CN116419756A - N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物用于治疗运动神经元疾病和神经肌肉接头病症的用途 - Google Patents

N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物用于治疗运动神经元疾病和神经肌肉接头病症的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及N‑(3‑(4‑(3‑(二异丁基氨基)丙基)哌嗪‑1‑基)丙基)‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑胺的硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物用于治疗和/或预防运动神经元疾病和神经肌肉接头病症。

Description

N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯 并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物用于治疗运动神经元疾 病和神经肌肉接头病症的用途
技术领域
本发明涉及N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物在治疗和/或预防运动神经元疾病和神经肌肉接头病症中的新用途。
背景技术
运动神经元疾病(MND)和神经肌肉接头病症(NJD)均被认为是神经肌肉障碍，其导致随着时间变得更明显的肌无力和疲劳。
运动神经元是存在于中枢神经系统(运动皮质、脑干、脊髓…)和外周神经系统中负责控制器官(如肌肉和腺体)的神经元细胞。运动神经元分为上运动神经元或下运动神经元。上部运动神经元(UMN)位于大脑皮质和脑干中，它们通过谷氨酸能神经传递将信号传递至中间神经元和下运动神经元(LMN)。LMN位于脊髓中并支配骨骼肌纤维(神经肌肉接头)，其中乙酰胆碱被释放以携带信号穿过肌肉细胞膜，发出肌肉收缩或放松的信号。UMN和LMN通常对于随意运动、平衡、身体姿势调节和肌肉控制都是必要的。
进行性运动神经元变性是运动神经元疾病的标志，其最终导致运动神经元凋亡和运动单位(定义运动神经元的单位－其轴突－神经肌肉接头－其共同支配的单个肌纤维)的肌束震颤，防止控制肌肉的神经流入的传递。运动神经元细胞体的死亡是MND中的主要过程，并且它与运动神经元和少突胶质细胞中聚集蛋白的沉积以及神经炎症一起发生。这些可影响UMN或LMN甚至两者的疾病引起肌无力、张力减退、运动低下、反射损伤和肌肉萎缩。
存在许多运动神经元疾病，并且肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最常见的可影响UMN和LMN的获得性运动神经元疾病。散发性ALS是在没有已知受疾病影响的家族成员的患者中诊断出的ALS的最常见形式(≥个病例的90％)。家族性ALS是遗传来源的并且在家族中存在，已经鉴定了几种基因突变并与其相关。最常见的是9号染色体开放阅读框72(C9ORF72)，并且也可导致患者罹患认知缺陷：ALS-FTD是ALS的特定形式，其中患者还患有额颞叶痴呆(FTD)。具有帕金森-痴呆复合体1的肌萎缩性侧索硬化(ALS-PDC)或Lytico-bodig病是其中患者经历ALS，痴呆和帕金森病(PD)症状的ALS形式。与家族性和散发性ALS相关的其它已知基因包括编码超氧化物歧化酶1(SOD1)、43-kDa的TAR DNA结合蛋白(TDP-43)、RNA结合蛋白(FUS/TLS：在肉瘤中融合/在肉瘤中易位)和泛素2(UBQLN2)。这些突变可引起这些蛋白质在运动神经元和星形胶质细胞中的毒性积聚，从而随后导致神经元死亡。显示43-kDa的TARDNA结合蛋白(TDP-43)在大多数ALS病例中积聚在运动神经元的细胞质中。TDP-43是参与RNA加工的几个方面的核RNA结合蛋白，其在细胞核和细胞质之间主动穿梭。在ALS中，TDP-43被排除在细胞核之外，但是这种细胞质错误定位在神经元损伤或应激中是常见的，并且TDP-43阳性包含物可以代表运动神经元疾病中的继发性病理。
其它运动神经元疾病可以仅影响UMN(如原发性侧索硬化(PLS))或仅影响LMN(如进行性肌萎缩(PMA))。此外，LMN变性和ALS可影响神经肌肉接头(Dupuis L et al CurrDrug Targets2010；11(10):1250-1261-Gromova A et al,Trends Neurosci.2020Sep；43(9):709-724-Hashizume A et al,J Neurol Neurosurg Psychiatry2020Oct；91(10):1085-1091)。NJD靶向该关键区域并阻断正常传递到肌肉的神经冲动以促进运动或其收缩。肌无力综合征(重症肌无力和Eaton-Lambert综合征)通过免疫或遗传过程影响突触传递的功效。在这些病理学中，NMJ的绝对数量保持大致相同，但是它们响应于运动神经元刺激而触发肌肉动作电位的功效降低，导致易疲劳的肌无力(Gilhus NE et al Curr OpinNeurol.2012Oct；25(5):523-9)。此外，认识到设计治疗以加强并稳定剩余的NMJ(具有LMN变性的疾病的常见最终途径)将对ALS、脊髓性肌萎缩(SMA)和脊髓延髓性肌萎缩(SBMA)患者同样有益。
目前美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)仅批准一种用于ALS患者的治疗方法。利鲁唑是阻断CNS中谷氨酸能神经传递的口服药物。认为这些作用可能部分是由于谷氨酸能神经末梢上电压依赖性钠通道的失活。利鲁唑还通过非竞争性阻断N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体来阻断谷氨酸的一些突触后效应。但是，利鲁唑对运动和呼吸功能没有影响，并且既不适用于晚期形式的ALS，也不适用于其它运动神经元疾病。
在3期临床试验中，静脉内注射的自由基清除剂Edavarone在患有ALS的小亚组人群中显示出功效。该研究表明与安慰剂相比，ALS功能评定量表修订评分的下降显著较小。迄今为止，没有迹象表明依达拉奉可能在不符合标准的ALS患者的更广泛群体中有效(Abeet al.,Lancet Neurol.2017,16(7),505-512)，并且EMA撤回了用于ALS治疗的上市许可申请。
除可能具有严重副作用的皮质类固醇或免疫抑制剂外，没有可用于神经肌肉接头病症的特定治疗。
