CN116421625A - 一种用于促进毛发再生的生物制品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于促进毛发再生的生物制品,所述生物制品的有效成分中,包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体,并提供了其制备方法和应用。本发明的的特点及优点是:本发明提供的用于促进毛发再生的生物制品及其制备方法和应用,所述生物制品中包含有从血液中提取的外泌体以及miRNA,保证了外泌体内容物含量和外泌体本身的数量,同时,由于血液中的外泌体本身就是组合体,其能够更有效的实现多种功效,且来源简单、广泛,有利于长期、重复、大量的使用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体涉及一种用于促进毛发再生的生物制品及其制备方法和应用。
技术背景
衰老,是指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象。衰老可分为两类:生理性衰老和病理性衰老。前者指成熟期后出现的生理性退化过程,后者是由于各种外来因素(包括各种疾病)所导致的老年性变化。人体衰老过程中的生理变化主要体现在机体组织细胞和构成物质的丧失,机体代谢率的减缓,机体和器官功能减退。衰老是不可避免的,但延缓衰老却是可能的。
机体的衰老主要受到遗传、环境、细胞基因等因素影响。遗传因素决定了各种动物的寿命都存在最高寿限。同时,外部环境(如空气质量、水质量等)和机体内部环境对衰老也会产生重大影响。此外,若机体大部分重要细胞都健康,那么机体的寿命也会相应加长。
现有医学和生物学研究发现,机体的衰老,是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现,是不可逆的生命过程,受各种内外因素影响。线粒体病的迟发和渐进过程提示线粒体功能随着年龄的增加而退化。在正常生理状态下,机体自身的防御系统可及时清除能量代谢过程中产生的氧自由基。而在机体衰老的进程中,抗氧化防御系统作用减弱,线粒体内自由基不能有效地清除而积累,从而导致线粒体的氧化性损伤,包括生物膜损伤、mtDNA损伤等。大量的研究证实,衰老与线粒体氧化磷酸化酶活性降低以及分裂终末的组织中突变mtDNA积累密切相关。与增龄有关的突变类型主要是缺失,并且与氧化损伤有关。体细胞中mtDNA突变随年龄而增加,与衰老的程度呈正相关性。mtDNA突变的累积可诱发多种老年性疾病。
外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构;存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中;外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息,不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用,更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
细胞分泌的外泌体通过携带生物分子(蛋白质、miRNAs、DNA和其他非编码RNAs)在细胞囊泡运输中发挥了不可或缺的作用。外泌体的功能取决于所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等多个进程中。
现有的针对抗衰老的技术研究中,存在有一些使用外泌体的相关技术文献,其主要聚焦在三个方面:
1、将某种类型的细胞进行体外培养后,分离其中的外泌体,产生抗衰老作用,其细胞来源主要为胚胎干细胞、脐带/胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牛胎盘细胞、神经干细胞、牙髓干细胞、脂肪来源干细胞等,如公开号CN113041208A的发明专利《胚胎干细胞外泌体在制备美白及抗衰老药物或者化妆品中的用途》;
2、将外泌体做为传递载体,负载某些抗衰物质或修饰某些小分子物质,包括活性肽、透皮肽、小分子肽、NAMPT基因等,如公开号CN112980801A的发明专利《一种NAMPT基因修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法》;
3、将外泌体与某种物质组合成组合物,共同用于抗衰老,如公开号CN111225659A的发明专利《包含乳酸菌来源的胞外囊泡的抗衰老组合物》。
但上述技术,均存在操作复杂、应用范围单一以及抗衰作用持续效果差等缺陷。
脱发是指头发脱落的现象。正常脱落的头发都是处于退行期及休止期的毛发,由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡,故能维持正常数量的头发。病理性脱发是指头发异常或过度的脱落,其原因很多,如雄激素性脱发、神经性脱发、营养性脱发、化学性脱发等。现有针对脱发的治疗多采用化学制剂涂抹、植发等外部方式,对机体造成了一定损伤。
由于大多数脱发分子机制尚不清楚,多是以雄激素、5α-还原酶、雄激素受体等为靶点治疗雄激素性脱发,目前,临床上常用治疗方式有涂抹米诺地尔、口服非那雄胺以及植发。
米诺地尔需要长期使用,停止后还会继续脱落。使用初期会导致原有大量头发脱落,很多患者无法忍受这一现象而停止使用,该药还有很多副作用,如:接触性皮炎、瘙痒、面部多毛症、头痛等。
非那雄胺会有一系列的副作用,如:性欲减退、乳房发育、勃起障碍、射精困难等,会对男性患者产生巨大的心理压力,严重时会有抑郁倾向,非那雄胺也需要长期服用,一旦停止,毛囊和血清内DHT升高,会继续毛囊萎缩,毛发脱落,且非那雄胺的副作用可能会持续存在。但时间久了,会导致2型糖尿病、肝肾损伤等,且备孕期间男性不建议服用非那雄胺。
植发是将患者枕部毛囊取出移植到脱发区,该技术难度较大,成本较高,且供体有限。并且可能会有一系列并发症的风险,如:头皮水肿、出血、毛发内生、供体部位留疤、细菌感染等。由于AGA是一个终生的过程,头发移植不会改变其进展,若长期依旧处于高雄激素浸润,依旧会继续脱发。需要为未来的脱发制定长期计划,通常涉及药物治疗和1次或多次外科手术来保持头发的生长。
现有的流行病学数据显示,雄激素性脱发(AGA)的发生率和流行程度受年龄和种族的影响。在白人群体中,30%以上的男性在30岁之前患有AGA,50岁时可达到50%,70岁时可达到80%,女性一生中受AGA影响者比例为40%-50%,且女性发病年龄比男性约晚10年,并在50岁或围绝经期之后达到高峰,甚至表现为男型脱发模式。中国人、日本人和非裔美国人受到的影响比白种人要小。在我国,超过90%以上的脱发属于AGA,男性患病率约为21.3%,女性患病率约为6.0%。这是一种具有遗传倾向的多基因隐性遗传疾病。国内的流行病学调查显示,雄激素性脱发患者中有家族遗传史的占53.3%-63.9%,父系明显高于母系。AGA作为最常见的脱发疾病,它既不危及生命、也不痛苦,但可能引发患者严重的心理问题,比如高度焦虑及抑郁,影响AGA患者正常的生活以及社交能力,如何切实有效地治疗,是困扰临床医生的一大难题。
