CN116396357A - 一种具有神经保护功能的肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有神经保护功能的肽的合成方法，属于有机合成技术领域。包括如下步骤：(1)将L‑肌肽在醇类质子溶剂中通过BOC酸酐保护转化为双BOC‑肌肽；(2)双BOC‑肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC‑肌肽甘氨酸叔丁酯；(3)双BOC‑肌肽甘氨酸叔丁酯采用浓盐酸的有机溶剂溶液脱除BOC保护基及叔丁酯保护基，反应完成后，分离溶剂并加入沉淀溶剂和有机碱，调整pH值至7‑9，过滤得到L‑肌肽‑甘氨酸；所述浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2‑5mol/L。本合成方法具有收率高和过程简单等优点。
Description
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，特别涉及一种具有神经保护功能的肽的合成方法，具体涉及L-肌肽-甘氨酸的合成方法。
背景技术
肌肽（L-carnosine)是一种天然的二肽，其化学名称为β-丙氨酰-L-组氨酸。肌肽具有很强的抗氧化能力，对人体有益。肌肽具有抗炎、抗糖化、抗氧化作用，可作为一种非处方食品补充剂，在预防和辅助治疗心血管疾病和神经退行性等慢性疾病方面具有一定的作用。在动物实验里，肌肽的神经保护机制可以防止永久性脑部缺血。补充肌肽被认为有助于缓解部分与年龄有关的神经疾病，例如阿尔茨海默症、帕金森症等。肌肽还是一种重要的细胞内抗氧化剂。肌肽不仅无毒，而且具备强的抗氧化性，因此以它作为一种新型的食品添加剂与药用试剂已经引起广泛关注。在医学上，肌肽还可以防止预防阿滋海默症，防止神经和脑部退化。甘氨酸是化学结构最简单的氨基酸。尽管结构简单，甘氨酸在中枢神经系统中却是一种重要的抑制性神经递质，在控制神经元兴奋性方面发挥重要作用。β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸（L-肌肽-甘氨酸）则是将肌肽与甘氨酸通过肽链连接起来组成的三肽，水溶性较强，其具有显著的生物活性，其神经保护功能大大强于肌肽或甘氨酸，在脑卒中，脑损伤，阿尔茨海默症、帕金森症等领域具有广阔的应用前景（李健雄，专利公开号：CN113150065A，2021/07/23，一种合成肽及其应用）。本专利开发了L-肌肽-甘氨酸的液相合成方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明实施例提供了一种具有神经保护功能的肽的合成方法，具有收率高和过程简单等优点。合成路线如下所示：
主要杂质有两种：一是叔丁酯保护基未脱掉，二是非环上的BOC未脱掉。环上的BOC非常好脱除。
本发明实施例提供了一种具有神经保护功能的肽的合成方法，包括如下步骤：
(1)将L-肌肽在醇类质子溶剂中通过BOC酸酐保护转化为双BOC-肌肽。
(2)双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯。
(3)双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯采用浓盐酸的有机溶剂溶液脱除BOC保护基及叔丁酯保护基，反应完成后，分离溶剂并加入沉淀溶剂和有机碱，调整pH值至7-9，过滤得到L-肌肽-甘氨酸；所述浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2-5mol/L。在本专利中，经试验，如果浓盐酸的浓度较低，无法脱除保护基；如果浓盐酸的浓度较高，肽链会断裂，得不到产物。
其中，在步骤(1)中，醇类质子溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇等，具体可以为乙醇。
其中，在步骤(1)中，反应温度为10-50℃，优选为20-30℃，具体可以为室温；L-肌肽与BOC酸酐的摩尔比为1：2.5-6.0，反应过程中BOC酸酐会分解放出二氧化碳，因此BOC酸酐要过量，分解的产物也好分离，对产物的纯度基本没有影响。
进一步地，在步骤(1)中，反应完成后，减压浓缩回收醇类质子溶剂得到蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体；再将发泡状固体于结晶溶剂中打浆（白色粉末悬浮在结晶溶剂中），过滤得到双BOC-肌肽。其中，结晶溶剂为甲苯与石油醚的混合溶剂，甲苯与石油醚的体积比为1：2-10。
