CN116406284A

CN116406284A - 用于癌症治疗的多肽

Info

Publication number: CN116406284A
Application number: CN202180074438.2A
Authority: CN
Inventors: 姜石松
Original assignee: Oxford Vaccine Medicine
Current assignee: Oxford Vaccine Medicine
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-07-07
Also published as: JP2024504540A; WO2022090716A1; GB202017119D0; EP4236994A1

Abstract

本发明涉及用于癌症的预防性疫苗接种和/或治疗性治疗的方法、多肽和所述多肽和/或其编码核酸的组合物，和多肽在治疗和/或预防癌症、和/或改善用于治疗癌症的药剂的疗效中的用途。

Description

用于癌症治疗的多肽

发明领域

本发明提供了用于癌症的预防性疫苗接种和/或治疗性治疗的方法、多肽和所述多肽和/或其编码核酸的组合物，和多肽在治疗和/或预防癌症、和/或改善用于治疗癌症的药剂的疗效中的用途。

发明背景

癌症可能是由于基因的突变、引入或异位表达而引起的，这些基因在功能上与细胞周期调节相关，并导致在称为“转化”的过程中失调的细胞分裂。此类突变可能是肿瘤抑制基因中的功能丧失突变，导致无法抑制细胞周期的进展，和/或可能是原癌基因中的功能获得性突变，导致异位信号传导和细胞周期加速.例如，存在于已感染HPV的个体中的病毒HPV E6和E7癌蛋白通过各种机制促进细胞周期进程，其中包括抑制肿瘤抑制基因p53(E6)和pRB(E7)。

免疫系统的正常功能是通过识别某些区分健康细胞和异常细胞的肿瘤特异性抗原(‘TSAs’)和肿瘤相关抗原(‘TAAs’)、细胞表面或分泌的分子标记来破坏癌细胞。这通常被称为“消除阶段”。随着时间的推移，由于患病组织内的持续突变，癌症的生长速度可能会超过免疫细胞破坏癌细胞的能力。在这些突变中，有一些突变允许癌细胞逃避免疫系统的检测，或者以其他方式抑制免疫系统的功能。这种突变的一个例子，也是许多癌症常见的突变，是生存素(survivin)(也称为“BIRC5”)的异位上调，它是“细胞凋亡抑制剂”(“IAP”)家族的一员。生存素的细胞内表达可以抑制所述细胞的凋亡。一旦突变积累到癌细胞生长速度超过免疫系统破坏癌细胞的能力的程度，癌组织就会继续生长。这被称为“逃逸阶段”。

癌症治疗有多种可用形式，包括化学疗法、手术和放射疗法。不幸的是，许多现有的治疗策略对患病细胞和/或组织相对于健康细胞和/或组织的选择性低，导致治疗过程中出现一系列副作用。例如，许多化学治疗剂专注于破坏正常健康细胞和癌细胞之间共有的过程，从而不加区别地影响两者。在一个这样的例子中，顺铂交联DNA碱基以防止DNA修复并最终导致细胞凋亡。这针对正常细胞和癌细胞中的DNA修复过程，从而损害健康和患病的组织。许多癌症在治疗过程中会对某些治疗策略产生抗性，导致所述策略对治疗癌症变得无效。

尽管这些方法都有其用武之地，但免疫疗法正作为一种更有针对性的治疗干预措施被越来越多地探索。免疫疗法采用消除阶段的免疫监视，人为地将免疫系统引导至肿瘤细胞上存在的特定分子靶标。免疫疗法旨在提高受试者免疫系统检测和破坏癌细胞的能力。

目前有许多不同的免疫治疗策略用于抗癌，包括免疫检查点疗法、TNFR激动剂和靶向疫苗接种策略。然而，癌症疫苗的适用性(通常仅适用于一小部分患者)和功效仍然有限。同样，检查点抑制剂和TNFR激动剂的疗效也同样受到高毒性和有限疗效的限制。

所需要的是一种治疗方法，它允许上述试剂的最大功效同时最小化受试者治疗过程中毒性事件的风险。令人惊讶的是，我们已经发现免疫肿瘤学药剂和源自靶肿瘤抗原的重组多肽的组合可以提高免疫治疗方法在治疗癌症中的功效并且还导致需要较低剂量的免疫肿瘤学药剂，从而改善治疗结果并且还减少或消除施用所述免疫肿瘤学药剂的毒性作用。

发明内容

在第一个方面，提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，包括：向受试者施用包含两个或更多肽片段的多肽，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列；和向受试者施用免疫肿瘤学药剂。

在一些实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和/或所述第二肿瘤抗原蛋白是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原或癌/睾丸抗原。在一些实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和第二肿瘤抗原蛋白是相同的肿瘤抗原蛋白。在一些实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和/或第二肿瘤抗原蛋白是自身抗原、改变的自身抗原、或非自身抗原。

在一些实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和/或第二肿瘤抗原蛋白是生存素。在其他实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和/或第二肿瘤抗原蛋白是病毒衍生的癌抗原，可选地是HPV蛋白，进一步可选地是HPV16蛋白。在一些实施方案中，所述第一肿瘤抗原蛋白和/或第二肿瘤抗原蛋白是HPV16E7。

在一些实施方案中，所述一个或多个外源组织蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶S切割序列，优选地是LRMK切割序列。

在一些实施方案中，将所述多肽和所述免疫肿瘤学药剂同时、分别、或依次施用于受试者。在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂。

在一些实施方案中，所述多肽的每次施用包含1μg.kg^-1至2000μg.kg^-1之间的多肽，优选5至20μg.kg^-1或更低。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在其他实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体或其片段。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂以对人类无毒的剂量施用。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。

在一些实施方案中，所述4-1BB激动剂以低于1mg.kg-1的剂量施用。

在一些实施方案中，定期重复向所述受试者施用所述多肽和所述免疫肿瘤学药剂，优选地每3、4、5、6或7天。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度在2到31个氨基酸之间。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。

在一些实施方案中，所述多肽在递送载体中递送，可选地进一步包括施用包含所述多肽的递送载体或在药学上可接受的运载体中的所述多肽。

在本发明的第二个方面，提供了一种用于治疗癌症的组合物，其中该组合物包含多肽，该多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列，并且其中所述治疗包括所述多肽与免疫肿瘤学药剂的共同施用。

在一些实施方案中，该组合物还包含以上或本文另外描述的任何实施方案的所述多肽。

在本发明的第三个方面，提供了一种确定癌症是否适合根据上述治疗方法进行治疗的方法，包括：向受试者或体外样品施用多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，还包含一个或多个位于所述两个或多个肽片段中的每一个之间的外源性组织蛋白酶切割位点序列；向受试者或体外样品施用免疫肿瘤学药剂；测量所述受试者或体外样品中的T细胞刺激。

在第四方面，提供了用于治疗癌症的免疫肿瘤学药剂，其中所述治疗包括施用所述免疫肿瘤学药剂和多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列并且其中第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列。

在一些实施方案中，与所述用于治疗癌症的免疫肿瘤学药剂共同施用的多肽是如上文或本文任何实施方案中所述的多肽。在一些实施方案中，癌症的所述治疗是通过如上文或本文的任何实施方案中所述的治疗方法。

在第五个方面，提供了用于治疗癌症的试剂盒，其包含：多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中所述第一肽片段包含源自第一个肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中所述第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列，以及免疫肿瘤学药剂。

在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂，可选地是肽或其片段、糖蛋白或其片段、小分子、或抗体或其片段。在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是检查点抑制剂，可选地是肽或其片段、糖蛋白或其片段、小分子、或抗体或其片段。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种药学上可接受的载体或编码所述多肽的核酸。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂，或者其中所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。

在一些实施方案中，本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自生存素的第一序列，并且其中第二肽片段包源自生存素的第二序列，还包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列，并且向所述受试者施用免疫肿瘤学药剂。

在一些实施方案中，将所述多肽和所述免疫肿瘤学药剂同时、分别、或依次施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族激动剂或检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述多肽的每次施用包含1μg.kg^-1至2000μg.kg^-1之间的所述多肽，优选地5至20μg.kg^-1或更低。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂以对人类无毒的剂量施用。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，所述4-1BB激动剂以低于1mg.kg^-1的剂量施用。

在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含与来自SEQ ID NO：1的连续序列具有至少90％同一性的序列，并且该多肽在受试者(优选人类受试者)中刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含来自SEQ ID NO：1的连续序列。

在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含与来自SEQ ID NO：43的连续序列具有至少90％同一性的序列，并且该多肽在受试者(优选人类受试者)中刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含来自SEQ ID NO：43的连续序列。

在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。

在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。

在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一个包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16，并且该多肽引发免疫反应或具有免疫刺激性。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含与SEQ ID NO：11和/或SEQ IDNO：12具有至少90％同一性的序列，并且该多肽引发免疫反应，可选地引发T细胞反应。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段中的至少一个包含与选自下组的序列具有至少90％同一性的序列：SEQ ID NO：45、46、47、和48，并且该多肽引发免疫反应或是免疫刺激性的。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含与SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和/或SEQ ID NO：48具有至少90％同一性的序列，并且所述多肽引发免疫反应，可选地引发T细胞反应。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度在2到31个氨基酸之间。可选地，所述一个或多个重叠序列的长度至少为8个氨基酸。

在一些实施方案中，所述多肽在递送载体中递送。

在一些实施方案中，所述方法包括施用包含所述多肽的递送载体或在药学上可接受的运载体中的所述多肽。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的联合疗法的组合物，其中该组合物包含多肽，该多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自生存素的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自生存素的第二序列，还包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列，并且其中所述联合疗法包括所述多肽与免疫肿瘤学药剂的共同施用。

在一些实施方案中，所述组合物还包含如任何先前方面或实施方案中所述的多肽或方法步骤。在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含与来自SEQ ID NO：1的连续序列具有至少90％同源性的序列，并且该多肽在受试者(优选地人类受试者)中刺激，T细胞反应。在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含来自SEQ ID NO：1的连续序列。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选地十个或更多个肽片段。

在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一个包含与选自下组的序列具有至少90％同源性的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16，并且其中所述多肽在受试者中引发免疫反应或具有免疫刺激性。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含与SEQ ID NO：11和/或SEQ IDNO：12具有至少90％同源性的序列，并且该多肽在受试者中引发免疫反应，可选地引发T细胞反应。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含一个或多个重叠序列。在一些实施方案中，所述一个或多个重叠序列的长度为2个和31个氨基酸。可选地，所述一个或多个重叠序列的长度至少为8个氨基酸。

在一些实施方案中，所述多肽在递送载体中递送。在一些实施方案中，所述组合物包含含有所述多肽的递送载体或在药学上可接受的运载体中的所述多肽。

在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子，或者其中所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂以对人类无毒的剂量施用。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂。在一些实施方案中，所述4-1BB激动剂以低于1mg.kg^-1的剂量施用。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗癌症的联合疗法的免疫肿瘤学药剂，其中所述联合治疗包括施用所述免疫肿瘤学药剂和多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自生存素的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自生存素的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列。

在一些实施方案中，所述多肽如本发明任何前述方面中所述。在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含与来自SEQ ID NO：1的连续序列具有至少90％同源性的序列，并且该多肽在受试者中引发免疫反应，可选地引发T细胞反应。

在一些实施方案中，所述第一和第二肽片段各自包含来自SEQ ID NO：1的连续序列。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶切割序列，优选地是组织蛋白酶S，更优选地是LRMK切割序列。在一些实施方案中，所述多肽包含三个或更多个肽片段，优选地五个或更多个肽片段，更优选十个或更多个肽片段。

在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的至少一个包含与选自下组的序列具有至少90％同源性的序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16，并且其中所述多肽在所述受试者中引发免疫反应或具有免疫刺激性。

在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段包含与SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12具有至少90％同源性的序列，并且该多肽在所述受试者中引发免疫反应，可选地引发T细胞反应，优选地是在人类受试者中。

在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的试剂盒，其包含包含两个或更多肽片段的多肽，其中所述第一肽片段包含源自生存素的第一序列并且其中所述第二肽片段包含源自生存素的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列，并且该试剂盒进一步包含免疫肿瘤学药剂。

在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗体或其片段。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种药学上可接受的运载体或编码所述多肽的核酸。

附图说明

现在将参考附图和实施例描述本发明的方面和实施方案，其中：

图1.显示生存素表达的图像，放大40倍并使用免疫组织化学(IHC)染色。这些图显示了苏木精染色的B16-F10细胞(A)和B16-GFP-生存素细胞(B)。两个样品都用抗生存素小鼠抗体染色，然后用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG染色，随后用二氨基联苯胺染色。B16-GFP-生存素细胞的IHC染色表明生存素的表达。B16-F10仅显示苏木精(细胞核)染色，证明不存在生存素。

图2.显示经过23天处理的小鼠肿瘤体积的图表，(i)仅佐剂(MPL)与磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照(黑色实线)，(ii)多肽('ROP-生存素')+佐剂(灰色虚线)，(iii)低剂量(0.6mg.kg^-1)的4-1BB激动剂(BE0239)+佐剂(黑色虚线)，以及(iv)多肽+低剂量(0.6mg.kg^-1)的4-1BB激动剂+佐剂所有三者的组合(黑色点状线)。在低剂量的4-1BB激动剂下，多肽+4-1BB激动剂+佐剂所有三者的组合最大程度地抑制肿瘤体积生长，并且比多肽ROP-生存素不存在时用4-1BB激动剂+佐剂治疗的抑制程度更大。

图3.显示小鼠经过23天的存活率的图表，(i)佐剂(MPL)和PBS作为对照(大点状线)，(ii)S-多肽ROP-生存素('ROP-生存素')+佐剂(小点状线)，(iii)低剂量(0.6mg.kg^-1)的4-1BB激动剂+佐剂(黑色虚线)，以及(iv)多肽+低剂量(0.6mg.kg^-1)的4-1BB激动剂+佐剂所有三者的组合(黑色实线)。接受多肽+4-1BB激动剂+佐剂所有三者的组合的小鼠存活率最高；仅接受佐剂的小鼠存活率最低。

图4.显示经过23天处理的小鼠的肿瘤体积的图表，(i)佐剂(MPL)和PBS作为对照(黑色实线)，(ii)S-多肽ROP-生存素('ROP-生存素')+佐剂(灰色虚线)，(iii)高剂量(1.8mg.kg^-1)的4-1BB激动剂+佐剂(黑色虚线)，以及(iv)多肽+高剂量(1.8mg.kg^-1)的4-1BB激动剂+佐剂所有三者的组合(黑色点状线)。

图5.电泳凝胶展示：

(a)S-多肽ROP-生存素(理论分子量879bp)合成成功。泳道1＝DNA MW阶梯；泳道2＝S-多肽ROP-生存素PCR产物；

(b)在大肠杆菌中成功转化和扩增含有S-多肽ROP-生存素的质粒，通过Bam HI和Xho I切割鉴定。泳道1＝质粒P1/YN8735；泳道2＝质粒P2/YN8736；泳道3＝质粒P3/YN8737；泳道4＝载体PYR1688对照。

图6.工程化S-多肽ROP-生存素表达质粒‘pYR1688’的质粒图谱。

图7.