伤口在医学上指受伤破裂的地方,多指人或其他动物的皮肤、肌肉、黏膜等而言,各种外伤,常常引起皮肤和软组织的损伤,伤口处理正确,在自体的调节下能够逐渐愈合;反之,可能化脓感染,经久不愈,甚至因并发全身感染、气性坏疽、破伤风等危及生命,而伤口愈合的速度与伤口的感染率高度关联,现有针对伤口防感染的方式,多采用外部包扎后待机体自身逐步自愈的方式,愈合速度慢,感染风险高。
发明内容
针对上述存在的拘束局限性,本发明提出了一种用于促进毛发再生的生物制品及其制备方法和应用,克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
本发明的发明点是提供了一种用于抗衰焕活的生物制品,所述生物制品的有效成分中,包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
本发明的第二个发明点是提供了一种用于促进毛发再生的生物制品,所述生物制品的有效成分中,包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
血液是唯一与所有器官都有接触的组织,携带着大量与机体相关的各种类型细胞,其所能产生的外泌体也是一个复杂的组合体,提取自血液的外泌体,其也具有最广泛的用途;同时,血液做为包含有外泌体的液态物质,其提取方法相对比较简单,而且血液做为机体内最大规模的液态物质,其所能够提取到的外泌体总量也明显要远高于其它器官/组织,更适于大规模、长期、重复性的施展用途。
进一步的,上述的生物制品,所述外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。
直接提取自年轻动物体血液的外泌体,实际上是一组外泌体的集合,包含有各种类型细胞所分泌的外泌体,相互之间联系紧密,共同发挥作用。由于年轻动物体处于高速生长发育阶段,其血液中的外泌体数量和活性要远远高于年老动物体,且外泌体所包含的内容物(如miRNA等)也要明显高于年老动物体。年老动物体血液内的外泌体,随着年龄增长,其中许多与抗衰老、抗氧化、激发活力相关的因子逐渐失活或减量,从而引发了衰老以及与衰老相关疾病的发生。而年轻动物体血液中所包含的外泌体,能够通过其中所包含的内容物,综合发挥出针对衰老及与衰老相关疾病发生的拮抗性,实现抗衰焕活的相应效果。
脱发和伤口愈合慢,实际上也可以看做是机体活性差的表现,提升机体活性有助于活化毛囊,也有助于提升伤口愈合速度。
年轻哺乳动物动物体是指生长年龄小于等于该物种平均寿命的17%的动物体;优选为生长年龄等于该物种平均寿命12%-16.5%的动物体。
由于动物体年龄总周期不同,而在针对动物体衰老机制的研究中,年龄是最直观的标准之一,故此,本发明也是采用年龄比例对“年轻”、“年老”的概念进行了定义。由于本发明的最终目的是以生物制品抑制人体的衰老,产生延寿效果的同时,拮抗由于衰老所产生的相关疾病,因而本发明在实验之初,即确定了以动物实验确定人体的外泌体使用效果,这也就确定了需要多种实验动物与人体的年龄之间具有相关性。
经过前期查询,为了更准确表达本发明所记载的“年轻动物体”、“年老动物体”的概念,申请人查询到了以下2篇相关文献,并以文献记载确定了实验小鼠的年龄定义:即“年轻”是指月龄4个月之内的小鼠,“年老”是指月龄在18个月以上的小鼠。
1、相关文献1:
《实验动物与人类年龄相关性研究进展》——中国比较医学杂志,2019,29(11):116-122,陈玥,苏丹,贵文娟,孙效容。
其中,记载了小鼠等实验动物和人年龄对应的相关性,以人类年龄计算实验动物年龄如图1中的表1所示。
2、相关文献2:
《THE MOUSE IN BIOMEDICAL RESEARCH,2ND EDITION》。
其中,记载了小鼠不同生长阶段与人类对应关系,并以C57BL/6J为例进行了统计,如图2所示。
结合上述文献记载,同时申请人也在进行了大量实验后,最终优化和确认了本发明中所描述的“年轻动物体”是指生长年龄小于等于该物种平均寿命17%的动物体,优选为生长年龄等于该物种平均寿命12%-16.5%的动物体;“年老动物体”是指生长年龄大于等于该物种平均寿命62%的动物体,优选为生长年龄等于该物种平均寿命62%-95%的动物体。
含有外泌体的生物制品用于促进毛发再生时,外泌体的来源则不完全限定为年轻的哺乳动物,亦可以为成年、中年哺乳动物,其潜在要求在于,供体动物的生物机体活性需要高于受体动物,或供体动物本身并未有相关不良现象的发生(如激素水平过高/过低、脱发等)。
进一步的,上述的生物制品,所述哺乳动物为体重大于等于1kg的哺乳动物,优选为中型/大型哺乳动物。
由于本技术中的外泌体为外部来源的生物制品(哺乳动物血液中提取),且其通常情况下,施用量较大、施用时间较长、施用频次较高,故此,选择稳定的生物体来源相对就比较重要,实验过程中,虽然多采用小鼠等小型哺乳动物,但其血液量较少,提供的外泌体数量相对较低,无法满足大量、长期、高频的施用,而体重较大的中大型哺乳动物,其血液量较大,也能够多次大量的提供外泌体生物制品,是本发明技术方案的更优选择。
进一步的,上述的生物制品,所述外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为哺乳动物。
也即是说,外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为相同的哺乳动物(亦可以为不同的哺乳动物,即跨物种施用)。
本申请中所记载的“供体动物”是指可以从其体内血液/血浆中分离/提取得到外泌体/miRNA的不限物种的年轻动物体/正常动物体;“受体动物”是指可以接收从“供体动物”体内血液/血浆中分离/提取得到的外泌体/miRNA的不限物种的年老动物体/非正常动物体;正常动物体为生物活性较高或无相应不良现象的动物体,非正常动物体为生物活性较低或已出现不良现象(如激素水平过高/过低、脱发等)的动物体。
2007年,Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的外泌体可以被人的肥大细胞捕获,并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中被翻译成蛋白质,不仅仅是mRNA,外泌体所转移的microRNA同样具有生物活性,在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。后续通过不断的研究发现,外泌体是存在“跨物种”特性的,也即是从小鼠等动物体内产生的外泌体可以被人类相同或相似细胞获取,从而实现外泌体内容物的跨物种传递。外泌体的此种特性,大大增加了其对人体各种疾病的基因层面的诊断和治疗作用,同时由于外泌体是单一的微小囊泡结构,不同物种之间的外泌体并不会产生相应的免疫反应,也即是摒弃了跨物种的“排异反应”,大幅扩展了基因制剂的来源。
基于前述研究结果,在本发明的具体实施过程中,可采用多种动物的年幼动物体/正常动物体做为供体动物,采用多种动物的年老动物体/非正常动物体做为受体动物,尤其是可以将年老人类群体/已出现不良现象的非正常人群做为受体动物,实现与相同物种一致的“抗衰”、“焕活”、“防脱”、“愈伤”等效果。
进一步的,上述的生物制品,所述外泌体的提取方法为:通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。也可单独采用超速离心或外泌体试剂盒的方式进行提取。
进一步的,上述的生物制品,所述外泌体的提取方法具体为:
S1.获得动物体血液,并分离得到血浆;