先前在WO2014/102339中公开的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物可用于治疗和/或预防神经变性疾病、淀粉样蛋白病、tau蛋白病和发育性疾病。这些化合物对于阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病特别有意义：正在进行N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐用于患有进行性核上性麻痹(PSP)的患者的2A期临床试验。这些盐能够调节Tau磷酸化并增加颗粒蛋白前体(PGRN)神经营养因子水平，已知该缺陷加速Tau沉积和磷酸化，如在表达人tau的小鼠中所证实的(J.Neuropathol.Exp.Neurol.74,158–165(2015))。因此，这些化合物尤其可用于治疗tau蛋白病，例如额颞痴呆，并因此被提议用于特异性治疗ALS-FTD。
患有运动神经元疾病或神经肌肉接头病症的患者可获得的治疗有限，并且本领域仍然需要可用于治疗或预防这些疾病的新的化学实体，因此本申请人研究了使用N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物用于该目的的潜力。
发明概述
本发明基于出乎意料的发现：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐对运动神经元和神经肌肉接头具有神经保护作用。
因此，本发明涉及N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物，其用于治疗和/或预防运动神经元疾病和神经肌肉接头病症。
此外，本申请人已经表明，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其溶剂合物能够减少运动神经元中TDP43从细胞核至细胞质的异常易位(在大多数ALS病例中观察到的病理特征)。
发明详述
申请人已显示N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物通过在谷氨酸诱导的损伤后促进其存活和其神经突网络的完整性，对野生型大鼠和SOD1G93A tg大鼠脊髓运动神经元的原代培养物发挥有益作用。此外，TDP-43从运动神经元的细胞核到细胞质的异常易位是在大多数ALS病例中观察到的病理特征。实施例部分中呈现的结果表明，所述硫酸盐还可以逆转谷氨酸能应激下TDP-43从细胞核到细胞质的异常易位。
此外，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物在成肌细胞和脊髓外植体的共培养中成功地保护神经肌肉接头和神经突网络对抗谷氨酸能应激。
所有这些发现支持N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物可以是改进运动神经元疾病(如ALS、SMA和SBMA)以及神经肌肉接头病症(如重症肌无力和Eaton-Lambert综合征)的有效疗法。
运动神经元疾病和神经肌肉接头病症包括但不限于非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、神经性昏迷、Konzo、Tay-Sachs病、Sandhoff病、进行性肌萎缩(PMA)、单体性肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、脊髓灰质炎后综合征、照射后综合征、僵人综合征、由事故引起的运动单元障碍、重症肌无力和Eaton-Lambert综合征。
非FTD肌萎缩性侧索硬化是指与额颞叶痴呆不相关的散发性或家族性肌萎缩性侧索硬化的形式，并且包括具有帕金森-痴呆复合体1(ALS-PDC)的肌萎缩性侧索硬化、由编码超氧化物歧化酶1(SOD1)、43-kDa的TAR DNA结合蛋白(TDP-43)、RNA结合蛋白(FUS/TLS：在肉瘤中融合/在肉瘤中易位)和泛素2(UBQLN2)的基因之一突变引起的家族性肌萎缩性侧索硬化。在ALS中，与肢体发作或LMN表现的患者相比，延髓发作的患者进展更快。最近对区域变体的描述提示一些患者具有分离到单个脊髓区域的ALS，包括肱型肌萎缩性两侧瘫痪、腿型肌萎缩性两侧瘫痪和分离的延髓麻痹，所有这些在本文中都是非FTD肌萎缩性侧索硬化的变体。非FTD ALS还包括呼吸发作型ALS，一种罕见的变体，占所有ALS病例的约3％，其中最初症状是休息时用力呼吸困难。
原发性侧索硬化(PLS)是一种引起脑内神经缓慢分解的运动神经元疾病。这使得神经不能激活控制肌肉的脊髓中的运动神经元。
遗传性痉挛性截瘫(HSP)也称为家族性痉挛性截瘫(FSP)，是由缓慢退化的上运动神经元引起的，引起进行性痉挛状态和腿无力。这导致行走困难。随着退化持续，症状恶化，包括视力受损、共济失调、癫痫、认知障碍、周围神经病变和/或耳聋。
神经山黧豆中毒是由来自消耗大量含有高浓度谷氨酸类似物神经毒素β-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(ODAP)的山黧豆属某些豆科植物的毒素引起的。ODAP是线粒体的毒物，导致过度的细胞死亡，尤其是在运动神经元中；这种毒素引起瘫痪，其特征在于缺乏力量或不能移动下肢，并且可能涉及锥体束，产生上运动神经元损伤的体征。
进行性肌萎缩(PMA)也称为杜氏肌萎缩，其临床特征在于较低运动神经元功能障碍的体征并可发展为ALS。PMA的症状包括萎缩、肌无力、反射缺乏和痉挛缺乏，症状可限于手臂、腿或两者。
单体性肌肉萎缩也称为良性局灶性肌肉萎缩、青少年节段性萎缩和Hirayama病，是一种罕见的良性下运动神经元疾病，其特征在于青春期远端上肢的肌无力和消瘦，随后是进展的自发停止和症状的稳定。
脊髓性肌萎缩(SMA)是通过影响脊髓中的运动神经细胞，带走行走、进食或呼吸的能力而使人丧失体力的疾病。SMA由控制肌肉的神经功能的关键的存活运动神经元基因1(SMN1)中的突变引起。没有它，神经细胞不能正常起作用并最终死亡，导致衰弱和有时致命的肌无力。
脊髓-延髓肌肉萎缩症(SBMA)也称为球脊髓肌肉萎缩症和肯尼迪病，是一种遗传性病症，其中运动神经元的丧失影响随意肌运动，特别是面部和吞咽肌肉，以及手臂和腿部肌肉，特别是最靠近身体中心的肌肉。
进行性延髓麻痹(PBP)涉及上和下运动。这种形式的MND经常引起言语或吞咽困难。如果下运动神经元受到影响，则舌头倾向于萎缩，伴有可见的肌束震颤和活动减少。这导致了相当鼻音的说话类型。如果上运动神经元受到影响，舌头是痉挛的并倾向于引起构音障碍，说话机制困难。
