任何治疗剂。适合的治疗剂或药物包括但不限于美国食品和药物管理局批准和/或列入2020年美国药典或国家处方集的小分子治疗剂(例如，分子量小于2,000道尔顿)。在一实施方案中，那些治疗剂或药物的分子量小于1,000。适合的药物包括但不限于抗生素、化学治疗剂(抗肿瘤剂)、抗真菌剂或抗蠕虫剂等(例如，柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、来氟米特；胺甲蝶呤、抗疟药、D-青霉胺、环孢素)。适合的化学治疗剂可为烷化剂、细胞骨架干扰物(紫杉烷类)、埃坡霉素、组织蛋白去乙酰化酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前驱物类似物、肽类抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素或放线菌素)，基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱。适合的药物还包括非甾体抗炎药和糖皮质激素等。
在一实施方案中，可与T细胞-MP-表位缀合物或其高级复合物一起施用的适合的治疗剂包含抗TGF-β抗体，诸如针对TGF-β1的美替木单抗(CAT192)和/或针对TGF-β1和TGF-β2或TGF-β阱的非苏木单抗(例如，
Figure BDA0004113828220002501
caplacizumab-yhdp)。一般而言，此类抗体不与包含结合抗体的序列，诸如TGF-β1或TGF-β2MOD的T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物组合施用。
在一实施方案中，可与T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物一起施用的适合的治疗剂包含针对以下的一种或多种抗体：B淋巴细胞抗原(例如，针对CD20的替伊莫单抗、奥托珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、针对CD30的本妥昔单抗和针对CD52的阿仑单抗)；EGFR(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗和耐昔妥珠单抗(necitumumab))；VEGF(例如，贝伐单抗)；VEGFR2(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab))；HER2(例如，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和阿多-曲妥珠单抗)；PD-1(例如，靶向检查点抑制的纳武单抗和派姆单抗)；RANKL(例如，地诺单抗)；CTLA-4(例如，靶向检查点抑制的伊匹单抗)；IL-6(例如，西妥昔单抗)；二唾液酸神经节苷脂(GD2)，(例如，地妥昔单抗)二唾液酸神经节苷脂(GD2)；CD38(例如，达雷木单抗)；SLAMF7(埃罗妥珠单抗)；EpCAM和CD3两者(例如，卡妥索单抗)；或CD19和CD3两者(博纳吐单抗)。一般而言，此类抗体不与包含结合任一所施用抗体的序列的T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物(例如，双链体T细胞-MP)组合施用。
可与T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物一起施用，尤其用于治疗癌症或肿瘤的适合的治疗剂可包含一种或多种化学治疗剂。此类化学治疗剂可选自：烷化剂、细胞骨架干扰物(例如紫杉烷类)、埃坡霉素、组织蛋白去乙酰化酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前驱物类似物、肽类抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素或放线菌素)，基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱和其衍生物。在一实施方案中，化学治疗剂选自放线菌素全反式维甲酸、氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、氯芥苯丁酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、脱氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟脲嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、甲氮芥、巯嘌呤、胺甲蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、柔比星、维莫非尼、长春花碱、长春新碱和长春地辛。
当正施用以治疗细菌、真菌和/或蠕虫感染时，可与T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物一起施用的适合的治疗剂可包含抗生素、抗真菌剂和/或抗蠕虫剂。
当正施用以治疗自身免疫性疾病或病症时，可与T细胞-MP或高级T细胞-MP复合物一起施用的适合的治疗剂包括但不限于：NSAID、皮质类固醇(例如，泼尼松)，抗增殖剂(例如，霉酚酸酯)和/或钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢素或他克莫司)。
VII.适合治疗的受试者
适合例如通过将MOD选择性地递送至T细胞或通过调节其T细胞活性而治疗的受试者包括患有癌症、传染病(例如，包括具有病毒、细菌和/或支原体病原体的那些传染病)、移植物对抗宿主病、移植排斥、过敏反应和/或自身免疫性疾病的受试者。
患有癌症的适合治疗的个体包括但不限于已提供其他癌症治疗但对治疗没有反应的受试者。可用本发明的方法治疗的癌症和肿瘤包括但不限于展示本文所述的任一癌症表位(参见例如第I章中所述的表位)，包括但不限于AFP、WT-1、HPV和HBV表位的那些癌症和肿瘤，以及本文描述的治疗方法中列举的那些癌症和肿瘤(参见例如第VI章)。
患有过敏的适合治疗的个体包括但不限于已提供其他过敏治疗但对治疗没有反应的受试者。可用本发明的方法治疗的过敏病状包括但不限于由暴露于坚果(例如，树和/或花生)、花粉和昆虫毒液(如蜜蜂和/或黄蜂毒液抗原)所引起的那些过敏。
患有自身免疫疾病的适合治疗的受试者包括但不限于已提供其他自身免疫疾病治疗但对治疗没有反应的个体。可用本发明的方法治疗的自身免疫疾病包括但不限于艾迪森氏病(Addison's disease)、斑秃、关节粘连性脊椎炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性相关不孕症、自身免疫性血小板减少性紫癜症、大疱性类天疱疮、乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn's disease)、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、肾小球性肾炎(例如，新月形肾小球性肾炎、增殖性肾小球性肾炎)、格雷氏病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、混合性结缔组织疾病、多发性硬化症、重症肌无力(MG)、天疱疮(例如，寻常性天疱疮)、恶性贫血、多发性肌炎、干癣、干癣性关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、休格伦氏症候群(
Figure BDA0004113828220002521
syndrome)、全身性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、血管炎和白斑病。
适合治疗的受试者包括可能暴露于感染因子(例如，病原体，诸如病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫)的受试者、疑似暴露的受试者和有活动性感染的受试者。此类受试者包括但不限于已提供其他传染病治疗但对治疗没有反应的个体。可用本发明的方法治疗的传染病包括但不限于具有本文所述的感染因子(例如，病毒，诸如HPV、HBV等)(参见例如，第I章中的感染因子)的那些传染病。
适合治疗的受试者包括已接受移植且以移植物对抗宿主病或移植排斥形式对植入组织具有免疫反应或处于该免疫反应风险下的个体。此类受试者包括但不限于已提供其他治疗但对治疗没有反应的个体。出于抑制对移植组织的免疫反应的目的，受试者可正接受与T细胞-MP的施用同时进行的其他治疗，包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松)、抗增殖剂(例如，霉酚酸酯)和/或钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，环孢素或他克莫司)。
VIII.剂量和施用途径
A.剂量
T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)的适合剂量可由主治医师或其他合格的医疗人员基于各种临床因素判定。正如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)、患者的性别、时间、施用途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。本领域技术人员也将理解，剂量含量可随所施用的特定T细胞-MP、症状的严重程度和受试者对副作用的易感性变化而变化。本领域技术人员可通过多种手段容易地判定给定化合物的优选剂量。
T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可以如下量施用：1纳克/公斤(ng/kg)体重至100毫克/公斤体重(mg/kg body weight)/剂量，例如0.01微克至100毫克/公斤体重、0.1微克至10毫克/公斤体重、1微克至50毫克/公斤体重、10微克至20毫克/公斤体重、100微克至15毫克/公斤体重、500微克至10毫克/公斤体重(例如，0.1至0.5毫克/公斤体重、0.5至1.0毫克/公斤体重、1.0至5.0毫克/公斤体重、5.0至10.0毫克/公斤体重、1.0至3.0毫克/公斤体重、2.0至4.0毫克/公斤体重、3.0至5.0毫克/公斤体重、4.0至6.0毫克/公斤体重、5.0至7.0毫克/公斤体重、6.0至8.0毫克/公斤体重、7.0至9.0毫克/公斤体重和8.0至10.0毫克/公斤体重)或0.5毫克/公斤体重至5毫克/公斤体重；然而，设想低于或高于所述例示性范围的剂量，尤其考虑上述因素。若方案为连续输注，则可以用上述剂量，或剂量可以在例如1微克至10毫克/公斤体重/分钟范围内。T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)也可以如下量进行施用：约0.1毫克/公斤体重至50毫克/公斤体重，例如约0.1毫克/公斤体重至约5毫克/公斤体重、约5毫克/公斤体重至约10毫克/公斤体重、约10毫克/公斤体重至约20毫克/公斤体重、约20毫克/公斤体重至约30毫克/公斤体重、约30毫克/公斤体重至约40毫克/公斤体重或约40毫克/公斤体重至约50毫克/公斤体重。本领域技术人员可基于所测量的停留时间和体液或组织中所施用药剂的浓度来容易地估计给药的重复率。
在成功治疗后，可能需要让患者经历维持治疗以防止疾病状态复发，其中以维持剂量施用T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)，该维持剂量例如介于0.01微克至100毫克/公斤体重、0.1微克至100毫克/公斤体重、1微克至50毫克/公斤体重、10微克至20毫克/公斤体重、100微克至15毫克/公斤体重或500微克至10毫克/公斤体重(例如，0.1至0.5毫克/公斤、0.5至1.0毫克/公斤、1.0至3.0毫克/公斤、2.0至4.0毫克/公斤、3.0至5.0毫克/公斤、4.0至6.0毫克/公斤、5.0至7.0毫克/公斤、6.0至8.0毫克/公斤、7.0至9.0毫克/公斤和8.0至10.0毫克/公斤)。
T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)的施用频率可视多种因素中的任一种而变化，例如症状的严重程度等。举例而言，在一些实施方案中，每两个月一次、每月一次、每月两次、每两周一次、每月三次、每三周一次、每两周一次(qow)、每周一次、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)施用T细胞-MP。
本发明的T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)的施用持续时间(例如，以一个或多个剂量施用T细胞-MP的时间段)可视各种因素中的任一种而变化，包括患者反应等。举例而言，可在介于如下的时间段内施用本发明的T细胞-MP-表位缀合物：约一天至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约八个月至约1年、约1年至约2年或约2年至4年或更长。
B.施用途径
可使用适合于递送的任何可用方法或途径，包括体内和离体方法以及全身和局部施用途径，将T细胞-MP(例如，本发明的未缀合T细胞-MP或T细胞-MP-表位缀合物)或编码所有或部分的未缀合T细胞-MP的核酸施用至个体。
可使用适合递送习知药物的任何可用方法和途径，包括全身或局部途径，将本发明的T细胞-MP施用至宿主。一般而言，考虑用于本发明的方法中的施用途径包括但不一定限于肠内、肠胃外和吸入途径。一些可接受的施用途径包括瘤内、瘤周、肌肉内、淋巴管内、气管内、颅内、皮下、皮内、局部、静脉内、动脉内、直肠、经鼻、经口和其他肠内和肠胃外施用途径。视需要，施用途径可组合或视所施用T细胞-MP和/或所需效果而进行调整。T细胞-MP可以单剂量或多剂量进行施用。
T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可经静脉内施用。在一些实施方案中，T细胞-MP是经肌肉内施用。T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可经淋巴管内施用。T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可经局部施用(例如，肺部施用，诸如呈雾化或其他气溶胶化形式)。T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可经颅内施用。T细胞-MP(例如，T细胞-MP-表位缀合物)可经皮下施用。