(a)电泳凝胶泳道1和泳道3中表明从pYR1688转化的大肠杆菌中提取并用Nde I+Xho I消化的质粒中存在S-多肽(ROP-生存素，879bp)。泳道2显示没有插入S-多肽(ROP-生存素)的质粒。

(b)SDS-PAGE表明成功诱导了S-多肽ROP-生存素(箭头所示)。“0h”泳道＝IPTG诱导前的总蛋白；“3h”泳道＝IPTG诱导3小时的总蛋白；“5h”泳道＝IPTG诱导5小时的总蛋白；“BL21”泳道＝宿主细胞系中的空载体(对照)。

图8.显示小鼠治疗14天后的肿瘤体积的图表，(i)佐剂(MPL)和PBS作为对照，(ii)小鼠S-多肽ROP-生存素('mROP-生存素)+佐剂，(iii)PD-1拮抗剂，和(iv)S-多肽ROP-生存素+PD-1拮抗剂+佐剂所有三者的组合，如图所示。

图9.显示小鼠体重经过14天的图表(i)佐剂(MPL)和PBS作为对照，(ii)小鼠S-多肽ROP-生存素('mROP-生存素)+佐剂，(iii)PD-1拮抗剂，和(iv)S-多肽ROP-生存素+PD-1拮抗剂+佐剂所有三者的组合。

图10.获得自小鼠的活化脾细胞释放的IFN-γ的ELISPOT分析，小鼠接受i)S-多肽ROP-生存素+佐剂，(ii)S-多肽ROP-生存素+PD-1拮抗剂+佐剂，iii)PD-1拮抗剂，iv)佐剂(MPL)，v)和载体(PBS)，如所示。

图11.用ROP-HPV或HPV16 E7蛋白治疗小鼠的示例疫苗接种方案。第0天标志着接种TC1肿瘤细胞系的日子。

图12.显示经过(i)ROP-HPV('ROP-HPV16E7'；空心线)，ii)蛋白HPV16E7(点状线)，iii)佐剂(三角点)和iv)载体(PBS；虚线)治疗22天的小鼠中TC-1肿瘤体积的图表，如图所示。

图13.接受i)ROP-HPV(“ROP-HPV16E7”；方形点)、ii)蛋白HPV16E7(圆形点)、iii)佐剂(三角形点)或iv)载体(PBS；菱形点)的小鼠的存活曲线，如图所示。第0天＝肿瘤接种。

图14.用ROP-HPV(“疫苗接种”)和4-1BB激动抗体或抗PD-1拮抗抗体(“抗体治疗”)蛋白HPV16 E7联合治疗小鼠的疫苗接种方案示例。第0天标志着接种TC1肿瘤细胞系的日子。

图15.显示用i)ROP-HPV(‘ROP-HPV16E7’；空心长虚线)，ii)ROP-HPV+4-1BB激动剂(实心黑线)，iii)4-1BB激动剂(“4-1BB”；空心短虚线)，iv)佐剂(虚线黑线)，v)载体(PBS；黑虚线)治疗22天的小鼠TC-1肿瘤体积的图表。

图16.显示用i)ROP-HPV(“ROP-HPV16E7”；空心长虚线)，ii)ROP-HPV+4-1BB激动剂(实心黑线)，iii)4-1BB激动剂('α4-1BB'；空心短虚线)，iv)佐剂(黑点划线)，v)载体(PBS；黑虚线)治疗47天的小鼠中TC-1肿瘤体积的图表。数据/线的过早终止是由于小鼠死亡。

图17.接受i)ROP-HPV+4-1BB激动剂(圆点)、ii)ROP-HPV(方点)、iii)佐剂(向上三角点)、iv)4-1BB激动剂(向下三角点)或v)载体(PBS；菱形点)的小鼠的27天存活曲线。第0天＝肿瘤接种。

图18.接受i)ROP-HPV+4-1BB激动剂、ii)ROP-HPV、iii)佐剂或iv)4-1BB激动剂的小鼠的47天存活曲线，如图所示。第0天＝肿瘤接种。

图19.图表显示小鼠用i)ROP-HPV(“ROP-HPV16E7”；空心线)，ii)ROP-HPV+抗PD-1拮抗剂(黑色实线)，iii)抗PD-1拮抗剂('αPD-1'；点状线)，iv)佐剂(黑色点划线)，或v)载体(PBS；黑色虚线)治疗47天的肿瘤体积。数据/线的过早终止是由于小鼠死亡。

图20.接受i)ROP-HPV(“ROP-HPV16E7”)、ii)ROP-HPV+抗PD-1拮抗剂、iii)抗PD-1拮抗剂、iv)佐剂或v)载体(PBS)的小鼠的存活曲线，如图所示。第0天＝肿瘤接种。

发明详述

目前有许多不同的免疫治疗策略用于抗癌，包括免疫检查点疗法、过继性T细胞转移疗法、和疫苗接种(参见Waldman等人，2020年)。TSA和TAA是有吸引力的候选疫苗，但需要强效佐剂才能引起有效反应，例如在Srivastava 2012和Srivastava 2014中试验的4-1BBL。分子靶向方法也很常见，旨在专门针对肿瘤进展的分子标记和/或分子驱动因素。正如Wheatley和Altieri(2019)指出的那样，尽管它是一种显著的癌症分子标志物，并且尽管具有作为治疗靶点的许多理想特征，“但令人失望的是，一种真正特异性的抗生存素药物尚未进入临床。”

癌症免疫治疗的两个领域是肿瘤坏死因子受体('TNFR')超家族受体('TNFRSF'受体)，例如4-1BB，以及免疫检查点分子，例如PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)。4-1BB是一种共刺激分子，当它被激活时，会导致T细胞扩增、细胞因子诱导和抗凋亡基因的上调。治疗策略通常侧重于4-1BB的单克隆抗体(mAb)激动剂，例如乌瑞芦单抗(urelumab)，它可以刺激4-1BB，从而产生有效的抗肿瘤作用。不幸的是，4-1BB激动与严重的肝毒性有关，并且已证明在小鼠中会引起免疫异常，从而影响脾脏、肝脏、和骨髓的功能(参见Compte等人，2018年)。这些毒性特征被描述为第一代4-1BB mAb激动剂的主要障碍。

同样，PD-1检查点抑制剂作为潜在的癌症治疗剂已被广泛探索，并且已经开发出许多PD-1或其配体PD-L1的抑制剂。PD-1于90年代初首次被描述。它负向调节T细胞介导的免疫反应。人们认为PD-1/PD-L1的激活可能是癌症逃避抗原特异性T细胞反应的方式之一，因此抑制该通路可能会阻止癌症减轻针对它们的典型T细胞反应。许多针对PD-1和PD-L1的抑制性抗体药物(例如纳武单抗(Nivolumab)和阿替利珠单抗(Atezolizumab))已针对多种癌症进行了测试(参见Gong等人，2018年)。与4-1BB聚焦疗法非常相似，这些检查点抑制剂通常显示出影响各种器官的重要毒性特征(参见Spiers等人，2019年)。

所需要的是一种治疗方法，它允许上述试剂的最大功效同时最小化受试者治疗过程中毒性事件的风险。

为了满足这种需要，提供了源自肿瘤抗原蛋白(例如肿瘤特异性抗原(TSA)、肿瘤相关抗原(TAA)或癌症/睾丸抗原)的多肽，当其与免疫肿瘤学药剂共同给药时，表现出抗肿瘤活性。如本文所示，这种抗肿瘤活性可以构成肿瘤缩小和/或肿瘤消退，甚至完全消退。如本文所示，本发明的多肽与免疫肿瘤学药剂的共同给药表现出协同效应。

本发明的所述多肽包含两个或多个肽片段，其中第一肽片段包含衍生自第一肿瘤抗原蛋白(可选地是TSA或TAA)的第一序列，并且其中第二肽片段包含衍生自第二肿瘤抗原蛋白(可选地是TSA或TAA)的第二序列。所述多肽在两个或多个肽片段的每一个之间包含一个或多个外源蛋白酶切割位点序列，使得所述多肽可以在体内被切割以释放所述一个或多个肽片段。所述蛋白酶切割位点序列是外源性的，因为它是在天然肿瘤抗原蛋白序列中其引入位置处并非天然存在的蛋白酶切割位点序列。在一些实施方案中，所述外源蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶切割序列。

在一个实施方案中，该多肽来源于生存素，当其与肿瘤坏死家族受体('TNFR')超家族('TNFRSF')激动剂或检查点抑制剂共同给药时，可以在所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂的最大功效下抑制癌症生长，同时允许每一种所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂以低于其通常的单一治疗剂量施用。在另一个实施方案中，所述多肽源自HPV16 E7，当与肿瘤坏死家族受体(“TNFR”)超家族(“TNFRSF”)激动剂或检查点抑制剂共同给药时，可以以所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂的最大功效抑制癌症生长，同时允许每一种所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂以低于其通常的单一治疗剂量给药。

换句话说，当与本文公开的多肽组合时，所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂可以较低剂量(即较小量)施用，同时仍然实现有用的治疗效果。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂或检查点抑制剂可以较低剂量给药，同时仍能达到其最大治疗效果。源自生存素的所述多肽包含源自生存素的序列，该序列连接形成重叠多肽，其能够产生针对细胞表面蛋白的抗体，并且另外刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。源自生存素的所述多肽可被认为是其变体。源自HPV16 E7的所述多肽包含源自HPV16 E7的序列，这些序列连接形成重叠多肽，所述重叠多肽能够产生针对细胞表面蛋白的抗体，此外还能刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞反应。源自HPV16E7的所述多肽可被认为是其变体。

使用以下定义可以更好地理解本文中使用的发明和术语。

如本文所用，“共同施用”是指两种或更多种治疗性或预防性物质，其均作为相同方案的一部分施用至受试者或患者。共同施用在时间上可以同时、依次或分开进行。共同施用可通过相同途径或通过不同途径发生。作为说明性示例，物质1每3天腹膜内给药一次，物质2每周皮下给药一次，可以说是“共同施用”。作为另一个说明性示例，物质1和物质2在同一天皮下递送也可以说是“共同施用”。

如本文所用，“重组”是指任何聚合物，可选地是多肽，其是非天然存在的或人工构建的，已经通过基因重组技术在细菌(例如但不限于大肠杆菌)中制造。

如本文所用，“多肽”是指通过肽键方式连接的线性氨基酸链，其长于如本文所用的“肽”或“肽片段”。

如本文所用的“肽”是指通过肽键方式连接的线性氨基酸链，其比本文所用的“多肽”短。

如本文所用，“氨基酸序列”是指肽、多肽或蛋白质中每个氨基酸残基的同一性，包括它们的顺序。这可以与“肽序列”互换使用。

如本文所用，“肽片段”是指氨基酸链(“肽”)，其是一段较大的多肽。换言之，如果两个或多个肽片段是相同较大多肽的片段，则可以一起形成较大多肽的全部或部分一级序列。在这种情况下，较大的多肽是本发明的重组多肽。

如本文所用，“蛋白质”是指主要由一种或多种肽和/或多肽组成并且已经折叠成或呈现为三维构象的分子实体。

如本文所用，“表位”是指肽片段、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、或其他被适应性免疫系统识别的部分，优选地被T细胞通过其T细胞受体识别('TCR')。

如本文所用，“LRMK”是指Leu-Arg-Met-Lys氨基酸序列SEQ ID NO:35，是尤其被组织蛋白酶S识别的切割位点。在一些实施方案中，提供可切割的接头，并且在一些进一步的实施方案中，该接头是LRMK。

如本文所用，“重叠”是指在两个不同的氨基酸序列、肽、或肽片段中相同或基本相似的氨基酸序列的一部分或“子序列”，优选地以一个氨基酸序列、肽或肽片段的C末端的亚序列，与另一氨基酸序列、肽或肽片段的N末端的亚序列相同或基本相似，和/或反之亦然的方式。重叠可也可不反映在编码所述氨基酸序列的多核苷酸序列中。

如本文所用，“同一性”是两个序列之间的相似度，换言之，两个序列在残基方面彼此匹配的程度，如通过比较两个或多个多肽或多核苷酸序列所确定的。可以使用两个序列的相似度来确定同一性，以提供对两个序列匹配程度的测量。技术人员熟知许多用于比较多肽或多核苷酸序列的程序，例如(但不限于)各种BLAST和CLUSTAL程序。百分比同一性可用于量化序列同一性。为计算同一性百分比，将两个序列(多肽或核苷酸)进行最佳比对(即，使两个序列在每个对应位置具有最多相同残基数，因此具有最高同一性百分比)将每个位置的氨基酸或核酸残基与该位置的相应氨基酸或核酸进行比较。在某些情况下，可通过在序列中插入空格以使其最匹配第二序列来实现最佳序列比对。相同氨基酸残基或核苷酸的数量提供同一性百分比，例如如果10个残基长的序列中有9个残基在被比较的两个序列之间是相同的，则同一性百分比为90％。同一性百分比通常是沿着被比较的两个序列的全长计算的。

如本文所用，“肿瘤抗原蛋白”是指在肿瘤细胞中、肿瘤细胞上、或由肿瘤细胞产生的蛋白质，并且其(在不存在免疫抑制的情况下，例如由肿瘤引起的免疫抑制)刺激免疫反应(即具有抗原性)。“肿瘤抗原蛋白”和“肿瘤抗原”在本文中可互换使用。肿瘤抗原蛋白可以是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)、或癌症/睾丸抗原。

如本文所用，“变体”是指肽、多肽和/或蛋白质，其氨基酸序列与野生型肽、多肽、和/或蛋白质具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性，可选地60-100％、65-100％、70-100％、75-100％、80-100％、85-100％、90-100％、91-100％、92-100％、93-100％、94-100％、95-100％、96-100％、97-100％、98-100％的同一性。

此处及通篇中的“源自”是指“与……的一部分相同或基本相似”。具有源自生存素蛋白的序列的蛋白质片段是含有与所述生存素的氨基酸序列的连续部分相同或基本相似的氨基酸序列的蛋白质片段。本文及全文“基本相似”是指氨基酸序列与参考野生型生存素蛋白序列或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性，可选地是70-100％、75-100％、80-100％、85-100％、90-100％、91-100％、92-100％、93-100％、94-100％、95-100％、96-100％、97-100％、98-100％的同一性。在一些实施方案中，本文和全文中的“至少”是指高达并包括100％的所述百分比。例如，“至少75％”在一些实施方案中可以表示“75％到100％”。通常，具有源自生存素蛋白的序列的肽片段的核酸序列与生存素蛋白核酸序列的差异程度大于所述肽片段氨基酸序列相对于生存素氨基酸序列的差异。这是由于制备和优化多肽表达的原因，例如密码子优化。为避免疑义，它是肽片段的氨基酸序列，肽片段来源于生存素的氨基酸序列的连续部分——因为它与连续部分至少有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。由于氨基酸遗传密码的固有冗余，核酸序列可能有更大程度的不同并且可能具有较低的序列同一性。

“重叠序列”是存在于本发明多肽的两个或更多个肽片段中的氨基酸序列的一部分或子序列。在一些实施方案中，一个肽片段的C末端包含与另一肽片段的N末端的氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列。这意味着在有重叠序列的地方，必须有至少一个肽片段的一部分在至少两个肽片段上是相同的。在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为2至40个氨基酸，因此肽片段的每个重叠部分为2至40个氨基酸。在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为2至31个氨基酸。在其他实施方案中，所述重叠序列的长度为4至30个氨基酸。在其他实施方案中，所述重叠序列的长度为6至20个氨基酸。在优选的实施方案中，所述重叠序列的长度为8至17个氨基酸。在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为8、9、10或11个氨基酸。在一些实施方案中，所述重叠序列的长度为12个氨基酸。在其他实施方案中，所述重叠序列的长度为13个氨基酸、14个氨基酸、15、16或17个氨基酸。在最优选的实施方案中，所述重叠序列的长度至少为8个氨基酸，用于产生细胞毒性T淋巴细胞('CTL')(CD8⁺T细胞)反应和/或长度至少为12个氨基酸，用于产生T辅助细胞(CD4⁺T细胞)反应。

在一个实施方案中，本发明的多肽包含肽片段，所述肽片段包含与多肽内的另一个肽片段的序列重叠的序列——例如，通过其N-末端序列或其C-末端序列。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含肽片段，所述肽片段包含与多肽内的两个其他肽片段的序列重叠的序列——例如，通过其N-末端序列和其C-末端序列。在一些实施方案中，本发明的多肽另外包含一个或多个肽片段，其包含不与包含在多肽内的任何其他肽片段的序列重叠的序列。

任何一个肽片段的长度可为2至55个氨基酸，更优选地为8至50个氨基酸，更优选地为12至45个氨基酸，更优选地为20至40个氨基酸。在一个优选的实施方案中，每个肽片段的长度为25至40个氨基酸，更优选地为28至38个氨基酸，甚至更优选地为29至37个氨基酸。在优选的实施方案中，每个肽片段的长度为29、30、31、32、33、34、35、36、或37个氨基酸。

在本发明的所有实施方案中，肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。“线性相邻”在这里是指在二级结构或氨基酸序列方面直接连续的肽片段。因此，一个或多个蛋白酶切割位点序列将每个肽片段分开。肽片段通过一个或多个蛋白酶切割位点序列连接。在本发明的一个实施方案中，两个或多个肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。在另一个实施方案中，三个或更多个肽片段通过位于每个线性相邻肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。在另一个实施方案中，4至30、5至20个肽片段，更优选地10至15、11至14、12、或13个肽片段通过位于每个线性相邻的肽片段之间的至少一个蛋白酶切割位点序列串联连接在一起以形成多肽。