僵直性综合征(也称为僵直性谱系障碍)是影响脑和脊髓的神经障碍，其引起波动的躯干和四肢僵硬，疼痛的肌肉痉挛，任务特异性恐怖症，夸大的惊跳应答和强直性畸形，如固定的腰椎脊柱后凸。
本文所用的“由事故引起的运动单元障碍”是指其中由于事故，例如家庭或交通事故后运动单元的神经病变而受损的障碍。
重症肌无力是损害神经肌肉接头处乙酰胆碱传递的自身免疫性疾病，即攻击乙酰胆碱受体导致肌无力的抗体。重症肌无力最常见的症状是虚弱、眼睑下垂、眼肌虚弱，其引起复视和使用后受累肌肉过度虚弱。
Eaton-Lambert综合征是其中抗体干扰神经肌肉接头处神经递质乙酰胆碱受体的释放的自身免疫性疾病。其导致肌无力，该肌无力倾向于在臀部和大腿肌肉中开始，然后典型地蔓延至肩部肌肉，然后沿臂和腿向下至手和脚。将头部、面部、眼睛、鼻子、肌肉和耳朵连接到大脑的神经(颅神经)最后受到影响。
在一个实施方案中，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐是式I的那些。
Figure BDA0004143139690000071
其中x是0.5-4，优选x是0.5-3.5，更优选x是0.9-3。
换言之，对于一分子N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐包含0.5-4当量，优选0.5-3.5当量，更优选0.9-3当量的硫酸。
在一个优选实施方案中，x是1.7-2.3，优选x是1.9-2.1，更优选x是约2或x是2。
在一个特别优选的实施方案中，硫酸盐是N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐。
在一个实施方式中，式I的硫酸盐为药学可接受的溶剂合物形式，优选水合物形式。对于1分子式I硫酸盐，溶剂合物化学计量为0.5-5，优选1-4，更优选1.5-2.5，仍然更优选1.8-2.2，甚至更优选2或约2分子溶剂合物。
因此，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐和药学上可接受的溶剂合物可用作药物，特别是用于治疗或预防运动神经元疾病、神经肌肉接头病症和其中观察到运动神经元中TDP43从细胞核至细胞质的异常易位的所有疾病。
因此，本发明还涉及如本文所定义的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于治疗和/或预防运动神经元疾病和神经肌肉接头病症，特别选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、神经山黧豆中毒、Konzo、Tay-Sachs病、Sandhoff病、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、脊髓灰质炎后综合征、照射后综合征、僵人综合征、由事故引起的运动单元障碍、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征。优选地，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征、由事故引起的运动单元障碍。更优选地，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。甚至更优选地，所述疾病是非FTD肌萎缩性侧索硬化。
在其它方面，本发明还提供了治疗和/或预防运动神经元疾病或神经肌肉接头病症，特别是以上引用的那些的方法及其实施方案，其包括向有需要的患者施用药学有效量的如本文所述的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。在具体实施方案中，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。
在其它方面，本发明还提供如本文所述的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防运动神经元疾病或神经肌肉接头病症，特别是以上引用的那些的药物中的用途及其实施方案。在具体实施方案中，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。
在一个具体实施方案中，本发明还涉及如本文所定义的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物，其用于延迟患者中运动神经元疾病和神经肌肉接头病症的发作，所述运动神经元疾病和神经肌肉接头病症特别地选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、神经山黧豆中毒、Konzo、Tay-Sachs病、Sandhoff病、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、脊髓灰质炎后综合征，照射后综合征、僵人综合征、由事故引起的运动单元障碍、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征。优选地，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征、由事故引起的运动单元障碍。更优选地，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。甚至更优选地，所述疾病是非FTD肌萎缩性侧索硬化。
在其它方面，本发明提供用于延迟患者中运动神经元疾病或神经肌肉接头病症，特别是以上引用的那些的发作的方法及其实施方案，所述方法包括向有需要的患者施用药学有效量的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。在具体实施方案中，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。
在其它方面，本发明还提供如本文所述的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物在制备用于在患者中延迟运动神经元疾病或神经肌肉接头病症，特别是以上引用的那些的发作的药物中的用途及其实施方案。在具体实施方案中，所述疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓性肌萎缩(SBMA)、进行性延髓性麻痹(PBP)。