S2.若S1中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
S3.采用超速差异化离心方法对步骤S1中或S2中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
S4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
S5.若步骤S4中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
近几年来,市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒,包括通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分、采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化、利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来等等。这些试剂盒不需要特殊设备,随着产品不断更新换代,提取效率和纯化效果也在逐渐提高。
超离法(超速离心法,或叫差速离心)是最常用的外泌体纯化手段,采用低速离心、高速离心交替进行,可分离到大小相近的外泌体囊泡颗粒。超离法因操作简单,获得的外泌体数量较多而广受欢迎,但过程比较费时,且回收率不稳定,纯度也受到质疑;此外,重复离心操作还有可能对外泌体造成损害,从而降低其质量。
本发明中提供的方法,是将外泌体试剂盒与超速离心方式相结合,对外泌体进行提取。结合提取的方式,克服了超速离心对外泌体的伤害,再辅以试剂盒提取则进一步增加了回收稳定性、增加了回收纯度,效果较单独使用超速离心或试剂盒提取更优。
进一步的,上述的生物制品,所述生物制品中的外泌体粒径范围为100-250纳米,优选的外泌体粒径范围为180-220纳米。
生物制品中,所包含的外泌体粒径范围需要在100-250纳米范围内,包括但不限于120、140、160、180、200、220、240、250纳米,优选的粒径范围为180-220纳米。通过对外泌体粒径和传递效率的相关性研究发现,外泌体粒径低于100纳米粒径或高于250纳米粒径,均会严重影响外泌体的传递效率。现有领域内的研究发现,理论上来说,外泌体粒径越小,其传播速度越快,同时这种传播速度的加快又会影响细胞的生长速度,使其生长速度加快;但由于本技术中,不仅需要外泌体的传递功能,也需要外泌体数量和外泌体内容物含量达到一定标准,故此粒径过低的外泌体,其内容物含量经过检测是无法达标的,也即是说,粒径过低或过高的外泌体均是无法实现本技术所需要效果的。申请人通过多次实验发现,粒径范围在100-250纳米的外泌体是能够实现相应的内容物传递并使其达到一定浓度,从而实现本发明所需的“抗衰”、“焕活”、“防脱”、“愈伤”效果,尤其是180-220纳米粒径的外泌体,其效率最高,效果最好。
本发明的第三个发明点是提供了一种生物制品的制备方法,所述生物制品为上述的生物制品,其制备方法包括以下步骤:
1)获得动物体血液,并分离得到血浆;
2)若1)中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
5)若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
本实验使用新生牛血浆均有南京市苏邦生物科技有限公司提供,该血浆来自于出生14h以内新生公牛,储存于-80℃。提起新生牛血浆外泌体是,先将新生牛血浆提取前放4℃过夜,融化后2000xg离心45min,弃沉淀,上清继续12000xg离心45min,弃沉淀,将上清置于45Ti超离管中,120000xg离心4h,将沉淀溶于PBS中,上清继续120000xg离心2h,将沉淀溶于PBS中,收集外泌体溶液。
本发明的第四个发明点是提供了一种生物制品,所述生物制品的有效成分中,包含有一组miRNA,所述miRNA为miR-144、miR-149和/或miR-455;所述miRNA包含在上述的外泌体中。
上述miRNA的组合可以为miR-144+miR-149+miR-455三种联用、miR-144单独使用、miR-149单独使用、miR-455单独使用、miR-144+miR-149两种联用、miR-149+miR-455两种联用、miR-144+miR-455两种联用。
优选地,上述一组miRNA,其既可以是包含在前述的外泌体中的miRNA并随外泌体共同施用共同发挥作用,也可以将一组miRNA单独提取出来后直接施用。
外泌体内包含多种不同分子,如蛋白质、脂质、DNA、mRNA和miRNA。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。
申请人经过大量实验研究发现,此三种miRNA可单独或通过外泌体内容物的方式,对动物体的衰老、机体失活产生一定拮抗作用。
本发明的第五个发明点是提供了上述的生物制品在制备抗衰焕活产品中的应用。
抗衰焕活产品的作用机理为,由于其所含有的年轻动物体血液所提取的大量外泌体,而采用此种外泌体可以“替换”、“置换”或“激活”年老动物体内的外泌体,从细胞层面改善了基础功能,从而减缓了衰老作用的发生,实现了延寿的效果。
进一步的,上述的应用,所述抗衰焕活产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、水凝胶包裹、滚针给药、无针注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
施用方式,可以采用常规的多种施用方式,不限于所列出的几种,但由于外泌体来源是血液,故而,外泌体“置换”“激活”效果比较好的,主要是静脉注射和静脉滴注方法,在静脉注射一定量的年轻动物体血液外泌体后,能够以最快的速度(通过血液的全身流动)实现年轻年老动物体内或正常非正常动物体内的外泌体“置换”过程;通过实验可以得知,静脉注射和静脉滴注方式中,最优的选择则是静脉滴注方式,静脉注射的缺陷在于,短时大量的注入提取的外泌体,会造成机体内局部外泌体浓度过高,极有可能会引发不可预估的后果,而且静脉注射的总体用量也必然要低于静脉滴注。静脉滴注的优势在于,由于静脉中血液的流动是实时的,同时通常情况下静脉滴注过程中会对滴注液进行稀释,即可有效防止外泌体在机体内局部浓度过高的问题,而且由于静脉滴注速度可调,也使得在一定周期内可向机体内注入更多的外泌体,更持久的发挥外泌体的抗衰老作用。同时,通过口服施用再进入血液、通过皮肤外敷施用直接作用于皮肤毛发以及通过肌肉注射作用于肌肉骨骼的施用方式,也能够实现对机体不同部位的局部“焕活”效果。
除了常规的施用方式外,近年来还产生了很多种新颖的施用方法,比较适合外泌体的主要为微针和OxOBand方法。
微针是利用微细针状器械对皮肤软组织实施机械性或物理性、微创损伤刺激,以期获得治疗作用的医疗技术,可伴随同步或分步给予本发明的外泌体生物制品,借助于微针提高其透皮/吸收效率,从而增强治疗功效。
抗氧化伤口敷料,由抗氧化聚氨酯(PUAO)组成,作为具有持续释氧特性的高度多孔冷冻凝胶,能够辅以本发明的外泌体生物制品发挥作用。