蛋白酶切割位点是外源性的，这意味着它已被人工引入多肽中，并且未在多肽来源的肿瘤抗原蛋白的野生型序列中发现——至少在它被引入多肽序列的位置。

如本文所用，“外源”是指人工引入。它也可能意味着不存在于天然序列中，例如野生型(包括任何变体)，至少不存在于现在人工引入的位置。例如，多肽可以包含两个序列，这两个序列在天然蛋白质中是连续的，并且被外源蛋白酶切割位点(即在连续的天然序列中不存在的切割位点)分开。作为另一个例子，在包含包含源自肿瘤抗原蛋白的序列的肽片段并且在每个肽片段之间包含外源蛋白酶切割位点的多肽中，外源性蛋白酶切割位点是人工引入的切割位点，或者在肿瘤抗原蛋白中抗原蛋白氨基酸序列内它现在所在的位置处天然未发现的切割位点。

当剂量以“μg.kg^-1”表示时，这是指以微克为单位的药剂质量/以千克为单位的受试者质量。因此，本领域技术人员将清楚，mg.kg^-1表示以毫克为单位的试剂质量/以千克为单位的受试者质量。所述试剂可以是本文所列的任何试剂，即所述多肽或所述免疫肿瘤试剂。可以将所述治疗性和/或预防性多肽和/或免疫肿瘤学药剂提供给哺乳动物对象，优选地是人。

在第一方面，本发明是一种在受试者中治疗癌症的方法，包括：向所述受试者施用包含两个或更多肽片段的多肽，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含衍生自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列；和向所述受试者施用免疫肿瘤学药剂。

在第二个方面，本发明是一种用于治疗癌症的组合物，其中该组合物包含一种多肽，该多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列，并且其中所述治疗包括所述多肽与免疫肿瘤学药剂的共同施用。

本发明的多肽特别针对用于治疗人类癌症的人类肿瘤抗原蛋白，尽管本领域技术人员显而易见的是，这些教导同样适用于用于治疗动物癌症的动物肿瘤抗原蛋白。所述肿瘤抗原蛋白可以是TAA、TSA、或癌症/睾丸抗原，所有这些都是由肿瘤细胞专门表达或以升高的水平表达的蛋白，因此成为有吸引力的疫苗接种靶点。

适用于本发明的方法或多肽的TAA对技术人员来说是显而易见的；它们包括但不限于Her2/neu、生存素、端粒酶、BING-4、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、间皮素、SAP-1、钙激活的氯离子通道2。在本文的一个实施方案中，例如，TAA是生存素。生存素是典型的TAA；设计用于靶向其他TAA的本发明的多肽和方法将表现出相似的功效，因为所有TAA的共同特征是它们是在肿瘤细胞上比在健康细胞上以更高水平表达的自身抗原。

适用于本发明的方法或多肽的TSA对本领域技术人员而言将是显而易见的。所述TSA可能是在成人中异位表达的发育抗原。所述TSA可能是一种新抗原和/或由健康细胞天然表达的蛋白质突变形式。所述TSA可以是病毒衍生的癌症抗原，是由具有致癌病毒来源的癌细胞表达的抗原。人类致癌病毒包括人类乳头瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、和人类T细胞嗜淋巴病毒1(HTLV-1)。

在一些实施方案中，病毒衍生的癌症抗原是HPV16 E7、HPV18 E7、HPV16E6、HPV18E6、EBV EBNA、EBV LMP-1、EBV LMP-2A、HBV HBx、HCV核心、HCV NS3、HCV Ns5A、HTLV-1Tax、HTVL-1HZB、KSHV vFLIP、KSHV LANA、KSHV vGPCR、KSHV vIRF-1。在本文的一个实施方案中，举例说明的TSA是HPV衍生的癌抗原E7。来自HPV16和HPV18毒株的E7蛋白特别致癌。此处示例的是HPV16 E7。设计用于靶向其他TSA的本发明的多肽和方法将表现出相似的功效，因为所有TSA的共同特征是它们仅由肿瘤细胞而不是在健康细胞上表达。

在一些实施方案中，本发明的多肽包含仅来自一种肿瘤抗原蛋白的肽片段。在一些实施方案中，本发明的多肽包含来自多于一种肿瘤抗原蛋白的肽片段。仅作为一个实例，多肽可以包含一个或多个包含源自HPV16 E7的序列的肽片段，并且还包含一个或多个包含源自HPV16 E6的序列的肽片段。所述HPV16 E6和E7肽片段可以各自被外源蛋白酶切割位点序列分开。

本发明是一种在受试者中治疗癌症的方法，包括施用多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中所述第一肽片段包含源自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中所述第二肽片段包含源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列，并且其中所述方法进一步包括向所述受试者施用免疫肿瘤学药剂。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中所述第一肽片段由衍生自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列组成，并且其中所述第二肽片段由源自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列组成，还包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个蛋白酶切割位点序列。

所述第一序列、第二序列、和任何进一步的序列可以是生存素序列。所述第一序列、第二序列、和任何进一步的序列可以是如上所述的全部或部分生存素序列的变体。

所述第一序列、第二序列、和任何其他序列可以是HPV16 E7序列。所述第一序列、第二序列、和任何进一步的序列可以是如上所述的全部或部分HPV16E7序列的变体。

所述多肽和/或免疫肿瘤剂(统称为“所述药物”)的施用可以多种方式进行，每种药物可以相同或不同的方式递送。在一些实施方案中，一种或多种药剂通过口服递送、鼻腔喷雾、或注射施用。在一些实施方案中，注射递送可以是皮下、静脉内、肌内、腹膜内、或皮内注射。一种或多种所述药剂的施用可以是同时的(意思是在单次施用中)，分开的(意思是至少两种药剂分开但在相同或不同的时间施用)，或者顺序的(意思是没有药剂被一起施用)。在一些实施方案中，分开可意指两种或更多种药剂彼此在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟、或更长时间内递送。在一些实施方案中，顺序地可以指在同一天或不同天。

所述多肽包含至少两个或更多个肽片段。在一些实施方案中，它可以包含三个或更多个肽片段、四个或更多个肽片段、五个或更多个肽片段、六个或更多个肽片段、七个或更多个肽片段、八个或更多个肽片段、九个或更多个肽片段、十个或更多个肽片段、十一个或更多肽片段、或十二个或更多肽片段。在一些实施方案中，它可以包含多于十二个肽片段。

该多肽具有至少两个具有肽序列的肽片段，这些肽序列来源于一种或多种肿瘤抗原蛋白或其变体。所述多肽可包含两个或多个具有相同序列的肽片段。以这种方式重复某些肽片段在构象上可能是有利的。所述多肽可以包含两个或更多个具有基本相似序列的肽片段，肽片段序列彼此具有至少80％的序列同一性，可选地至少90％的序列同一性和/或在于肽片段序列最多有4、3、2、或1个氨基酸不同。这可以允许在所述多肽内呈现各种癌症相关的单核苷酸多态性。同样地，所述多肽可以包含两个或多个具有不同序列的肽片段，这些序列源自一种或多种肿瘤抗原蛋白的不同且不重叠的部分。这可以允许在给定的肿瘤抗原蛋白内呈现不同的、可选表位的序列，或者允许在所述多肽内呈现源自与肿瘤相关的两种或更多种肿瘤抗原蛋白的不同序列。在一些实施方案中，所述多肽可包含两个或更多个具有重叠序列的肽片段。这可以允许对给定肿瘤抗原蛋白内的一个或多个表位进行完全甚至多重覆盖，其优点是可以以不依赖HLA类型的方式在一群体中引发广泛的T细胞反应。同样地，所述多肽可包含多个肽片段，其中一些具有相同序列、一些具有基本相似的序列、一些具有不同序列、一些具有重叠序列、或其任何组合。

在一些实施方案中，所述多肽具有至少两个具有肽序列的肽片段，所述肽序列源自生存素或是其变体，也称为BIRC5(含有杆状病毒IAP重复序列的蛋白5)。生存素的示例性蛋白质序列包括在本文中作为SEQ ID NO:1。

SEQ ID NO:1(142aa)

MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFCFKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK KKEFEETAKKVRRAIEQLAA MD

这涉及生存素同种型1(uniprot识别号O15392-1)，但在一些实施方案中，所述序列可源自生存素同种型2(uniprot识别号O15392-2,SEQ ID NO:2)、3(uniprot识别号O15392-3,SEQ ID NO:3)、4(uniprot识别号O15392-4,SEQ ID NO:4)、5(uniprot识别号O15392-5,SEQ ID NO:5)、6(uniprot识别号O15392-6,SEQ ID NO:6)、或7(uniprot识别号O15392-7,SEQ ID NO:7)的一种或多种、或是其变体。

SEQ ID NO:2(165aa)

SEQ ID NO:3(137aa)

SEQ ID NO:4(120aa)

SEQ ID NO:5(117aa)

SEQ ID NO:6(78aa)

MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN

EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPMRELC

SEQ ID NO:7(74aa)

MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN

EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPM

本领域技术人员将理解，可以为上述肽中的每一种提供核酸序列(DNA或RNA，或两者的混合物)，并且这对于本领域技术人员来说将是常规推导出来的。例如，编码SEQ IDNO：1的DNA序列如下所示。

SEQ ID NO:20(426bp)

ATGGGCGCCCCCACCCTGCCCCCCGCCTGGCAGCCCTTCCTGAAGGACCACAGGATCAGCACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCCGAGAGGATGGCCGAGGCCGGCTTCATCCACTGCCCCACCGAGAACGAGCCCGACCTGGCCCAGTGCTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAGGGCTGGGAGCCCGACGACGACCCCATCGAGGAGCACAAGAAGCACAGCAGCGGCTGCGCCTTCCTGAGCGTGAAGAAGCAGTTCGAGGAGCTGACCCTGGGCGAGTTCCTGAAGCTGGACAGGGAGAGGGCCAAGAACAAGATCGCCAAGGAGACCAACAACAAGAAGAAGGAGTTCGAGGAGACCGCCAAGAAGGTGAGGAGGGCCATCGAGCAGCTGGCCGCCATGGAC

源自生存素的所述第一肽片段和源自生存素的所述第二肽片段可以来自相同的同种型，或来自不同的同种型，或其变体。所述多肽的任何肽片段可包含来自以上列出的任何同种型的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一肽片段和所述第二肽片段分别包含第一序列和第二序列，其中所述序列来自所述生存素序列的连续部分。作为说明性实例，所述第一序列可包含序列所源自的蛋白质(例如生存素同种型1)的残基1至10，并且所述第二序列可包含所述蛋白质序列的残基11至20，等等。来自任何上述同种型的任何残基可以形成源自生存素或其变体的所述第一序列或第二序列的起点。

应当理解，在存在三个或更多个肽片段的情况下，这些片段中的每一个都将具有作为生存素的变体或源自生存素的氨基酸序列。肽片段之间的所述序列可以相同或每个肽片段之间可以不同。作为说明性实例，所述第一肽片段可具有包含来自例如生存素同种型1的残基1至10的第一序列，所述第二肽片段可具有包含残基11至20的第二序列，并且所述第三肽片段可具有包含残基11至20的第一序列。

在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的任一者可包含“重叠序列”。重叠序列是指在多肽的两个肽片段的每一个中，氨基酸序列的一部分或子序列相同或基本相似。作为说明性实例，所述第一肽片段可包含该片段所源自的蛋白质(例如生存素同种型1)的氨基酸序列的残基1至10，并且所述第二肽片段可包含所述蛋白质的残基5至15，由此，每个肽片段中对应于每个肽片段所源自的蛋白质序列的残基5至10的残基是“重叠序列”。包含这些重叠序列的多肽可称为重组重叠多肽(ROP)。ROP已被证明比传统疫苗具有优势(参见Cai等人，2017年，WO2007125371和WO2016095812)。

在一些实施方案中，所述多肽具有至少两个具有肽序列的肽片段，所述肽序列源自HPV E7或是其变体。HPV E7的示例性蛋白质序列包括在本文中作为SEQ ID NO:43。

SEQ ID NO:43(98aa):

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

这涉及野生型HPV16 E7。然而，在一些实施方案中，HPV E7的蛋白质序列可以是HPV18 E7(SEQ ID NO：44)，或任何HPV变体的E7蛋白质。

SEQ ID NO:44(105aa):

MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ

本领域技术人员将理解，可以为上述肽中的每一种提供核酸序列(DNA或RNA，或两者的混合物)，并且这对于本领域技术人员来说将是常规推导出来的。例如，下面给出编码SEQ ID NO：43的DNA序列。

SEQ ID NO:52(294bp)

ATGCACGGCGACACCCCCACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCCGAGACCACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAGGAGGACGAGATCGACGGCCCCGCCGGCCAGGCCGAGCCCGACAGGGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGGCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGGACCCTGGAGGACCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCC

可以使用上述序列的密码子优化序列版本代替上述SEQ ID NO:52。

源自HPV E7的所述第一肽片段和源自HPV E7的所述第二肽片段可以来自相同的病毒变体，或来自不同的病毒变体，或是其序列变体。在一些实施方案中，所述第一肽片段和所述第二肽片段分别包含第一序列和第二序列，其中所述序列来自所述HPV16 E7序列的连续部分。作为说明性实例，所述第一序列可包含序列所源自的蛋白质(例如HPV16 E7)的残基1至10，并且所述第二序列可包含所述蛋白质序列的残基11至20，等等。来自任何上述同种型的任何残基可以形成源自HPV16 E7或其变体的所述第一序列或第二序列的起点。

应当理解，在存在三个或更多个肽片段的情况下，这些片段中的每一个都将具有作为HPV E7的变体或衍生自HPV E7的氨基酸序列。肽片段之间的所述序列可以相同或每个肽片段之间可以不同。作为说明性实例，所述第一肽片段可具有包含来自例如HPV16 E7的残基1至10的第一序列，所述第二肽片段可以具有包含残基11至20的第二序列，并且所述第三肽片段可以具有包含残基11至20的第一序列。

在一些实施方案中，所述两个或更多个肽片段中的任一者可包含“重叠序列”。重叠序列是指在所述多肽的两个肽片段的每一个中，氨基酸序列的一部分或子序列相同或基本相似。作为说明性实例，所述所述第一肽片段可包含片段所源自的蛋白质(例如HPV16E7)的氨基酸序列的残基1至10，并且所述第二肽片段可包含所述蛋白质序列的残基5至15，因此每个肽片段中对应于每个肽片段所源自的蛋白质序列的残基5至10的残基是“重叠序列”。包含这些重叠序列的多肽可称为重组重叠多肽(ROP)。ROP已被证明比传统疫苗具有优势(参见Cai等人，2017年，WO2007125371和WO2016095812)。

在一些实施方案中，所述多肽可包含多个重叠序列。作为说明性实例，所述第一肽片段可包含残基1至10，所述第二肽片段可包含残基5至15，且所述第三肽片段可包含残基11至20。因此，在所述说明性实例中，在多肽中存在两个重叠序列，具体地是所述第一和第二肽片段中的残基5至10，以及所述第二和第三肽片段中的残基11至15。此外，或备选地，可能存在一个或多个重叠序列，但并非所有所述肽片段都需要包含重叠序列。作为说明性实例，所述第一和第二肽片段可包含由残基5至10定义的重叠序列，但所述第三肽片段可包含残基16至25，因此不与任何一个重叠。在一些实施方案中，所述多肽可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多重叠序列。

在一些实施方案中，两个或更多个肽片段都不重叠。在一些实施方案中，所述多肽不包含重叠序列。

可以存在任何数量的重叠并且这仅受所述多肽的肽片段的数量和大小的限制。

在一些实施方案中，所述多肽包含覆盖目标癌症的肿瘤抗原蛋白的整个氨基酸序列的序列。在一些实施方案中，所述多肽包含覆盖感兴趣的癌症的肿瘤抗原蛋白的感兴趣部分的整个氨基酸序列的序列。例如，感兴趣的部分可以是具有免疫原性和/或包含大部分或所有T细胞表位区域和/或抗体表位的肿瘤抗原蛋白部分；作为另一个例子，感兴趣的部分可以是暴露在细胞外的肿瘤抗原蛋白的部分。在一些实施方案中，所述多肽包含代表至少10％的肿瘤抗原蛋白或感兴趣的部分、至少20％、30％、40％、50％的肿瘤抗原蛋白或感兴趣的部分的序列，优选地，至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的肿瘤抗原蛋白或感兴趣的部分。在一些实施方案中，所述多肽包含代表肿瘤抗原蛋白或感兴趣部分的100％序列的序列。

