CN116410855A - 一种单细胞分选装置、芯片及分选方法 - Google Patents

一种单细胞分选装置、芯片及分选方法 Download PDF

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Abstract

一种单细胞分选装置，包括微流控芯片、细胞信号采集装置、细胞信号处理与控制装置，其中，所述微流控芯片，包括细胞样品在外部动力源驱动进样的进样管道、在外部动力源驱动进细胞稀释液的液流管道、单细胞分选管道，及其交叉连通处设置的细胞信号采集窗口；所述细胞信号采集装置，设置在微流控芯片的细胞信号采集窗口处，对细胞信号进行采集并实时传输给细胞信号处理与控制装置；所述细胞信号处理与控制装置，用于细胞信号的分析，控制液流管道内细胞稀释液注入，实现单细胞分选。

Description

一种单细胞分选装置、芯片及分选方法
技术领域
本发明属于微流体细胞分选领域，特别涉及到一种单细胞分选装置、芯片及分选方法。
背景技术
液滴微流控技术是使用微管道处理与操纵微小流体的系统所涉及的技术，被广泛应用到生物、化学、医学分析等过程中。微流控分选基于流体力学原理实现细胞分选，适用于高通量、大规模单细胞研究，然而现有技术因细胞活性、检测精度、连续性筛选效率受到的局限。
目前，流式细胞仪是常用的单细胞分选装置，其以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而识别细胞种类，并通过高压电场使液滴发生偏转从而实现分选。然而该方法主要是进行两路分选，较难实现多路分选，且分选后细胞的活性受到很大影响。近年基于图形处理的细胞分选方法也逐渐发展起来，采用该技术方法能实现无细胞活性影响下的分选，如专利文献1（公开号CN109863384A）公开了基于图像的细胞分选系统和方法，专利文献2（公开号CN112342137A）公开了一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置及方法等，然而现有技术中，对于距离足够远的细胞能实现单细胞分选，而对于距离比较近单细胞间是很难实现单细胞精确分选。因此，需要一种能够分离距离较近的单细胞的装置和方法。
发明内容
本发明针对现有技术问题提供了一种单细胞分选装置、芯片及分选方法，通过细胞信号采集装置采集获取细胞位置、细胞尺寸、细胞形态、细胞数量、细胞荧光信号等，控制微流体系管道的进液实现微流控管道中的单细胞分选，尤其是距离较近的单细胞的分选。
本发明的技术方案如下：
1. 一种单细胞分选装置，其特征在于，包括微流控芯片、细胞信号采集装置、细胞信号处理与控制装置，其中，
所述微流控芯片，包括细胞样品在外部动力源驱动进样的进样管道、在外部动力源驱动进细胞稀释液的液流管道、单细胞分选管道，及其交叉连通处设置的细胞信号采集窗口；
所述细胞信号采集装置，设置在微流控芯片的细胞信号采集窗口处，对细胞信号进行采集并实时传输给细胞信号处理与控制装置；
所述细胞信号处理与控制装置，用于细胞信号的分析，控制液流管道内细胞稀释液注入，实现单细胞分选。
2. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述单细胞分选管道的内径为进样管道内径的2-4倍，所述液流管道的内径为进样管道内径的1-2倍。
3. 根据权利要求2所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述进样管道内径为40-60 um，液流管道内径为40-120 um，单细胞分选管道内径为80-240 um。
4. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述液流管道为纵穿进样管道、单细胞分选管道的管道，所述液流管道从两端分别向单细胞分选管道进细胞稀释液。
5. 根据权利要求4所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述液流管道与单细胞分选管道的连通口大于其与进样管道的连通口。
6. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述进样管道入口设有分流挡板、过滤孔道。
7. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，在所述进样管道两侧设置有鞘流管道。
8. 根据权利要求2所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述进样管道进样速率为5 nL/min -20 nL/min，所述液流管道注液速率为300 uL/min -600uL/min。
9. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号采集装置包括图像采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量。
10. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号采集装置包括图像采集装置和荧光采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量，所述荧光采集装置采集细胞的荧光信号。
11. 根据权利要求1-10任一所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述微流控芯片单细胞分选管道外延端接有微管道，所述外延的微管道出口下方设置有液滴收集装置，用于收集单细胞液滴。
12. 根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号处理与控制装置根据细胞信号采集装置传送的细胞信号进行细胞信号处理与分析，同步通过控制进液管道动力源，实现细胞稀释液进入液流管道的流量和时间的精确控制。
