CN116376675A - 用于生化反应的快速热循环反应器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于生化反应的快速热循环反应器,包括底座;玻璃毛细管,其内部为PCR反应腔室;支架,固定在底座上,用于固定玻璃毛细管;加热套,具有由石墨烯加热膜围成的供玻璃毛细管插入的套筒,用于对玻璃毛细管进行加热;散热风扇,固定在底座上,通电后转动使得玻璃毛细管周围的空气流动,便于玻璃毛细管上的热量对流扩散,对玻璃毛细管进行降温;控制单元,根据预设程序驱动加热套或散热风扇对玻璃毛细管进行升温或降温。本发明还公开了采用所述的快速热循环反应器进行PCR反应的方法。本发明的快速热循环反应器能显著提高升降温速度,进而减少PCR反应时间。
Description
技术领域
本发明涉及DNA扩增设备技术领域,尤其涉及一种用于生化反应的快速热循环反应器及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术,它可以实现在体外对微量DNA的大量复制。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是刑事案件中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出少量DNA,就能通过PCR扩增进行DNA比对。因此,PCR技术不仅应用于基础研究,还广泛应用于疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。
一个完整的PCR反应主要由若干个循环构成,每个循环可以分为3个步骤,分别是:高温变性、低温退火和适温延伸。第一步是DNA模板的高温变性,即在90-95℃的条件下,模板DNA由双链解链成单链;第二步是引物与模板的低温退火,即在55℃左右,引物与单链DNA模板中的一端按照碱基互补配对进行结合;第三步是适温延伸,即在适宜的温度条件下(72℃左右),在DNA聚合酶的作用下,以底物中的4种脱氧核苷酸为原料,按碱基互补配对与半保留复制原理,将模板DNA单链合成一条新的DNA双链。一般经过25-40个循环过后,DNA模板可扩增至100万至200万倍。
在PCR反应中,温度控制是关键技术,其控制性能直接影响PCR扩增结果。一个好的温控系统应具有较快的响应速率、较小的超调量、较高的稳态精度以及较强的抗干扰能力,以满足PCR热循环的控制要求。
传统的PCR仪通过加热块对放有DNA的样品槽反复变温实现热循环,由于样品槽热容大、PCR单管管壁厚,导致传统PCR仪升降温速度慢、扩增时间长,通常完成30-40个循环需要1小时左右。同时由于加热快自身温度分布不均匀,PCR单管内反应液体积较大(100μL~200μL),所以加热过程中,反应液上下存在较大的温度梯度,这会导致引物的退火效率和扩增的特异性大大降低。
为了解决传统PCR仪升降温速度慢、温度分布不均匀的问题,相关研究人员结合微流控技术制作了PCR芯片。现有的PCR芯片主要采用MEMS工艺在硅、玻璃、塑料、高聚合物等基片材料上加工出一系列的微流道、微反应室及各种微控制器,从而在PCR芯片上实现快速扩增。由于PCR芯片属于耗材,不可重复使用,所以相比较传统PCR仪使用的PCR单管,PCR芯片的成本比较高。现有的PCR芯片主要依赖外置的加热或冷却系统对芯片内部的试剂进行温度控制,使其在三个温度间循环变化,进而实现DNA的扩增。由于外置的加热或制冷系统通常由半导体制冷片或者PI加热膜制作成的加热块构成,体积大且热容大,从开始加热到芯片内的反应液达到预设温度需要几十秒的时间,多次循环下来总时长会大大增加。同时升降温速度慢会导致引物退火效率和扩增特异性的降低,影响DNA扩增结果。
经检索,公开号为CN111500406A的中国发明专利申请,公布了一种微流控PCR芯片,其在一块芯片上集成了控制冷却板、微流体反应板和温度控制板,并通过光刻法在ITO玻璃基底上制作微加热器件和微温度传感器。