其中，在步骤(2)中，双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐于有机溶剂中，在缩合剂、敷酸剂和催化剂的作用下进行缩合反应，反应温度为0-30℃，反应配比与现有技术一致。反应8-10小时，反应完成后加水淬灭，分液，有机相减压浓缩回收溶剂得到油状物，经纯化（具体可以采用重结晶法）后得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯。其中，缩合剂选自EDC盐酸盐（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐）等，敷酸剂选自DIPEA（二异丙基乙胺）等，催化剂选自DMAP（4-二甲氨基吡啶）等。本步骤的结晶溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1：2-10。有机溶剂选自二氯甲烷等。
其中，在步骤(3)中，反应温度为20-50℃，浓盐酸的有机溶剂溶液与双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯的体积质量比为3-10mL/g。
其中，在步骤(3)中，浓盐酸的有机溶剂溶液选自浓盐酸-乙酸乙酯溶液、浓盐酸-乙腈溶液、浓盐酸-四氢呋喃溶液、浓盐酸-丙酮溶液或浓盐酸-丁酮溶液等，这些溶液浓盐酸与有机溶剂能互溶，处于清亮不分层的状态，能同时脱除BOC保护基及叔丁酯保护基。具体可以为浓盐酸-乙腈溶液或浓盐酸-乙酸乙酯溶液。
其中，在步骤(3)中，沉淀溶剂选自乙醇、异丙醇和丙酮等中的一种或两种；发明人发现：其他常见的溶剂均不能将L-肌肽-甘氨酸有效沉淀下来；优选为异丙醇，沉淀效果非常好。
其中，在步骤(3)中，有机碱选自三乙胺或DIPEA等，优选为三乙胺。
进一步地，在步骤(3)中，得到L-肌肽-甘氨酸后经活性炭纯化和重结晶得到高纯度的产品。具体过程为：L-肌肽-甘氨酸采用热水溶解，加入活性炭进行脱色，脱色温度为30-60℃，脱色后热过滤，加入异丙醇进行重结晶，结晶过滤干燥后得到三肽β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸精品。活性炭的量为双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯质量的0-5%，水的用量为双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯质量的1-5倍，异丙醇的用量为双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯质量的5-20倍。
优选地，本发明提供了一种具有神经保护功能的肽的合成方法，包括如下步骤：
(1)L-肌肽和BOC酸酐在醇类质子溶剂中进行反应，反应温度为10-50℃，反应完成后，减压浓缩回收醇类质子溶剂得到蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体；再将发泡状固体于结晶溶剂中打浆，过滤得到双BOC-肌肽。其中，所述醇类质子溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇等；所述结晶溶剂为甲苯与石油醚的混合溶剂，所述甲苯与石油醚的体积比为1：2-10；所述L-肌肽与BOC酸酐的摩尔比为1：2.5-6.0。
(2)双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯。
(3)双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯于浓盐酸的有机溶剂溶液中进行脱保护反应，反应温度为20-50℃，反应完成后，分离溶剂并加入异丙醇，再加入三乙胺或DIPEA使pH值至7-9，过滤、活性炭纯化和重结晶得到L-肌肽-甘氨酸。其中，所述浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2-5mol/L，浓盐酸的有机溶剂溶液与双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯的体积质量比为3-10mL/g，浓盐酸的有机溶剂溶液选自浓盐酸-乙酸乙酯溶液、浓盐酸-乙腈溶液、浓盐酸-四氢呋喃溶液、浓盐酸-丙酮溶液或浓盐酸-丁酮溶液等。
具体地，本发明提供了一种具有神经保护功能的肽的合成方法，包括如下步骤：
(1)L-肌肽和BOC酸酐在乙醇中进行反应，反应温度为10-50℃，反应完成后，减压浓缩回收乙醇得到蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体；再将发泡状固体于结晶溶剂中打浆，过滤得到双BOC-肌肽。其中，结晶溶剂为甲苯与石油醚的混合溶剂，甲苯与石油醚的体积比为1：2-10； L-肌肽与BOC酸酐的摩尔比为1：2.5-6.0。
(2)双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯。