除吸入施用以外的肠胃外施用途径包括但不限于局部、经皮、皮下、肌肉内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、瘤内、淋巴管内、瘤周和静脉内途径，即，除经由消化道以外的任何施用途径。可进行肠胃外施用以实现T细胞-MP的全身或局部递送。在需要全身递送的情况下，施用通常涉及侵入性或全身吸收局部或经粘膜施用药物制剂。
IX.某些方面
虽然已参考本发明的特定实施方案描述本发明，但本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的真实精神和范畴的情况下，可进行各种改变且可进行等效替换。另外，可进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、工艺和/或一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范畴。所有此类修改均意图在所附权利要求书的范畴内。
1.一种未缀合T细胞调节多肽(T细胞-MP)，该多肽包含(例如，自N端至C端)：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2接头多肽序列，其将一个或多个MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；
(v)I类MHC-H多肽序列；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中未缀合T细胞-MP包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)或(ix)的MOD)；并且
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的一个或多个化学缀合位点。
2.如方面1的未缀合T细胞-MP，该多肽自N端至C端包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合)；
(ii)任选的L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)任选的L3接头多肽序列(例如，长度为10至50个aa)；
(v)I类MHC-H多肽序列；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列(例如，免疫球蛋白Fc序列)；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合)；
其中未缀合T细胞-MP包含至少一个MOD多肽序列(例如，元件(i)或(ix)的MOD)；并且
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的一个或多个化学缀合位点。
方面1和2的用于表位缀合的化学缀合位点允许将表位呈递分子(例如，肽表位)共价连接至T细胞-MP，使得其可由MHC-H多肽结合且将其呈递至TCR。应理解，方面1和2的未缀合T细胞-MP不包含肽表位(共价连接至T细胞-MP多肽或与其融合)，其可定位于MHC-H/β2M多肽序列的结合槽中且将其呈递至TCR。
3.如方面1或方面2的未缀合T细胞-MP，其中：
MHC-H多肽序列包含选自以下的人I类MHC-H链多肽序列：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G MHC-H多肽序列，所述多肽序列与图3A至图3H中的任一者所提供的MHC-H多肽的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
4.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H序列不包括将T细胞-MP锚定在细胞膜中的MHC-H跨膜结构域或其一部分。
5.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-A等位基因的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
6.如方面1至5中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与图3E所提供的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401多肽序列的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
7.如方面1至6中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3303或HLA-A*3401多肽序列(例如，如图3E所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
8.如方面1至4中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-B等位基因的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
9.如方面1至4或8中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、B27(亚型HLA-B*2701-2759)、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301多肽序列(例如，如图3F所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
10.如方面1至4或8中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H序列与HLA-B*0702的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
11.如方面1至4中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-C等位基因的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
12.如方面1至4或11中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H序列与HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502多肽序列(例如，如图3G所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
13.如方面1至4或11中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-C*0701的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
14.如方面1至4中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-E的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
15.如方面1至4或14中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-E*0101、HLA-E*01:03、HLA-E*01:04、HLA-E*01:05、HLA-E*01:06、HLA-E*01:07、HLA-E*01:09或HLA-E*01:10多肽序列(例如，如图3H所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
16.如方面1至4或14中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与以下HLA-E等位基因共有序列的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性：
Figure BDA0004113828220002601
其中X1＝K或E，X2＝R或G，X3＝R或G，X4＝A或V，X5＝Q或P，和X6＝P或S。(SEQ IDNO:58)
17.如方面1至4中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-F等位基因的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
18.如方面1至4或17中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-F*0101(HLA-F*01:01:01:01)、HLA-F*01:02、HLA-F*01:03(HLA-F*01:03:01:01)、HLA-F*01:04、HLA-F*01:05或HLA-F*01:06多肽序列(例如，如图3H中所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
19.如方面1至4或17中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与以下HLA-F等位基因共有序列的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性：
Figure BDA0004113828220002611
其中X1＝Y或F；X2＝P或Q；X3＝S或P；和X4＝P或L。(SEQ ID NO:59)
20.如方面1至4中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-G等位基因的α1、α2和α3结构域的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
21.如方面1至4或20中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与HLA-G*01:04(HLA-G*01:04:01:01)、HLA-G*01:06、HLA-G*01:07、HLA-G*01:08、HLA-G*01:09、HLA-G*01:10、HLA-G*01:11、HLA-G*01:12、HLA-G*01:14、HLA-G*01:15、HLA-G*01:16、HLA-G*01:17、HLA-G*01:18、HLA-G*01:19、HLA-G*01:20或HLA-G*01:22多肽序列(例如，如图3H所提供)的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性。
22.如方面1至4或20中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列与以下HLA-G等位基因共有序列的至少200个(例如，至少225、至少250、至少260或至少275个)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、至少95％或98％)或100％序列同一性：
Figure BDA0004113828220002621
其中X1＝S或F，X2＝Y或H，X3＝T、S或M，X4＝L或V；X5＝Q或R，X6＝P或L，X7＝G或D，X8＝G或V，X9＝S或C，X10＝L或I，X11＝Y或H，X12＝H或R，X13＝Y或H，X14＝M或T，X15＝P或A，X16＝R、W或Q，X17＝T或M，X18＝K或E。(SEQ ID NO:60)
23.如方面1至22中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列包含选自由以下组成的组的至少一个突变(例如，两个或三个突变)：位置84处的丙氨酸(例如，在HLA-F的情况下为Y84A或R84A)、位置84处的半胱氨酸(例如，在HLA-F的情况下为Y84C或R84C)、位置139处的半胱氨酸(例如，在HLA-F的情况下为A139C或V139C)和位置236处的半胱氨酸(例如，A236C)。关于那些aa位置的定位，参见图3I。
24.如方面1至23中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列包含选自由以下组成的组的突变的组合：Y84A和A139C；Y84A和A236C；Y84C和A139C；Y84C和A236C；和Y84C、A139C和A236C。
25.如方面1至23中任一项的未缀合T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列包含：位置84处的半胱氨酸(例如，在HLA-F的情况下为Y84C或R84C)，位置139处的半胱氨酸(例如，在HLA-F的情况下为A139C或V139C)和任选地位置236处的半胱氨酸(例如，A236C)。关于那些aa位置的定位，参见图3I。
26.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中β2M序列与成熟人β2M多肽(例如，图4所提供的NCBI登录号NP_004039.1的aa 21至119)的至少50个(例如，60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少90％(例如，至少95％或98％)或100％序列同一性。
27.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中β2M序列在成熟人β2M多肽(例如，图4所提供的NCBI登录号NP_004039.1的aa 21至119)的至少70个(例如，至少80、90、96、97或98个或所有)连续aa的aa区段内具有至多6个(例如，1、2、3、4或5个)aa取代。
28.如方面1至27中任一项的未缀合T细胞-MP，其中该未缀合T细胞-MP包含至少一个接头序列，该接头序列包含以下、实质上由以下组成或由以下组成：i)Gly和/或Ser；ii)Ala和Ser；iii)Gly、Ala和Ser；iv)Gly、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)；v)Ala、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)；或vi)Gly、Ala、Ser和Cys(例如，单一Cys残基)。