进一步的,上述的应用,所述抗衰焕活产品的有效成分为外泌体时,其施用周期分为短期施用和长期施用;短期施用为将抗衰焕活产品每隔1-3天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg,连续施用6-8次;长期施用为将抗衰焕活产品每6-8天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg。
优选地,短期施用为将抗衰焕活产品每隔1天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg,连续施用7次;长期施用为将抗衰焕活产品每7天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg。
申请人设计的两种施用周期方式,分别为短期施用和长期施用,其效果相差不大,可根据受试体的反应进行相应调整。
进一步的,上述的应用,所述抗衰焕活产品的有效成分为miRNA时,其是先构建miRNA过表达的质粒,再将含有所述质粒的抗衰焕活产品进行施用,施用周期为每6-8天静脉注射1-3次,施用剂量为每次4-6mg/kg;优选为施用周期每7天静脉注射1次,施用剂量为每次5mg/kg。
进一步的,上述的应用,所述抗衰焕活产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于提高体内NAD+辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷NR/烟酰胺单核苷酸NMN制剂、加入雷帕霉素制剂。
本申请中所提供的生物制品(年轻动物体血液提取的外泌体或外泌体内容物miRNA),除了单独使用以外,还能够与其它具有抑制衰老或抗氧化的制剂联合使用,也能够与其它用于抑制衰老或抗氧化的方法进行联合使用,实现了制剂或方法上的互补及相互影响,从而得以实现更优的效果。
本发明的第六个发明点是提供了上述的生物制品在制备促进毛发再生产品中的应用。
促进毛发再生产品的作用机理为,由于其所含有的年轻/正常动物体血液所提取的大量外泌体,而采用此种外泌体可以“替换”、“置换”或“激活”年老/非正常动物体内的外泌体,从细胞层面改善了基础功能,从而减缓了失活作用的发生,实现了生发及增加愈伤速度的效果。
进一步的,上述的应用,所述促进毛发再生产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、水凝胶包裹、滚针给药、无针注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
进一步的,上述的应用,所述促进毛发再生产品的有效成分为外泌体时,其施用周期为3-30天,施用方式为外敷涂抹至脱发或伤痕部位,每天1次,每次剂量为200-2400μg/cm2(溶于200-2400ml PBS),优选为200-600μg/cm2(溶于200-600ml PBS)或1000-2000μg/cm2(溶于1000-2000ml PBS)。
优选为,施用周期为9-21天(更优选为15天),施用剂量为400μg(溶于400ml PBS)。
进一步的,上述的应用,所述促进毛发再生产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于加入防脱药剂米诺地尔、非那雄胺;加入愈伤药剂疤克;透明质酸钠与外泌体混合以增加外泌体透皮效率。
本发明生物制品所能够起到促进生长作用的毛发,不仅限于雄性激素导致的脱发,还包括了因疾病导致的脱发和外力导致的脱发,如斑秃、化学系脱发(癌症化疗)、物理性脱发、营养代谢性脱发、女性产后脱发、内分泌失调性脱发、精神性脱发等。
本申请中所提供的生物制品(正常动物体血液提取的外泌体或外泌体内容物miRNA),除了单独使用以外,还能够与其它具有抑制/治疗脱发和促进伤口愈合的制剂联合使用,也能够与其它用于抑制/治疗脱发和促进伤口愈合的方法进行联合使用,实现了制剂或方法上的互补及相互影响,从而得以实现更优的效果。
与现有技术相对比,本发明具有以下优点:
本发明提供的用于抗衰焕活或促进毛发再生的生物制品及其制备方法和应用,生物制品中包含有从中大型动物血液中提取的外泌体以及miRNA,保证了外泌体内容物含量和外泌体本身的数量,同时,由于血液中的外泌体本身就是组合体,其能够更有效的实现多种功效,且来源简单、广泛,有利于长期、重复、大量的使用。
外泌体来源,可选择年轻动物的血液或正常动物的血液,以年轻动物/正常动物血液中提取的外泌体“替换”、“置换”或“激活”年老动物/非正常动物体内的外泌体,提高年轻动物/正常动物外泌体及外泌体内容物在年老动物/非正常动物体内的含量,从而能够实现激发年老动物/非正常动物生机活力的作用,也能够有效激发机体对抗因衰老引发疾病的体内机制以及有效激发机体对抗因失活引发的不良现象的体内机制。
本技术中的动物体血液外泌体的提取方法,综合了试剂盒方法和超速离心方法的优势,通过将两种方法结合,克服了两种方法中的固有缺陷,提高了动物体血液外泌体提取过程的控制、准确性,降低了提取难度。
附图说明
图1为现有文献中记载的以人类年龄计算实验动物年龄的对比表格。
图2为现有文献中记载的以C57BL/6J为例显示的小鼠不同生长阶段与人类对应关系图示。
图3显示为胎牛/新生小牛血浆中的外泌体鉴定结果,其中,A-B:Nanosight(A)与电镜(B)观察外泌体粒径大小;C:Western Blot检测外泌体特异性标记蛋白。
图4显示为胎牛血浆外泌体梯度共培后三种细胞系衰老指标P21蛋白的表达水平,其中,A:C2C12的胎牛血浆外泌体梯度共培结果;B:AML-12的胎牛血浆外泌体梯度共培结果;C:NE4C的胎牛血浆外泌体梯度共培结果;T-test,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图5显示为胎牛血浆外泌体共培后的EDU增殖实验结果,其中,A:C2C12的EdU增殖实验结果;B:AML-12的EdU增殖实验结果;C:NE4C的EdU增殖实验结果;T-test,***P<0.001。
图6显示为两组衰老小鼠的代谢能力检测结果,其中,A:氧气消耗量(m/h/kg);B:二氧化碳生成量(m/h/kg);C:呼吸交换率;D:产热(kcal/h/kg);E:摄食量(g);F:饮水量(g);G:活动性(count);Np=6,Nf=5,T-test,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图7显示为两组衰老小鼠的运动能力检测结果,其中,A:快速力竭跑台方案;B:力竭距离(m);C:力竭时间(s);Np=6,Nf=6,T-test,**P<0.01。
图8显示为两组衰老小鼠的运动平衡和协调能力检测结果,其中,A:平衡木实验方案;B:通过平衡木的时间(S);Np=6,Nf=6,T-test,**P<0.01。
图9显示为两组衰老小鼠的学习记忆能力检测结果,其中,A:新物体识别实验方案;B:实验组与对照组识别相同物体的NOR指数(NOR指数小于0.2,表明小鼠不会表现出对左侧或右侧的偏好);C:实验组与对照组识别不同物体的NOR指数;NOR指数:NOR index=(Tn–Tf)/Ttot,Tn:新物体的探测时间;Tf:熟悉物体的探测时间;Ttot:总探测时间;Np=5,Nf=6,T-test,***P<0.001。
图10显示为两组小鼠的毛发生长能力检测结果,其中,A:小鼠肤色评分表;B:小鼠皮毛拍摄图;C:小鼠肤色评分统计图;Np=3,Nf=3,T-test,*P<0.05,**P<0.01。