在一些实施方案中，所述多肽可以包含具有与野生型肿瘤抗原蛋白序列具有部分序列同一性的序列的肽片段(例如，生存素，包括上面列出的任何同种型，或其同源物，或例如，HPV E7，包括任何病毒变体E7序列)。作为说明性实例，至少一个肽片段可包含与肿瘤抗原蛋白序列的相关部分具有至少99％同一性的序列。或者，至少一个肽片段可包含与肿瘤抗原蛋白序列的相关部分有至少98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的同一性的序列。“相关部分”是指相关肽片段所基于的肿瘤抗原蛋白序列的连续残基串。作为说明性实例，如果所述肽片段包含与肿瘤抗原蛋白的残基1至10(例如包括生存素同种型1)具有至少90％同一性的序列，则10个残基中的9个将与肿瘤抗原蛋白(同样，例如生存素)残基1到10相同，一个将是不同的。本领域技术人员将理解，只要同一性百分比是不变的，任何残基都可以互换。本领域技术人员将进一步理解，较低百分比的同一性是可接受的，前提是保留关键残基。

两个或多个肽片段中的每一个在氨基酸方面可以是任意长度。两个或多个肽片段中的每一个可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多氨基酸长度。肽片段之间的重叠(即重叠序列)可能受限于肽片段的长度，这些重叠序列长度可为至少有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个的氨基酸。在一些实施方案中，所述重叠的长度为2至31个氨基酸，可选地至少为8个氨基酸。

所述多肽的两个或多个肽片段可包含一个或多个覆盖蛋白质整个序列的序列。作为说明性实例，所述多肽可包含两个肽片段，所述第一肽片段具有衍生自生存素同种型1的残基1至71的序列，所述第二片段具有衍生自生存素同种型1的残基72至142的序列。本领域技术人员会理解可以使用任何数量的片段来覆盖所述多肽所基于的所述生存素同种型的整个序列。作为进一步的说明性实例，所述多肽可包含三个多肽片段，所述第一肽片段具有衍生自生存素同种型1的残基1至71的第一序列，所述第二肽片段具有衍生自生存素同种型1的残基72至142的第二序列，并且所述第三肽片段具有衍生自生存素同种型1的残基50至120的第三序列。

这样的多肽可包含任何数量的重叠序列，它可包含任何长度的肽片段，并且所述多肽序列可以是任何长度，条件是所述肽片段来源于肿瘤抗原蛋白(包括，例如，如上所述的生存素或其变体或HPV16 E7或其变体)。

在一些实施方案中，本发明的多肽是免疫刺激性的。在一些实施方案中，本发明多肽的一个或多个肽片段是免疫刺激性的。在一些实施方案中，包含在本发明多肽的肽片段内的一个或多个序列是免疫刺激性的。本文中提到的“免疫刺激”是指在施用于受试者时刺激、激发、引起、和/或产生免疫反应。在优选的实施方案中，所述免疫反应包括适应性免疫反应。在一些实施方案中，所述适应性免疫反应包括产生针对所述多肽和/或针对其中包含的一个或多个肽片段和/或序列的抗体。在其他实施方案中，所述适应性免疫反应包括CD8+和/或CD4+T细胞的激活和/或增殖。在一些实施方案中，所述适应性免疫反应包括针对所述多肽和/或针对其中包含的一个或多个肽片段和/或序列的抗体的产生，以及CD8+和/或CD4+T细胞的激活和/或增殖。

在一个实施方案中，该多肽包含两个或更多个肽片段，每个片段包含源自生存素或其变体的序列，其中该多肽刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述两个或更多个各自包含源自生存素或其变体的序列的肽片段包含以下序列中的一个或多个：

SEQ ID NO:8(30aa)

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEG

SEQ ID NO:9(30aa)

DHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIH

SEQ ID NO:10(28aa)

ACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF

SEQ ID NO:11(29aa)

PTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIE

SEQ ID NO:12(30aa)

FKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVK

SEQ ID NO:13(28aa)

EHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLK

SEQ ID NO:14(29aa)

QFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNK

SEQ ID NO:15(30aa)

RERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAI

SEQ ID NO:16(21aa)

KEFEETAEKVRRAIEQLAAMD

可选地，其中所述多肽能够引发免疫反应或具有如上所定义的免疫刺激性。

在一些实施方案中，所述多肽包含两个或更多个肽片段，每个片段由源自生存素或其变体的序列组成，其中所述多肽刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段由序列SEQ ID NO:8至16的一个或多个组成。

在一个实施方案中，该多肽包含两个或更多个肽片段，每个片段包含源自HPV16E7或其变体的序列，其中该多肽刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述两个或更多个各自包含源自HPV16 E7或其变体的序列的肽片段包含以下序列中的一个或多个：

SEQ ID NO:45(35aa):

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE

SEQ ID NO:46(35aa):

EQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK

SEQ ID NO:47(35aa):

HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG

SEQ ID NO:48(23aa):

IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

在一些实施方案中，所述多肽包含两个或更多个肽片段，每个片段由源自HPV16E7或其变体的序列组成，其中所述多肽刺激T细胞反应。在一些实施方案中，所述两个或多个肽片段由序列SEQ ID NO:45至48的一个或多个组成。

所述肽片段可以以任何顺序出现在所述多肽中。

如前所述，这些序列中的一个或多个源自肿瘤抗原蛋白，因此可能仅与其具有如上所述的部分序列同一性。如前所述，技术人员可以容易地推导出核酸序列(对于DNA、RNA、或两者的混合物)。

如前所述，所述多肽可包含一个或多个重叠序列。作为进一步的说明性实例，如果所述多肽包含具有第一序列的第一肽片段，所述第一序列是SEQ ID NO：8，并且所述多肽包含具有第二序列的第二肽片段，所述第二序列是SEQ ID NO：9，则所述多肽将具有一个重叠序列，该重叠序列在每个肽片段中是相同的。

在这种情况下，所述重叠序列将是以下氨基酸序列：

DRRISTFKNWPFLEG

一个或多个蛋白酶切割位点序列位于本发明多肽的两个或多个肽片段中的每一个之间。在一个优选的实施方案中，一个或多个蛋白酶切割位点序列是存在于该多肽被施用至的目标或宿主或受试者或患者中的蛋白酶的切割位点序列，使得所述多肽可以在宿主内切割成其肽碎片。所述蛋白酶可以在细胞外或更优选地在细胞内起作用。所述蛋白酶可以是与所述多肽或其编码核酸联合递送的非宿主蛋白酶。更优选地，所述蛋白酶是宿主蛋白酶。宿主蛋白酶可以组成型存在、仅在诱导时存在、或以其他方式存在。

在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列可以是因子Xa消化位点，可选地是Ile-Glu-Gly-Arg。该序列在Arg之后被切割。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列可以是HRV 3C蛋白酶，可选地是Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro，其中切割发生在所述谷氨酰和甘氨酰残基之间。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶切割位点序列可以是HIV蛋白酶。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶切割位点序列可以是金属蛋白酶。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶切割位点序列可以是类胰蛋白酶。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶切割位点序列可以是其他蛋白酶，例如组织蛋白酶(S、L和B等)、CD13(人氨肽酶N)。

在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列可以是组织蛋白酶的切割位点序列。在一个更优选的实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶S的切割位点序列。组织蛋白酶S识别并切割许多氨基酸序列，其中任何一个都可以用于本发明，包括但不限于Arg-Cys-Gly-Leu、Thr-Val-Gly-Leu、Thr-Val-Gln-Leu、X-Asn-Leu-Arg、X-Pro-Leu-Arg、X-Ile-Val–Gln、和X-Arg-Met-Lys。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白酶切割位点可以是上述那些的任意数量的任何组合。作为说明性实例，所述多肽可包含六个肽片段，每个由一个或多个蛋白酶切割位点隔开，其中所述一个或多个蛋白酶切割位点包含四个组织蛋白酶S切割位点、一个类胰蛋白酶切割位点、和一个金属蛋白酶切割位点。

在本发明的一个优选实施方案中，X-Arg-Met-Lys是所述蛋白酶切割位点序列，更优选地Leu-Arg-Met-Lys(‘LRMK’，SEQ ID NO：17)是所述蛋白酶切割位点序列。LRMK是组织蛋白酶S的优选识别位点底物(Xu等人，2009年；Kallinteris等人，2005年)。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点序列包含LRMK序列SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点序列由LRMK序列SEQ ID NO:17组成。

在本发明的一个实施方案中，组织蛋白酶S的Leu-Arg-Met-Lys‘LRMK’切割位点序列被用作一个或多个蛋白酶切割位点序列，具有氨基酸序列：

SEQ ID NO:17(4aa):

LRMK

CD8⁺T细胞(也称为“细胞毒性T淋巴细胞”、“CTL”)靶向并裂解患病和/或受感染的细胞。传统上，MHC I类分子被理解为呈递细胞内来源的片段，用于CD8+T细胞识别和激活；例如，癌细胞可能会在MHC I类细胞上呈现异常表达的细胞内蛋白质的蛋白酶体消化的片段化产物。CD4+T细胞有助于激活和扩增其他免疫细胞，包括T细胞和B细胞。传统上，MHC II类分子被理解为向CD4+T细胞呈递细胞外来源的片段，这些片段已被抗原呈递细胞内化以进行呈递。最近，已知除了这些传统途径外还会发生交叉呈递，由此内化的细胞外片段可能呈递在MHC I类分子上，反之亦然。

已经被蛋白酶切割的本发明的肽片段可以被加工并呈递(例如通过MHC I类和II类分子)给免疫系统的细胞。源自本发明的肽片段的氨基酸序列通过它们分别经由MHC I类和II类分子的呈递刺激CD8+和CD4+T细胞。

在一些实施方案中，本发明的多肽在刺激T细胞反应方面非常有效。在一些实施方案中，所述多肽刺激CD8+T细胞反应。在一些实施方案中，所述多肽刺激CD4+T细胞反应。在一些实施方案中，本发明的多肽刺激CD8+和CD4+T细胞反应。

本发明的多肽包含重叠的肽片段，进一步增强了T细胞反应(Zhang等人，2009)。此外，重叠肽的使用更全面地代表了潜在T细胞表位的范围。

群体内T细胞受体和MHC库的遗传变异意味着在呈递给CD4+和/或CD8+T细胞和/或被其识别的序列中可能存在群体范围的变异。本发明的多个重叠肽片段通过平铺或提供更大覆盖一个或多个表位的能力以及通过提供免疫识别的替代选择来补偿这种变化。

在一个示例性实施方案中，本发明的多肽具有以下序列，包括源自人生存素同种型1的肽片段：

SEQ ID NO:18(287aa)

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGLRMKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHLRMKACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFLRMKPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIELRMKFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKLRMKEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLRMKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKLRMKRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAILRMKKEFEETAEKVRRAIEQLAAMD

在一个示例性实施方案中，编码本发明的多肽的多核苷酸具有以下序列(在该示例性实施方案中，该序列具有在5'末端添加的两个限制性核酸内切酶位点——Bam HI用粗体标记，Nde I用下划线标记——并且还在3'末端添加了一个限制性核酸内切酶位点——Xho I由带下划线的字体标记)：

SEQ ID NO:19(879bp)

Ggatcccatatgggtgcaccaactcttcctccagcatggcaacctttcctgaaggatcatcgtatctctactttcaagaactggccattcctggaaggtctgcgtatgaaggatcaccgtatctctactttcaagaactggccattccttgagggttgtgcttgtactcctgagcgtatggctgaggctggtttcatccacctgcgtatgaaggcttgcactcctgaacgtatggctgaagctggtttcatccactgtccaactgagaacgagcctgatctggcacaatgcttcttccttcgtatgaagcctactgagaacgaacctgatctggctcagtgcttcttctgcttcaaggaacttgagggttgggagcctgatgatgatccaatcgagctgcgtatgaagttcaaggagctggaaggttgggagcctgatgatgatcctatcgaggagcacaagaagcgctcttctggttgtgctttcctgtctgtcaaactgcgtatgaaggagcacaagaagcactcttctggttgtgctttcctgtctgtcaagaagcagttcga agaactgactctgggtgagttcctgaagctgcgtatgaagcagttcgaggagctgactctgggtgagttcctgaagctggatcgtgaacgtgctaagaacaagatcgctaaggagactaacaacaagctgcgtatgaagcgtgagcgtgctaagaacaagatcgctaaggagactaacaacaagaagaaggagttcgaggagactgctgagaaggttcgtcgtgctatccttcgtatgaagaaggagttcgaggagactgctgagaaggttcgtcgtgctatcgagcagctggctgccatggactaactcgag

本领域技术人员将理解，在上述实施方案中，有9个肽片段，具有8个重叠序列，每个肽片段由LRMK接头分开。在上述实施方案中，9个肽片段涵盖了人生存素的全序列。为了本发明的目的，所述肽片段的顺序无关紧要。为了本发明的目的，所述肽片段的数量必须是两个或更多。需要注意的是，这些肽片段来源于生存素，上面详细解释了“来源于”的含义。这些肽片段也可以源自生存素的变体，或者可以是源自生存素的片段的变体，如上所述。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NOs：8、9、10、11、12、13、14、15、和16，每个由LRMK蛋白酶切割位点隔开。在本发明的一个实施方案中，该多肽包含一个或多个SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14、15、和16的变体(如上定义)，每个由LRMK蛋白酶切割位点隔开。

在另一个示例性实施方案中，本发明的多肽具有以下序列：

SEQ ID NO:49(140aa):

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEELRMKEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKLRMKHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGLRMKIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

在一个示例性实施例中，编码本发明多肽的多核苷酸具有以下序列：

SEQ ID NO:50(423bp):

ATGCATGGTGATACCCCGACCCTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAACCGGAAACCACCGATCTGTATTGTTATGAGCAGCTGAATGATAGCAGCGAAGAGGAATTACGCATGAAGGAACAGCTGAACGATTCAAGCGAAGAAGAGGACGAAATTGACGGTCCGGCAGGTCAGGCAGAACCGGATCGTGCACATTACAACATTGTTACCTTTTGTTGCAAACTGAGAATGAAACACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGTAAATGTGATAGCACCCTGCGTCTGTGTGTTCAGAGCACCCATGTTGATATTCGTACATTAGAGGACCTGCTGATGGGCCTGCGGATGAAAATTCGTACCCTGGAAGACCTGTTAATGGGCACCCTGGGTATTGTTTGTCCGATTTGTAGCCAGAAACCGtaa

本领域技术人员将理解，在上述实施方案中，有4个肽片段，具有3个重叠序列，每个所述肽片段由LRMK接头分开。为了本发明的目的，所述肽片段的顺序无关紧要。为了本发明的目的，所述肽片段的数量必须是两个或更多。需要注意的是，这些肽片段来源于生物素，上面详细解释了“来源于”的含义。这些肽片段也可以源自生存素的变体，或者可以是源自生存素的片段的变体，如上所述。

在本发明的一个实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：45、46、47、和48，每个由LRMK蛋白酶切割位点分隔。在本发明的一个实施方案中，该多肽包含一个或多个SEQ ID NO：45、46、47、和48的变体(如上定义)，每个变体被LRMK蛋白酶切割位点分隔。

按照相同的逻辑，可以构建和/或表达本发明的多肽用于小鼠。在一个实施方案中，该多肽包含源自小鼠生存素的肽片段，使得该多肽覆盖完整的小鼠生存素序列，可选地通过重叠序列。在一个实施方案中，所述多肽具有以下序列，该序列具有来源于小鼠生存素的肽片段：

SEQ ID NO:51(279aa):

MHHHHHHGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDLRMKNYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIHLRMKCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCLRMKCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIELRMKFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKLRMKEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDLRMKKQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKETNNKLRMKRQRAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAA

在一些实施方案中，所述多肽还包含标签。所述标签可以是本领域技术人员已知的任何标签。例如，所述标签可以是myc-标签、HIS-标签、FLAG-标签、GFP(或与其相关的任何其他重组荧光蛋白)、HA-标签、GST-标签、或V5标签。所述标签可用于检测样品中的所述多肽或用于在所述多肽制造期间应用的分离和纯化技术。识别标签的抗体在本领域中广为人知并且可广泛购买。