29.如方面1至27中任一项的未缀合T细胞-MP，其中该未缀合T细胞-MP包含至少一个接头(例如接头L1至L6中的任一种)，该至少一个接头包含选自以下的一个或多个序列：polyG(例如，包含1至10个Gly残基的聚甘氨酸)、GA、AG、AS、SA、GS、GSGGS(SEQ ID NO:130)、GGGS(SEQ ID NO:131)、GGSG(SEQ ID NO:132)、GGSGG(SEQ ID NO:133)、GSGSG(SEQ ID NO:134)、GSGGG(SEQ ID NO:135)、GGGSG(SEQ ID NO:136)、GSSSG(SEQ ID NO:137)、GGGGS(SEQID NO:139)或AAAGG(SEQ ID NO:532)，其中的任一种可重复2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
30.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中该未缀合T细胞-MP包含至少一个接头，该至少一个接头包含可重复1至10次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)的G4S或AAAGG序列。
31.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其中该支架多肽序列独立地选自非种间序列或种间序列。
32.如方面31的未缀合T细胞-MP，其中种间和非种间序列选自由以下组成的组：免疫球蛋白重链恒定区(Ig Fc，例如CH2-CH3)；胶原凝集素多肽、卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域；Fos多肽；Jun多肽；Ig CH1；Ig CLκ；Ig CLλ；不具有二硫键的杵臼结构(KiH)；具有稳定二硫键的杵臼结构(KiHs-s)；HA-TF；ZW-1；7.8.60；DD-KK；EW-RVT；EW-RVTs-s；和A107序列。
33.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP，其经复合以形成包含如方面1至32中任一项的至少第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP的双链体T细胞-MP或高级T细胞-MP，其中：
(i)第一未缀合T细胞-MP包含第一β2M多肽序列、第一I类MHC-H多肽序列和第一支架多肽；并且
(ii)第二未缀合T细胞-MP包含第二β2M多肽序列、第二I类MHC-H多肽序列和第二支架多肽；并且
其中第一和第二未缀合T细胞-MP通过第一支架多肽与第二支架多肽之间的结合相互作用而缔合，所述支架多肽任选地包括一个或多个链间共价键(例如，一个或两个二硫键)。参见例如，图8和图9中的双链体。
34.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中支架包含非免疫球蛋白多肽序列。
35.如方面34的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非免疫球蛋白多肽序列为非种间多肽序列(例如，非种间卷曲螺旋或亮氨酸拉链序列)。
36.如方面34的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非免疫球蛋白多肽序列为种间多肽序列(例如，种间卷曲螺旋或亮氨酸拉链序列；与Jun蛋白序列配对的Fos多肽；或与Fos蛋白序列配对的Jun多肽)。
37.如方面1至33中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中支架包含免疫球蛋白多肽序列。
38.如方面37的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中免疫球蛋白多肽序列包含相对于其中免疫球蛋白多肽序列未经取代的T细胞-MP降低与Ig Fc受体和/或C1q蛋白结合的一个或多个取代。
39.如方面37或38的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中支架包含非种间免疫球蛋白多肽序列。
40.如方面39的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非种间免疫球蛋白多肽序列包含人IgA Fc、IgD Fc或IgE Fc(例如，包含与图2A至图2C所描绘的Ig Fc区的aa序列的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。
41.如方面39的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非种间免疫球蛋白多肽序列包含人IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4Fc(例如，包含与图2D至图2G所描绘的Ig Fc区的aa序列的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。举例而言，非种间免疫球蛋白多肽序列可包含与图2D至图2G所描绘的Ig Fc区的至少150或200个连续aa具有至少约90％或至少约95％aa序列同一性的人IgG1Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc aa序列。
42.如方面39或41中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非种间免疫球蛋白多肽序列包含人IgG1 Fc(例如，包含与图2D所描绘的野生型(wt.)Ig Fc序列的aa序列的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)或所有aa具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)或100％aa序列同一性的aa序列。举例而言，非种间免疫球蛋白多肽序列可包含人IgG1 Fc(例如，包含与图2D所描绘的野生型(wt.)Ig Fc序列(SEQ ID NO:4)的至少150或至少200个连续aa具有至少约90％或至少约95％aa序列同一性的aa序列。
43.如方面42的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中非种间免疫球蛋白多肽包含L234、L235、G236、G237、P238、S239、D270、N297、K322、P329和/或P331(分别为图2D中的野生型IgG1aa序列的aa L14、L15、G16、G17、P18、S19、D50、N77、K102、P109和P111)处的至少一个取代或相对于不含取代的相同序列降低与Fcλ受体和/或C1q蛋白的结合的另一取代(例如，对应取代)。
44.如方面42的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含：(i)N297的取代(例如，N297A)；(ii)aa 234至239中的任一种的取代；(iii)L234处的取代；(iv)L235处的取代；(v)L234和L235处的取代(例如，L234A和L235A或“LALA”取代)；(vi)P331的取代；或(vii)D270、K322和/或P329的取代；L234和/或L235处的取代和P331处的取代(例如，L234F、L235E和P331S取代)。
45.如方面39的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中支架序列包含IgM重链恒定区。
46.如方面1至33中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中支架包含种间免疫球蛋白多肽序列。
47.如方面46的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白序列选自由以下组成的组：免疫球蛋白重链恒定区(Ig Fc CH2-CH3)；Ig CH1；Ig CLκ；Ig CLλ；不具有二硫键的杵臼结构(KiH)、具有稳定二硫键的杵臼结构(KiHs-s)、HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s和A107序列。
48.如方面46的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白序列包含KIH或KIHs-s多肽序列。
49.如方面46的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白包含EW-RVT或EW-RVTs-s多肽序列。
50.如方面46的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白序列包含HA-TF、ZW-1、7.8.60、DD-KK或A107多肽序列。
51.如方面46至50中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含相对于不具有取代的相同序列降低与Fcλ受体和/或C1q蛋白结合的一个或多个取代(例如，IgG1 aa L234和/或L235或K322处的取代)。
52.如方面46至50中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含相对于不具有取代的相同序列限制补体活化的一个或多个取代(例如，降低与补体C1q蛋白结合，诸如通过IgG D270、N297、K322、P329和/或P331处的取代)。
53.如方面46至52中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白多肽序列包含人IgG1 Fc，其包含与图2D中的野生型Ig Gg1 Fc序列的至少125个连续aa(例如，至少150、至少175、至少200或至少210个连续aa)具有至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％或95％)aa序列同一性的aa序列。
54.如方面53的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中种间免疫球蛋白多肽序列包含一个或多个Ig Fc区，该一个或多个Ig Fc区包含在L234、L235、G236、G237、P238、S239、D270、N297、K322、P329和/或P331(分别为图2D中的野生型IgG1 aa序列的aa L14、L15、G16、G17、P18、S19、D50、N77、K102、P109和P111)处的至少一个取代或相对于不含取代的相同序列降低与Fcλ受体和/或C1q蛋白的结合的另一取代(例如，对应取代)。
55.如方面53的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含：(i)N297的取代(例如，N297A)；(ii)aa234至239中的任一种的取代；(iii)L234处的取代；(iv)L235处的取代；(v)L234和L235处的取代(例如，L234A和L235A或“LALA”取代)；(vi)P331的取代；或(vii)D270、K322和/或P329的取代；L234和/或L235处的取代和P331处的取代(例如，L234F、L235E和P331S取代)。
56.如方面1至55中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含独立地选自由以下组成的组的至少一个(例如，至少两个或至少三个)野生型MOD或变体MOD多肽序列：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD80、(B7-1)、CD83、CD86(B7-2)、HVEM(CD270)、ILT3(类免疫球蛋白转录体3)、ILT4(类免疫球蛋白转录体4)、Fas配体(FasL)、ICAM(细胞间粘附分子)、ICOS-L(诱导型共刺激配体)、JAG1(CD339)、淋巴毒素β受体、3/TR6、OX40L(CD252)、PD-L1、PD-L2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、4-1BBL和抗CD28多肽序列。
57.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含独立地选自由以下组成的组的至少一个(例如，至少两个或至少三个)野生型MOD或变体MOD多肽序列：4-1BBL、抗CD28、PD-L1、IL-2、CD80、CD86、OX40L(CD252)、Fas配体(FasL)、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD83、HVEM(CD270)、JAG1(CD339)、CD70、CD80、CD86、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3多肽序列。
58.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含独立地选自由以下组成的组的至少一个(例如，至少两个或至少三个)野生型MOD或变体MOD多肽序列：4-1BBL、PD-L1、IL-2、CD80、CD86、FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列和抗CD28。举例而言，未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP可包含至少一个野生型MOD和/或变体IL-2MOD多肽序列和至少一个野生型CD80、野生型CD86、变体CD80或变体CD86多肽序列。
59.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含至少一个野生型IL-2或变体IL-2MOD(例如，包含H16A或T取代和F42A取代)多肽序列，或至少一对串连的野生型IL-2MOD或变体IL-2MOD多肽序列。