根据本发明的另一个特征，提供了用于在需要此类治疗的患者，优选温血动物，并且甚至更优选人中减少运动神经元中TDP43从细胞核至细胞质的异常易位的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物。
根据一个实施方案，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐以及其药学上可接受的溶剂合物可作为组合疗法的一部分施用。因此，包括组合物和药物的共施用的实施方案包括在本发明的范围内，所述组合物和药物除了包含N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐或其药学上可接受的溶剂合物作为活性成分之外，还含有另外的治疗剂和/或活性成分。这种多药物方案，通常称为“联合治疗”，可用于治疗和/或预防任何运动神经元疾病或神经肌肉接头病症。在需要治疗的患者或处于变成这种患者的风险中的患者中，使用这种治疗剂组合尤其与上述运动神经元疾病的治疗有关。
除可能需要使用除N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物之外的活性剂的治疗功效的要求之外，存在额外的迫使或高度推荐联合使用涉及活性成分的药物的理由，所述活性成分代表辅助治疗，即其补充和增补通过N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物执行的功能。用于辅助治疗目的的适合的补充治疗剂包括不直接治疗和/或预防由运动神经元变性、神经肌肉接头变性和/或运动神经元细胞质中TDP-43的病理性积聚介导或与其相关的疾病或病症而是治疗由所述变性直接产生或间接伴生的疾病或病症的药物。
根据本发明的另一个特征，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的琥珀酸盐，其药学上可接受的溶剂合物可以与用于治疗运动神经元疾病(如ALS、SMA、SBMA)和神经肌肉接头病症(如重症肌无力)和Eaton-Lambert综合征的其他药物组合治疗。更特别地，式I化合物及其药学上可接受的溶剂合物可与利鲁唑、依达拉奉、吡啶斯的明、葡糖神经酰胺降解抑制剂(如氨溴索和环庚醇B环氧化物)、乙酰胆碱释放诱导剂(如胍)、皮质类固醇(如泼尼松龙)、抗癫痫药(如卡马西平和苯妥英)，或如VanEijk et al.,Current opinion in neurology 2020,33(5),655所公开的目前正在用于治疗ALS的临床试验中的药物组合用作辅助疗法。
因此，本发明的治疗方法和药物组合物可以在运动神经元疾病和神经肌肉接头病症的单一疗法中使用N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺或其药学可接受的溶剂合物。然而，所述方法和组合物也可以用于多重疗法，其中一种或多种N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺或其药学可接受的盐或溶剂合物与一种或多种其他的治疗剂结合而共施用。
在上述实施方案中，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺或其药学可接受的盐或溶剂合物和其他治疗学活性剂的组合可以在剂型方面单独或结合彼此和在其施用时间方面顺次或同时施用。因此，施用一种组分试剂可以在施用其他组分试剂之前、同时或之后。
通常，对于药学应用，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物可配制成药物组合物，其包含N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的至少一种硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物和至少一种药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂以及任选的一种或多种其他治疗剂和/或活性成分。
作为非限制性实例，药物组合物可以是适于口服施用、肠胃外施用(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部施用、通过吸入、通过皮肤贴剂、通过植入物、通过栓剂等施用的剂型。这种适合的施用形式(其取决于施用方式可以是固体、半固体或液体)以及方法和供其制剂用的载体、稀释剂和赋形剂将对于技术人员而言是清楚的；参考最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences。药物组合物可配制成固体形式并在使用之前再分散或悬浮。
一些优选但非限制性的剂型实例包括片剂、丸剂、粉末、锭剂、小袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软膏、霜剂、洗液、软和硬胶囊、栓剂、滴剂、作为推注施用和/或连续施用的灭菌可注射溶液和灭菌包装粉末(其通常在使用之前重组)，其可与本身适合于这种制剂的载体、赋形剂和稀释剂一起配制，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、琼脂、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、凝胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、纤维素、(无菌)水、甲基纤维素、甲基-和丙基羟基苯甲酸盐、滑石、硬脂酸镁、食用油、植物油和矿物油或其合适的混合物。药物组合物可以任选包含通常用于药物制剂的其他物质，例如润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、等渗剂、膨胀剂、填充剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、着色剂、抗菌剂和/或抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、分配剂、流动调节剂、释放剂等。所述组合物也可以配制以便提供包含于其中的活性物质的快速释放、持续释放或延迟释放。
本发明的药物组合物优选为单位剂型，且可以合适地包装于例如盒子、泡罩、小瓶、瓶子、小袋、安瓿或任何其他适合的单剂量或多剂量储器或容器(其可以适当标记)中；任选带有一种或多种包含产品信息的传单和/或使用说明书。通常，这种单位剂量将包含0.05-1000mg，通常1-500mg的至少一种本发明化合物，例如大约10、25、50、100、200、300或400mg/单位剂量。
