CN116430564A - 一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，包括：进入半波片的损耗光束；损耗光进行波前调制系统，设置于半波片的光路之后，用于形成三维的中空型损耗光束；进入第一分光镜的激发光束，第一分光镜设置于损耗光进行波前调制系统的光路之后；探测器，用于检测样品中心区域发出的荧光；第二分光镜，设置于第一分光镜的光路之后；第三反射镜，设置于第二分光镜的光路之后；四分之一波片，设置于第三反射镜的光路之后；物镜，设置于四分之一波片的光路之后。本发明通过简单的单物镜架构实现高分辨率光学显微镜，解决了三维STED超分辨率显微镜结构复杂、成本高的问题，实现超分辨率成像，并最终提高光学显微镜的分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及超分辨率显微镜技术领域，尤其涉及一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜。
背景技术
光学显微镜是材料和生命科学领域最古老的技术，它利用可见光和透镜的组合来获得非常小的物体的放大图像。在光学显微镜中，由于光的波动性质，物镜不能将所有的光集中在样品上的一个点上，这是由于衍射公式给出的光的衍射极限限制了分辨率。而超分辨率成像正是超越了这一衍射极限成像的技术。STED超分辨率显微镜利用涡旋光束抑制自发辐射荧光克服衍射极限，在医学成像和材料表征方面具有重要应用。尤其是在医学方面，超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具，具有突破光学衍射极限的分辨能力，从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段，对生命科学相关领域具有重大意义[Nature 440,935(2006)]。
在显微领域里，典型的超衍射极限成像技术主要分为三大类：结构光照明显微成像技术(SIM)、单分子定位显微成像技术(SMLM)以及受激发射损耗显微成像技术(STED)。STED成像在这些超分辨率模式中是独一无二的，它是一种基于共焦或双光子成像的光束扫描显微镜技术，在厚样品光学切片检测中具有显著的的优势[Neurobiology of Disease156,105420(2021)]。
STED基本原理是采用两束激光同时照射样品，其中一束激光用来激发荧光分子(fluorescence)，使物镜焦点艾里斑范围内的荧光分子处于激发态，称为激发光(excitation)。另一束光为损耗光(STED光束)，可以使物镜焦点艾里斑边沿区域处于激发态的荧光分子通过受激辐射损耗过程返回基态而不自发辐射荧光，因此只有中心区域的荧光分子可自发荧光辐射，从而获得超衍射极限的荧光发光点。简单来说，激发光的作用是将荧光分子激活，而损耗光的作用是将荧光猝灭。成像系统对点光源的响应使用点扩散函数描述，如果能够使光学系统的点扩散函数尽可能的接近或成为一个理想的点，则可以使光学系统突破衍射极限。这种方法通过物理手段减小点扩散函数，使用特殊的荧光材料，是一种直接成像方法，无需后期处理过程，成像结果稳定可靠。STED显微镜通过选择性地使荧光分子失活，使成像系统的有效点扩散函数(PSF)面积最小化，从而产生超分辨率图像。
目前STED超分辨率显微镜通常为二维结构，相关的研究也主要集中在二维成像的STED超分辨率显微镜上。而物质本身是三维结构，因此实现三维STED超分辨率显微镜是非常重要的。受衍射极限的影响和三维光学成像的要求，超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率更难以提高，实现数十纳米分辨率的三维超分辨率成像更加困难。在二维STED超分辨率显微镜中，通常使用涡旋光作为STED光束。涡旋光具有甜甜圈形状的分布，可以较好地满足仪器对中心荧光不耗散而对周围荧光耗散的需求。但涡旋光束仅能沿横向(x，y)方向提供分辨率增强，而在纵向(Z)方向无法提供有效的荧光抑制。对于三维超分辨率成像，受激光子的焦点分布需要被设计成一个空心的“零”强度点，在所有方向上被高强度区域包围。目前实现三维STED超分辨率成像的方式有基于单光纤光镊的STED超分辨显微成像[基于单光纤光镊的STED超分辨显微成像装置，邓洪昌，CN111653380A]和基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法[基于并行STED和超临界角成像的三维超分辨显微成像方法和装置，匡翠方，CN111781173A]，但以上两种方式包含多束光纤或显微镜，结构复杂，光路校准困难，且价格昂贵。