60.如方面59的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含以下中的至少一种：(i)野生型或变体CD80或CD86 MOD多肽序列；(ii)野生型或变体PD-L1 MOD多肽序列；和/或(iii)野生型或变体FasL MOD多肽序列。
61.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含MHC-H多肽序列的取代至α1螺旋的羧基末端部分中的半胱氨酸与α2-1螺旋的氨基末端部分中的半胱氨酸之间的链内二硫键。
62.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其包含MHC-H多肽序列的取代至位置84处的α1螺旋的羧基末端部分中的半胱氨酸与位置139处的α2-1螺旋的氨基末端部分中的半胱氨酸之间的链内二硫键；
其中位置84的氨基和羧基端的五残基团簇(分别表示为aac 1和aac 2)和位置139的氨基和羧基端的五残基团簇(分别表示为aac 3和aac 4)可各自经1至5个经独立选择的天然存在的aa取代，并且位置236的氨基和羧基端的五残基团簇(分别表示为aac 5和aac6)可各自经1至5个经独立选择的天然存在的aa取代。
63.如方面62的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中aac 1至aac 6可各自经1至5个经独立选择的除脯氨酸之外的天然存在的aa取代。
64.如方面62的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中MHC-H多肽序列的α1螺旋的羧基末端部分包含第一序列CYNQSE且α2-1螺旋的氨基末端部分包含第二序列D(M/T)CAQ，并且其中在第一和第二序列中的半胱氨酸之间形成链内二硫键。参见图3I的aac1至aac 4。
65.如方面33至64中任一项的双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP不通过二硫键连接。
66.如方面33至64中任一项的双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP通过至少一个(例如，两个)二硫键共价连接。
67.如方面66的双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP通过第一T细胞-MP和第二T细胞-MP的支架多肽序列之间的至少一个(例如，两个)二硫键共价连接。
68.如方面33至66中任一项的双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，两种)的序列不包含Ig CH1结构域多肽序列。
69.如方面33至35和37至45中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP相同，并且未缀合的双链体T细胞-MP为同二聚体。参见例如，图6结构A和B。
70.如方面69的未缀合T细胞-MP，其包含独立地选自由以下组成的组的至少一个(例如，至少两个或至少三个)野生型MOD或变体MOD多肽序列：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD80、(B7-1)、CD83、CD86(B7-2)、HVEM(CD270)、ILT3(类免疫球蛋白转录体3)、ILT4(类免疫球蛋白转录体4)、Fas配体(FasL)、ICAM(细胞内粘附分子)、ICOS-L(诱导型共刺激配体)、JAG1(CD339)、淋巴毒素β受体、3/TR6、OX40L(CD252)、PD-L1、PD-L2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、4-1BBL多肽序列和抗CD28。
71.如方面69的未缀合双链体T-细胞MP，其包含独立地选自由以下组成的组的至少一个(例如，至少两个或至少三个)野生型MOD或变体MOD多肽序列：4-1BBL、PD-L1、IL-2、CD80、CD86、FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列和抗CD28。举例而言，未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP可包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列，和至少一个CD80、CD86、变体CD80或变体CD86多肽序列。
72.如方面69的未缀合双链体T细胞-MP，其包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD(例如，包含H16A或T取代和F42A取代)多肽序列，或至少一对串连的IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列。
73.如方面69的未缀合双链体T细胞-MP，其进一步包含至少一个：(i)CD80和/或CD86野生型MOD或变体MOD多肽序列；(ii)至少一个PD-L1野生型MOD或变体MOD多肽序列；和/或(iii)至少一个FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列。
74.如方面33至34、36至38和46至68的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP的支架多肽为一对种间多肽序列，并且未缀合双链体T细胞-MP为异二聚体。
75.如方面74的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含独立地选自由以下组成的组的至少一个野生型MOD或变体MOD多肽序列：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD80(B7-1)、CD83、CD86(B7-2)、HVEM(CD270)、ILT3(类免疫球蛋白转录体3)、ILT4(类免疫球蛋白转录体4)、Fas配体(FasL)、ICAM(细胞内粘附分子)、ICOS-L(诱导型共刺激分子)、JAG1(CD339)、淋巴毒素β受体、3/TR6、OX40L(CD252)、PD-L1、PD-L2、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、抗CD28和4-1BBL多肽序列。
76.如方面74的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含独立地选自由以下组成的组的至少一个野生型MOD或变体MOD多肽序列：4-1BBL、抗-CD28、PD-L1、IL-2、CD80、CD86和FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列。举例而言，未缀合T细胞-MP可包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列，和至少一个抗CD28、CD80、CD86、变体CD80或变体CD86多肽序列。
77.如方面74的未缀合双链体T-细胞MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列，或至少一对串连的IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列。
78.如方面74的未缀合双链体T-细胞MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含至少一个：(i)CD80和/或CD86野生型MOD或变体MOD多肽序列；(ii)至少一个PD-L1野生型MOD或变体MOD多肽序列；和/或(iii)至少一个FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列。
79.如方面74的未缀合双链体T-细胞MP，其中第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含至少一个CD80和/或CD86野生型MOD或变体MOD多肽序列。
80.如方面74的未缀合双链体T-细胞MP，其中第一T细胞-MP和第二T细胞-MP中的至少一种(例如，至少两种)包含至少一个PD-L1野生型MOD或变体MOD多肽序列。
81.如方面74至80中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中：(i)第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP不包含相同MOD；(ii)第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP不包含相同数目的MOD；或(iii)将MOD置放于第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP的不同位置中。
82.如方面1至64中任一项的T细胞-MP，其经复合以形成三个异二聚体的三链体T细胞-MP、四个异二聚体的四链体T细胞-MP、五个异二聚体的五链体T细胞-MP或六个二聚体的六链体T细胞-MP。
83.如方面1至82中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中各化学缀合位点共同或独立地选自：a)氨基酸化学缀合位点；b)非天然氨基酸和/或硒代半胱氨酸；c)充当酶促修饰序列的肽序列(例如，硫酸酯酶模体)；d)碳水化合物或寡糖部分；和/或e)IgG核苷酸结合位点。
84.如方面1至83中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含酶促修饰序列。
85.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含硫酸酯酶模体。
86.如方面85的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中硫酸酯酶模体包含序列X1Z1X2Z2X3Z3，其中：
Z1为半胱氨酸或丝氨酸；Z2为脯氨酸或丙氨酸残基；Z3为碱性氨基酸(精氨酸、赖胺酸或组氨酸，通常为赖胺酸)或脂族氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或脯氨酸，通常为A、G、L、V或I)；
X1存在或不存在，并且当存在时可为任何氨基酸，但通常为脂族氨基酸、含硫氨基酸或极性不带电氨基酸(以及，除芳族氨基酸或带电氨基酸以外的)，通常为L、M、V、S或T，更通常为L、M、S或V，其前提条件为当硫酸酯酶模体位于目标多肽的N端处时，X1存在；并且
X2和X3可独立地为任何氨基酸，但通常为脂族氨基酸、极性不带电氨基酸或含硫氨基酸(即，除芳族氨基酸或带电氨基酸以外的)，通常为S、T、A、V、G或C，更通常为S、T、A、V或G。
87.如方面86的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个Z1残基已转化为fGly氨基酸残基。
88.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中：
化学缀合位点中的至少一种(例如，或更多种、两种)包含位于至少一个(例如两个)T细胞-MP多肽的C端的分选酶A酶位点(例如，包含氨基酸序列LP(X5)TG、LP(X5)TA或LPETGG)；或
化学缀合位点中的至少一种为分选酶A酶位点，其包含位于第一或第二T细胞-MP多肽中的至少一种或两种的氨基末端处的寡聚甘氨酸(例如，(G)2、3、4或5)或寡聚丙氨酸(例如，(A)2、3、4或5)。
89.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含转谷氨酰胺酶位点(例如，选自由以下组成的组：LQG、LLQGG、LLQG、LSLSQG和LLQLQG)。
90.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含硒代半胱氨酸，或含有一个或多个经独立选择的非天然氨基酸的氨基酸序列。
91.如方面90的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个非天然氨基酸中的至少一种(例如，两种或更多种)选自由以下组成的组：对乙酰基苯丙氨酸、对叠氮基苯丙氨酸和丙炔基酪氨酸。
92.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含碳水化合物、单糖、二糖和/或寡糖。
93.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含一个或多个IgG核苷酸结合位点。
94.如方面1至84中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含氨基酸缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造其序列而提供于T细胞-MP中的半胱氨酸)。
95.如方面94的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含提供于T-细胞MP多肽序列中(例如，通过蛋白质工程改造其多肽序列而提供于T细胞-MP中)的赖胺酸的ε氨基。
96.如方面94的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个(例如，两个或更多个)化学缀合位点包含提供于T-细胞MP多肽序列中(例如，通过蛋白质工程改造其多肽序列而提供于T细胞-MP中)的硒代半胱氨酸的硒醇基团和/或半胱氨酸的巯基。
97.如方面94的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个化学缀合位点包含提供于T-细胞MP多肽序列或双链体T细胞-MP的第一T细胞-MP和第二T细胞-MP中的各者的多肽序列中(例如，通过多肽序列的蛋白质工程改造提供于T细胞-MP中)的半胱氨酸的巯基。
98.如方面1至97中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中存在于未缀合T细胞-MP或双链体未缀合T细胞-MP中的各化学缀合位点(例如，用于缀合表位)经选择为相同的(例如，两者均为通过蛋白质工程改造多肽序列而提供于T细胞-MP多肽序列中的半胱氨酸的巯基)。