通常，取决于待预防或治疗的病症和施用途径，本发明活性化合物通常以0.01-100mg/公斤施用，更通常为0.1-50mg，例如1-25mg，如约0.5、1、2、5、10、15、20或25mg/公斤患者体重/天，其可作为单一日剂量、分成一个或多个日剂量、或基本上连续例如利用滴注输注而施用。
式I化合物的所有参考包括参考溶剂合物，特别是其水合物、多组分络合物和液体晶体。
遍及本申请公开的化合物采用
Figure BDA0004143139690000131
Ultra 11.0版本(CambridgeSoft,Cambridge,MA,USA)命名。
N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的游离碱可如WO2006/051489中所公开获得，其硫酸盐及其溶剂合物根据WO2014/102339中所报导的程序制备。
定义
下文的定义和解释是针对整个申请中使用的术语，包括说明书、附图和权利要求。
术语“施用(administration)”或其变体(例如“施用(administering)”)是指向待治疗或预防病症、症状或疾病的患者单独或作为药学可接受的组合物的一部分提供活性剂或活性成分(例如N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)。
术语“人”是指两性和在任何发育阶段的受试者(即新生儿、婴儿、幼年、青年、成人)。
术语“患者”是指恒温动物，更优选人，他/它等待接受或正在接受医疗护理或是/将是医学程序的对象。
“药学可接受”是指药物组合物的成分彼此相容且对其患者无害。
本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指延迟或阻止病症或疾病和/或其伴随症状的发作、阻止患者获得病症或疾病、或降低患者获得病症或疾病的风险的方法。
本文所用的表述“降低”是指部分降低或完全降低。
本文使用术语“溶剂合物”来描述在本发明中包含化学计量或亚化学计量的一种或多种药学可接受的溶剂分子(例如乙醇)的化合物。当所述溶剂是水时，使用术语“水合物”。药学可接受的溶剂分子可以与本发明化合物共结晶，和/或存在于其固体的结晶相和/或无定形相中，和/或吸附在其上。
本文使用的术语“治疗有效量”(或更简单的“有效量”)是指足以在向它/他施用的患者中实现期望的治疗性或预防性作用的活性剂或活性成分(例如N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)的量。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”意指包括缓解、减弱或去除病症或疾病和/或其伴随症状。
参考以下实施例将更好地理解本发明。这些实施例旨在代表本发明的具体实施方案，而不旨在限制本发明的范围。
附图说明
图1显示在大鼠脊髓运动神经元的原代培养物中，在谷氨酸损伤20分钟后孵育N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐48小时对MAP-2阳性MN的存活(A)、神经突网络(B)和核外TDP-43(eTDP43)(C)的影响。结果以对照的百分比表示为平均值±SEM(n＝5-6/组)。单向ANOVA分析，随后进行PLSD Fisher检验。
图2显示在谷氨酸损伤20分钟前预孵育N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐24小时加损伤后孵育24小时对MAP-2阳性MN的存活(A)、神经突网络(B)和核外TDP-43(eTDP43)(C)的影响。结果以对照的百分比表示为平均值±SEM(n＝5-6/组)。单向ANOVA分析，随后进行PLSD Fisher检验。
图3显示与利鲁唑(Ril)和Edavarone(Eda)相比，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐在用谷氨酸损伤的SOD1G93A Tg大鼠脊髓运动神经元的原代培养物中的作用。(A)神经元的数量(A)，神经突网络的完整性(B)和TDP43的易位(C)。结果以对照的百分比表示为平均值+/-SEM(n＝4-6)。单向ANOVA分析，随后进行PLSD Fisher检验。
图4显示与利鲁唑(Ril)相比，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐在用谷氨酸盐损伤的脊髓外植体和成肌细胞的共培养物中的作用：(A)NMJ的数目，(B)NMJ的大小，和(C)NFH(+)MN的神经突网络。结果以对照的百分比表示为平均值+/-SEM(n＝4-6)。单向ANOVA分析，随后进行PLSD Fisher检验。
具体实施方式
实施例1：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐对用谷氨酸损伤的大鼠原代运动神经元的作用
原代运动神经元的培养
大鼠运动神经元(MN)如Martinou et al.,Neuron.1992,Apr；8(4),737-44和Wanget al.Hum.Mol.Genet.,2013Dec 1；22(23),4706-19之前所述来培养。将妊娠14天的怀孕雌性大鼠(Rats Wistar；Janvier Labs France)用CO2深度麻醉，然后颈脱位处死。然后，从子宫中取出胎儿并立即置于含有2％青霉素(10,000U/mL)和链霉素(10mg/mL)溶液(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷L15 Leibovitz培养基中。在37℃下，用最终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸酸(EDTA)处理脊髓20分钟。通过添加含有4.5g/升葡萄糖的Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM)停止解离，所述培养基含有II级DNA酶I(终浓度0.5mg/mL)和10％胎牛血清(FCS)。通过10-mM移液管尖端的三次强制通过来机械解离细胞。然后将细胞在+4℃下在L15培养基中的BSA(3.5％)层上以180x g离心10min。弃去上清液，并将沉淀重悬于由含2％B27补充物溶液，2mmol/升L-谷氨酰胺，2％PS溶液和10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)的Neurobasal培养基组成的确定培养基中。使用台盼蓝排除试验在Neubauer细胞计数器中计数活细胞。将细胞以20，000/孔的密度接种在用聚-L-赖氨酸预包被的96孔板(免疫染色)中，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。每2天更换培养基。培养13天后，运动神经元被谷氨酸损伤。