因此市场上亟需一种高分辨率、低成本、结构简单的三维STED超分辨率显微镜。
发明内容
为了克服上述技术的不足，本发明的目的是提供一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜。
本发明所采用的技术方案是：一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，包括：
进入半波片的损耗光束，半波片用于调节损耗光束不同方向的偏振；
损耗光进行波前调制系统，设置于半波片的光路之后，用于形成三维的中空型损耗光束；
进入第一分光镜的激发光束，激发光束用于激发待测样品的荧光，第一分光镜设置于损耗光进行波前调制系统的光路之后，第一分光镜用于使三维的中空型损耗光束与激发光束合束；
探测器，用于检测样品中心区域发出的荧光；
第二分光镜，设置于第一分光镜的光路之后；
第三反射镜，设置于第二分光镜的光路之后；
四分之一波片，设置于第三反射镜的光路之后；
物镜，设置于四分之一波片的光路之后。
优选的，所述损耗光进行波前调制系统包括第一偏振分光棱镜、0～2π涡旋相位板、第一反射镜、第二反射镜、0/π环形相位板和第二偏振分光棱镜，第一偏振分光棱镜设置于半波片的光路之后，0～2π涡旋相位板和第二反射镜分别设置于第一偏振分光棱镜的光路之后，第一反射镜设置于0～2π涡旋相位板的光路之后，0/π环形相位板设置于第二反射镜的光路之后，第二偏振分光棱镜设置于第一反射镜和0/π环形相位板的光路之后。
优选的，所述损耗光进行波前调制系统包括四分之一波片Ⅰ、空间光调制器、第一反射镜Ⅰ、第二反射镜Ⅱ和聚焦镜，第一反射镜Ⅰ设置于半波片的光路之后，空间光调制器322设置于第一反射镜Ⅰ的光路之后，四分之一波片Ⅰ设置于空间光调制器第一次射出的光路之后且与该光路呈垂直设置，聚焦镜设置于四分之一波片Ⅰ的光路之后，第二反射镜Ⅱ设置于聚焦镜的光路之后，第一分光镜设置于空间光调制器第二次射出的光路之后。
进一步，所述四分之一波片Ⅰ与聚焦镜呈平行设置，
进一步，所述聚焦镜与第二反射镜Ⅱ呈平行设置。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明根据STED的成像原理，通过让损耗光束在样品焦平面处聚焦成一个三维中空暗斑，只有暗斑中心所在位置可以发出荧光，其他位置的荧光都被损耗，从而提升三维显微成像系统的空间分辨率，实现样品的三维超分辨率成像，本发明通过简单的单物镜架构实现高分辨率光学显微镜，解决了三维STED超分辨率显微镜结构复杂、成本高的问题，实现超分辨率成像，并最终提高光学显微镜的分辨率。
附图说明
图1是本发明的实施例1的结构示意图；
图2是本发明实施例1中光经过0～2π涡旋相位板后得到相位分布示意图；
图3是本发明实施例1中光经过0/π环形相位板后得到相位分布示意图；
图4是本发明的实施例2的结构示意图；
图5是本发明实施例2中1st光束的相位分布示意图；
图6是本发明实施例2中2nd光束的相位分布示意图；
图7是图4中①、②、③各位置对应的偏振分布示意图；
图8是本发明实施例2中的PSF结果的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
实施例1
如图1所示，一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，包括：
进入半波片2的损耗光束1，半波片2用于调节损耗光束1不同方向的偏振；
损耗光进行波前调制系统3，设置于半波片2的光路之后，用于形成三维的中空型损耗光束；