在一些实施方案中，所述多肽以编码所述多肽的多核苷酸(DNA、RNA或两者的混合物)提供。这种多核苷酸可用于代替本发明的任何方法中的多肽。例如，编码所述多肽的多核苷酸可以与免疫肿瘤学药剂共同给予对象，并且一旦给予将引起本发明的多肽的表达，使得所述多肽已经有效地给予对象。

在一些实施方案中，所述多肽可以是重组多肽。在以下段落中，上述具有序列SEQID NO：18的多肽将被称为‘S-多肽’。术语“S-多肽”、“ROP-生存素”和“生存素ROP”在本文中可以互换使用。上述具有序列SEQ ID NO:49的多肽将被称为“ROP-HPV”。

在一些实施方案中，免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂。所述TNFR超家族激动剂可以是激活、上调、或刺激TNFR超家族成员的任何分子、抗体或其片段、肽、多肽、或蛋白质。作为说明性实例，所述激动剂可作用于以下靶标中的一个或多个：HVEM、CD40、OX40、4-1BB、CD30、GITR、TNFR2、和/或DR3。所述TNFR超家族激动剂可以直接激动TNFR超家族成员，或者它可以变构增强其他TNFR超家族配体的作用，或两者兼而有之。技术人员可以很容易地在IUPHAR数据库(www.guidetopharmacology.org)上找到合适的激动剂。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是HVEM激动剂、CD40激动剂、OX40激动剂、4-1BB激动剂、CD30激动剂、GITR激动剂、TNFR2激动剂、和/或DR3激动剂。当与任何上述TNFR超家族激动剂共同施用时，本发明的多肽增加所述激动剂的效力和/或最大功效。

在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂，其起到增强、上调、或刺激4-1BB作用的作用。4-1BB已被研究作为治疗癌症的免疫疗法中的潜在治疗靶点。所述4-1BB激动剂可以是肽或其片段、糖蛋白或其片段、抗体或其片段、或小分子。本领域已经证明了几种4-1BB激动剂。作为示例，以下分子是已知的4-1BB激动剂：4-1BB配体、乌托鲁单抗(utomilumab)、和乌瑞芦单抗。任何4-1BB激动剂(包括上面列出的那些)都可以与本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)联合给药。

在一些实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是作用于PD-1的检查点抑制剂。PD-1已被研究作为治疗癌症的潜在治疗靶点。所述检查点抑制剂可以是肽或其片段、糖蛋白或其片段、抗体或其片段、或小分子。本领域已经证明了几种作用于PD-1的检查点抑制剂。作为示例，以下分子是已知的PD-1抑制剂：AUNP-12、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、纳武单抗和西米普利单抗(cemiplimab)。任何检查点抑制剂(包括上面列出的那些)都可以与本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)联合给药。

在其他实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是作用于PDL1的检查点抑制剂。PDL1已被研究作为治疗癌症的潜在治疗靶点。所述检查点抑制剂可以是肽或其片段、糖蛋白或其片段、抗体或其片段、或小分子。本领域已经证明了几种作用于PDL1的检查点抑制剂。作为说明性示例，阿替利珠单抗是已知的PDL1抑制剂。任何检查点抑制剂(包括上面列出的那些)都可以与本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)联合给药。

在其他实施方案中，所述免疫肿瘤学药剂是作用于CTLA-4的检查点抑制剂。CTLA-4已被研究作为治疗癌症的潜在治疗靶点。所述检查点抑制剂可以是肽或其片段、糖蛋白或其片段、抗体或其片段、或小分子。本领域已经证明了几种作用于CTLA-4的检查点抑制剂。作为示例，伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)是已知的CTLA-4抑制剂。任何检查点抑制剂(包括上面列出的那些)都可以与本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)联合给药。

当施用本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)时，所述多肽的剂量将取决于待治疗的癌症、其严重程度和病程、所述治疗是否是预防性的、患者的临床特征和病史、以及熟练医生的判断、经验和判断力。所述治疗可仅施用一次，或在治疗过程中施用多次直至达到期望的结果。在这种情况下，期望的结果将是缩小或消除癌性肿瘤。在一些实施方案中，所述多肽的每次施用包含1至2000μg.kg^-1之间的多肽，优选地1至1000μg.kg^-1，或1至100μg.kg^-1，更优选地5至20μg.kg^-1。在一些实施方案中，每次施用中所述多肽的量可以在1μg到10000μg之间，优选地在100μg到2000μg之间，优选地在250μg到1000μg之间。可以使用本领域技术人员已知的技术从常规实验中获得用于向特定受试者施用的此类多肽(即本发明的多肽，例如S-多肽或ROP-HPV)的合适量。

本文所述的发明包括共同施用所述多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和免疫肿瘤学药物，其量可有效治疗癌症，同时避免与TNFR超家族激动剂和检查点抑制剂相关的毒副作用。在一些实施方案中，所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂在所述多肽之前、之后、或同时以对所述受试者无毒的剂量施用。已知4-1BB激动剂在剂量超过特定阈值时对人体有毒。已经表明，4-1BB激动剂的功效与其毒性成正比(参见Qi,X.,Li,F.,Wu,Y.等(2019))。因此，乌托鲁单抗具有低疗效和低毒性，而乌瑞芦单抗是高效但在0.3mg.kg^-1或更高剂量时引起肝毒性，并且在大于或等于1mg.kg^-1的剂量时引起严重肝毒性(Timmerman等人(2020)；Segal等人(2017))。最近的一项研究表明，乌瑞芦单抗在人类患者中的最大耐受剂量仅为0.1mg.kg^-1(Timmerman等人(2020))；在这样的剂量下，疗效很低。

在本发明中，共同施用本发明的多肽(例如S-多肽)和4-1BB激动剂具有有效的抗肿瘤活性，即使当所述4-1BB激动剂以对人类无毒的剂量或低于1mg.kg^-1(可选地低于0.3mg.kg^-1)的剂量施用时。在一些实施方案中，所述多肽(例如S-多肽)与一定剂量4-1BB激动剂共同给药，所述剂量小于10mg.kg^-1，优选地小于1mg.kg^-1、小于0.6mg.kg^-1、小于0.3mg.kg^-1、小于0.1mg.kg^-1。本领域技术人员将会理解，此处列出的任何剂量的所述4-1BB激动剂都可以与所述上述剂量的多肽(例如S-多肽)的施用相结合，，即1至2000μg.kg^-1的多肽，优选地1至1000μg.kg^-1，或1至100μg.kg^-1，更优选地5至20μg.kg^-1。在一些实施方案中，每次施用中多肽的量可以在1μg到10000μg之间，优选地在100μg到2000μg之间，优选地在250μg到1000μg之间。同样，应当理解，所述4-1BB激动剂的剂量取决于所选择的激动剂及其毒性特征、待治疗的癌症、其严重性和病程、所述治疗是否是预防性的、患者的临床特征和病史，以及熟练的医生的判断、经验、和判断力，并且对于任何特定情况的剂量方案对于本领域技术人员而言将是容易推导出来的。未显示乌托鲁单抗具有剂量限制性肝毒性，因此可以比乌瑞芦单抗更高的剂量给药。然而，乌托鲁单抗的功效可以通过与本发明的多肽(例如S-多肽)联合施用来提高。任何TNFR超家族激动剂与所述多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)的共同给药导致更有效的癌症治疗。

在一些实施方案中，本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)与检查点抑制剂共同施用。所述检查点抑制剂可以是PD-1抑制剂，并且可以在多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)给药之前、同时、或之后、和/或以对受试者无毒的剂量给药。本领域技术人员将理解，此处列出的检查点抑制剂的任何剂量都可以与上述剂量的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)的施用组合，即1至2000μg.kg^-1的多肽，优选地1至1000μg.kg^-1，或1至100μg.kg^-1，更优选地5至20μg.kg^-1。在一些实施方案中，每次施用中所述多肽的量可以在1μg到10000μg之间，优选地在100μg到2000μg之间，优选地在250μg到1000μg之间。同样，应理解检查点抑制剂的剂量取决于所选择的抑制剂及其毒性特征、待治疗的癌症、其严重性和病程、所述治疗是否是预防性的、该患者的临床特征和病史、以及熟练的医生的判断、经验、和审慎，以及任何特定情况下的剂量方案对于本领域技术人员而言将是容易推导出来的。有关常见检查点抑制剂及其毒性概况的综述，请参阅Spiers、Laura等人。“与检查点抑制剂相关的毒性——概述。”风湿病学(英国，牛津)卷58，增刊7(2019年)。任何检查点抑制剂与所述S多肽的共同给药导致更有效的癌症治疗。

本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和所述TNFR超家族激动剂或所述检查点抑制剂的施用可以周期性地重复。在一些实施方案中，每天或每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天重复施用本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和所述免疫肿瘤学药剂(TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂)。在一些实施方案中，每天、每周、每两周、每3周、每月、或每季度重复施用本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和所述免疫肿瘤学药剂(TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂)。

在一个实施方案中，提供了包含本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和/或如上文定义的免疫肿瘤学药剂的组合物或药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物或药物组合物另外包含药学上可接受的递送载体。本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和/或本发明的多核苷酸可以通过所述递送载体施用于受试者。同样，所述免疫肿瘤学药剂也可以在相同或不同的药学上可接受的递送载体中递送。在一个实施方案中，所述药学上可接受的递送载体是病毒载体，例如——但不限于——腺病毒、腺相关病毒、MVA、HSV。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的递送载体是细菌载体，例如——但不限于——李斯特菌属、沙门氏菌属。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的递送载体是质粒、纳米颗粒、脂粒、聚合物颗粒、或病毒样颗粒。

在一个实施方案中，所述组合物或药物组合物可选地包含一种或多种药学上可接受的运载体(或赋形剂)。用于本文所述的不同形式的药物组合物的此类合适赋形剂的实例可以在《药用辅料手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》，第2版，(1994)，AWade和PJ Weller编中找到。组合物或药物组合物可包含一种或多种附加组分。在一个实施方案中，该运载体适用于注射递送。在另一个实施方案中，该运载体适用于肺部递送。在另一个实施方案中，该运载体适用于口服递送。在一个实施方案中，该组合物或药物组合物另外包含治疗活性剂。在一个实施方案中，所述组合物或药物组合物可选地包含一种或多种药学上可接受的佐剂。合适的佐剂将被技术人员理解。在一个实施方案中，所述药学上可接受的佐剂可以选自非穷尽的清单：单磷酰脂质A(MPL)、明矾、AS501、montanide、CpG、ICLC。在一个实施方案中，所述组合物或药物组合物可选地与一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体混合。

在一些实施方案中，所述癌症可以是恶性的或良性的并且是原发性或继发性的。本发明可用作预防性治疗或治疗性治疗。在一些实施方案中，所述癌症是表达生存素的任何癌症。此类癌症的说明性实例包括肺癌、食道癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、皮肤癌、肠癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌、结直肠癌和口腔癌，以及血液癌症，例如如急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病。确定所述癌症是否可通过本文所述的本发明的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和免疫肿瘤学药剂的共同施用来治疗，对于本领域技术人员来说是常规的。

本发明还包括一种用于治疗癌症的组合物，其中该组合物包含任何上述实施方案的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)，并且治疗癌症的方法包括如前述实施方案中的任一个所述的共同施用所述多肽和免疫肿瘤学药剂。

本发明还包括用于治疗癌症的多肽，其中该多肽是如本文详细描述的本发明的多肽，并且治疗癌症的方法包括如前述实施方案中的任一个所述的共同施用该多肽和免疫肿瘤学药剂。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的联合疗法的组合物，其中该组合物包含任何上述实施方案的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)，并且该联合疗法包含如前述实施方案中的任一个所述的共同施用该多肽和免疫肿瘤学药剂。

本发明还包括一种用于治疗癌症的方法的免疫肿瘤学药剂，其中该免疫肿瘤学药剂包括上述任一实施方案的4-1BB激动剂或PD-1抑制剂，治疗癌症的方法包括如任何前述实施方案中免疫肿瘤学药剂与所述多肽(例如S-多肽)的共同给药。在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗癌症的联合疗法的免疫肿瘤学药剂，其中该免疫肿瘤学药剂包含任何上述实施方案的4-1BB激动剂或PD-1抑制剂，以及该联合疗法包括如任何前述实施方案中所述的共同施用所述免疫肿瘤学药剂与本发明的多肽(例如S-多肽)。

本发明还包括与任何前述实施方案中概述的免疫肿瘤学药剂联合使用的组合物。

本发明还包括一种用于治疗癌症的方法的组合物，其中该组合物包含任何前述实施方案的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)，其中该治疗癌症的方法包括分开地、顺序地、或同时地，如任何前述实施方案中所述地施用所述多肽和免疫肿瘤学药剂。

本发明还包括用于治疗癌症的试剂盒，其包含任何前述实施方案的多肽(例如S-多肽或ROP-HPV)和如上文概述的任何前述实施方案中所述的免疫肿瘤学药剂。

本发明还包括一种确定癌症是否适合根据本文所述的本发明的治疗方法、组合物、和共同给药进行治疗的方法，该方法包括i)向受试者或体外样品施用多肽，所述多肽包含两个或多个肽片段，其中第一肽片段包含源自肿瘤抗原的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自肿瘤抗原的第二序列，进一步包含位于两个或多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列；ii)给受试者或体外样品施用免疫肿瘤学药剂；和iii)测量所述受试者或体外样品中的T细胞刺激。T细胞刺激与所述治疗的成功相关。

所述体外样品可以是从患者或受试者分离的活组织。

通过参考以下非限制性实施例描述本发明。

实施例1–重组重叠蛋白的设计、表达和纯化

重组重叠肽设计

融合蛋白是通过识别长度在20到35个氨基酸之间的肽片段来设计的，这些肽片段源自一种或多种感兴趣的蛋白质，并且在将融合蛋白施用于受试者后最终将在细胞内释放。在一些实施方案中，肽片段具有重叠序列，因此此类融合蛋白被称为“重组重叠肽”或“ROP”。在一些实施方案中，肽片段一起覆盖了感兴趣的蛋白质的整个序列，但在其他实施方案中，只有感兴趣的蛋白质的免疫原性最相关的部分出现在肽片段中。然后通过LRMK序列串联连接肽片段。

ROP-生存素：

使用人生存素序列(SEQ ID NO：1，Uniprot识别号O15392-1)设计了包含重组重叠蛋白(‘ROP’)(SEQ ID NO：18)的多肽疫苗。这种名为“ROP-生存素”的ROP包含9个肽片段(“PF”)，每个片段通过组织蛋白酶S的LRMK裂解序列与下一个片段相连，因此PF可以在被组织蛋白酶S消化后在细胞内释放。每个PF根据ROP中连续氨基酸的位置编号为1到9，PF1是最接近N-末端的PF，PF9是最接近C-末端的。PF的顺序如下：

PF 1至9包含来自人类生存素同种型1(SEQ ID NO：1)的序列，并且被设计为使得PF覆盖所述蛋白质的整个序列，每个PF与至少一个其他PF共享部分序列(即具有“重叠序列”)。例如，PF1包含人类生存素的第1至30位氨基酸，而PF2包含人类生存素的第16至45位氨基酸，因此两者均包含第16至30位氨基酸，即所谓的“重叠序列”。

ROP-生存素的完整序列是SEQ ID NO:18。

mROP-生存素：

还设计并生产了小鼠ROP-生存素('mROP-生存素')，其肽片段来源于小鼠生存素，具有8个PF，序列如下：

编号	氨基酸序列
		PF1	GAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLED
PF2	NYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIH
		PF3	CACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFC
PF4	CPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIE
		PF5	FKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVK
PF6	EHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLD
		PF7	KQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKETNNK
PF8	RQRAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAA

mROP-生存素的完整序列是SEQ ID NO:51。

ROP-HPV16 E7：

ROP-HPV16 E7包含4个PF，序列如下：

PF 1至4包含来自HPV16 E7蛋白(SEQ ID NO：43)的序列，并且被设计为使得PF覆盖所述蛋白质的整个序列，每个PF与至少一个其他PF共享部分序列(即具有“重叠序列”)。例如，PF1包含HPV16 E7蛋白的第1至35位氨基酸，而PF2包含HPV16 E7蛋白的第26至61位氨基酸，因此两者均包含第26至35位氨基酸，即所谓的“重叠序列”。

ROP-HPV16 E7的完整序列是SEQ ID NO:49。

分子克隆

组分基因片段被设计成与设计的融合蛋白相对应，密码子被优化以在大肠杆菌中表达。通过PCR从片段构建融合蛋白的全基因序列，并通过电泳验证产物。通过水平电泳在含有1XTAE缓冲液的琼脂糖回收凝胶上分离产物。ROP-生存素和ROP-HPV16 E7的具体反应条件如下：