99.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于T细胞-MP的N端或C端，或若存在，连接至位于T细胞-MP的N端或C端处的接头或位于该接头内。
100.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中化学缀合位点位于T细胞-MP的接头(例如，L1至L6接头)中。
101.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于MHC-H多肽序列、β2M多肽序列或接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列(L3接头)中。
102.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列(L3接头)中。
103.如方面102的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点为存在于接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列中的半胱氨酸的巯基。
104.如方面103的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列进一步包含含甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸和丝氨酸、或丙氨酸甘氨酸和丝氨酸的多肽序列。
105.如方面103的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列包含多肽序列GGGS或GGGGS。
106.如方面103的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列包含选自由以下组成的组的多肽序列：GCGGS(G4S)(SEQ ID NO:141)，其中G4S单元可重复1至10次(例如，重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)；GCGASGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:142)；GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:143)；和GCGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:144)。
107.如方面101至106中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列(L3接头)包含15至50个氨基酸。
108.如方面101至106中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中接合MHC-H和β2M多肽序列的接头序列(L3接头)包含10至50个氨基酸。
109.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于T细胞-MP MHC-H多肽序列中，该多肽序列与图3A至图3I所展示的MHC-H序列的至少150、175、200或225个连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
110.如方面109的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点包含半胱氨酸或硒代半胱氨酸。
111.如方面110的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个半胱氨酸或硒代半胱氨酸化学缀合位点位于具有如图3D至图3I中的编号的MHC-H多肽的位置2、5、7、59、84、116、139、167、168、170或171处。
112.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于β2M多肽序列中，该β2M多肽序列与图4所展示的成熟β2M多肽序列(例如，图4所展示的自aa 21开始且在其C端结束的序列)的至少50个(例如，至少60、70、80、90、96、97或98个或所有)连续aa具有至少85％(例如，至少90％、95％、98％或99％或甚至100％)aa序列同一性。
113.如方面112的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中一个或多个化学缀合位点位于图4的成熟人β2M多肽序列的aa 35至55(例如，40至50)之间且具有0至15个aa取代。
114.如方面112的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一个半胱氨酸或硒代半胱氨酸化学缀合位点位于成熟β2M多肽的位置2、44、50、77、85、88、91或98(如图4所展示的β2M序列的aa 22、64、70、97、105、108、111或118)处。
115.如方面1至98中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中化学缀合位点(例如，用于缀合表位)位于β2M多肽序列中，与图4所阐述的成熟β2M多肽(自aa 21开始且在其C端结束)相比，该β2M多肽序列具有1至15个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)aa缺失、插入和/或变化。
116.如方面112至115中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中化学缀合位点为半胱氨酸。
117.如方面112至115中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中β2M多肽序列为图4的成熟人β2M序列。
118.如方面33至117中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中至少第一T细胞-MP多肽序列和任选地第一和第二T细胞-MP多肽序列自N端至C端包含：
(i)一个或多个MOD多肽序列，其任选地通过L1接头连接；
(ii)L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其包含10至50个(例如，10至20、10至25、15至25、20至30、25至35、25至50、30至35、35至45或40至50个)氨基酸；
(v)I类MHC-H多肽序列，其包含在位置84和139处经取代的半胱氨酸(参见图3E至图3H，例如Y84C和A139C取代)且形成二硫键；
(vi)L4接头多肽序列；
(vii)种间或非种间免疫球蛋白Fc支架序列；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列(例如，两个或更多个诸如串连，任选地通过L6接头接合的MOD多肽序列)；
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于直接或间接(例如，经由接头)共价连接表位(例如，肽、磷酸肽、糖肽、脂肽或碳水化合物表位)的化学缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造添加)；并且
其中第一和第二T细胞-MP经由其Ig Fc支架序列之间的至少一个二硫键而共价连接。
119.如方面33至117中任一项的未缀合双链T细胞-MP，其中至少第一T细胞-MP多肽序列和任选地第一和第二T细胞-MP多肽序列包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列，其任选地通过L1接头接合；
(ii)任选的L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其包含10至50个氨基酸；
(v)I类MHC-H多肽序列，其包含在位置84和139处经取代的半胱氨酸(参见图3E至图3H，例如Y84C和A139C取代)且形成二硫键；
(vi)L4接头多肽序列；
(vii)种间或非种间免疫球蛋白Fc支架序列；
(viii)L5接头多肽序列；和
(ix)一个或多个MOD多肽序列，其通过L6接头多肽接合；
其中β2M多肽序列、L3接头多肽序列或MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于直接或间接(例如，经由接头)共价连接表位(例如，肽、磷酸肽、糖肽、脂肽或碳水化合物表位)的化学缀合位点(例如，通过蛋白质工程改造添加)；并且
其中第一和第二T细胞-MP经由其Ig Fc支架序列之间的至少一个二硫键而共价连接。
120.如方面118或119的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一和第二T细胞-MP多肽的化学缀合位点位于L3接头内。
121.如方面120的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一和第二T细胞-MP多肽的化学缀合位点为存在于L3接头中的半胱氨酸的巯基，其包含，基本上(主要)由或另外由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成。
122.如方面118或119的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一和第二T细胞-MP多肽的化学缀合位点位于β2M多肽序列内(例如，图4所提供的成熟β2M多肽中的E44C取代)。
123.如方面122的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一和第二T细胞-MP多肽的化学缀合位点为提供于β2M多肽序列处的半胱氨酸的巯基。
124.如方面123的未缀合双链体T-细胞MP，其中第一和第二T细胞-MP多肽的化学缀合位点为提供于图4所提供的成熟β2M多肽序列的位置44处的β2M多肽处的半胱氨酸的巯基。
125.如方面118至124中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中一个或多个MOD多肽序列包含至少一个(例如，两个或更多个)野生型IL-2或变体IL-2序列(例如，包含H16A或T取代和F42A取代)。
126.如方面118至125中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中一个或多个MOD多肽序列包含至少一个野生型或变体CD80或CD86序列。
127.如方面118至126中任一项的未缀合双链T细胞-MP，其中一个或多个MOD多肽序列包含至少一个野生型或变体PD-L1序列。
128.如方面118至127中任一项的未缀合双链T细胞-MP，其中一个或多个MOD多肽序列包含至少一个野生型或变体4-1BBL或PD-L1序列。
129.如方面118至128中任一项的未缀合双链体T细胞-MP，其中：
(i)免疫球蛋白Fc支架为非种间支架多肽且双链体为包含相同的第一和第二T细胞-MP多肽的同二聚体；或
(ii)第一和第二支架多肽为免疫球蛋白Fc支架多肽的种间对(例如，KIH或KIH-ss对)，并且双链体为异二聚体。
130.如方面129的未缀合双链体T细胞-MP，其中第一和第二支架多肽为免疫球蛋白Fc支架多肽的种间对，并且第一T细胞-MP多肽序列包含不存在于第二T细胞-MP多肽序列中的至少一个MOD多肽序列。
131.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含共价连接至T细胞-MP的额外肽和/或有效负载。
132.如方面131的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中额外肽为表位标签或亲和性结构域。
133.如方面131的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中额外肽为靶向序列。
134.如方面133的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列为抗体或其抗原结合片段、或单链T细胞受体。
135.如方面132至133中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列针对感染因子的蛋白或非蛋白表位。
136.如方面135的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中感染因子为病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。
137.如方面132至133中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列针对自身抗原或过敏原。
138.如方面132至133中任一项的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列针对癌症相关抗原(“CAA”)。
139.如方面138的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中癌症相关抗原选自第I.A.7.b.i.(a)章“癌症相关抗原“CAA”中所述的那些。
140.如方面138的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列选自由以下组成的组：抗CD51、抗CD74、抗CD22、抗CD20、抗CD20、抗CD22、抗CD38、抗PD-1受体、抗CTLA-4、抗TROP-2、抗粘蛋白、抗CEA、抗CEACAM6、抗结肠特异性抗原-p、抗-α-甲胎蛋白、抗IGF-1R、抗CD19、抗PSMA、抗PSMA二聚体、抗碳酸酐酶IX、抗HLA-DR、抗CD52、抗EpCAM、抗VEGF、抗EGFR、抗CD33、抗HER2、抗CD79b、抗BCMA和抗间皮素抗体，或其抗原结合片段。
141.如方面138的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中CAA为由HLA呈递为肽/HLA复合物的肽。参见第I.A.7.b.i.(b)章“肽/HLA复合物。”