13. 一种微流控芯片，其特征在于，包括细胞样品在外部动力源驱动进样的进样管道、在外部动力源驱动进细胞稀释液的液流管道、单细胞分选管道，及其交叉连通处设置有细胞信号采集窗口。
14.根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述单细胞分选管道的内径为进样管道内径的2-4倍，所述液流管道的内径为进样管道内径的1-2倍。
15. 根据权利要求14所述的微流控芯片，其特征在于，所述进样管道内径为40-60um，液流管道内径为40-120 um，单细胞分选管道内径为80-240 um。
16. 根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述液流管道为纵穿进样管道、单细胞分选管道的管道，所述液流管道从两端分别向单细胞分选管道进细胞稀释液。
17. 根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述液流管道与单细胞分选管道的连通口大于其与进样管道的连通口。
18. 根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述进样管道入口设有分流挡板、过滤孔道。
19. 一种基于权利要求1-12所述的单细胞分选装置的分选方法，包括以下步骤：
细胞样品在外部动力源驱动下进入微流控芯片进样管道；
当细胞样品中单细胞进入细胞信号采集窗口，细胞信号采集装置捕捉细胞，采集细胞信号，并将细胞信号传递给细胞信号处理与控制装置；
细胞信号处理与控制装置处理、分析细胞信号，同步控制液流管道动力源注入细胞稀释液，使进入细胞信号采集窗口的单细胞在细胞稀释液驱动下进入细胞分选管道实现单细胞分选。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明细胞信号采集装置采集细胞信号，并将细胞信号传递给细胞信号处理与控制装置，细胞信号处理与控制装置处理、分析细胞信号，同步控制液流管道动力源注入细胞稀释液，使进入细胞信号采集窗口的单细胞在细胞稀释液驱动下进入细胞分选管道实现单细胞分选；
（2）本发明提供了多种信号采集方法，如图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量，或者其与荧光采集装置采集细胞的荧光信号联用，实现多种指标的单细胞分选；
（3）本发明采用内径大于单细胞分选管道的进样管道，且通过从液流管道两端进液，减少进液时间的同时减少细胞沿着管壁流动的几率，避免细胞损伤，提高分选效率。
附图说明
图1为本发明一种单细胞分选装置的结构示意图；
图2为本发明一种单细胞分选芯片一实施方式结构示意图；
图3为本发明一种单细胞分选芯片另一实施方式结构示意图；
图4为本发明一种单细胞分选芯片进样口结构示意图；
图5为本发明一种单细胞分选装置的单细胞液滴收集装置结构示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个附图并不构成对本发明实施例的限定。
具体而言，如图1所示，本发明的一种单细胞分选装置，包括微流控芯片（1）、细胞信号采集装置（2）、细胞信号处理与控制装置（3）。
本发明装置中，所采用的微流控芯片（1），包括细胞样品在外部动力源（4）驱动进样的进样管道（6）、在外部动力源（5）驱动进细胞稀释液的液流管道（7）、单细胞分选管道（8），在所述进样管道、液流管道、单细胞分选管道交叉连通处设置有细胞信号采集窗口（5）。
本发明中，所述细胞样品为稀释到一定程度使细胞在培养液中充分分散的细胞悬液，所述细胞稀释液为细胞缓冲液如PBS等或无细胞的细胞培养液。
一实施例方式，本发明装置采用的微流控芯片（1），其单细胞分选管道（8）内径为进样管道（6）内径的2-4倍，其液流管道（7）内径为进样管道（6）内径的1-2倍。在一具体实施方式中，所述进样管道（6）的内径为40-60 um，液流管道（7）内径为40-120 um，单细胞分选管道（8）内径为80-240 um。
如图1、图2、图3所示的微流控芯片，所述液流管道（7）为纵穿进样管道（6）、单细胞分选管道（8）的管道，所述液流管道（7）从两端分别向单细胞分选管道（8）进细胞稀释液，利于维持细胞样品液流平衡，避免细胞靠管壁流动，减少与管壁接触带来的细胞损伤。在一实施方式中，所述液流管道（7）与单细胞分选管道（8）的连通口大于其与进样管道（6）的连通口，利于液流管道（7）快速进入单细胞分选管道（8），减小液流管道（7）液体对进样管道（6）带来的液流压力影响，避免进样管道（6）中细胞靠近与挤压。
在一实施方式中，所述的进样管道（6）的进样口为图1所示的设置在侧管壁的管道。在另一实施方式中，所述的进样管道（6）的进样口（10）为图2所示，设置在芯片中间部位。进一步具体的，所述进样口（10）包括入液口（11）、分流挡板（12）和过滤孔道（13），如图4所示，细胞样品经过分流挡板（12）和过滤孔道（13），一方面有利于阻止粘连在一起的细胞进入芯片微流控管道，另一方面，有利于分散细胞，将粘连的细胞分开。
在微流控芯片进样管道（6）中，由于进样动力源的驱动，细胞随着液流向单细胞分选管道（8）方向流动。然而并非所有的细胞都是沿着进样管道（6）中部移动，常常会有细胞贴近管壁流动，这种方式易引起细胞损伤。为了解决该问题，本发明中，在进样管道（6）中部的两侧设置有鞘流管道（15）和（16），通过鞘液引导细胞向管道中间游动。
本发明中，所述微流控芯片由玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)形成。在进样管道（6）、液流管道（7）、单细胞分选管道（8）的交汇连通处为细胞信号采集窗口（9），所述为细胞信号采集窗口（9）透明的区域，利于细胞信号采集装置对微管道中液样中单细胞信息的采集。
本发明中，所述进样管道（6）、液流管道（7）的外部动力源为注射泵、压力泵、蠕动泵、隔膜泵中的任一种，优选动力源为注射泵，可精准控制液体的流速和流量。