图11显示为两组小鼠的毛发生长能力检测结果,其中,A:小鼠创口拍摄图;B:小鼠创口面积统计图;Np=3,Nf=3,T-test,*P<0.05,**P<0.01。
图12显示为实验组和对照组健康脱毛小鼠皮内、涂抹给药的检测结果(照片及毛发覆盖率统计)。
图13显示为雄激素性脱发造模的检测结果(照片及毛发覆盖率统计)。
图14显示为实验组和对照组针对造模进行皮内注射、涂抹给药的检测结果(照片及毛发覆盖率统计)。
图15显示为实验组和对照组针对造模进行皮内注射、涂抹给药的HE染色结果、皮肤厚度统计结果以及毛囊数量统计结果。
图16显示为实验组和对照组针对造模进行皮内注射、涂抹给药的小鼠新生毛发SEM拍摄结果图以及毛发直径统计结果。
图17显示为实验组和对照组针对造模进行滚针、涂抹给药的结果,包括了所使用的滚针以及PHK26外泌体示踪图。
图18显示为实验组和对照组针对造模进行滚针、涂抹给药的检测结果(照片及毛发覆盖率统计)。
图19显示为实验组和对照组针对造模进行滚针、涂抹给药的HE染色结果、皮肤厚度统计结果以及毛囊数量统计结果。
图20显示为实验组和对照组针对造模进行滚针、涂抹给药的CBS毛发镜拍摄结果图。
图21显示为实验组和对照组针对造模进行滚针、涂抹给药的小鼠新生毛发SEM拍摄图以及毛发直径统计结果。
图22显示为外泌体透皮给药率的增加检测效果。
图23显示为采用无针注射气枪分别对两组小鼠注射NBPexo和PBS,16天后的外观图片及毛发覆盖率统计结果。
图24显示为采用涂抹方式分别对两组小鼠注射同样配比的NBPexo-(HA)(新生牛血浆外泌体与透明质酸钠的混合液)和PBS-(HA)(PBS与透明质酸钠的混合液),18天后的外观图片及毛发覆盖率统计结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了,下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解,此处所描述仅仅用以解释本发明,并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同,本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得,所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述,本文中不再赘述。
为了进一步了解本发明,下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种用于抗衰焕活的生物制品,生物制品的有效成分中包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
另一种用于促进毛发再生的生物制品,生物制品的有效成分中包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
所述外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。
年轻哺乳动物动物体是指生长年龄小于等于该物种平均寿命的17%的动物体;优选为生长年龄等于该物种平均寿命12%-16.5%的动物体。
含有外泌体的生物制品用于促进毛发再生时,外泌体的来源则不完全限定为年轻的哺乳动物,亦可以为成年、中年哺乳动物,其潜在要求在于,供体动物的生物机体活性需要高于受体动物,或供体动物本身并未有相关不良现象的发生(如激素水平过高/过低、脱发等)。
所述哺乳动物为体重大于等于1kg的哺乳动物,优选为中型/大型哺乳动物。
外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为哺乳动物(既包括来源与施用对象为相同的哺乳动物,也包括来源与施用对象为不同的哺乳动物,即跨物种施用)。
也即是说,外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为相同的哺乳动物(亦可以为不同的哺乳动物,即跨物种施用)。
基于前述研究结果,在本发明的具体实施过程中,可采用多种动物的年幼动物体/正常动物体做为供体动物,采用多种动物的年老动物体/非正常动物体做为受体动物,尤其是可以将年老人类群体/已出现不良现象的非正常人群做为受体动物,实现与相同物种一致的“抗衰”、“焕活”、“防脱”、“愈伤”等效果。
外泌体的提取方法为:通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。
外泌体的提取方法具体为:
S1.获得动物体血液,并分离得到血浆;
S2.若S1中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
S3.采用超速差异化离心方法对步骤S1中或S2中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
S4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
S5.若步骤S4中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
所述生物制品中的外泌体粒径范围为100-250纳米,优选的外泌体粒径范围为180-220纳米。
生物制品中,所包含的外泌体粒径范围需要在100-250纳米范围内,包括但不限于120、140、160、180、200、220、240、250纳米,优选的粒径范围为180-220纳米。
生物制品的制备方法,包括以下步骤:
1)获得动物体血液,并分离得到血浆;
2)若1)中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
5)若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
再一种生物制品,生物制品的有效成分中,包含有一组miRNA,所述miRNA为miR-144、miR-149和/或miR-455;所述miRNA包含在上述的外泌体中。
上述miRNA的组合可以为miR-144+miR-149+miR-455三种联用、miR-144单独使用、miR-149单独使用、miR-455单独使用、miR-144+miR-149两种联用、miR-149+miR-455两种联用、miR-144+miR-455两种联用。
本发明还提供了上述的生物制品在制备抗衰焕活产品中的应用。
抗衰焕活产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、水凝胶包裹、滚针给药、无针注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
抗衰焕活产品的有效成分为外泌体时,其施用周期分为短期施用和长期施用;短期施用为将抗衰焕活产品每隔1-3天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg,连续施用6-8次;长期施用为将抗衰焕活产品每6-8天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg。