142.如方面138的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中靶向序列选自抗HER2、抗CD19、抗间皮素、抗TROP2、抗BCMA、抗MUC-1、抗MUC16或抗密连蛋白抗体，或其抗原结合片段。参见第I.A.7.b.ii(a)至(h)章。
143.如任一前述方面的T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其进一步包含共价连接至T细胞-MP的有效负载。
144.如方面143的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中有效负载为治疗剂、化学治疗剂、诊断剂或标记。
145.如任一前述方面的未缀合T细胞-MP或双链体T细胞-MP，其中至少一种T细胞-MP在β2M多肽序列、L3多肽序列和/或MHC-H多肽序列中的化学缀合位点处缀合于非肽或肽表位，以形成T细胞-MP-表位缀合物或高级T细胞-MP-表位缀合物复合物，诸如双链体T细胞-MP-表位缀合物。
146.如方面145的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为癌症表位、感染因子表位、自身表位(自身抗原)或过敏原表位。
147.如方面145至146中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为肽、糖肽、磷酸肽或脂肽，其包含约4个aa(aas/aa)至约25个aa(例如，表位的长度可为4个aa至约10个aa、约6个aa至约12个aa、约10个aa至约15个aa、约15个aa至约20个aa或约20个aa至约25个aa)。
148.如方面147的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中肽表位为约6个aa至约12个aa。
149.如方面145至148中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为癌症表位。
150.如方面149的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中癌症表位阐述于第I.A.8.d.i章“存在于癌症-癌症相关抗原(“CAA”)中的表位”中。
151.如方面150的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中癌症表位为阐述于第I.A.8.d.i(a)章“甲胎蛋白(AFP)”中的甲胎蛋白(AFP)。
152.如方面150的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中癌症表位为阐述于第I.A.8.d.i(b)章“威尔姆氏瘤抗原(WT-1)”中的威尔姆氏瘤抗原(WT-1)蛋白的表位。
153.如方面150的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中癌症表位为阐述于第I.A.8.d.i(c)章“人乳突状瘤病毒I(HPV)”中的人乳突状瘤病毒I(HPV)表位。
154.如方面150的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中癌症表位为阐述于第I.A.8.d.i(d)章“B型肝炎病毒(HBV)”中的B型肝炎病毒(HBV)表位。
155.如方面145至148中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为自身表位。
156.如方面145至148中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为过敏原(例如，过敏蛋白质)的表位。
157.如方面156的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中过敏原选自以下的蛋白或非蛋白组分：坚果(例如，树和/或花生)、麸质、花粉、蛋(例如，鸡、家鸡)、贝类、大豆、鱼和昆虫毒液(例如蜜蜂和/或黄蜂毒液抗原)。
158.如方面145至148中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中表位为由感染因子呈递的表位。
159.如方面158的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中感染因子为病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。
160.如方面145至159中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中感染因子为病毒且表位为由病毒传染病原(例如，阐述于第I.A.8.d.ii章“感染因子”中的病毒)呈递的表位。
161.一种治疗或预防疾病(例如，癌症或感染)或病状(例如，过敏)的方法，其包括：
(i)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的一个或多个如方面1至144中任一项的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP；
(ii)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的一个或多个如方面145至160中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物；
(iii)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的编码如方面1至144中任一项的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP的一个或多个核酸；
(iv)使细胞或组织与一个或多个如方面1至144中任一项的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP体外、体内或离体接触且向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用细胞、组织或其后代；
(v)使细胞或组织与一个或多个如方面145至160中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物体外、体内或离体接触且向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用细胞、组织或其后代；
或
(vi)使细胞或组织与编码如方面1至133中任一项的T细胞-MP或双链体T细胞-MP的一个或多个核酸体外、体内或离体接触且向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用细胞、组织或其后代。
162.一种治疗或预防疾病(例如，癌症或感染)或病状(例如，过敏)的方法，其包括
(i)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的一个或多个如方面145至160中任一项的T细胞-MP缀合物或双链体T细胞-MP缀合物；或
(ii)使细胞或组织与一个或多个如方面145至160中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物体外、体内或离体接触且向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用细胞、组织或其后代。
163.如方面162的方法，其中一个或多个T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物包含缀合于表位(例如，肽、脂肽、磷酸肽、碳水化合物或糖肽表位)的如方面118至130中任一项的未缀合T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物，以形成T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物。
164.如方面161至163中任一项的方法，其中T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物进一步包含至少一个靶向序列(例如，对细胞或组织具有特异性的靶向序列)。
165.如方面131至164中任一项的方法，其中对哺乳动物患者或受试者进行施用。
166.如方面165的方法，其中患者或受试者为人。
167.如方面165的方法，其中患者或受试者为非人(例如，啮齿动物、兔类动物、牛、犬、猫、啮齿动物、鼠、山羊、猿猴、绵羊、马、兔、猪等)。
168.如方面161至167中任一项的方法，其中疾病或疾患为癌症，并且其中当存在靶向序列时，其为CTP(例如，抗HER2、抗CD19、抗间皮素、抗TROP2、抗BCMA、抗MUC-1、抗MUC16)。
169.如方面161至168中任一项的方法，其中表位为癌症表位。
170.如方面161至167中任一项的方法，其中疾病或疾患为感染。
171.如方面161至167中任一项的方法，其中疾病为病毒感染。
172.如方面161至167中任一项的方法，其中疾病为细菌、真菌或原生动物感染。
173.如方面161至172中任一项的方法，其进一步包括施用增强CD 8+T细胞功能(例如，效应功能)和/或治疗疾病或疾患的一种或多种治疗剂。
174.如方面173的方法，其中增强CD 8+功能和/或治疗疾病或疾患的治疗剂包含抗TGF-β抗体，诸如针对TGF-β1的美替木单抗(CAT192)和针对TGF-β1和TGF-β2或TGF-β阱的非苏木单抗(任选地受限于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含缀合抗体或TGF-β阱的aa序列，诸如TGF-β1或TGF-β2野生型MOD或变体MOD aa序列)。
175.如方面173至174中任一项的方法，其中增强CD 8+功能和/或治疗疾病或疾患的治疗剂包含针对以下的一种或多种抗体：B淋巴细胞抗原(例如，针对CD20的替伊莫单抗、奥托珠单抗、奥法木单抗、利妥昔单抗、针对CD30的本妥昔单抗和针对CD52的阿仑单抗)；EGFR(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗和耐昔妥珠单抗(necitumumab))；VEGF(例如，贝伐单抗)；VEGFR2(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab))；HER2(例如，帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和阿多-曲妥珠单抗)；PD-1(例如，靶向检查点抑制的纳武单抗和派姆单抗)；RANKL(例如，地诺单抗)；CTLA-4(例如，靶向检查点抑制的伊匹单抗)；IL-6(例如，西妥昔单抗)；二唾液酸神经节苷脂(GD2)(例如，地妥昔单抗)；CD38(例如，达雷木单抗)；SLAMF7(埃罗妥珠单抗)；EpCAM和CD3两者(例如，卡妥索单抗)；或CD19和CD3两者(博纳吐单抗)(任选地受限于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含结合抗体的aa序列)。
176.如方面161至175中任一项的方法，其进一步包括施用一种或多种额外治疗剂(例如，化学治疗剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂和/或抗蠕虫剂)。
177.如方面176的方法，其中疾病为癌症且方法进一步包含施用一种或多种化学治疗剂。
178.如方面177的方法，其中一种或多种化学治疗剂选自由以下组成的组：烷化剂、细胞骨架干扰物(紫杉烷类)、埃坡霉素、组织蛋白去乙酰化酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物或前驱物类似物、肽类抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素或放线菌素)，基于铂的药剂、类视色素或长春花生物碱和其衍生物。
179.如方面176的方法，其中一种或多种化学治疗剂选自由以下组成的组：放线菌素全反式维甲酸、氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、氯芥苯丁酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、道诺霉素、多西他赛、脱氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟脲嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、甲氮芥、巯嘌呤、胺甲蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、柔比星、维莫非尼、长春花碱、长春新碱和长春地辛。
180.如方面161至167中任一项的方法，其进一步包括施用抑制CD 8+T细胞功能(例如，抑制效应功能)、抑制免疫反应和/或治疗疾病或疾患的一种或多种治疗剂。
181.如方面180的方法，其中疾病或疾患为自身免疫性疾病且表位为自身抗原(自身表位)。
182.如方面180的方法，其中疾病或疾患为过敏且表位为过敏原。
183.如方面180至182中任一项的方法，其进一步包括施用NSAID(例如，Cox-1和/或Cox-2抑制剂，诸如塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬和萘普生)。
184.方面180至183中任一项的方法，其进一步包括施用皮质类固醇(例如，皮质酮、地塞米松、氢皮质酮、伊塞米松、氟皮质酮、甲泼尼松龙、泼尼松、泼尼松龙和曲安西龙)。
185.如方面180至184中任一项的方法，其进一步包括施用阻断肿瘤坏死因子α的一种或多种作用的药剂(例如，抗TNFα，诸如戈利木单抗、英夫利昔单抗、赛妥珠单抗、阿达木单抗或TNFα诱饵受体，诸如依那西普)(任选地受制于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含肿瘤坏死因子α野生型MOD或变体MOD和/或结合阻断TNFα的一种或多种作用的药剂的aa序列)。