在一实施方式中，所述进样管道（6）进样速率为5 nL/min -20 nL/min，所述液流管道（7）注液速率为300 uL/min -600uL/min，在该速率下，即可以维持单细胞间的间距，避免流速过高引起细胞挤压和损伤，又可以控制单细胞有效快速分选，使其分选速率达到5-20个/min。
在一实施方式中，所述细胞信号采集装置（2），设置在微流控芯片的细胞信号采集窗口（9）处，对细胞信号进行采集并实时传输给细胞信号处理与控制装置（3）。
一具体实施方式中，所述细胞信号采集装置（2）为图像采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量。在该实施方式中，一旦细胞进入细胞信号采集窗口（9）就会触发细胞信号采集装置（2）进行细胞位置采集，并快速将位置信息传递给细胞信号处理与控制装置（3），并通过细胞信号处理与控制装置（3）实现对液流管道动力源（5）的控制，至少能维持进入细胞信号采集窗口（9）的细胞与前一个细胞的位置距离，并且还能根据细胞尺寸、细胞形态、内部细胞结构的大小形态如细胞核、荧光图案、荧光颜色等对单细胞实施有效的分选。
另一具体实施方式中，所述细胞信号采集装置（2）为图像采集装置和荧光采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量，即能实现上述的单细胞位置的控制和基于单细胞图像采集处理的细胞特征如细胞尺寸、细胞形态、内部细胞结构大小形态（如细胞核）、荧光图案、荧光颜色等实施单细胞分选。所述荧光采集装置采集细胞的荧光信号，所述荧光采集装置包括光源和光学检测器，所述光学检测器进一步为光纤光谱检测器。
具体的，本发明中采用的图像采集装置采集帧率为大于5帧/s的成像系统。
本发明中，所述细胞信号处理与控制装置（3），用于对细胞信号的分析，并控制液流管道（7）内细胞稀释液注入，实现单细胞分选。所述细胞信号处理与控制装置（3）包括数字信号处理器和单片机。在一具体实施方式中，所述细胞信号处理与控制装置（3）根据细胞信号采集装置（2）传送的细胞信号进行细胞信号处理与分析，且同步通过控制进液管道动力源（5），实现细胞稀释液进入液流管道的流量和时间的精确控制，使单细胞以液滴的方式在液流和重力共同作用下滴入回收容器中。
在一具体实施方式中，所述细胞信号处理与控制装置（3），实施处理来自荧光采集装置的细胞信号，并进行信号的处理，且在30 ms时间内，进行决策和操作指令的传送给管道动力源，以满足实施分选的需要。
在一实施方式中，所述细胞信号处理与控制装置（3）根据细胞信号采集装置（2）传送的细胞信号进行细胞信号处理与分析，且同步完成对进液管道动力源（5）注入液体的控制，使包含有单个细胞的液体从单细胞分选管道（7）出口端流出。在一具体实施方式中，所述微流控芯片单细胞分选管道（8）外延端接有微管道（8-1），所述外延的微管道（8-1）出口下方设置有液滴收集装置，用于收集单细胞液滴。
在一实施方式中，本发明中，在所述单细胞分选管道（8）的出口端设置有液滴收集装置收集单细胞液体，如图5所示，其包括包括基座（15）；移动机构，其设置在基座（15）上，包括X轴导轨（112）和控制沿着X轴移动的X轴电机（111），安装在X轴导轨上的Y轴导轨（114），控制沿着Y轴移动的Y轴电机（113），及安装在Y轴导轨上的固定目标液滴回收容器的支架（115）；管道固定结构，其包括管道支架（131）、管道（8-1）；液滴回收机构，其包括摆臂（141）、控制摆臂移动的摆臂电机（142）、控制摆臂移动的限位开关（143）及设置在摆臂上的废液回收勺（144），根据细胞信号处理与控制装置（3）控制移动机构的电机、液滴检测机构的光纤光谱仪、液滴回收机构的电机和限位开关、驱动管道液体流动的动力源，最终将液滴分选至目标液滴回收的96孔板（121）或废液回收勺（132）中。
本发明中，一种基于单细胞分选装置的分选方法，包括以下步骤：
S1步骤，细胞样品在外部动力源驱动下进入微流控芯片进样管道；
S2步骤，细胞样品中单细胞进入细胞信号采集窗口，细胞信号采集装置捕捉细胞，采集细胞信号，并将细胞信号传递给细胞信号处理控制装置；
S3步骤，细胞信号处理控制装置处理、分析细胞信号，同步控制液流管道动力源注入细胞稀释液，使进入细胞信号采集窗口的单细胞通过细胞稀释液液流驱动下进入细胞分选管道实现单细胞分选。
本发明方法中，所述细胞样品为稀释到一定程度使细胞在培养液中充分分散的细胞悬液，所述细胞稀释液为细胞缓冲液如PBS等或无细胞的细胞培养液。
在S1步骤中，所采用的进样管道（6），其内径为40-60 um，进样速率为5 nL/min -20 nL/min。
在S2步骤中，细胞信号采集装置为图像采集装置，或者图像采集装置和荧光采集装置，当细胞一进入细胞信号采集窗口，捕获细胞位置，采集其他的细胞信号，并将细胞细胞信号传递给细胞信号处理控制装置。其他的细胞信号包括、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量、内部细胞结构的大小形态如细胞核、荧光图案、荧光颜色等。
在S3步骤中，细胞信号处理控制装置是核心部件，当其接受到细胞位置信息立即对液流管道动力源下达指令，注入细胞稀释液，所述细胞稀释液注入体积大于等于50 uL。且同时对细胞其他信号进行处理和分选，控制下游单细胞液滴收集装置进行单细胞的收集。
本发明，通过细胞信号采集装置细胞信号，同时触发启动液流管道动力源，驱动细胞稀释液进入管道，并在细胞稀释液的驱动下，使细胞从单细胞分选管道分选出来。本发明提供了多种信号采集方法，如图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量等，或者其与荧光采集装置采集细胞的荧光信号联用，实现多种指标的单细胞分选。本发明采用内径大于单细胞分选管道的进样管道，且通过从液流管道两端进液，减少进液时间的同时减少细胞沿着管壁流动的几率，避免细胞损伤，提高分选效率。