优选地,短期施用为将抗衰焕活产品每隔1天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg,连续施用7次;长期施用为将抗衰焕活产品每7天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg。
抗衰焕活产品的有效成分为miRNA时,其是先构建miRNA过表达的质粒,再将含有所述质粒的抗衰焕活产品进行施用,施用周期为每6-8天静脉注射1-3次,施用剂量为每次4-6mg/kg;优选为施用周期每7天静脉注射1次,施用剂量为每次5mg/kg。
抗衰焕活产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于提高体内NAD+辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷NR/烟酰胺单核苷酸NMN制剂、加入雷帕霉素制剂。
本发明还提供了上述的生物制品在制备促进毛发再生产品中的应用。
促进毛发再生产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
促进毛发再生产品的有效成分为外泌体时,其施用周期为3-30天,施用方式为外敷涂抹至脱发或伤痕部位,每天1次,每次剂量为200-2400μg/cm2,优选为200-600μg/cm2或1000-2000μg/cm2。
优选为,施用周期为9-21天(更优选为15天),施用剂量为400μg(溶于400ml PBS)。
促进毛发再生产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于加入防脱药剂米诺地尔、非那雄胺;加入愈伤药剂疤克;透明质酸钠与外泌体混合以增加外泌体透皮效率。
实施例2
一、动物体选择:
1、年龄选择:
年轻动物体:选择生长年龄小于等于该物种平均寿命17%的动物体;优选为生长年龄等于该物种平均寿命12%-16.5%的动物体;
本实施例所用实验用年轻小鼠,为月龄4个月之内的小鼠(约相当于人类年龄13.15岁之内);
年老动物体:选择生长年龄大于等于该物种平均寿命62%的动物体,优选为生长年龄等于该物种平均寿命62%-95%的动物体;
本实施例所用实验用年老小鼠,为月龄18个月以上的小鼠(约相当于人类年龄59岁以上)。
以人类年龄计算实验动物年龄的对比表如图1所示,小鼠不同生长阶段与人类的对应关系如图2所示。
在现有的研究中,还存在其它相关记载,如DNA甲基化变化与衰老的相关性(Stubbs,T.M.,Bonder,M.J.,Stark,AK.et al.Multi-tissue DNA methylation agepredictor in mouse.Genome Biol 18,68(2017).https://doi.org/10.1186/s13059-017-1203-5)。该研究在多个组织和年龄的小鼠中生成了迄今为止最全面的一组匹配的单碱基分辨率甲基化组。该结果可以研究DNA甲基化变化与衰老之间的相关性。该研究第一次建立了一个小鼠表观遗传时钟,它根据整个小鼠基因组329个离散CG位点的甲基化状态估计年龄。这种新的表观遗传时钟的表现类似于人类表观遗传时钟,可以用于评估无关甲基化数据集中的(表观遗传)年龄。具体而言,小鼠时钟在测试的所有组织和年龄时,年龄相关性为0.839,测试数据中的中位绝对误差(MAE)为3.33周。因此:小鼠表观遗传时钟的329个位点在预测小鼠样本年龄方面的表现优于小鼠基因组中对应于人类Horvath时钟位点的位点;小鼠表观遗传时钟存在预测误差,需要进行实验和数据集来评估其在老年小鼠中的准确性。
上述的DNA甲基化研究对于动物体衰老的时间描述更加精准,是完全可以用于本发明技术中进行年轻动物和年老动物的具体限定的,相信也必然会给出更加精准的机体机能对应阶段,但由于动物体内的各组织是随时在变化的,而本技术也并不需要对生长阶段进行严格限定,只是以年龄或甲基化程度做为判定外泌体是否为“年轻”或“年老”动物体的就可以,故此,本发明的限定及描述中,仍采用了以动物体年龄限定“年轻”、“年老”的方式。
2、动物选择:
本实施例中所用小鼠,购自维通利华实验动物技术有限公司。
二、血液来源、血浆提取及保存:
血液来源:本实施例中的血液来源为胎牛/新生小牛血浆,胎牛/新生小牛血浆可购自市售来源的已有产品,如平睿生物、苏邦生物、Bio-Channel等。
三、外泌体提取及保存:
1、外泌体提取:
(1)血浆在37℃水浴锅中融化,用等体积的PBS稀释;
(2)在4℃下以500×g离心5分钟,取上清,在4℃下以3,000×g离心25分钟,取上清,在4℃下以12,000×g离心60分钟,取上清;
(3)将上清在4℃下以120,000×g离心70分钟,小心移除上清液备用,沉淀用PBS溶解;
(4)根据总外泌体分离试剂盒(来自血浆)(Invitrogen,4484450,MA,USA)的使用说明书提取一半的上清液,将0.2倍上清体积的外泌体沉淀试剂添加到上清液中;
(5)迅速涡旋振荡混匀,在室温下孵育10分钟;
(6)血浆来源于胎牛血浆,在室温下10,000×g离心10分钟;小心移除上清液,在4℃下10,000×g离心30秒,小心移除上清液,沉淀用PBS溶解。
2、外泌体保存:
将步骤(3)和(6)得到的沉淀集合,即为外泌体,外泌体制成的生物制品,4℃可保存2周,-80℃长期保存。
购买的胎牛/新生小牛血浆,使用超速离心法和血浆外泌体提取试剂盒分离牛血浆中的外泌体。鉴定外泌体分离的纯度主要依靠Nanosight和电镜观察大小以及Westernblot检测外泌体特异性标记蛋白(Alix、TSG101、CD63)的表达。结果(图3)显示:所提取的胎牛血浆外泌体(FBP-exo)纯度与浓度均达到标准,可以进行后续体内体外实验。
四、生物制品施用方式:
直接提取到的外泌体或保存之后的外泌体,可通过多种施用方式进行“年老动物”或“非正常动物”的施用,包括口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、肌肉注射、静脉注射和/或静脉滴注等。其中,口服的施用方式,效果相对较差,但施用方式较方便;皮肤外敷施用的方式,其针对皮肤毛发的效果较好,但吸收效果相对较差;肌肉注射施用方式针对肌肉骨骼的活化效果较好,但对于机体其它部位的效果较差;静脉注射和静脉滴注,是所有施用方式中的最优选择,其通过血液边激活外泌体或活化物质(miRNA等),边将其运输至全身各个部位,能够有效实现机体的全面“焕活”。
五、生物制品施用周期:
抗衰焕活产品的有效成分为外泌体时,其施用周期分为短期施用和长期施用;短期施用为将抗衰焕活产品每隔1-3天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg,连续施用6-8次;长期施用为将抗衰焕活产品每6-8天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg。
通常情况下,短期施用为将抗衰焕活产品每隔1天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg,连续施用7次;长期施用为将抗衰焕活产品每7天以静脉注射施用一次,每次剂量180μg。
实施例3:
另外一种相关生物制品:
另一种生物制品,其有效成分为,上述的外泌体中所含有的miRNA;miRNA为miR-144、miR-149和/或miR-455。