化合物处理
在培养的第13天，添加谷氨酸至终浓度为5μM，在硫酸盐存在下在对照培养基中稀释20分钟。20分钟后，洗涤谷氨酸盐，并添加含有硫酸盐的新鲜培养基48小时。
终点评价-48小时共培养
培养14或15天后(谷氨酸损伤后48小时)，收集细胞培养上清液，并在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定脊髓MN 5分钟。用0.1％皂苷透化后，用含有1％胎牛血清的PBS阻断细胞2小时。然后，将细胞与以下一起孵育：
a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/400稀释的小鼠单克隆抗体抗微管相关蛋白2(MAP-2)。该抗体特异性结合存在于所有MN的细胞体和神经突中的MAP-2。用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG显示该抗体。通过荧光标记(Hoechst溶液)标记神经元的核。
b)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗-TDP43。研究了TDP43的细胞质定位。用Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG显示该抗体。
对于每种条件，使用ImageXpress(Molecular Devices)以20x放大倍数自动拍摄每孔30张照片(代表孔面积的90％)。在相同条件(曝光时间、增益和激光强度)下拍摄所有图像。使用定制模块编辑器(Molecular Devices)自动进行不同终点的分析。使用以下形态学标准区分运动神经元(MAP-2)和中间神经元(染色MAP-2)：细胞体直径>15mm并且存在最少三个神经炎过程(Ferraiuolo et al.Brain 2011:134；2627–2641)。
终点为：
-MN的存活(MN的数目)
-MN的总神经突生长(以μm表示)
-MN中的TDP43(核外的，eTDP43)(表示为面积eTDP43-μm2/MN的数目)
统计分析
所有值均表示为平均值+/-SEM。通过单向ANOVA进行统计分析，然后进行PLSDFisher检验。使用GraphPad Prism软件版本7.04对不同条件进行Neuro-Sys图形和统计分析。*p<0.05被认为是显著的。
结果
·运动神经元存活：如所预期，与对照组相比，谷氨酸中毒显著降低细胞存活(平均存活：55％；图1A)。与谷氨酸盐条件相比，低剂量的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐(10nM至30nM)对存活显示出积极且显著的影响。用30nM的剂量获得最大效果(平均存活率：82％)。
·神经突网络完整性：谷氨酸显著减少神经突网络(图1B)。所有研究剂量的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐施用能够改进谷氨酸损伤后的神经突网络，其中在30nM具有最大作用(平均长度：80％)。
·核外TDP-43：谷氨酸施用显著增加异常细胞质TDP-43信号(图1C)。浓度为10和30nM的二硫酸盐能够防止TDP-43在细胞质中的积聚。
实施例2：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐预处理对用谷氨酸盐损伤的大鼠原代运动神经元的作用：24h预处理-损伤-24h处理
原代运动神经元的培养
如实施例1所述进行培养。
化合物处理-24h预孵育+24h共孵育
在培养的第12天，用硫酸盐处理原代运动神经元24小时。在培养的第13天，添加谷氨酸至终浓度为5μM，在硫酸盐存在下在对照培养基中稀释20分钟。20分钟后，洗涤谷氨酸盐，并且添加含有硫酸盐的新鲜培养基24小时。
终点评价
如实施例1所述进行终点评价。
统计分析
如实施例1所述进行统计分析。
结果
·运动神经元存活：如所预期，与对照组相比，谷氨酸显著降低细胞存活(平均存活：65％；图2A)。与谷氨酸盐条件相比，低剂量的硫酸盐(3nM至30nM)对存活显示出积极且显著的影响。用30nM的硫酸盐剂量获得最大效果(平均存活率：87％)。
·神经突网络完整性：谷氨酸强烈地损伤脊髓运动神经元的神经突网络(图1B)。所有研究剂量的硫酸盐能够保护神经突网络免受谷氨酸损伤，最大效应在30nM(平均长度：91％)。
·核外TDP-43：谷氨酸应用显著增加细胞质TDP43信号(平均eTDP-43信号：与对照相比128％，图1C)。硫酸盐(10nM至30nM的剂量下)也能够完全防止TDP-43的异常分布。
实施例3：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐对谷氨酸损伤后大鼠原代SOD1运动神经元成熟的作用
遗传啮齿动物模型已用于研究ALS发病机制，包括过度表达具有已知引起人家族性ALS的突变的人超氧化物歧化酶1(SOD1)的大鼠(例如SOD1G93A大鼠)。表达hSOD-1G93A的突变形式的ALS大鼠模型表现出密切概括人疾病的临床和组织病理学特征的特征(Nagaiet al.,The Journal of Neuroscience,December 1,2001,21(23):9246–9254)。在人或啮齿动物研究(SOD1模型)中，MN损失之前是兴奋性增加。当增加的神经元兴奋性与树突状结构和棘的结构改变相关时，观察到纹状体中型多棘神经元(MSN)和腰脊髓的下MN中的树突状萎缩和棘损失(Ferrucci et al.,Neurobiology of Disease 37(2010)370–383；Avossaet al.,Neuroscience 138(2006)1179–1194)。
SOD1运动神经元胚胎的基因分型