进入第一分光镜6的激发光束4，激发光束4用于激发待测样品11的荧光，第一分光镜6设置于损耗光进行波前调制系统3的光路之后，第一分光镜6用于使三维的中空型损耗光束与激发光束4合束；
探测器5，用于检测样品11发出的荧光；
第二分光镜7，设置于第一分光镜6的光路之后；
第三反射镜8，设置于第二分光镜7的光路之后；
四分之一波片9，设置于第三反射镜8的光路之后；
物镜10，设置于四分之一波片9的光路之后；
第一分光镜6用于将合束后的激光反射至第二分光镜7，第二分光镜7将合束后的激光反射至第三反射镜8，第三反射镜8将激光反射进入四分之一波片9，之后激光再进入物镜10。四分之一波片9用于形成非相干叠加，使三维的中空型损耗光束在待测样品焦平面处聚焦成一个三维中空暗斑，只有三维中空暗斑的中心所在位置可以发出荧光，其他位置的荧光都被损耗，当激发光束达到待测样品11后，激发其发出荧光。中空型损耗光束光斑抑制除中间一点外其他位置的荧光发射。中心暗斑处发出的荧光又通过第三反射镜8反射到第二分光镜7，通过第二分光镜7进入探测器5成像。
所述损耗光进行波前调制系统3包括第一偏振分光棱镜31、0～2π涡旋相位板32、第一反射镜33、第二反射镜34、0/π环形相位板35和第二偏振分光棱镜36，第一偏振分光棱镜31设置于半波片2的光路之后，0～2π涡旋相位板32和第二反射镜34分别设置于第一偏振分光棱镜31的光路之后，第一反射镜33设置于0～2π涡旋相位板32的光路之后，0/π环形相位板35设置于第二反射镜34的光路之后，第二偏振分光棱镜36设置于第一反射镜33和0/π环形相位板35的光路之后。
通过半波片2调节后不同偏振方向的光束分束进入第一偏振分光棱镜31后形成水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz，水平偏振光STEDxy经过0～2π涡旋相位板32形成涡旋光，即得到二维平面的“甜甜圈”状光束分布，光经过0～2π涡旋相位板32后得到如图2所示的相位分布，涡旋光再经第一反射镜33进入第二偏振分光棱镜36；垂直偏振光STEDz首先经过第二反射镜34，再通过0/π环形相位板35进入第二偏振分光棱镜36，第二偏振分光棱镜36使水平偏振光STEDxy与垂直偏振光STEDz合束，光通过0/π环形相位板35后得到如图3所示的相位分布。为了保证水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz的非相干性并形成高质量的三维暗斑，水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz脉冲在时间上有一定的延迟，即水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz的相位不同步。
实施例2
如图4所示，一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，包括：
进入半波片2的损耗光束1，半波片2使损耗光束1产生不同方向的偏振；
损耗光进行波前调制系统3，设置于半波片2的光路之后，用于形成三维的中空型损耗光束；
进入第一分光镜6的激发光束4，激发光束4用于激发待测样品11的荧光，第一分光镜6设置于损耗光进行波前调制系统3的光路之后，第一分光镜6用于使三维的中空型损耗光束与激发光束4合束；
探测器5，用于检测样品11发出的荧光；
第二分光镜7，设置于第一分光镜6的光路之后；
第三反射镜8，设置于第二分光镜7的光路之后；
四分之一波片9，设置于第三反射镜8的光路之后；
物镜10，设置于四分之一波片9的光路之后；
第一分光镜6用于将合束后的激光反射至第二分光镜7，第二分光镜7将合束后的激光反射至第三反射镜8，第三反射镜8将激光反射进入四分之一波片9，之后激光再进入物镜10。四分之一波片9用于形成非相干叠加，使三维的中空型损耗光束在待测样品焦平面处聚焦成一个三维中空暗斑，只有三维中空暗斑的中心所在位置可以发出荧光，其他位置的荧光都被损耗，当激发光束达到待测样品11后，激发其发出荧光。中空型损耗光束光斑抑制除中间一点外其他位置的荧光发射。中心暗斑处发出的荧光又通过第三反射镜8反射到第二分光镜7，通过第二分光镜7进入探测器5成像。