实施例4:
胎牛血浆外泌体延缓多种细胞衰老:
为了验证胎牛血浆外泌体的抗衰焕活效果,申请人以C2C12(小鼠成肌细胞),AML-12(小鼠正常肝细胞)以及NE4C(小鼠神经干细胞)三种细胞系与胎牛血浆外泌体梯度共培实验(BCA法测定外泌体的浓度为1.0-2μg/μL,梯度共培的外泌体量分别为为50μg、100μg、200μg和400μg,共培24小时)。实验中将细胞分为两组,分别为PBS空白对照组(PBS)、胎牛血浆外泌体共培实验组(FBP-exo),结果显示,实验组中三种细胞系的衰老检测指标P21蛋白(一种在细胞发生复制性衰老时,参与调控细胞周期停滞的衰老标志蛋白)的表达水平与对照组相比显著降低,且外泌体浓度越高,P21蛋白表达水平降低越明显(图4),验证了胎牛血浆外泌体可以延缓细胞衰老。
实施例5:
胎牛血浆外泌体提高多种细胞的增殖能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对细胞增殖能力的提升效果,申请人以C2C12,AML-12和NE4C的胎牛血浆外泌体共培(共培的外泌体量分别为为50μg、100μg、200μg和400μg,共培24小时)后的EdU增殖实验检测共培后各细胞的增殖能力变化,结果表明,实验组细胞的增殖信号与对照组细胞相比显著增强(图5,本图只展示200μg效果),验证了胎牛血浆外泌体可以提高细胞的增殖能力。
实施例6:
胎牛血浆外泌体提高衰老小鼠的代谢能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对衰老小鼠代谢能力的提升效果,申请人将22月龄的衰老雄鼠分为两组,分别为尾静脉注射PBS的空白对照组(pbs→aged)、尾静脉注射胎牛血浆外泌体的实验组(FBPexo→aged),并通过代谢笼实验,检测了两组小鼠在代谢能力上的差异,结果显示:实验组的各项指标(氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率、产热、摄食、饮水以及活动性)与对照组相比均显著提高(图6),验证了胎牛血浆外泌体可以提高衰老小鼠的代谢能力。
实施例7:
胎牛血浆外泌体提高衰老小鼠的运动能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对衰老小鼠运动能力的提升效果,申请人通过快速力竭方案的跑台实验(方案见图7-A)检测了两组衰老小鼠在运动能力和耐力上的差异。结果显示,实验组力竭时的运动时间与力竭时的运动距离与对照组相比均显著增加(图7-BC),验证了胎牛血浆外泌体可以提高衰老小鼠的运动能力。
实施例8:
胎牛血浆外泌体提高衰老小鼠的运动平衡和协调能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对衰老小鼠运动平衡和协调能力的提升效果,申请人通过平衡木实验(方案见图8-A)检测了两组衰老小鼠在运动平衡和协调能力上的差异。结果显示,实验组通过平衡木的时间与对照组相比显著降低(图8-B),验证了胎牛血浆外泌体可以提高衰老小鼠的运动平衡和协调能力。
实施例9:
胎牛血浆外泌体提高衰老小鼠的学习记忆能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对衰老小鼠学习记忆能力的提升效果,申请人通过新物体识别实验(方案见图9-A)检测了两组衰老小鼠在学习记忆能力上的差异。结果显示,实验组小鼠的NOR指数相比于对照组显著增加(图9-BC),验证了胎牛血浆外泌体可以提高衰老小鼠的学习记忆能力。
实施例10:
胎牛血浆外泌体提高小鼠的毛发生长能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对小鼠毛发生长能力的提升效果,选取6-8周C57BL/6雄鼠分别腹腔注射注射0.5-2mgDHT(二氢睾酮溶于玉米油),一周两次,第一次注射DHT四天后,小鼠用松香和蜡混合物脱毛,脱毛后继续长期给予DHT。将小鼠随机分为如下两组:对照组:背部均匀涂抹200-600ml PBS(磷酸盐缓冲液),每天一次;实验组:背部均匀涂抹200-600μg(溶于200~600ml PBS)胎牛血浆外泌体,每天一次。(外泌体是否可增加如微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand等)
所有小鼠均通过腹腔注射戊巴比妥(1mg/d)麻醉,在拍照过程中保持温暖。按照0、3、6、9、12、15、18、21天拍照记录两组毛发生长状况并根据小鼠肤色评分表(图10-A)制作肤色变化曲线,观察毛囊周期转换和生长状况。结果显示,实验组小鼠的肤色得分相比于对照组显著增加(图10-BC),验证了胎牛血浆外泌体可以提高小鼠的毛发生长能力。
实施例11:
胎牛血浆外泌体提高小鼠的创口愈合能力:
为了验证胎牛血浆外泌体对小鼠创口愈合能力的提升效果,取8-12周C57BL/6小鼠,使用电动理发器配合脱毛膏进行背部毛发脱除,在背部使用动物皮肤打孔器创造直径0.8mm的伤口,使用碘酒消毒。将小鼠随机分为如下两组:对照组:伤口均匀涂抹PBS 200-600ml(磷酸盐缓冲液),每天一次;实验组:伤口均匀涂抹200-600μg胎牛血浆外泌体(溶于200-600ml PBS),每天一次。涂抹后第0、3、6、9天取对照组和实验组进行创面拍照记录并记录并计算每个伤口面积。结果显示,实验组小鼠的伤口面积相比于对照组显著缩小(图11),提示胎牛血浆外泌体可以提高小鼠的创口愈合能力。
实施例12
1、健康脱毛小鼠皮内、涂抹新生牛血浆外泌体(NBPexo):
1)实验组:皮内注射NBPexo(1200μg/次,溶于100μLPBS),3天一次,每次皮内注射4个点,每个点25μL;或
2)涂抹NBPexo(400μg/次,溶于150μLPBS),每天一次;
3)对照组:皮内注射100μLPBS,3天一次,每次皮内注射4个点,每个点25μL。
实验最终统计结果(图12)表明:涂抹NBPexo可以促进小鼠毛发生长,皮内注射效果较差。
2、雄激素性脱发造模:
造模方式:腹腔注射二氢睾酮(DHT),浓度梯度为0mg/次、0.5mg/、1mg/次、1.5mg/次、2mg/次,4天一次;
实验结果(图13)表明:腹腔注射2mg/次DHT可以长时间抑制小鼠毛发的生长。
3、造模后皮内注射、涂抹给药新生牛血浆外泌体(NBPexo):
1)造模:腹腔注射DHT,2mg/次,4天一次;
2)实验组:涂抹NBPexo 800μg/次(溶于150μLPBS),1天一次;
皮内注射NBPexo 2400μg/次(溶于180μLPBS,每次皮内注射9个点,每个点20μL),2天一次;
3)对照组:皮内注射PBS180μL/次,每次皮内注射9个点,每个点20μL,2天一次。
实验结果(图14-图16)表明:涂抹可促进雄激素脱发模型小鼠毛发生长,皮内注射无改善效果。
4、造模后滚针、涂抹给药新生牛血浆外泌体(NBPexo):
1)造模:腹腔注射DHT,2mg/次,4天1次;
2)实验组:涂抹NBPexo 500μg/次(溶于150μLPBS),1天2次;
滚针NBPexo 3000μg/次(溶于250LPBS,先涂抹100μL,滚针后再涂抹150μL,3天1次;
3)对照组:滚针PBS,先涂抹100μL,滚针后再涂抹150μL,3天1次。