(3)双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯于浓盐酸的有机溶剂溶液中进行脱保护反应，反应温度为20-50℃，反应完成后，分离溶剂并加入异丙醇，再加入三乙胺使pH值至7-9，过滤、活性炭纯化和重结晶得到L-肌肽-甘氨酸。其中，浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2-5mol/L，浓盐酸的有机溶剂溶液与双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯的体积质量比为3-10mL/g，浓盐酸的有机溶剂溶液选自浓盐酸-乙腈溶液或浓盐酸-乙酸乙酯溶液。
本发明提供的具有神经保护功能的肽的合成方法具有如下优点：直接采用市场化L-肌肽为起始原料，不用再在反应中考虑丙氨酸与组氨酸的肽链连接问题，直接过量BOC酸酐在简单醇类中上BOC，同时保护L-肌肽的丙氨酸氨基和组氨酸环上氮氢功能团，反应完成后回收溶剂，结晶即得到双BOC-肌肽。肌肽上BOC保护（EP1454627A1，WO2014011624A2）由于两个氨基的存在，传统方法（加碱生成羧酸钠，上BOC保护得到双BOC-肌肽钠再加酸得到双BOC-肌肽，加酸容易让一个BOC脱离（环上的BOC非常容易脱离），通常需要特殊的有机酸溶液才行）收率很低（收率通常在10-20%），调pH过程中产物即分解，不能满足生产需要。本发明简单结晶得到双BOC-肌肽，再直接缩合甘氨酸叔丁酯，盐酸有机溶剂溶液在脱除BOC 保护基的同时水解掉叔丁酯，得到三肽β- 丙氨酰- L- 组氨酰-甘氨酸。三肽β- 丙氨酰- L-组氨酰-甘氨酸也可以通过固相合成方法合成，但成本高，不适合产业化生产（李健雄，专利公开号：CN113150065A，2021/07/23，一种合成肽及其应用）。
附图说明
图1是双BOC-肌肽的质谱图；
图2是双BOC-肌肽-甘氨酸叔丁酯的液相质谱图；
图3是双BOC-肌肽-甘氨酸叔丁酯的质谱图；
图4是L-肌肽-甘氨酸的液相质谱图；
图5是L-肌肽-甘氨酸的质谱图；
图6是L-肌肽-甘氨酸的氢谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1 双BOC肌肽的合成
肌肽226g(1.0mol)加入乙醇2000ml，滴加BOC酸酐600g(2.8mol)，常温搅拌反应，滴加过程可见肌肽慢慢溶解，并有气体（为二氧化碳）放出，搅拌过夜，反应完全减压50℃回收乙醇，得到黄色蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体420g，用适量甲苯和石油醚，搅拌打浆得到白色粉末，过滤得到332g白色固体双BOC肌肽，收率78%。
实施例2 双BOC肌肽甘氨酸叔丁酯的合成
双BOC肌肽100g(0.24mol)，加二氯甲烷1000ml，加甘氨酸叔丁酯盐酸盐100g(0.6mol)，加入DMAP5g，加入EDC盐酸盐120g(0.62mol)，氮气保护下搅拌。降温至0℃，慢慢滴加DIPEA（二异丙基乙胺）130g(1.3mol)，滴完慢慢搅拌升至室温搅拌反应8-10小时，加水200ml，分液后回收二氯甲烷，得黄色油状物。用300ml乙酸乙酯和石油醚混合溶剂在搅拌加热下溶解该黄色油状物，然后降温至-10℃结晶，过滤后石油醚淋洗，得白色固体双BOC肌肽甘氨酸叔丁酯75g，收率60%。
实施例3 β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸(L-肌肽-甘氨酸)的合成
双BOC肌肽甘氨酸叔丁酯54g(0.1mol)，丙酮200ml，搅拌滴加浓盐酸50ml，滴完加热至40℃搅拌3-4小时，回收溶剂得到黄色油状物。加异丙醇200ml到该黄色油状产物，再滴加三乙胺调至碱性，可见固体析出，过滤得黄色固体。将固体加60ml纯水，2g活性炭至脱色20min，过滤，另外10ml纯水洗涤活性炭并过滤，向滤液中加入异丙醇400ml，打浆搅拌24小时，过滤得白色粉末β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸，烘干得纯品约14g。
实施例4 β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸(L-肌肽-甘氨酸)的合成
双BOC肌肽甘氨酸叔丁酯54g(0.1mol)，乙酸乙酯200ml，搅拌滴加浓盐酸50ml，滴完加热至40℃搅拌3-4小时，回收溶剂得到黄色油状物。加异丙醇200ml到该黄色油状产物，再滴加三乙胺调至碱性，可见固体析出，过滤可得黄色固体。将固体加60ml纯水，2g活性炭至脱色20min，过滤，另外10ml纯水泡洗涤活性炭并过滤，向滤液中加入异丙醇400ml，搅拌打浆搅拌24小时，过滤得到肌肽甘氨酸，过滤得到白色粉末β-丙氨酰-L-组氨酰-甘氨酸，烘干得纯品约16g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将L-肌肽在醇类质子溶剂中通过BOC酸酐保护转化为双BOC-肌肽；