所述损耗光进行波前调制系统3包括四分之一波片Ⅰ311、空间光调制器322、第一反射镜Ⅰ333、第二反射镜Ⅱ344和聚焦镜355，第一反射镜Ⅰ333设置于半波片2的光路之后，空间光调制器322设置于第一反射镜Ⅰ333的光路之后，四分之一波片Ⅰ311设置于空间光调制器322第一次射出的光路之后且与该光路呈垂直设置，聚焦镜355设置于四分之一波片Ⅰ311的光路之后，第二反射镜Ⅱ344设置于聚焦镜355的光路之后，第一分光镜6设置于空间光调制器322第二次射出的光路之后。
所述四分之一波片Ⅰ311与聚焦镜355呈平行设置，所述聚焦镜355与第二反射镜Ⅱ344呈平行设置。
所述空间光调制器322与射入其中的激光呈近乎垂直设置，空间光调制器322与水平方向的夹角不大于5度，可以选择5度。
第一反射镜Ⅰ333与水平方向可以呈45度夹角设置。
四分之一波片Ⅰ311与水平方向的夹角不大于10度，可以选择10度。
通过半波片2产生的不同偏振方向的光束分束，即水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz，光束分束经过第一反射镜Ⅰ333第一次进入空间光调制器322，空间光调制器322只对水平偏振光STEDxy起作用，因此水平偏振光STEDxy进行作用后产生如图5所示的1st光束的相位分布。之后水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz又通过四分之一波片Ⅰ311，四分之一波片Ⅰ311的作用是分别为水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz引入四分之一的相移。然后损耗光束到达聚焦镜355后经过第二反射镜Ⅱ344后反射，经原路返回聚焦镜355和四分之一波片Ⅰ311，水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz再次分别引入四分之一相移。两次经过四分之一波片Ⅰ311后使水平偏振光STEDxy变成垂直偏振光，垂直偏振光STEDz变成水平偏振光。之后损耗光束再次到达空间光调制器322，此时空间光调制器322仍只对水平偏振光起作用，原来的垂直偏振光STEDz已经变成水平偏振光，因此调制为了如图6所示的2nd光束的相位分布。最后，经过损耗光进行波前调制系统3调制后形成的三维的中空型损耗光束进入第一分光镜6。
这里采用相位型的液晶空间光调制器进行波前调制，其特点是只能对一种方向的偏振光进行调制，偏振光的偏振方向与液晶取向一致时可以被调制。空间光调制器只对水平偏振光进行调制，其加载的第一个全息图是0～2π涡旋相位，相位的第二个全息图是0/π环形相位；水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz，经空间光调制器第一个全息图的调制后，只有损耗光STEDxy受到调制；两束损耗光随后依次经过1/4波片、透镜，再经反射镜原路返回经过透镜、1/4波片，此时原来的垂直偏振光STEDz已经变成水平偏振光，受到空间光调制器第二个全息图的调制，而原来的水平偏振光STEDxy已经变成垂直偏振光，不再被空间光调制器调制。图7展示了此过程中不同位置的损耗光的状态和偏振变化过程。通过调节两束损耗光的光强比，可以分别调节横向和纵向的损耗能力，最终可以得到不同形状的荧光点扩展函数(PSF)。
图8展示了三维STED显微成像技术中激发光、损耗光和荧光点扩散函数在xy和xz平面的强度分布。值得注意的是，空间光调制器的表面要和物镜后焦面光学共轭。根据点扩散函数，荧光点的半高全宽为：
其中i＝x,y,z，和di表示主衍射点在特定方向上对应的半高全宽。I是损耗光峰值处的强度，IS是特征强度，可以从物理上解释为在该点的受激发射通过竞争占据主导的过程。该值通常为损耗光将激发态粒子损耗到一半时的强度。
在样品没有优先方向的情况下，分辨率最低的维度对分辨极限的限制最大。因此，三维成像需要在所有方向上增加分辨率。当在所有维度上达到临界分辨率时，可以获取最大量的空间信息。对于近球形点，由点扩散函数的半高全宽定义，焦点位置的体积可以用来评估三维焦点的分辨率，焦点位置的体积为：