ROP-生存素：

为了构建设计的ROP，我们设计并合成了22个合成基因片段(SEQ ID NO：21-42)，其密码子针对在大肠杆菌中的表达进行了优化：

ROP的整个基因序列是通过PCR使用购自TOYOBO Co.的Taq DNA聚合酶KOD FX从SEQ ID NOs 21-42这些基因片段构建的，使用反应系统：

并参考核酸研究(Nucleic Acids Research),2004,32,e98。

PCR在三步反应条件下运行：

A–预变性：94℃，2分钟；B–变性：98℃，10秒

C–退火：54℃，30秒；D–延伸：68℃，1分钟/kb

重复步骤B-D x25个循环以进行扩增。扩增后，加入少量EX Taq聚合酶以在68℃下将反应再延长30分钟。

通过在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测来验证合成的PCR产物(图5A)。该条带对应于理论879bp分子量。

通过水平电泳在含有1XTAE缓冲液的0.8％浓度琼脂糖回收凝胶上分离ROP DNAPCR产物。制备琼脂糖凝胶并加入EB至浓度为0.5μg/ml。样品与上样缓冲液混合：

10x上样缓冲液：

施加1-5伏特/厘米的电压20分钟，并在紫外光下观察条带。要从凝胶中回收DNA，可使用购自Axygen Xo的DNA片段回收试剂盒。根据试剂盒方案使用。

ROP-HPV16 E7：

ROP-HPV16E7的密码子优化合成DNA序列作为SEQ ID NO:50提供。

转化

ROP-生存素：

使用购自TAKARA Co.的载体系统pMD18-T试剂盒在反应条件下将回收的产物扩增至总体积为30μl。5×T4 DNA连接酶缓冲液按以下组成配制：

将材料彻底均匀地混合，并在4℃下放置过夜。

从-70℃取出一小瓶1ml感受态ED60大肠杆菌细胞，并在冰上解冻5分钟。1.5ml离心管在冰上预冷5分钟，加入200μl感受态细胞。加入5μl连接反应液，混匀，冰上放置20分钟；管子每10分钟轻弹一次。通过在含有100mg/ml氨苄青霉素的2YT培养基琼脂平板上37℃过夜培养来筛选细胞。

从过夜平板中挑出4个白色菌落接种到3ml含100mg/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃振荡孵育过夜。将1.5ml过夜培养物以13,000rpm离心30秒。弃去上清液，用STE缓冲液(0.1M NaCl 5.85g；10mM Tris.Cl pH 8 1.21g；1mM EDTA pH8)洗涤细胞一次，并悬浮于100μl预冷溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tris.Cl pH 8；10mM EDTA pH 8)。加入200μl新鲜制备的溶液II(0.2M NaOH；1％SDS)并均匀混合。加入150μl预冷溶液III(5M KAc 60mL；HAc11.5mL；H2O 28.5mL)并均匀混合并置于冰上15分钟。将溶液以13,000rpm离心10分钟。将上清液转移到新的离心管中，加入无DNase的RNase至终浓度为100μg/ml。将管置于冰上10分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入1ml预冷乙醇，混合均匀，室温静置5分钟，然后以13000rpm离心10分钟。

通过Bam HI+Xho I限制性消化产物的电泳验证转化，使用3μL质粒DNA，0.2μL每种限制酶，2μL 10X缓冲液，总体积为20μL，在37℃下孵育2小时。1-5V的电压持续20分钟并在紫外线下观察，通过在1、2和3的每个泳道中存在879bp的条带，证实了成功的转化(图5B)。将所得质粒YN8735(泳道1)、TN8736(泳道2)、YN8737(泳道3)保存在-20℃。

为了构建用于工程化的质粒，用NdeI和XhoI将YN8735消化至总体积为40μl，并使用来自Axygen Co.的试剂盒从8％琼脂糖凝胶中回收裂解产物。同样用NdeI和XhoI消化载体质粒pET32a，消化产物用T4 DNA连接酶在16-18℃连接12-18小时。生成了质粒pYR1688(图6)。将pYR1688转化到感受态DH5α大肠杆菌中，并在2YT琼脂上在37℃下在100mg/ml氨苄青霉素存在下过夜筛选。挑选3个菌落并用NedI和XhoI从中消化质粒DNA至总体积为40μL，确认在菌落1和3中发生转化(图7A：泳道1＝菌落1；泳道2＝菌落2；泳道3＝菌落3)。质粒P1和P3(分别来自菌落1和3)由上海Sang Ni生物工程有限公司进行的DNA测序验证。菌落1和3的过夜细胞培养物(分别命名为“YN5144”和“YN5145”)被存放在细胞库中。

蛋白质表达和纯化

从YN5144中提取质粒P1并转化到感受态大肠杆菌EG63(BL21)中。转化后的大肠杆菌在含有100mg/ml氨苄青霉素的2YT琼脂上进行37℃过夜筛选。挑取菌落并分别两次接种到含有100mg/mL氨苄青霉素的2YT培养物中，在37℃下振荡12小时，首先接种到5ml 2YT+Amp中，然后接种到100ml 2YT+Amp中。将20ml这种种子细胞培养物接种到1000ml 2YT+Amp中，并在37℃下振荡孵育至OD 0.3-0.5。添加IPTG至终浓度为1mM，并在30℃下孵育3-5小时。诱导后，将1L细胞培养物在4℃5000rpm下离心15分钟。弃去上清液，并以1g湿细胞:3mlTE的比例用TE缓冲液悬浮细胞。以15-20kHz对细胞进行超声处理，然后以10,000rpm离心15分钟。分别收集上清液和沉淀。

诱导和表达通过12％分离凝胶和5％浓缩凝胶的SDS-PAGE(30％Acr/Bis溶液；1.5mol/L Tris-HCl pH8.8；0.5mol/L Tris-HCl pH6.8；Tris-甘氨酸电泳缓冲液)。向样品中加入1X上样缓冲液，将溶液煮沸5分钟，然后立即浸入冰中。将溶液以12,000rpm离心5分钟，并向每个泳道添加10μl上清液。浓缩阶段使用8V/cm，分离阶段使用15V/cm，直到溴酚蓝到达凝胶末端。

His标签序列在表达载体中。将凝胶在蒸馏水中洗涤10分钟，然后在37℃下加入染色溶液(考马斯亮蓝R250 0.25g，91ml 50％甲醇，9ml HAc)2小时。回收染色液，将凝胶移至脱色液(50ml甲醇，75mL HAc，加875ml蒸馏水)中，每3小时更换一次，直至背景清晰。SDS-PAGE结果显示，在用IPTG诱导5小时后，表达的重组蛋白的分子量为30kDa(与理论计算相同)，表达量约为总蛋白的50％(图7B)。

ROP-生存素主要在沉淀中检测到。因此，将细胞沉淀重悬于缓冲液(25mM Tris-HCl、200mM NaCl、8M尿素、10mM咪唑、pH8.0)中，并以20,000g离心45分钟，然后施加到Ni-NTA树脂。洗涤缓冲液和洗脱缓冲液也含有8M尿素。对于重折叠，首先将洗脱的蛋白质缓冲液交换为25mM Tris-HCl、200mM NaCl、0.5精氨酸-HCl、pH 10.5，然后使用PD10柱(GE保健生命科学(GE Healthcare Life Sciences)，英国)将缓冲液交换为含有10％甘油的PBS。

ROP-HPV

回收的产物如上针对ROP-生存素进行扩增，并转化入感受态大肠杆菌用于过夜培养。通过添加IPTG(终浓度为0.5mM)诱导ROP表达。收集细胞并重悬于裂解缓冲液(25mMTris-HCl、200mM NaCl、2％Triton X-100、10mM咪唑、pH8.0)中，并通过超声裂解。通过以20,000g离心45分钟分离不溶性部分。His标签序列在表达载体中。对于表达的可溶性蛋白质，将Ni-NTA树脂添加到可溶性组分中30分钟，然后用30树脂体积的裂解缓冲液洗涤，并用含有300mM咪唑的裂解缓冲液洗脱。将洗脱的蛋白质透析到含有10％甘油的PBS缓冲液中。

小鼠ROP-生存素(mROP-生存素)

将单个转化的BL21(DE3)菌落挑选到LB(50μg/ml Kan)中，并在37℃下培养过夜。然后将过夜培养物用新鲜LB稀释100倍并培养至OD600达到0.6。然后加入IPTG至终浓度为0.5mM。在IPTG诱导后16小时通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(25mMTris-HCl、200mM NaCl、2％Triton X-100、10mM咪唑、pH8.0)中并通过超声裂解。通过以20,000g离心45分钟分离不溶性部分。将不溶性组分重新悬浮在缓冲液(25mM Tris-HCl、200mMNaCl、8M尿素、10mM咪唑、pH8.0)中，并在20,000g下再离心45分钟，然后加入到Ni-NTA树脂。洗涤缓冲液和洗脱缓冲液也含有8M尿素。对于重折叠，首先将洗脱的蛋白质缓冲液交换为25mM Tris-HCl、200mM NaCl、pH 8.0，然后使用PD10柱(GE保健生命科学，UK)将缓冲液交换为含10％甘油的PBS。

实施例2–TNFR超家族激动剂和基于生存素的重组重叠肽用于治疗癌症的联合方法的论证

材料和方法

小鼠

从常州卡文斯实验动物有限公司订购了总共70只雌性C57BL/6小鼠。这些动物没有特定病原体，到达常州牛津石松生物技术有限公司(‘CBI’)时大约6-7周龄。收到后，将动物打开包装并放入笼子中。对每只动物进行健康检查，包括评估皮毛、四肢和孔口。还检查每只动物的姿势或运动是否有任何异常迹象。

肿瘤细胞系

购入B16-F10和B16-GFP-生存素细胞(上海南方模式生物科技发展有限公司生产)。B16-GFP-生存素和B16-F10细胞在添加有10％FBS的DMEM培养基中维持在37℃、5％CO2下，，随后在接种到小鼠中之前在10代内培养。

免疫组织化学

通过免疫组织化学(IHC)检测B16-GFP-生存素中GFP-生存素的表达。B16-F10细胞用作阴性对照。在盖玻片上生长的细胞在室温下固定在4％多聚甲醛中10分钟。透化(PBS中的0.5％Triton X-100)后，将细胞用0.5％BSA封闭30分钟，并在室温下与抗生存素抗体XA281 NO10(CBI生产)孵育1小时。洗涤细胞并与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(ab6789，1/500稀释)再孵育1小时，然后进行二氨基联苯胺染色(DAB)。细胞核用苏木精复染。

肿瘤模型

在第0天，给小鼠的胁腹皮下注射混合了RPMI 1640培养基的1x10⁵ B16-GFP-生存素细胞。肿瘤细胞接种后5天，70只小鼠根据体重随机分为7组(每组10只)。分组后开始治疗(细胞接种后5天)。这些组示于下表1中。ROP-生存素根据实施例1生产。单磷酰脂质A佐剂(MPL)购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich),多赛特,UK(目录号S6322)。激动剂4-1BB(CD137)抗体(BE0239)购自BioXCell(美国新罕布什尔州)。所提供的MPL包含0.5mg MPL，并将其稀释到2ml PBS中，使MPL的浓度为0.25mg.ml^-1。ROP-生存素、MPL和/或PBS每7天皮下给药一次。每3天腹膜内施用4-1BB抗体。

表1

(S.C.＝皮下；i.p.＝腹膜内)

每3天用卡尺测量一次肿瘤(长×宽)。使用以下公式确定肿瘤体积：1/2×D×d²其中D是长轴，d是短轴。当肿瘤达到2立方厘米或发生溃疡时处死小鼠。

第23天，处死所有小鼠。收集血清和脾细胞用于通过ELISPOT和ELISA测试体液和细胞免疫反应。

酶联免疫吸附试验

纯化的人生存素、ROP-生存素(4μg/ml)或生存素肽(2μg/ml)在PBS中于4℃下包被到平底96孔微量滴定板(康宁(Corning-Costar))上过夜。在室温下用5％BSA封闭孔1小时。随后在室温下与小鼠血清(在PBS中以1:10000稀释)孵育一小时。使用HRP偶联的抗小鼠IgG二抗检测抗体结合。洗涤后，通过添加100μl TMB底物溶液显影板。停止反应并根据标准方案使用光谱仪测量450nm处的吸光度。

小鼠脾细胞的分离和ELISPOT检测

小鼠脾脏通过筛网过滤并加载到鼠脾细胞分离培养基(索莱宝(Solarbio))中，并以1000g离心22分钟，然后将分层的淋巴细胞转移到装有细胞培养基的新试管中。细胞用RPMI 1640洗涤两次，每孔2.5x10⁵个脾细胞用于ELISPOT测定中的刺激。

根据制造商的说明，使用微珠试剂盒(美天旎(Miltenyi)，德国)通过阴性或阳性选择纯化Cd4+或CD8+T细胞。

使用ELISPOT试剂盒(Mabtech，瑞典)进行测定。简言之，在抗-IFN-γ-Ab预包被板(密理博(Millipore))中用5μg/孔人生存素或ROP-生存素再刺激脾细胞过夜。弃去细胞，加入生物素化的抗IFN-γ抗体在室温下孵育两小时，然后在室温下与碱性磷酸酶(ALP)偶联的链霉亲和素再孵育一小时。显色后，通过用自来水洗涤板来终止反应并将板风干。使用ELISPOT阅读器(CTL)对斑点进行计数。

统计分析

结果表示为平均值±S.E.M.。视情况通过学生t检验或对数秩检验进行比较，p<0.05被认为是显著的。

结果

人生存素在B16-GFP-生存素细胞中高表达

B16-GFP-生存素细胞首先通过IHC使用抗人生存素抗体进行测试。图1显示了与B16-F10细胞相比，B16-GFP-生存素细胞中生存素表达的结果。B16-F10或B16-GFP-生存素细胞在玻璃盖玻片上生长，在用显微镜(放大40倍)检查之前用抗人生存素抗体固定和染色。细胞核用苏木精复染。如图1所示，B16-GFP-生存素细胞表达人生存素蛋白的水平远高于B16-F10对照细胞。

ROP-生存素和低剂量抗4-1BB抗体的联合治疗显著抑制B16-GFP-生存素肿瘤生长

每只C57BL/6小鼠注射1x10⁵ B16-GFP-生存素细胞并随机分为4组(每组10只小鼠)。肿瘤细胞接种后五天，用PBS+MPL佐剂、ROP-生存素(100μg)+MPL佐剂、0.6mg/kg抗4-1BB抗体、或ROP-生存素(100μg)+0.6mg/kg抗4-1BB抗体和MPL的组合处理小鼠。图2和3分别显示了每组的肿瘤体积和存活率。图2显示了每三天测量和记录的每组肿瘤体积。图3显示了经过处理的小鼠的存活百分比。

如图2所示，在肿瘤细胞接种后23天，ROP-生存素+MPL接种组的肿瘤体积显著小于(p<0.05)PBS+MPL治疗组。如图2所示，即使与ROP-生存素(100μg)+MPL或抗4-1BB抗体治疗组相比，ROP-生存素(100μg)+MPL和0.6mg/kg抗4-1BB抗体的联合治疗也显著抑制肿瘤生长(p<0.05)。图3显示联合治疗组的存活率远高于其他组(ROP-生存素(100μg)+4-1BB抗体对比PBS，p<0.01；ROP-生存素(100μg)+4-1BB抗体对比ROP-生存素，p<0.05；ROP-生存素(100μg)+4-1BB抗体对比4-1BB抗体，p<0.05)。

与仅使用ROP-生存素或抗4-1BB抗体的组相比，ROP-生存素和高剂量抗4-1BB抗体的联合治疗并未显著抑制肿瘤生长

图4显示了ROP-生存素(100μg)+1.8mg/kg 4-1BB抗体、ROP-生存素(100μg)、4-1BB抗体或PBS处理的对照组的肿瘤体积。MPL+ROP-生存素(100μg)或1.8mg/kg抗4-1BB抗体处理组的平均肿瘤体积比PBS处理组小得多(p<0.05)。MPL+ROP-生存素(100μg)+1.8mg/kg 4-1BB抗体治疗组的肿瘤体积与MPL+1.8mg/kg4-1BB抗体组非常相似，且不显著小于MPL+ROP-生存素(100μg)组(p>0.05)。