Claims (10)

1.一种单细胞分选装置，其特征在于，包括微流控芯片、细胞信号采集装置、细胞信号处理与控制装置，其中，
所述微流控芯片，包括细胞样品在外部动力源驱动进样的进样管道、在外部动力源驱动进细胞稀释液的液流管道、单细胞分选管道，及其交叉连通处设置的细胞信号采集窗口；
所述细胞信号采集装置，设置在微流控芯片的细胞信号采集窗口处，对细胞信号进行采集并实时传输给细胞信号处理与控制装置；
所述细胞信号处理与控制装置，用于细胞信号的分析，控制液流管道内细胞稀释液注入，实现单细胞分选。
2.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述单细胞分选管道的内径为进样管道内径的2-4倍，所述液流管道的内径为进样管道内径的1-2倍。
3.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述液流管道为纵穿进样管道、单细胞分选管道的管道，所述液流管道从两端分别向单细胞分选管道进细胞稀释液，所述液流管道与单细胞分选管道的连通口大于其与进样管道的连通口。
4.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，在所述进样管道两侧设置有鞘液管道。
5.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号采集装置包括图像采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量。
6.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号采集装置包括图像采集装置和荧光采集装置，其中所述图像采集装置采集细胞位置、细胞尺寸、细胞形态和细胞数量，所述荧光采集装置采集细胞的荧光信号。
7.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述微流控芯片单细胞分选管道外延端接有微管道，所述外延的微管道出口下方设置有液滴收集装置，用于收集单细胞液滴。
8.根据权利要求1所述的单细胞分选装置，其特征在于，所述细胞信号处理与控制装置根据细胞信号采集装置传送的细胞信号进行细胞信号处理与分析，同步通过控制进液管道动力源，实现细胞稀释液进入液流管道的流量和时间的精确控制。
9.一种微流控芯片，其特征在于，包括细胞样品在外部动力源驱动进样的进样管道、在外部动力源驱动进细胞稀释液的液流管道、单细胞分选管道，及其交叉连通处设置的细胞信号采集窗口。
10.一种基于权利要求1-8所述的单细胞分选装置的分选方法，包括以下步骤：
细胞样品在外部动力源驱动下进入微流控芯片进样管道；
当细胞样品中单细胞进入细胞信号采集窗口，细胞信号采集装置捕捉细胞，采集细胞信号，并将细胞信号传递给细胞信号处理与控制装置；
细胞信号处理与控制装置处理、分析细胞信号，同步控制液流管道动力源注入细胞稀释液，使进入细胞信号采集窗口的单细胞在细胞稀释液驱动下进入细胞分选管道实现单细胞分选。
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