186.如方面180至185中任一项的方法，其进一步包括施用与IL-1(例如阿那白滞素)竞争性结合于IL-1受体的一种或多种药剂(任选地受制于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含IL-1野生型MOD或变体MOD和/或结合药剂的aa序列)。
187.如方面180至186中任一项的方法，其进一步包括施用结合于IL-6受体且抑制IL-6经由受体信号传导的一种或多种药剂(例如，托珠单抗)，(任选地受制于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含IL-6野生型MOD或变体MOD和/或结合药剂的aa序列)。
188.如方面180至187中任一项的方法，其进一步包括施用结合于CD80和/或CD86受体且抑制T细胞增殖和/或B细胞免疫反应的一种或多种药剂(例如，阿巴西普(abatacept))(任选地受限于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含CD80和/或CD86野生型MOD或变体MOD和/或结合药剂的aa序列)。
189.如方面180至188中任一项的方法，其进一步包括施用结合于CD20，从而引起B细胞死亡的一种或多种药剂(例如，利妥昔单抗)(受限于以下条件：T细胞-MP或双链体T细胞-MP不包含CD20野生型MOD或变体MOD和/或结合药剂的aa序列)。
190.如方面180至189中任一项的方法，其中以包含T细胞-MP或双链体T细胞-MP和至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物形式施用T细胞-MP或双链体T细胞-MP或编码T细胞-MP或双链体T细胞-MP的核酸。
191.一种核酸序列，其编码任选地包含额外多肽的如方面1至144中任一项的未缀合T细胞-MP。
192.如方面191的核酸序列，其可操作地连接至启动子。
193.一种或多种核酸，其包含编码如方面1至144中任一项的未缀合双链体T细胞-MP的核酸序列，其中双链体分子中的至少一种任选地包含额外多肽。
194.如方面193的一种或多种核酸，其中编码未缀合双链体T细胞-MP的核酸序列可操作地连接至启动子。
195.一种产生表达T细胞-MP或双链体T细胞-MP的细胞的方法，该方法包括在体外或离体将一个或多个根据方面191至194中任一项的核酸体外或离体引入细胞中；选择产生未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP的细胞；和任选地选择包含未整合或整合至至少一个细胞染色体中的一个或多个核酸的所有或部分的细胞。
196.如方面195的方法，其中细胞为选自以下的哺乳动物细胞系的细胞：HeLa细胞、CHO细胞、293细胞(HEK-293细胞)、Vero细胞、NIH 3T3细胞、Huh-7细胞、BHK细胞、PC12、COS细胞、COS-7细胞、RAT1细胞、小鼠L细胞、人胚肾(HEK)细胞和HLHepG2细胞。
197.一种或多种细胞，其瞬时或稳定表达通过如方面195或196的方法制备的T细胞-MP或双链体T细胞-MP。
198.如方面197的细胞，其中细胞表达约20至约200(例如，20至40、40至80、80至100、100至120、120至140、140至160、160至180或180至200)毫克/升或更多的未缀合T细胞-MP。
199.如方面198的细胞，其中细胞表达约20至约200毫克/升或更多的未缀合T细胞-MP而相对于不表达T细胞-MP或双链体T细胞-MP的其他相同细胞的细胞生存率的无显著降低(小于5％、10％或15％降低)。
200.一种将一个或多个(例如，两个或更多个)野生型MOD多肽和/或变体MOD多肽选择性递送至患者或受试者的一种或多种细胞或组织的方法，该方法包括：
(i)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的一个或多个如方面1至160中任一项的T细胞-MP或双链体T细胞-MP；
其中一个或多个T细胞-MP或双链体T细胞-MP中的至少一个或多个T细胞-MP包含对一种或多种细胞或组织具有特异性的靶向序列；并且
其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含一个或多个(例如，两个或更多个)野生型MOD和/或变体MOD。
201.一种将一个或多个(例如，两个或更多个)野生型MOD多肽和/或变体MOD多肽选择性递送至患者或受试者的一种或多种T细胞或组织的方法，该方法包括：
(i)向患者/受试者(例如，有需要的患者)施用有效量的一个或多个如方面145至160中任一项的T细胞-MP-表位缀合物或双链体T细胞-MP-表位缀合物；
其中存在于一种或多种T细胞或组织中的至少一种T细胞对缀合至T细胞-MP的表位具有选择性(例如，特异性)；并且
其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含一个或多个野生型MOD或变体MOD。
202.如方面200或201的方法，其中一个或多个野生型MOD多肽和/或变体MOD多肽独立地选自由以下组成的组：4-1BBL、PD-L1、IL-2、CD80、CD86、OX40L(CD252)、Fas配体(FasL)、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD83、HVEM(CD270)、JAG1(CD339)、CD70、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3野生型MOD或变体MOD多肽序列。
203.如方面200或201的方法，其中一个或多个野生型MOD多肽和/或变体MOD多肽独立地选自：4-1BBL、PD-L1、IL-2、CD80、CD86和FasL野生型MOD和其任何变体MOD多肽序列。
204.如方面200至202中任一项的方法，其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列，和至少一个CD80、CD86、变体CD80或变体CD86多肽序列。
205.如方面200至202中任一项的方法，其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含至少一个IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列，或至少一对串连的IL-2野生型MOD或变体MOD多肽序列。
206.如方面200至202中任一项的方法，其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含至少一个CD80和/或CD86野生型MOD或变体MOD多肽序列。
207.如方面200至202中任一项的方法，其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含至少一个PD-L1野生型MOD或变体MOD多肽序列。
208.如方面200至202中任一项的方法，其中T细胞-MP或双链体T细胞-MP包含至少一个FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列。
X.实施例
实施例1
制备编码一系列构建体的核酸，所述构建体包含I类HLA-A*02:01(HLA-A02)重链多肽序列、人β2M多肽序列和IgG支架序列，作为如图12中A、B和C处的双链体所展示的分裂链或单链构建体的核心元件。
各分裂链构建体(结构A或B)具有第一多肽序列，其自N端至C端包含：具有F42A、H16A取代的串连的人IL-2多肽序列(2xhIL2)、HLA-A*02:01(A02)α1、α2和α3结构域以及具有L234A和L235A取代的人IgG1支架。出现在大部分分裂链构建体中的1694第一多肽包含A236C、Y84C和A139C取代2xhIL2(F42A、H16A)-(G4S)4-HL A-A02(A236C、Y84C、A139C)-AAAGG-IgG1(L234A、L235A)：
Figure BDA0004113828220002941
Figure BDA0004113828220002951
Figure BDA0004113828220002954
(接头序列以粗体和斜体表示)(SEQ ID NO:493)。
出现于两种分裂链构建体中的4008多肽平行于1694构建体，但在HLA-A02序列中包含A236C、Y85C和D137C取代—2xhIL2(F42A、H16A)-(G4S)4-HLA-A02(A236C、Y85C、D137C)-AAAGG-IgG1(L234A、L235A)：
Figure BDA0004113828220002952
Figure BDA0004113828220002953
Figure BDA0004113828220002961
图12中的各分裂链构建体(结构A和B)包含第二多肽，其包含具有R12C和E44C取代的β2M多肽序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGCRI EKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPK IVKWDRDM(SEQ ID NO:495)；如下文提供的表所指示，在其N端处添加所指示接头或CMV肽表位NLVPMVATV和接头。
图12所列出的未缀合T细胞-MP缀合物自N端至C端各自包含IL-2、β2M、HLA-A*02:01(A02)α1、α2和α3结构域以及人IgG1多肽序列作为单一多肽链。下文提供3861构建体的aa序列，并且单链T细胞-MP构建体的其余者可视为3861构建体的变化形式，其具有带F42A和H16A取代的串连的2xIL-2序列-(G4S)4接头-β2M(E44C)-具有Y84C、A139C的(G4S)3接头-HLA-A02-AAAGG接头-和具有L234A和L235A取代的IgG1：
Figure BDA0004113828220002962
/>
Figure BDA0004113828220002963
Figure BDA0004113828220002971
当串连IL-2序列存在于此实施例的构建体中时，其由(G4S)4接头分隔开。除3861以外的各序列在存在于如所指示的IL-2与β2M和/或β2M与HLA-A02序列(L3接头)之间的接头中具有变化形式。另外，构建体3984仅具有单一IL-2序列，并且3999至4002中的各者在HLA-A02多肽序列中具有额外aa取代，如下表所指示。
Figure BDA0004113828220002972
/>
Figure BDA0004113828220002981
/>
Figure BDA0004113828220002991
将编码蛋白质构建体的核酸转染至CHO细胞中且由CHO细胞表达为培养基中的可溶蛋白。7天后，通过BLI分析使用蛋白质A以捕获所表达蛋白来测定培养基中表达的蛋白质量(图12的D处)。通过使用磁性蛋白A珠粒自培养基中分离蛋白质来评估以未聚集双链体形式出现的蛋白质分率。洗涤后，通过降低pH自珠粒上溶析出结合的蛋白质，并且接着在
Figure BDA0004113828220002992
色谱系统上使用UV检测进行分析尺寸排阻色谱。图12的E处所报告的未聚集蛋白质的分率是基于对应于双链体的分子量的峰面积相对于所色谱蛋白质的总面积。
结果指示，未缀合单链T细胞-MP构建体似乎以比其未缀合分裂链构建体对应体更高的量更均匀地表达。
实施例2
通过在28和32℃下在CHO细胞中瞬时表达构建体3861(参见实施例1)来检查培养时间、细胞培养密度和培养温度对未缀合T细胞-MP的影响。通过使用将编码多肽的盒克隆至其中的重组pTT5载体，用
Figure BDA0004113828220003001
转染试剂盒(GibcoTM/ThermoFisher Scientific,Skokie,IL)完成转染。将经转染细胞稀释至每毫升2、4或6百万个细胞，并且在第2、4、7和/或9天测定T细胞-MP 3861表达量和呈双链体形式的未聚集蛋白的分率，如通过移除一部分培养物所指示。分析如实施例1中进行且展示于图13中(A和B处)，其中各直方图组下方显示细胞数目和培养温度(例如，32℃下的六百万个细胞表示为6M/32C)。图13也展示自培养物中采集的使用蛋白质A和在通过尺寸排阻色谱法进一步纯化后(分别为上部色谱图和下部色谱图)的未缀合3861T细胞-MP的尺寸排阻色谱图(C和D)。考马斯蓝染色的SDS PAGE分析(在E处)确认纯化材料的纯度和均匀性，将其样本以还原(R)和非还原形式(NR)施加至凝胶上。
实施例3
通过将分子与对图14A提供的Elispot资料的直方图中的CMV肽NLVPMVATV(黑条)或Melan-A和粘蛋白相关肽(MART-1)ELAGIGILTV(白条)有反应的T细胞一起孵育来评估T细胞-MP表位缀合物和对照构建体与表位特异性T细胞的特定相互作用。平行执行未缀合3861T细胞-MP双链体(一般结构参见图12的C处)第1组和包含多肽1694和2686的未缀合分裂链构建体(如图12的B处的双链体)第2组的对照样本与测试样本。通过顺丁烯二酰亚胺基团经由(G4S)3接头缀合于β2M的E44C位置的T细胞-MP和分裂链构建体展示于第3组和第4组中。具有CMV或MART-1多肽作为融合蛋白的一部分的对照构建体分裂链融合蛋白(图12结构A)的效果分别展示于第5组和第6组中。通过CMV和MART-1肽的对照刺激分别展示于第7组和第8组中。直方图指示由于捕获的干扰素γ引起的点数目，从而指示处理对T细胞的活化。
图14B中所展示的SDS-PAGE凝胶提供表位缀合物和融合蛋白的还原和非还原样本的分析，指示其纯度和同质性。
实施例4
制备来自CMV反应性供体(供体8、10、38和39)和MART-1反应性供体(供体17和18)的
Figure BDA0004113828220003011
纯化的白细胞样本且用于证实T细胞-MP-表位缀合物扩增对CMV或MART-1特异性表位具有特异性的T细胞的能力。MART-1反应性供体18也显示出对CMV肽的一定反应性。阳性和阴性对照处理包括：用缀合于CMV和MART-1肽的分裂链构建体进行的处理；用含CMV或MART-1肽的培养基进行的处理；和仅培养基对照处理。对于实验，将白细胞以2.5×106个细胞/毫升悬浮于含指定量的对照或T细胞-MP-表位缀合物或对照处理的ImmunoCultTM培养基(Stemcell Technologies,Vancouver,British Columbia)中。培养10天后，使用自MBL International Corp购买的CMV或MART-1四聚体通过流式细胞术评估对CMV或MART-1有反应的细胞数目。结果指示，缀合于CMV肽和较小程度的CMV肽的T细胞-MP和分裂链构建体两者以浓度依赖性方式刺激来自CMV反应性供体的CMV特异性T细胞的扩增。缀合于MART-1肽和较低程度的MART-1肽的T细胞-MP和分裂链构建体以浓度依赖性方式刺激来自MART-1反应性供体的MART-1特异性T细胞的扩增。在各种情况下，CMV肽缀合物选择性刺激来自CMV反应性供体而非MART-1反应性供体的T细胞，反之亦然。不存在IL-2下的游离肽无法产生与在T细胞-MP表位缀合物下观测到的效果相同的效果。结果提供于图15中。