外泌体透皮示踪结果(图17)表明:外泌体可进入小鼠真皮层。
实验结果(图18-图21)表明:滚针和涂抹均可以促进雄激素性脱发造模小鼠毛发生长。
5、增加外泌体透皮给药率:
1)造模:腹腔注射DHT,2mg/次,4天1次;
2)实验组:
a、涂抹NBPexo+20W透明质酸钠(HA)混合液;
b、涂抹NBPexo+36W透明质酸钠(HA)混合液;
c、涂抹NBPexo;
d、采用无针注射气枪注射NBPexo;
3)对照组:涂抹350μlPBS,3天1次。
外泌体透皮示踪结果(图22)表明:透明色质酸钠与外泌体混合以及无针注射均可以增加外泌体的透皮率。
对比了实验组a和b的最终结果,确定了实验组b(即36W透明质酸钠+NBPexo)的效果更优,故此选择以此方案进行了更进一步的表观动物体实验结果观察和统计。
采用无针注射气枪分别对两组小鼠注射NBPexo和PBS,16天后的外观图片及毛发覆盖率统计结果如图23所示。
无针注射过程是将2500μg的NBPexo溶于350μl的PBS,注射到小鼠体内,两天注射一次,对照组是无针注射350μl的PBS。
采用涂抹方式分别对两组小鼠注射同样配比的NBPexo-(HA)(新生牛血浆外泌体与透明质酸钠的混合液)和PBS-(HA)(PBS与透明质酸钠的混合液),18天后的外观图片及毛发覆盖率统计结果如图24所示。
新生牛血浆外泌体与透明质酸钠混合液的使用,是选择36w的ha,浓度是2%。将1250μg的NBPexo溶于150μl的PBS,添加2%的透明质酸钠HA;对照组是150μl的PBS,添加有2%的透明质酸钠HA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (19)
1.一种用于抗衰焕活的生物制品,其特征在于,所述生物制品的有效成分中,包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
2.一种用于促进毛发再生的生物制品,其特征在于,所述生物制品的有效成分中,包含有提取自哺乳动物血液中的外泌体。
3.根据权利要求1或2所述的生物制品,其特征在于,所述外泌体为提取自年轻哺乳动物动物体血液或血浆的外泌体。
4.根据权利要求1-3任一所述的生物制品,其特征在于,所述哺乳动物为体重大于等于1kg的哺乳动物,优选为中型/大型哺乳动物。
5.根据权利要求1-4任一所述的生物制品,其特征在于,所述外泌体的提取来源与所述生物制品的施用对象为哺乳动物。
6.根据权利要求1-5任一所述的生物制品,其特征在于,所述外泌体的提取方法为:通过超速离心与外泌体试剂盒相结合的方式提取。
7.根据权利要求6所述的生物制品,其特征在于,所述外泌体的提取方法具体为:
S1.获得动物体血液,并分离得到血浆;
S2.若S1中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
S3.采用超速差异化离心方法对步骤S1中或S2中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
S4.采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
S5.若步骤S4中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
8.根据权利要求1-5任一所述的生物制品,其特征在于,所述生物制品中的外泌体粒径范围为100-250纳米,优选的外泌体粒径范围为180-220纳米。
9.一种生物制品的制备方法,其特征在于,所述生物制品为权利要求1-8任一所述的生物制品,其制备方法包括以下步骤:
1)获得动物体血液,并分离得到血浆;
2)若1)中获得的血浆不立即使用,则置于-80℃保存;
3)采用超速差异化离心方法对步骤1)中或2)中的血浆进行分离纯化,离心后得到上清液和含有粗提外泌体的沉淀;
4)采用外泌体分离试剂盒进行外泌体提取,得到外泌体终产物;
若步骤4)中获得的外泌体终产物不立即使用,则置于4℃保存并于14天内使用,或置于-80℃保存。
10.一种生物制品,其特征在于,所述生物制品的有效成分中,包含有一组miRNA,所述miRNA为miR-144、miR-149和/或miR-455;所述miRNA包含在权利要求1-9任一所述的外泌体中。
11.权利要求1或权利要求3-10任一所述的生物制品在制备抗衰焕活产品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述抗衰焕活产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、水凝胶包裹、滚针给药、无针注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
13.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述抗衰焕活产品的有效成分为外泌体时,其施用周期分为短期施用和长期施用;短期施用为将抗衰焕活产品每隔1-3天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg,连续施用6-8次;长期施用为将抗衰焕活产品每6-8天以静脉注射施用一次,每次剂量170-190μg。
14.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述抗衰焕活产品的有效成分为miRNA时,其是先构建miRNA过表达的质粒,再将含有所述质粒的抗衰焕活产品进行施用,施用周期为每6-8天静脉注射1-3次,施用剂量为每次4-6mg/kg。
15.根据权利要求11-14任一所述的应用,其特征在于,所述抗衰焕活产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于提高体内NAD+辅酶水平的方法、加入烟酰胺核糖苷NR/烟酰胺单核苷酸NMN制剂、加入雷帕霉素制剂。
16.权利要求2或权利要求3-10任一所述的生物制品在制备促进毛发再生产品中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述促进毛发再生产品的施用方式包括但不限于:口服、外敷、微针、抗氧化和抗菌冷冻凝胶伤口敷料OxOBand、水凝胶包裹、滚针给药、无针注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、纳米电穿孔递送、水光针、静脉注射和/或静脉滴注。
18.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述促进毛发再生产品的有效成分为外泌体时,其施用周期为3-30天,施用方式为外敷涂抹至脱发或伤痕部位,每天1次,每次剂量为200-2400μg/cm2,优选为200-600μg/cm2或1000-2000μg/cm2。
19.根据权利要求16-18任一所述的应用,其特征在于,所述促进毛发再生产品中,还包括有可与生物制品联用的其它制剂或方法,包括但不限于加入防脱药剂米诺地尔、非那雄胺;加入愈伤药剂疤克;透明质酸钠与外泌体混合以增加外泌体透皮效率。
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