(2)双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯；
(3)双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯采用浓盐酸的有机溶剂溶液脱除BOC保护基及叔丁酯保护基，反应完成后，分离溶剂并加入沉淀溶剂和有机碱，调整pH值至7-9，过滤得到L-肌肽-甘氨酸；所述浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2-5mol/L。
2.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述醇类质子溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
3.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，反应温度为10-50℃，L-肌肽与BOC酸酐的摩尔比为1：2.5-6.0。
4.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，反应完成后，减压浓缩回收醇类质子溶剂得到蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体；再将发泡状固体于结晶溶剂中打浆，过滤得到双BOC-肌肽，所述结晶溶剂为甲苯与石油醚的混合溶剂，所述甲苯与石油醚的体积比为1：2-10。
5.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐于有机溶剂中，在缩合剂、敷酸剂和催化剂的作用下进行缩合反应，反应温度为0-30℃，反应完成后加水淬灭，分液，有机相减压浓缩回收溶剂得到油状物，经纯化后得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯；缩合剂选自EDC盐酸盐，敷酸剂选自DIPEA，催化剂选自DMAP。
6.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，反应温度为20-50℃，浓盐酸的有机溶剂溶液与双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯的体积质量比为3-10mL/g。
7.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，浓盐酸的有机溶剂溶液选自浓盐酸-乙酸乙酯溶液、浓盐酸-乙腈溶液、浓盐酸-四氢呋喃溶液、浓盐酸-丙酮溶液或浓盐酸-丁酮溶液。
8.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述沉淀溶剂选自乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或两种。
9.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述有机碱选自三乙胺或DIPEA。
10.根据权利要求1所述的具有神经保护功能的肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)L-肌肽和BOC酸酐在醇类质子溶剂中进行反应，反应温度为10-50℃，反应完成后，减压浓缩回收醇类质子溶剂得到蜡状固体，油泵减压得到发泡状固体；再将发泡状固体于结晶溶剂中打浆，过滤得到双BOC-肌肽；所述醇类质子溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇；所述结晶溶剂为甲苯与石油醚的混合溶剂，所述甲苯与石油醚的体积比为1：2-10；所述L-肌肽与BOC酸酐的摩尔比为1：2.5-6.0；
(2)双BOC-肌肽与甘氨酸叔丁酯盐酸盐缩合得到双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯；
(3)双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯于浓盐酸的有机溶剂溶液中进行脱保护反应，反应温度为20-50℃，反应完成后，分离溶剂并加入异丙醇，再加入三乙胺或DIPEA使pH值至7-9，过滤、活性炭纯化和重结晶得到L-肌肽-甘氨酸；所述浓盐酸的有机溶剂溶液的浓度为2-5mol/L，浓盐酸的有机溶剂溶液与双BOC-肌肽甘氨酸叔丁酯的体积质量比为3-10mL/g，浓盐酸的有机溶剂溶液选自浓盐酸-乙酸乙酯溶液、浓盐酸-乙腈溶液、浓盐酸-四氢呋喃溶液、浓盐酸-丙酮溶液或浓盐酸-丁酮溶液。
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