用于分析的T细胞-MP-表位缀合物为在β2M多肽中的半胱氨酸(E44C)处经由携载顺丁烯二酰亚胺基团的(G4S)3接头(例如，对于CMV肽的NLVPMVATV-(G4S)3-赖胺酸-ε氨基-顺丁烯二酰亚胺)缀合CMV(NLVPMVATV)或MART-1(ELAGIGILTV)(SEQ ID NO:533)肽的3186多肽的双链体(未缀合双链体的一般形式参见实施例1和图12结构C)。分裂链表位缀合物为两种分裂链构建体的双链体，各构建体包含a1694和2686多肽(未缀合双链体的一般形式参见实施例1和图12结构B)，其在β2M多肽序列中的半胱氨酸(E44C)处经由携载顺丁烯二酰亚胺基团的(G4S)3接头缀合于CMV(NLVPMVATV)或MART-1(ELAGIGILTV)肽。在还原以自半胱氨酸缀合位点移除任何封端后，使用至少两次添加的携载顺丁烯二酰亚胺基团的肽，如顺丁烯二酰亚胺偶联反应中所述进行缀合。
在另一测试中，将携载(G4S)7L3接头(β2M序列与HLA-A02序列之间的接头)但与3861在其他方面相同的构建体的效果与3861多肽双链体(即，构建体4125 2xIL2(F42A、H16A)-(G4S)7-β2M(E44C)-(G4S)3-HLA-A02(Y84C、A139C)-AAAGG-IgG1(L234A、L235A))进行比较。3861和4125构建体两者的双链体通过顺丁烯二酰亚胺封端的(G4S)3接头缀合于CMV或MART-1肽，并且并排测试以表位特异性方式扩增T细胞的能力。除仅进行仅培养基对照之外，如上文针对3861表位缀合物所述进行分析。图16所展示的结果指示，延伸接头长度并不实质性改变在3861表位缀合物下所见的T细胞扩增。
实施例5
为了检查L3接头长度对T细胞-MP蛋白的细胞表达量和质量(未聚集分率)的影响，制备编码与构建体3861相关但具有增加长度的L3接头的构建体4125至4128的一系列核酸且将其插入至表达载体(pTT5)中。还制备第二组构建体(4129-4133)，其在β2M多肽中携载额外R12C取代(R12C、E44C)，并且在HLA-A02肽中携载可形成链间二硫键的A236C取代。利用
Figure BDA0004113828220003021
转染试剂盒将载体转染至CHO细胞中，并且如所指示在第4、6、8和/或11天评估培养基中表达的蛋白质量和使用磁珠纯化后未聚集蛋白质的分率。特定构建体包括下表中列举的那些。/>
Figure BDA0004113828220003031
使用实施例1中所描述的方法在BioForte仪器上使用蛋白质A进行捕获，通过BLI分析测定所表达未缀合T细胞-MP构建体的量。结果提供在图17直方图A中。
通过尺寸排阻色谱法测定在磁性蛋白A珠粒上纯化后的未聚集(以双链体形式存在)的未缀合T细胞-MP的分率。使用对应于双链体的分子量的色谱峰面积相对于如图1所描述的色谱图下方的面积来测定分率。结果展示于图17直方图B中。
额外最优化指示更高产率是可能的。在分离前在CHO细胞培养基中，已观测到构建体4125达到200mg/ml且已观测到构建体4127达到170mg/ml。

Claims (25)

1.一种未缀合T细胞调节多肽(T细胞-MP)，所述多肽包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合；
(ii)任选的L2接头多肽序列，其将所述一个或多个MOD多肽序列接合至β2M多肽序列；
(iii)所述β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其长度为10至50个aa；
(v)I类MHC-H多肽序列，其中所述MHC-H多肽包含在位置84和139处的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代形成链内二硫键；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合；
其中所述未缀合T细胞-MP包含至少一个MOD多肽序列作为元件(i)或(ix)的部分；并且
其中所述β2M多肽序列、所述L3接头多肽序列和/或所述MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点。
2.如权利要求1所述的未缀合T细胞-MP，所述多肽自N端至C端包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合；
(ii)任选的L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其长度为10至50个aa；
(v)I类MHC-H多肽序列，其中所述MHC-H多肽包含在位置84和139处的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代形成链内二硫键；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个诸如串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合；
其中所述未缀合T细胞-MP包含至少一个MOD多肽序列作为元件(i)或(ix)的部分；并且
其中所述β2M多肽序列、所述L3接头多肽序列和/或所述MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点。
3.如权利要求1所述的未缀合T细胞-MP，所述多肽自N端至C端包含：
(i)一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合；
(ii)任选的L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其长度为10至50个aa；
(v)I类MHC-H多肽序列，其中所述MHC-H多肽包含在位置84和139处的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代形成链内二硫键；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合；
其中所述β2M多肽序列、所述L3接头多肽序列和/或所述MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点。
4.如权利要求1所述的未缀合T细胞-MP，所述多肽自N端至C端包含：
(i)任选的一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L1接头彼此接合；
(ii)任选的L2接头多肽序列；
(iii)β2M多肽序列；
(iv)L3接头多肽序列，其长度为10至50个aa；
(v)I类MHC-H多肽序列，其中所述MHC-H多肽包含在位置84和139处的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代形成链内二硫键；
(vi)任选的L4接头多肽序列；
(vii)支架多肽序列；
(viii)任选的L5接头多肽序列；和
(ix)一个或多个MOD多肽序列或两个或更多个串连的MOD多肽序列，其中当存在两个或更多个MOD多肽序列时，其任选地通过独立选择的L6接头彼此接合；
其中所述β2M多肽序列、所述L3接头多肽序列和/或所述MHC-H多肽序列中的至少一种包含用于表位缀合的化学缀合位点。
5.如任一前述权利要求所述的未缀合T细胞-MP，其中所述β2M多肽序列、所述L3接头多肽序列或所述MHC-H多肽序列包含用于表位缀合的化学缀合位点。
6.如权利要求5所述的未缀合T细胞-MP，其中所述β2M多肽序列与图4中提供的成熟人β2M多肽NP_004039.1SEQ ID NO:61的至少70个或至少90个连续aa具有至少90％或至少95％序列同一性。
7.如权利要求6所述的未缀合T细胞-MP，其中所述MHC-H多肽序列包含选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-GMHC-H多肽序列的人I类MHC-H链多肽序列，其与图3A至图3H中的任一个中提供的MHC-H多肽的至少200个连续aa具有至少85％序列同一性。
8.如权利要求7所述的未缀合T细胞-MP，其中所述MHC-H多肽序列包含在位置84与位置139之间的二硫键。
9.如权利要求8所述的未缀合T细胞-MP，其中所述MHC-H多肽序列包含与以下的至少200个连续aa具有至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列：HLA-A*0101(SEQ ID NO:24)、HLA-A*0201(SEQ ID NO:27)、HLA-A*0301(SEQ ID NO:35)、HLA-A*1101(SEQ ID NO:32)、HLA-A*2301(SEQ ID NO:36)、HLA-A*2402(SEQ IDNO:33)、HLA-A*2407(SEQ ID NO:37)、HLA-A*3303(SEQ IDNO:34)、HLA-A*3401(SEQ ID NO:38)、HLA-E(SEQ ID NO:58)、HLA-F(SEQ ID NO:59)或HLA-G(SEQ ID NO:60)。
10.如权利要求9所述的未缀合T细胞-MP，其包含至少一个、至少两个或至少三个野生型MOD或变体MOD多肽序列，其中各MOD独立地选自由抗CD28、4-1BBL、PD-L1、IL-2、CD80、CD86和FasL野生型MOD或变体MOD多肽序列组成的组。
11.如权利要求10所述的未缀合T细胞-MP，其包含至少一个野生型或变体IL-2MOD多肽序列，或至少一对串联的野生型或变体IL-2MOD多肽序列。
12.如权利要求10所述的未缀合T细胞-MP，其中所述未缀合T细胞-MP包含单一变体IL-2MOD或一对串连的变体IL-2MOD多肽序列，并且其中所述变体IL-2MOD多肽序列包含F42A和H16A或T取代。
13.如权利要求10所述的未缀合T细胞-MP，其中所述支架多肽序列为选自由以下组成的组的种间或非种间多肽序列：免疫球蛋白重链恒定区；胶原凝集素多肽、卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域；Fos多肽；Jun多肽；Ig CH1多肽；Ig CLκ多肽；Ig CLλ多肽；不具有二硫键的杵臼结构(KiH)多肽；具有稳定二硫键的杵臼结构(KiHs-s)多肽；HA-TF多肽；ZW-1多肽；7.8.60多肽；DD-KK多肽；EW-RVT多肽；EW-RVTs-s多肽；和A107多肽序列。
14.如权利要求13所述的未缀合T细胞-MP，其复合形成双链体或高级T细胞-MP，其包含：
至少如权利要求13所述的第一未缀合T细胞-MP和第二未缀合T细胞-MP，其中
(i)所述第一未缀合T细胞-MP包含第一β2M多肽序列、第一I类MHC-H多肽序列和第一支架多肽序列；并且
(ii)所述第二未缀合T细胞-MP包含第一β2M多肽序列、第二I类MHC-H多肽序列和第二支架多肽序列；并且
其中所述第一未缀合T细胞-MP和所述第二未缀合T细胞-MP通过任选地包括其间的一个或多个链间共价键的所述第一支架多肽序列与所述第二支架多肽序列之间的结合相互作用而缔合；并且
其中所述双链体或高级T细胞-MP是同聚的或异聚的。
15.如权利要求14所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其进一步包含降低与Fcλ受体和/或C1q蛋白的结合的一个或多个取代。
16.如权利要求14所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其中各化学缀合位点共同地或独立地选自：a)氨基酸化学缀合位点；b)非天然氨基酸和/或硒代半胱氨酸；c)用作酶修饰序列的肽序列；d)碳水化合物或寡糖部分；和/或e)IgG核苷酸结合位点。
17.如权利要求16所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其中用于表位缀合的各化学缀合位点为通过蛋白质工程改造引入的半胱氨酸。
18.如权利要求17所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其中通过蛋白质工程改造引入的所述半胱氨酸位于所述β2M多肽序列内。
19.如权利要求18所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其中所述β2M多肽序列内通过蛋白质工程改造引入的所述半胱氨酸位于所述β2M多肽的位置44处。
20.如权利要求19所述的未缀合T细胞-MP或未缀合双链体T细胞-MP，其进一步包含一个或多个靶向序列。
21.如权利要求14所述的未缀合双链体T细胞-MP，其缀合于所述β2M多肽序列、所述L3多肽序列和/或所述MHC-H多肽序列中的所述化学缀合位点处的非肽或肽表位，以形成双链体T细胞-MP-表位缀合物；其中所述双链体T细胞-MP-表位缀合物任选地包含靶向序列。
22.如权利要求21所述的T细胞-MP-表位缀合物，其中所述表位直接或经由键间接地缀合于所述β2M多肽序列中的半胱氨酸，所述键形成于所述半胱氨酸与连接至所述表位的顺丁烯二酰亚胺基团之间。
23.如权利要求22所述的双链体T细胞-MP-表位缀合物，其中所述表位为癌症表位(由癌细胞呈递的表位)、感染因子表位(感染因子的抗原的表位)、自身表位(自身抗原的表位)或过敏原表位(过敏原的表位)。
24.一种治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求22所述的T细胞-MP-表位缀合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述表位为癌症表位并且所述受试者罹患癌症。
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