进一步，利用空间光调制器还可以很方便地对暗斑的形状及位置进行控制。例如：可以通过泽尼克系数对损耗光波前进行补偿，达到像差校正的目的；可以随时切换到二维STED模式(两个全息图都加载0～2π涡旋相位)；可以调节全息图的大小以及环形相位的直径以匹配不同的物镜；可以通过加载光栅相位实现和激发光的自动对准。
上述实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (5)
1.一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，其特征在于，包括：
进入半波片(2)的损耗光束(1)，半波片(2)调节损耗光束(1)偏振光的方向；
损耗光进行波前调制系统(3)，设置于半波片(2)的光路之后，用于形成三维的中空型损耗光束；
进入第一分光镜(6)的激发光束(4)，激发光束(4)用于激发待测样品(11)的荧光，第一分光镜(6)设置于损耗光进行波前调制系统(3)的光路之后，第一分光镜(6)用于使三维的中空型损耗光束与激发光束(4)合束；
探测器(5)，用于检测样品中心区域发出的荧光；
第二分光镜(7)，设置于第一分光镜(6)的光路之后；
第三反射镜(8)，设置于第二分光镜(7)的光路之后；
四分之一波片(9)，设置于第三反射镜(8)的光路之后；
物镜(10)，设置于四分之一波片(9)的光路之后。
2.如权利要求1所述的一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，其特征在于，所述损耗光进行波前调制系统(3)包括第一偏振分光棱镜(31)、0～2π涡旋相位板(32)、第一反射镜(33)、第二反射镜(34)、0/π环形相位板(35)和第二偏振分光棱镜(36)，第一偏振分光棱镜(31)设置于半波片(2)的光路之后，0～2π涡旋相位板(32)和第二反射镜(34)分别设置于第一偏振分光棱镜(31)的光路之后，第一反射镜(33)设置于0～2π涡旋相位板(32)的光路之后，0/π环形相位板(35)设置于第二反射镜(34)的光路之后，第二偏振分光棱镜(36)设置于第一反射镜(33)和0/π环形相位板(35)的光路之后。
3.如权利要求1所述的一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，其特征在于，所述损耗光进行波前调制系统(3)包括四分之一波片Ⅰ(311)、空间光调制器(322)、第一反射镜Ⅰ(333)、第二反射镜Ⅱ(344)和聚焦镜(355)，第一反射镜Ⅰ(333)设置于半波片(2)的光路之后，空间光调制器322设置于第一反射镜Ⅰ(333)的光路之后，四分之一波片Ⅰ(311)设置于空间光调制器(322)第一次射出的光路之后且与该光路呈垂直设置，聚焦镜(355)设置于四分之一波片Ⅰ(311)的光路之后，第二反射镜Ⅱ(344)设置于聚焦镜(355)的光路之后，第一分光镜(6)设置于空间光调制器(322)第二次射出的光路之后。
4.如权利要求3所述的一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，其特征在于，所述四分之一波片Ⅰ(311)与聚焦镜(355)呈平行设置。
5.如权利要求3所述的一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜，其特征在于，所述聚焦镜(355)与第二反射镜Ⅱ(344)呈平行设置。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310392042.3A CN116430564A (zh) | 2023-04-13 | 2023-04-13 | 一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310392042.3A CN116430564A (zh) | 2023-04-13 | 2023-04-13 | 一种基于单物镜架构的三维超分辨率显微镜 |
Publications (1)
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