在解剖当天(从妊娠第14天的怀孕雌性)，用新的解剖刀将每一片胚胎头(～3mm3)置于2mL管游离DNA酶中。用SYBR Green Extract-N-Amp组织PCR试剂盒(Sigma Aldrich)提取DNA。简言之，将120μL提取溶液置于每片胚胎头上。然后，将它们在室温下孵育10分钟。在该孵育期结束时，将胚胎头在95℃下孵育5分钟。最后一次孵育后立即添加100μL中和溶液；将每种DNA提取物以1/40稀释并储存在+4℃下直至使用。使用具有人SOD1引物(5'-CATCAGCCCTAATCCATCTGA-3'；5'-CGCGACTAACAATCAAAGTGA-3')的基因组片段测定SOD1G93A基因。将SOD1引物在无菌超纯水中以3μM稀释。简言之，用超纯水(4μL/样品)、3μM引物(2μL/样品)和主混合物(10μL/样品)制备用于PCR的混合物。在PCR 96孔板中，在每个孔中添加16μL PCR混合物。根据计划储备添加4μL每种稀释的DNA。
使用CFX96 Biorad RT-PCR系统，使用以下程序进行RT-PCR：
-开始：95℃－20秒
-45个循环：95℃－10秒，65℃－10秒，72℃－30秒(数据采集)
-熔融曲线：95℃－15秒，64℃－1分钟，90℃－30秒(连续数据采集)，60℃15秒
利用Biorad软件分析扩增曲线和熔解曲线。
将每个样品的结果与阴性对照(超纯水)和阳性对照进行比较，以总结每个胚胎的基因型(WT或Tg)。
脊髓SOD1运动神经元的培养
如Martinou et al.,Neuron.1992,Apr；8(4),737-44and Wang etal.Hum.Mol.Genet.,2013Dec 1；22(23),4706-19所述培养大鼠脊髓(SC)运动神经元。通过颈脱位处死妊娠14天的怀孕雌性大鼠。收集胎儿并立即置于含有2％青霉素(10,000U/mL)和链霉素(10mg/mL)溶液(PS)和1％牛血清白蛋白(BSA)的冰冷L15 Leibovitz培养基中。将每个胎儿分配到编号的皮氏培养皿(直径35mm)上。切取胎尾，置于1.5ml试管游离DNA酶上；用Extract-N-Amp组织试剂盒提取DNA。
用试剂盒Fast SYBR Green Master Mix进行SOD tg胎儿的基因分型。该基因分型在脊髓解剖期间进行，因此在SOD Tg脊髓和WT脊髓的解剖培养结束时进行。取出脊髓并置于冰冷的Leibovitz培养基(L15)中。
将SC在37℃下用胰蛋白酶-EDTA溶液以0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的终浓度处理20分钟。通过添加含有4.5g/升葡萄糖的Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM)停止解离，所述培养基含有II级DNA酶I(终浓度0.5mg/mL)和10％胎牛血清(FCS)。通过10-mM移液管尖端的三次强制通过来机械解离细胞。然后，将细胞在+4℃下在L15培养基中的BSA(3.5％)层上以180x g离心10min。弃去上清液，并将沉淀重悬于由含2％B27补充物溶液，2mmol/升L-谷氨酰胺，2％PS溶液和10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)的Neurobasal培养基组成的确定培养基中。使用台盼蓝排除试验，在Neubauer细胞计数器中计数活细胞。将细胞以20，000/孔的密度接种在用聚-L-赖氨酸预包被的96孔板(免疫染色)中，并在37℃下在空气(95％)-CO2(5％)培养箱中培养。每2天更换培养基。
化合物处理-48h共孵育
在第13天，除去培养基并在37℃下将培养物暴露于限定培养基中的测试化合物：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐，对比利鲁唑和Edavarone以及谷氨酸盐(5μM)20分钟。谷氨酸盐暴露后，在37℃下将培养物用限定培养基洗涤，然后再置于含有测试化合物的新鲜培养基中48小时。
终点评价
培养15天后(谷氨酸损伤后48小时)，取出细胞培养上清液，通过乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液在-20℃固定脊髓运动神经元5分钟。
在用0.1％皂苷透化后，将细胞与以下一起孵育2小时：
-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/400稀释的小鼠单克隆抗体抗微管相关蛋白2(MAP-2)(该抗体染色所有运动神经元，成熟和早期分化的)，用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG显示该抗体。
-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的PBS中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗-TDP43(该抗体结合TDP43，其是一种在ALS中发生异常易位的蛋白质)。考虑TDP-43(细胞核和细胞质)。用Alexa Fluor568山羊抗兔IgG显示该抗体。神经元的核用荧光标记物(Hoechst溶液)标记。
终点为：
-MN的总存活(MAP-2阳性MN的数目)，
-MAP-2阳性神经突的总神经突网络(以μm表示的长度)，
-MN中的细胞质TDP43(核外，eTDP-43)表示为面积(μm2)/MN的数目。
统计分析
如实施例1所述进行统计分析。
结果
谷氨酸的应用显著减少了MN的数目，减少了它们的神经突网络的长度并引发了TDP-43向细胞质的异常分布(参见图3)。
所有研究剂量的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐是神经保护性的。对神经元存活和TDP-43分布的保护作用是剂量依赖性的。在300nM的剂量下，即使分别在较高的1μM和5μM浓度下，N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐的保护作用大于利鲁唑或依达拉奉的保护作用。
实施例4：N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐对谷氨酸损伤的脊髓/肌肉神经肌肉接头的作用。
人成肌细胞和大鼠脊髓外植体的培养
所有实验均根据国家实验动物护理和使用健康指导机构进行，并遵循现行欧洲联盟法规(指令2010/63/EU)。
从解离的细胞(每孔22000个细胞)建立人肌肉细胞系。将它们接种在明胶包被的0.1％水溶液中的48孔板上，并使其在增殖培养基中生长，所述增殖培养基由62％MEM培养基和25％M199培养基的混合物组成，所述M199培养基补充有谷氨酰胺2Mm、人胰岛素10μg/mL、人重组表皮生长因子10ng/mL(EGF)、人重组成纤维细胞生长因子基础2ng/mL(bFGF)、胎牛血清10％(FCS)和2％青霉素10.000U/mL和链霉素10.000μg/mL(PS)。每2天更换一次培养基。