我们已经证实，较高剂量的4-1BB激动剂比较低剂量的4-1BB激动剂具有更高的抗肿瘤功效。我们进一步证明，ROP-生存素与低剂量4-1BB激动剂联合给药显著增强了抗肿瘤功效，优于单独使用低剂量4-1BB激动剂治疗。这种功效的增加允许提供有效的治疗而无需增加施用的4-1BB激动剂的剂量。换句话说，4-1BB激动剂的效力增加了。这是有利的，因为目前有效治疗人类患者癌症所需的高剂量4-1BB激动剂具有令人望而却步的毒性(如本文所讨论)。与ROP-生存素共同给药可以提高疗效，而不会有剂量依赖性毒性的风险。

实施例3–检查点抑制剂和基于生存素的重组重叠肽用于治疗癌症的联合方法的论证

材料和方法

小鼠

雌性C57BL/6小鼠共50只，购自常州凯文斯实验动物有限公司。这些动物没有特定的病原体，并且在到达CBI时大约6-7周大。收到后，将动物打开包装并放入笼子中。对每只动物进行健康检查，包括评估皮毛、四肢和孔口。还检查每只动物的姿势或运动是否有任何异常迹象。

肿瘤细胞系

MC38肿瘤细胞购自上海模式生物(Model Organisms)。B16-GFP-生存素在添加了10％FBS的DMEM培养基中保持在37℃、5％CO2的条件下，随后在接种到小鼠之前在10代内培养。

肿瘤模型

在第0天，每只小鼠的侧腹皮下注射3x10⁵个与RPMI 1640培养基混合的MC38细胞。肿瘤细胞接种后五天，根据体重将50只小鼠随机分为5组(每组10只小鼠)，并用根据实施例1生产的小鼠ROP-生存素('mROP-生存素')免疫，和/或根据下面的表3使用抗PD-1抗体治疗。

单磷酰脂A佐剂(MPL)购自西格玛。抗PD1抗体购自BioXcell。ROP-生存素、MPL和/或PBS每7天皮下给药一次。每3天腹膜内注射抗PD-1抗体。

表3

每3天用卡尺测量一次肿瘤(长×宽)。肿瘤体积使用以下公式确定：1/2×D×d²其中D是长轴，d是短轴。当肿瘤达到2立方厘米或发生溃疡时处死小鼠。

每3天测量一次体重。

第14天，处死所有小鼠。收集血清和脾细胞用于通过ELISPOT测试体液和细胞免疫反应。分离小鼠脾细胞并根据实施例2进行ELISPOT测定。

统计分析

结果表示为平均值±S.E.M.。视情况通过t检验或对数秩检验进行比较，p<0.05被认为是显著的。

结果

mROP-生存素(200μg/小鼠)和抗PD-1抗体(2mg/kg)联合治疗可显著降低小鼠MC38 肿瘤的生长

从图8中可以看出，在14天时在接受mROP-生存素(200μg/小鼠)和抗PD-1抗体(2mg/kg)联合治疗的组中小鼠MC38肿瘤体积显著低于(p<0.05)其他方案。特别值得注意的是，单独使用mROP-生存素(200μg)或抗PD-1抗体(2mg/kg)均不能显著抑制MC38肿瘤生长；然而，mROP-生存素:抗PD-1抗体组合方案可有效显著减小肿瘤体积。

小鼠的体重不随治疗方案而变化

在任何时间点，治疗组之间观察到的体重没有显著差异(图9)。

mROP-生存素(200μg/小鼠)和抗PD-1抗体(2mg/kg)的联合治疗导致特异性T细胞反应显著高于单独治疗组

T细胞反应是通过IFN-γ释放(通过ELISPOT测量)从从接受上述治疗的小鼠中收获的活化脾细胞来测量的(图10)。相对于对照，无论是否用小鼠生存素蛋白或小鼠ROP-生存素刺激，在已被mROP-生存素(200μg/小鼠)和抗PD-1抗体(2mg/kg)的组合激活的脾细胞中，T细胞显著升高(p<0.0001)。与单独使用mROP-生存素激活的脾细胞相比，无论是用PMS还是用RMS刺激，在由mROP-生存素和抗PD-1抗体的组合激活的脾细胞中，T细胞也显著升高(p<0.01)。来自仅接受抗PD-1抗体的小鼠的脾细胞未表现出任何T细胞反应。

可以得出结论，mROP-生存素和抗PD-1抗体的联合治疗在体内比任何一种单一疗法都更有效。

实施例4–TNFR超家族激动剂和基于HPV-16E7的重组重叠肽用于治疗癌症的联合方法的论证

材料和方法

小鼠

从常州凯文斯实验动物有限公司订购了总共40只雌性C57BL/6小鼠。这些动物没有特定病原体，到达常州牛津石松生物技术有限公司(‘CBI’)时大约6-7周大。收到后，将动物打开包装并放入笼子中。对每只动物进行健康检查，包括评估皮毛、四肢和孔口。还检查每只动物的姿势或运动是否有任何异常迹象。

肿瘤细胞系

小鼠TC-1细胞购自Biofeng Ltd。小鼠TC-1表达来自HPV-16的E7癌蛋白，并用作感染HPV-16的人类肿瘤的替代物。TC-1细胞在含10％FBS的RPMI1640中维持在37℃、5％CO2条件下，随后在接种到小鼠体内之前在5代内培养。

HPV E7蛋白合成

HPV16 E7蛋白基因序列针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化。该基因由GeneArt DNA合成服务合成。在2.5mM dCTP和dGTP存在下，分别用T4 DNA聚合酶(22℃下30分钟)处理合成的cDNA和Bsa4线性化载体pNIC28-Bsa4(SGC Oxford)。通过在80℃下孵育20分钟使T4 DNA聚合酶失活。T4 DNA处理的PCR产物和载体在25℃下以1:50的比例混合10分钟。连接产物的等分试样用于转化DH5a感受态细胞。通过菌落PCR鉴定阳性克隆，并用相应的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。

将单个转化的BL21(DE3)菌落挑入LB(50μg/ml Kan)并在37℃下培养过夜。然后将过夜培养物用新鲜LB稀释100倍并培养至OD600达到0.6。然后加入IPTG至终浓度为0.5mM。在IPTG诱导后16小时通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(25mM Tris-HCl、200mM NaCl、2％Triton X-100、10mM咪唑，pH8.0)中并通过超声裂解。通过以20,000g离心45分钟分离不溶性部分。对于表达的可溶性蛋白质，这时将Ni-NTA树脂添加到可溶性组分中30分钟，然后用30树脂体积的裂解缓冲液洗涤，并用含有300mM咪唑的裂解缓冲液洗脱。对于形成包涵体的蛋白质，将不溶性部分重新悬浮在缓冲液(25mM Tris-HCl、200mM NaCl、8M尿素、10mM咪唑、pH8.0)中，并在20,000g下再离心45分钟，然后再应用Ni-NTA树脂。洗涤缓冲液和洗脱缓冲液也含有8M尿素。对于重折叠，首先将洗脱的蛋白质缓冲液交换为25mMTris-HCl、200mM NaCl、0.5精氨酸-HCl、pH 8.0，然后使用PD10柱(GE保健生命科学，UK)交换为PBS。

肿瘤模型

第0天，在小鼠侧腹皮下注射2x10⁵个TC-1细胞与RPMI 1640培养基的混合物。

为了研究ROP-HPV16 E7相对于野生型HPV16 E7蛋白对肿瘤生长的影响，根据体重将40只小鼠随机分为4组(每组10只小鼠)。分组后和细胞接种后5天开始处理。这些组示于下表4中。方案如表4和图11所示。每7天皮下施用ROP-HPV16 E7、佐剂(MPL)和/或PBS。每3天腹膜内施用抗4-1BB抗体。

表4

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(S.C.＝皮下；i.p.＝腹膜内)

为了评估ROP-HPV16 E7和抗4-1BB抗体的联合治疗，50只小鼠在肿瘤细胞接种后5天根据体重随机分为5组(每组10只小鼠)。分组后和细胞接种后五天开始处理。这些组示于下方的表5中。方案如表5和图14所示。每7天皮下施用ROP-HPV16E7、佐剂(MPL)、和PBS。每3天腹膜内施用抗4-1BB抗体。第1-4组使用佐剂。

表5

(S.C.＝皮下；i.p.＝腹膜内)

根据实施例1生产ROP-HPV16 E7。单磷酰脂A佐剂(MPL)购自英国多塞特郡的西格玛奥德里奇(目录号S6322)。激动剂4-1BB(CD137)抗体(BE0239)购自BioXCell(美国新罕布什尔州)。所提供的MPL包含0.5mg MPL，并将其稀释到2ml PBS或蛋白质溶液中，使MPL的浓度为0.25mg.ml^-1。

当肿瘤达到2立方厘米或发生溃疡时处死小鼠。

统计分析

结果

ROP-HPV16 E7抑制肿瘤生长。

接受wt蛋白HPV16 E7的TC-1接种小鼠在22天时显示肿瘤体积是对照组的三分之二(p<0.01)。然而，接受ROP-HPV16 E7的小鼠表现出更大的肿瘤生长抑制，在22天时肿瘤体积小于对照组的三分之一(p<0.001)和用wt蛋白治疗的小鼠的一半(p<0.05)(图12)。这种益处转化为生存结果。接受ROP-HPV16 E7的小鼠同样表现出最佳存活结果(图13)：60％接受ROP-HPV16 E7的小鼠存活到第26天，显著高于(p<0.01)对照组(佐剂或PBS)小鼠的存活率(10％)，并且显著(p<0.05)高于用wt HPV16 E7处理的小鼠的存活率(30％)。

ROP-HPV16 E7与抗4-1BB抗体结合显示出强大的协同作用，可导致肿瘤消退并提高生存率

单独使用ROP-HPV16 E7或单独使用抗4-1BB抗体治疗可减缓肿瘤生长，其中ROP-HPV16 E7比抗4-1BB抗体更能减缓肿瘤生长(图15)。然而，虽然这些治疗减缓了肿瘤生长，但使用ROP-HPV16 E7(100μg)和抗4-1BB抗体(10mg/kg)联合治疗TC-1接种小鼠可在第22天使肿瘤消退至接近零的水平(图15)。在第22天，接受联合治疗的小鼠的肿瘤体积显著低于接受任何其他方案治疗的小鼠的肿瘤体积：对照(p<0.00001)、单独4-1BB(p<0.001)、或单独的ROP-HPV16 E7(p<0.05)。

剔除肿瘤大小超过1500mm³的小鼠。由于0％存活率，佐剂的数据在22天停止，PBS的数据在25天停止(图16)。当治疗持续超过22天时，观察到用抗4-1BB Ab治疗的小鼠的肿瘤体积达到稳定水平，上限为1500mm³(由于存活率为0％，数据在第40天停止)(图16)。仅用ROP-HPV16 E7治疗的小鼠的肿瘤体积从低于500迅速增加到相当于抗4-1BB抗体或更高的水平。然而，用联合疗法治疗的小鼠表现出非常低(接近零)的肿瘤体积直到第40天(此时开始观察到生长略有上升)(图16)，证明了有效的抗肿瘤活性。这种抗肿瘤活性比仅通过ROP-HPV16 E7和抗4-1BB抗体的累加效应所预期的更为显著；即证明了协同作用。接受联合疗法治疗的小鼠在140天的随访期内保持无肿瘤状态(数据未显示)。

图17和18显示联合治疗组的存活率远高于所有其他组(ROP-HPV16 E7+抗4-1BB抗体对比ROP-HPV16 E7，第26天p<0.05；ROP-HPV16 E7+抗4-1BB抗体对比抗4-1BB抗体，第26天p<0.001；ROP-HPV16 E7+抗4-1BB抗体对比PBS，第26天p<0.001)。联合组100％的小鼠存活到第47天，而ROP-HPV16 E7组的存活率在治疗过程中下降到30％，抗4-1BB抗体组和对照组的存活率下降到0％。

总之，ROP-HPV16 E7和抗4-1BB抗体的联合治疗在体内非常有效。

实施例5–检查点抑制剂和基于HPV-16E7的重组重叠肽用于治疗癌症的联合方法的论证

材料和方法

小鼠

肿瘤细胞系

小鼠TC-1细胞购自Biofeng Ltd.。细胞在添加有10％FBS的RPMI1640培养基中保持在37℃、5％CO₂的条件下，随后在接种小鼠之前培养5代。

肿瘤模型

在第0天，用重悬浮在无血清RPMI 1640培养基中的2x10⁵个TC-1细胞在小鼠侧腹皮下注射。

为了评估ROP-HPV16 E7和抗PD-1阻断抗体的联合疗法，50只小鼠在肿瘤细胞接种5天后根据体重随机分为5组(每组10只小鼠)。分组后和细胞接种后五天开始处理。这些组示于下方的表6中。ROP-HPV16 E7(也可选择PD-1抗体)与MPL一起施用。方案如表6和图14所示。每7天皮下施用ROP-HPV16 E7、佐剂(MPL)和PBS。每3天腹膜内注射抗PD-1抗体。

表6

(S.C.＝皮下；i.p.＝腹膜内)

当肿瘤达到2立方厘米或发生溃疡时处死小鼠。

统计分析

结果

ROP-HPV16 E7(100μg/小鼠)和抗PD-1抗体(10mg/kg)的联合治疗显著降低了小鼠 TC-1肿瘤的生长

从图19可以看出，在接受佐剂、PBS、和αPD-1抗体治疗的小鼠中，肿瘤体积在20-22天内迅速增加到大约1500-2000mm³。仅接受ROP-HPV16 E7治疗的小鼠中的肿瘤在第33天体积迅速增加之前保持较低(约500立方毫米)。然而，接受联合治疗的小鼠体内的肿瘤在第40-43天之前仍然很低(大约500立方毫米)。因此，联合疗法提供了最有效的治疗选择。在治疗期间，与其他治疗组相比，ROP-HPV16 E7治疗显示肿瘤体积有统计学意义显著的减少(p<0.01)。

ROP-HPV16 E7(100μg/小鼠)和抗PD-1抗体(10mg/kg)的联合治疗导致存活率显著高于单独治疗组

图20表明，接受ROP-HPV16 E7(100μg/小鼠)和αPD-1抗体(10mg/kg)联合治疗的小鼠存活率最高，10％的小鼠存活至试验结束。相比之下，仅接受ROP-HPV16 E7的组在第47天的存活率为30％，而在仅接受αPD-1抗体、PBS或佐剂的其余组中，第47天的存活率为0％。在测量期间，与其他治疗组相比，用ROP-HPV16 E7治疗小鼠的存活率在统计学上显著增加(p<0.01)。

可以得出结论，ROP-HPV-E7疫苗接种与抗PD-1治疗的组合产生协同肿瘤抑制作用。

这些实施例一起证明了本发明的多肽降低TNFR超家族受体激动剂(例如4-1BB)的有效剂量和/或增加它们的最大功效的能力。类似地，它们证明了本发明的多肽增加检查点抑制剂(如抗PD-1)的效力和/或疗效的能力。出乎意料的是，本发明的多肽和免疫肿瘤学药物——例如TNFR超家族受体激动剂或检查点抑制剂——的联合治疗效果是协同的。本领域需要提高现有抗癌免疫疗法的效力和功效，以提高安全性、耐受性和临床结果；已经尝试了各种方法，但没有取得明显的成功。成功有许多障碍：一个是难以从大量可考虑的免疫疗法中确定有效的组合方案，这从大量相关学术文献中显而易见。推测性地考虑但未实现的一种此类方法是多肽构建体与免疫肿瘤学药物的组合方案(牛津疫苗医学公司(OxfordVacmedix Ltd)，生物医药商讯广告专题(Biopharmerdealmaker AdvertisementFeature)，2017)。成功的另一个障碍是难以在不同患者和癌症类型和阶段之间实现可靠和一致的治疗反应(Ventola，2017)。本发明基于意外发现，即本发明的多肽与TNFRSF激动剂或与检查点抑制剂的组合协同增强多肽和试剂的抗癌活性。协同作用表现为协同效能、协同功效或两者兼而有之。源自生存素并免疫靶向生存素的本发明多肽出乎意料地能够增加4-1BB激动剂的效力，从而允许以无毒剂量给药(图2)并增加抗PD-1的功效(图8)，特别是通过显著升高的T细胞反应(图10)。源自HPV16 E7并免疫靶向HPV16 E7的本发明的多肽出乎意料地证明了与4-1BB激动剂的协同作用，导致显著的肿瘤消退(图15)和跨越所有测量时间点的小鼠的100％存活率(图17和18)。因为本发明的多肽包含多个肽片段(可选地覆盖整个肿瘤抗原蛋白或其免疫学相关部分，进一步可选地是以重叠方式)，所以该多肽适用于广泛的HLA类型，而不需要在治疗前对HLA分型或患者筛选。技术人员会理解，本发明的多肽可以很容易地靶向癌症甚至患者特异性标志物，从而进一步拓宽可以受益于联合递送的免疫疗法的治疗的患者基础。