培养开始后5天，卫星细胞融合后立即将取自13天大的大鼠Wistar胚胎(JanvierLabs,France)的附着有4个背根神经节(DRG)的脊髓的整个横向切片置于肌肉单层上(中央区域每孔一个外植体)。DRG的存在对于实现良好的神经分布比率是必要的。将受神经支配的培养物维持在由MEM和补充有5％FCS、胰岛素5μg/ml、谷氨酰胺2mM和2％PS的培养基199组成的混合(67％/25％)培养基中。共培养24小时后，通常观察到来自脊髓外植体的神经突伸长。这些神经突与肌管接触并诱导神经肌肉接头的形成，并且在共培养约8天后观察到第一次收缩。此后很快，位于脊髓外植体附近的受神经支配的肌纤维实际上连续收缩。受神经支配的纤维在形态和空间上与非神经支配的纤维不同，并且可以容易地与它们区分开。将板在加湿培养箱中在空气(95％)-CO2(5％)的气氛中保持在37℃。
化合物处理-48h共孵育
在第27天(共培养)，将共培养物与N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐和谷氨酸盐应用一起孵育。添加谷氨酸盐至终浓度为60μM，在二硫酸盐存在下在对照培养基中稀释20分钟。
中毒20分钟后，除去上清液，再添加含有N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺)二硫酸盐的新鲜培养基48小时。
终点评价
免疫染色
中毒48小时后，将细胞与偶联Alexa 488的500nMα-金环蛇毒素在37℃下在培养基中孵育15分钟以检测运动终板。在PBS中洗涤2次后，在室温下用4％多聚甲醛的PBS溶液(pH＝7.3)固定细胞20分钟。
将细胞在PBS中洗涤两次。将含有0.1％皂苷和1％FCS的PBS溶液在室温下放置15分钟以透化细胞并封闭非特异性位点。
然后，在室温下将共培养物与在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1/400稀释的小鼠单克隆抗神经丝200KD抗体(NFH)孵育2小时。抗NFH抗体染色运动神经元的神经突和轴突。在室温下，将该抗体用在含有1％FCS、0.1％皂苷的PBS中以1/400稀释的Alexa Fluor568山羊抗小鼠IgG显示1小时。用Hoechst溶液标记神经元的核，Hoechst溶液是相同溶液中1μm/ml的核荧光标记。
分析
进行一次共培养(每种条件6个孔)。对于每种条件，使用ImageXpress(Moleculardevices)以10x放大倍数自动拍摄每孔20张照片。在相同条件下拍摄所有图像。
自动测量以下终点：
(1)NMJ的数量，
(2)NMJ的平均大小(NMJ面积以μm2表示)，
(3)总神经突长度(μm)(＝神经分布网络)。
统计分析
如实施例1所述进行统计分析。
结果
施用谷氨酸盐(60μM，20分钟)导致培养物中NMJ的数目(A)和总面积(B)显著减少。此外，损伤导致神经突(C)的显著损失。二硫酸盐(300nM)以剂量依赖性方式显示神经保护作用，因为它增加NMJ的数目、总面积和总神经突网络，它成功地保护神经肌肉接头和神经突网络对抗谷氨酸能应激。
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Figure IDA0004143139910000021

Claims (8)

1.N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物，其用于治疗和/或预防选自以下的运动神经元疾病和神经肌肉接头病症：非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、神经山黧豆中毒、Konzo、Tay-Sachs病、Sandhoff病、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、脊髓灰质炎后综合征、照射后综合征、僵人综合征、由事故引起的运动单元障碍、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征。
2.N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物，其用于延迟患者中选自以下的运动神经元疾病和神经肌肉接头病症的发作：非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、神经山黧豆中毒、Konzo、Tay-Sachs病、Sandhoff病、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、脊髓灰质炎后综合征，照射后综合征、僵人综合征、由事故引起的运动单元障碍、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征。
3.根据权利要求1或2所述的用于用途的硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物，所述硫酸盐具有式I
Figure FDA0004143139670000011
其中x是0.5-4。
4.根据权利要求3所述的用于用途的硫酸盐及其药学上可接受的溶剂合物，其特征在于x为约2。
5.根据权利要求4所述的用于用途的硫酸盐，其中所述硫酸盐是N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺二硫酸盐。
6.根据权利要求1或2所述的用于用途的硫酸盐，其中所述运动神经元疾病和神经肌肉接头病症选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、进行性肌萎缩(PMA)、单体肌萎缩、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)、重症肌无力、Eaton-Lambert综合征、由事故引起的运动单元障碍。
7.根据权利要求6所述的用于用途的硫酸盐，其中所述运动神经元疾病选自非FTD肌萎缩性侧索硬化、原发性侧索硬化(PLS)、遗传性痉挛性截瘫(HSP)、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊髓-延髓肌萎缩(SBMA)、进行性延髓麻痹(PBP)。
8.根据权利要求7所述的用于用途的硫酸盐，其中所述运动神经元疾病是非FTD肌萎缩性侧索硬化。
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