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SEQUENCE LISTING

<110> 牛津疫苗医学公司

<120> 用于癌症治疗的多肽

<130> P000257WO

<150> 2017119.5

<151> 2020-10-28

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

<210> 2

<211> 165

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr

85 90 95

Arg Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

100 105 110

Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp

115 120 125

Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys

130 135 140

Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln

145 150 155 160

Leu Ala Ala Met Asp

165

<210> 3

<211> 137

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile

65 70 75 80

Arg Arg Lys Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser

85 90 95

Ser Ser Trp Leu Pro Trp Ile Glu Ala Ser Gly Arg Ser Cys Leu Val

100 105 110

Pro Glu Trp Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro Gly Ala Thr Ser

115 120 125

Leu Pro Val Gly Pro Leu Ala Met Ser

130 135

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Glu Arg Ala Leu Leu Ala Glu

115 120

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Val Arg Glu Thr Leu Pro Pro Pro

100 105 110

Arg Ser Phe Ile Arg

115

<210> 6

<211> 78

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met Arg Glu Leu Cys

65 70 75

<210> 7

<211> 74

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Met

65 70

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys

1 5 10 15

Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His

20 25 30

<210> 10

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro

1 5 10 15

Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe

20 25

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys

1 5 10 15

Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu

20 25

<210> 12

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu

1 5 10 15

His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys

20 25 30

<210> 13

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys

1 5 10 15

Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys

20 25

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu

1 5 10 15

Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys

20 25

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys

1 5 10 15

Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile

20 25 30

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ala Ala Met Asp

20

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 组织蛋白酶S的切割位点

<400> 17

Leu Arg Met Lys

1

<210> 18

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 含源自人生存素同种型1的肽片段的人工肽。

<400> 18

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Leu Arg

20 25 30

Met Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu

35 40 45

Gly Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His

50 55 60

Leu Arg Met Lys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe

65 70 75 80

Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe

85 90 95

Leu Arg Met Lys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe

100 105 110

Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile

115 120 125

Glu Leu Arg Met Lys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp

130 135 140

Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu

145 150 155 160

Ser Val Lys Leu Arg Met Lys Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys

165 170 175

Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu

180 185 190

Phe Leu Lys Leu Arg Met Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu

195 200 205

Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu

210 215 220

Thr Asn Asn Lys Leu Arg Met Lys Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile

225 230 235 240

Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu

245 250 255

Lys Val Arg Arg Ala Ile Leu Arg Met Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr

260 265 270

Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

275 280 285

<210> 19

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码源自人生存素同种型1的人工蛋白的多核苷酸。

<400> 19

ggatcccata tgggtgcacc aactcttcct ccagcatggc aacctttcct gaaggatcat 60

cgtatctcta ctttcaagaa ctggccattc ctggaaggtc tgcgtatgaa ggatcaccgt 120

atctctactt tcaagaactg gccattcctt gagggttgtg cttgtactcc tgagcgtatg 180

gctgaggctg gtttcatcca cctgcgtatg aaggcttgca ctcctgaacg tatggctgaa 240

gctggtttca tccactgtcc aactgagaac gagcctgatc tggcacaatg cttcttcctt 300

cgtatgaagc ctactgagaa cgaacctgat ctggctcagt gcttcttctg cttcaaggaa 360

cttgagggtt gggagcctga tgatgatcca atcgagctgc gtatgaagtt caaggagctg 420

gaaggttggg agcctgatga tgatcctatc gaggagcaca agaagcgctc ttctggttgt 480

gctttcctgt ctgtcaaact gcgtatgaag gagcacaaga agcactcttc tggttgtgct 540

ttcctgtctg tcaagaagca gttcgaagaa ctgactctgg gtgagttcct gaagctgcgt 600

atgaagcagt tcgaggagct gactctgggt gagttcctga agctggatcg tgaacgtgct 660

aagaacaaga tcgctaagga gactaacaac aagctgcgta tgaagcgtga gcgtgctaag 720

aacaagatcg ctaaggagac taacaacaag aagaaggagt tcgaggagac tgctgagaag 780

gttcgtcgtg ctatccttcg tatgaagaag gagttcgagg agactgctga gaaggttcgt 840

cgtgctatcg agcagctggc tgccatggac taactcgag 879

<210> 20

<211> 426

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

atgggcgccc ccaccctgcc ccccgcctgg cagcccttcc tgaaggacca caggatcagc 60

accttcaaga actggccctt cctggagggc tgcgcctgca cccccgagag gatggccgag 120

gccggcttca tccactgccc caccgagaac gagcccgacc tggcccagtg cttcttctgc 180

ttcaaggagc tggagggctg ggagcccgac gacgacccca tcgaggagca caagaagcac 240

agcagcggct gcgccttcct gagcgtgaag aagcagttcg aggagctgac cctgggcgag 300

ttcctgaagc tggacaggga gagggccaag aacaagatcg ccaaggagac caacaacaag 360

aagaaggagt tcgaggagac cgccaagaag gtgaggaggg ccatcgagca gctggccgcc 420

atggac 426

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第1个）。

<400> 21

ggatcccata tgggtgcacc aactcttcct ccagcatggc aacctttcct gaaggatcat 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第2个）。

<400> 22

gaccttccag gaatggccag ttcttgaaag tagagatacg atgatccttc aggaaaggtt 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第3个）。

<400> 23

ctggccattc ctggaaggtc tgcgtatgaa ggatcaccgt atctctactt tcaagaactg 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第4个）。

<400> 24

catacgctca ggagtacaag cacaaccctc aaggaatggc cagttcttga aagtagagat 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第5个）。

<400> 25

cttgtactcc tgagcgtatg gctgaggctg gtttcatcca cctgcgtatg aaggcttgca 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第6个）。

<400> 26

ggacagtgga tgaaaccagc ttcagccata cgttcaggag tgcaagcctt catacgcagg 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第7个）。

<400> 27

gctggtttca tccactgtcc aactgagaac gagcctgatc tggcacaatg cttcttcctt 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第8个）。

<400> 28

actgagccag atcaggttcg ttctcagtag gcttcatacg aaggaagaag cattgtgcca 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第9个）。

<400> 29

cgaacctgat ctggctcagt gcttcttctg cttcaaggaa cttgagggtt gggagcctga 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第10个）。

<400> 30

cagctccttg aacttcatac gcagctcgat tggatcatca tcaggctccc aaccctcaag 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第11个）。

<400> 31

gtatgaagtt caaggagctg gaaggttggg agcctgatga tgatcctatc gaggagcaca 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第12个）。

<400> 32

agtttgacag acaggaaagc acaaccagaa gagtgcttct tgtgctcctc gataggatca 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第13个）。

<400> 33

gctttcctgt ctgtcaaact gcgtatgaag gagcacaaga agcactcttc tggttgtgct 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第14个）。

<400> 34

ccagagtcag ttcttcgaac tgcttcttga cagacaggaa agcacaacca gaagagtgct 60

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第15个）。

<400> 35

gttcgaagaa ctgactctgg gtgagttcct gaagctgcgt atgaagcagt tcgaggagct 60

<210> 36

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第16个）。

<400> 36

agcacgttca cgatccagct tcaggaactc acccagagtc agctcctcga actgcttcat 60

<210> 37

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第17个）。

<400> 37

agctggatcg tgaacgtgct aagaacaaga tcgctaagga gactaacaac aagctgcgta 60

<210> 38

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第18个）。

<400> 38

gtctccttac gatcttgttc ttagcacgct cacgcttcat tacgcagctt gttgttagtc 60

<210> 39

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第19个）。

<400> 39

aacaagatcg ctaaggagac taacaacaag aagaaggagt tcgaggagac tgctgagaag 60

<210> 40

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第20个）。

<400> 40

cctcgaactc cttcttcata cgaaggatag cacgacgaac cttctcagca gtctcctcga 60

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第21个）。

<400> 41

tatgaagaag gagttcgagg agactgctga gaaggttcgt cgtgctatcg agcagctggc 60

<210> 42

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码本发明多肽一部分的多核苷酸（22个合成基因片段的第22个）。

<400> 42

ctcgagttag tccatggcag ccagctgctc gatagcacg 39

<210> 43

<211> 98

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 43

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 44

<211> 105

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒18型（Human papillomavirus type 18）

<400> 44

Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu

1 5 10 15

Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser

20 25 30

Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His

35 40 45

Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met

50 55 60

Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Lys Leu Val Val Glu Ser Ser Ala

65 70 75 80

Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe

85 90 95

Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln

100 105

<210> 45

<211> 35

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 45

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 46

<211> 35

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 46

Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro

1 5 10 15

Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

20 25 30

Cys Cys Lys

35

<210> 47

<211> 35

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 47

His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg

1 5 10 15

Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu

20 25 30

Leu Met Gly

35

<210> 48

<211> 23

<212> PRT

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 48

Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys

1 5 10 15

Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro

20

<210> 49

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 包含源自HPV16 E7的肽片段的多肽。

<400> 49

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Leu Arg Met Lys Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu

35 40 45

Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala

50 55 60

His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Leu Arg Met Lys His Tyr

65 70 75 80

Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys

85 90 95

Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met

100 105 110

Gly Leu Arg Met Lys Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr

115 120 125

Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro

130 135 140

<210> 50

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码根据本发明的多核苷酸的多核苷酸，其包含源自HPV16 E7的序列。

<400> 50

atgcatggtg ataccccgac cctgcatgaa tatatgctgg atctgcaacc ggaaaccacc 60

gatctgtatt gttatgagca gctgaatgat agcagcgaag aggaattacg catgaaggaa 120

cagctgaacg attcaagcga agaagaggac gaaattgacg gtccggcagg tcaggcagaa 180

ccggatcgtg cacattacaa cattgttacc ttttgttgca aactgagaat gaaacactac 240

aatatcgtga ccttctgctg taaatgtgat agcaccctgc gtctgtgtgt tcagagcacc 300

catgttgata ttcgtacatt agaggacctg ctgatgggcc tgcggatgaa aattcgtacc 360

ctggaagacc tgttaatggg caccctgggt attgtttgtc cgatttgtag ccagaaaccg 420

taa 423

<210> 51

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 根据本发明的多肽，包含源自小家鼠生存素的序列。

<400> 51

Met His His His His His His Gly Ala Pro Ala Leu Pro Gln Ile Trp

1 5 10 15

Gln Leu Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro

20 25 30

Phe Leu Glu Asp Leu Arg Met Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys

35 40 45

Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala

50 55 60

Glu Ala Gly Phe Ile His Leu Arg Met Lys Cys Ala Cys Thr Pro Glu

65 70 75 80

Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro

85 90 95

Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Leu Arg Met Lys Cys Pro Thr Glu

100 105 110

Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu

115 120 125

Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Leu Arg Met Lys Phe Lys

130 135 140

Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asn Pro Ile Glu Glu His Arg

145 150 155 160

Lys His Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Leu Arg Met Lys

165 170 175

Glu His Arg Lys His Ser Pro Gly Cys Ala Phe Leu Thr Val Lys Lys

180 185 190

Gln Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Leu Arg

195 200 205

Met Lys Lys Gln Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu

210 215 220

Asp Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys

225 230 235 240

Leu Arg Met Lys Arg Gln Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr

245 250 255

Asn Asn Lys Gln Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Thr Thr Arg Gln

260 265 270

Ser Ile Glu Gln Leu Ala Ala

275

<210> 52

<211> 294

<212> DNA

<213> 人类乳头瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16）

<400> 52

atgcacggcg acacccccac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc cgagaccacc 60

gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aggaggacga gatcgacggc 120

cccgccggcc aggccgagcc cgacagggcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag 180

tgcgacagca ccctgaggct gtgcgtgcag agcacccacg tggacatcag gaccctggag 240

gacctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccc 294

Claims

1.一种在受试者中治疗癌症的方法，包括：

向所述受试者施用多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含衍生自第一肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含衍生自第二肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含一个或多个位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的外源性组织蛋白酶切割位点序列；和

向所述受试者施用免疫肿瘤学药剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一肿瘤抗原和/或所述第二肿瘤抗原蛋白是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或癌症/睾丸抗原。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一肿瘤抗原蛋白和所述第二肿瘤抗原蛋白是相同的肿瘤抗原蛋白。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一肿瘤抗原蛋白和/或第二肿瘤抗原蛋白是自身抗原、改变的自身抗原、或非自身抗原。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原蛋白是生存素。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原蛋白是病毒衍生的癌抗原，可选地是HPV蛋白，进一步可选地是HPV16蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤抗原蛋白是HPV16 E7。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列是组织蛋白酶S切割序列，优选地是LRMK切割序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述多肽和所述免疫肿瘤学药剂同时、分别、或依次施用于所述受试者。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫肿瘤学药剂是TNFR超家族激动剂或检查点抑制剂。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽的每次施用包含1μg.kg^-1至2000μg.kg^-1之间的所述多肽，优选地5至20μg.kg^-1或更低。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子，或者其中所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、或小分子。

13.如权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述TNFR超家族激动剂是抗体或其片段，或者所述检查点抑制剂是抗体或其片段。

14.如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述TNFR超家族激动剂以对人类无毒的剂量施用。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂，或者其中所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述4-1BB激动剂以低于1mg.kg^-1的剂量施用。

17.如前述权利要求中任一项的方法，其中周期性地重复向所述受试者施用所述多肽和所述免疫肿瘤学药剂，优选地每3、4、5、6或7天。

18.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述两个或更多个肽片段包含一个或多个重叠序列。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述一个或多个重叠序列的长度为2至31个氨基酸，可选地其中所述一个或多个重叠序列的长度为至少8个氨基酸。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽在递送载体中递送，可选地还包括施用包含所述多肽的递送载体或在药学上可接受的运载体中的所述多肽。

21.一种用于治疗癌症的组合物，其中该组合物包含多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第一序列，并且其中第二肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列，

并且其中所述治疗包括所述多肽与免疫肿瘤学药剂的共同施用。

22.根据权利要求21所述使用的组合物，其进一步包含如权利要求1至20中任一项所述的多肽，和/或如权利要求1至20中任一项所述的方法。

23.一种确定癌症是否适合根据权利要求1至20中任一项所述的方法进行治疗的方法，包括：

向受试者或体外样品施用多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第一序列并且其中第二肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第二序列，还进一步包含一个或多个位于所述两个或多个肽片段中的每一个之间的外源性组织蛋白酶切割位点序列；

向受试者或体外样品施用免疫肿瘤学药剂；和

测量所述受试者或体外样品中的T细胞刺激。

24.一种用于治疗癌症的免疫肿瘤学药剂，其中所述治疗包括施用所述免疫肿瘤学药剂和多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第一序列并且其中第二肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或更多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列。

25.根据权利要求24所述使用的免疫肿瘤学药剂，其中所述共同施用的多肽是如权利要求1至20中任一项所述的多肽，和/或其中所述的治疗癌症是通过如权利要求1至20中任一项所述的方法进行的。

26.一种用于治疗癌症的试剂盒，包括：

多肽，所述多肽包含两个或更多个肽片段，其中第一肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第一序列并且其中第二肽片段包含源自肿瘤抗原蛋白的第二序列，进一步包含位于所述两个或多个肽片段中的每一个之间的一个或多个外源性组织蛋白酶切割位点序列，和

免疫肿瘤学药剂。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述免疫肿瘤学药剂是

TNFR超家族激动剂，可选地，其中所述TNFR超家族激动剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、小分子、或抗体或其片段，或

检查点抑制剂，可选地，其中所述检查点抑制剂是肽或其片段、糖蛋白或其片段、小分子、或抗体或其片段。

28.如权利要求27所述的试剂盒，还包含一种或多种药学上可接受的运载体或编码所述多肽的核酸。

29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述TNFR超家族激动剂是4-1BB激动剂，或其中所述检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。