公开号为CN106222068A的中国发明专利申请,公开了一种玻璃毛细管微型PCR系统及其制备方法,该系统使用玻璃毛细管作为PCR反应器,通过加热槽和风扇实现升降温控制。该设计耗材成本低,缺点是加热槽自身热容大,变温速度慢,而且加热槽内的单个加热电极不能保证PCR芯片反应腔内反应液温度的均匀性。
发明内容
本发明提供了一种用于生化反应的快速热循环反应器,能显著提高升降温速度,进而减少PCR反应时间。
本发明的技术方案如下:
一种用于生化反应的快速热循环反应器,包括:
底座;
玻璃毛细管,其内部为PCR反应腔室;
支架,固定在底座上,用于固定玻璃毛细管;
加热套,具有由石墨烯加热膜围成的供玻璃毛细管插入的套筒,用于对玻璃毛细管进行加热;
散热风扇,固定在底座上,通电后转动使得玻璃毛细管周围的空气流动,便于玻璃毛细管上的热量对流扩散,对玻璃毛细管进行降温;
控制单元,根据预设程序驱动加热套或散热风扇对玻璃毛细管进行升温或降温。
本发明中,玻璃毛细管通过支架固定,玻璃毛细管外部套有石墨烯薄膜加热套,可以对玻璃毛细管内样品进行加热;在玻璃毛细管外侧还设有散热风扇,散热风扇转动加快玻璃毛细管周围的空气流动,从而达到降温的目的。
石墨烯是目前为止导热系数最高的材料,导热性能非常好。本发明采用石墨烯加热膜代替传统的半导体加热块,石墨烯薄膜可以实现大曲率地随形加热,可以将其做成圆筒状,紧贴在毛细管外围对其加热,提高加热效率,并且其自身热容小,能显著提高升降温速度,进而减少PCR反应时间。
优选的,石墨烯加热膜包括功能层和包覆在功能层两侧的绝缘层;所述的功能层上设有电极,所述的电极通过外接导线与控制单元电连接。
所述的功能层通过石墨烯导电浆料经丝网印刷而成;所述的石墨烯导电浆料包括0.5~3wt%石墨烯粉体、0.8~10wt%分散剂和10~40wt%有机树脂,余量为水。
所述的绝缘层为聚酰亚胺膜。
石墨烯加热膜的制备方法包括:在基材表面依次铺设下绝缘层、功能层、上绝缘层,在功能层上引出电极后密封抽真空、加热固化,得到所述石墨烯加热膜。
所述的控制单元包括:
电源模块,将外部输入的电压转化成控制电路各模块所需电压值;
测温模块,实时采集玻璃毛细管内部的温度并传输给控制器;
控制器,基于预设程序及玻璃毛细管内部的温度,向驱动模块输出驱动信号;
驱动模块,根据控制器的驱动信号控制加热套和散热风扇的启闭,对玻璃毛细管进行加热和降温。
优选的,所述的测温模块为红外测温传感器。
所述的预设程序为:
当玻璃毛细管当前温度值小于设定温度值时,控制器发出驱动信号驱动加热套工作,对玻璃毛细管进行加热;
当玻璃毛细管当前温度值大于设定温度值时,控制器发出驱动信号驱动散热风扇工作,对玻璃毛细管进行降温;
当玻璃毛细管当前温度值等于设定温度值时,启动恒温计时,恒温计时结束后开始下一轮温度控制。
优选的,控制器发出的驱动信号为PWM信号,调节PWM信号的占空比来控制升温或降温的速度。
采用本发明的快速热循环反应器进行PCR反应的方法包括:
将PCR反应液充分混匀后装入玻璃毛细管中,封口;
将玻璃毛细管固定在支架上并插入加热套中,启动控制器,根据预设程序对玻璃毛细管进行热循环;
热循环结束后,取下玻璃毛细管,取出扩增后的PCR产物,进行PCR结果分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明在加快PCR升降温速度方面进行了两点设计。一是用玻璃毛细管作为PCR反应器,相较于PCR芯片,玻璃毛细管的热容更小,在控温模块作用下变温速度更快。二是用石墨烯薄膜作为加热材料代替传统的半导体加热块,石墨烯是目前为止导热系数最高的材料,导热性能非常好,同时石墨烯薄膜可以实现大曲率地随形加热,可以将其做成圆筒状,紧贴在毛细管外围对其加热,提高加热效率,又由于其自身热容小,所以能显著提高升降温速度,进而减少PCR反应时间。
本发明的快速热循环反应器耗材主要是市面上常见的玻璃毛细管,价格低廉,其他模块均可重复使用,大大降低了制作成本。
附图说明
图1为快速热循环反应器的结构示意图;
图2为快速热循环反应器的硬件结构框图;
图3为快速热循环反应器的软件流程图;
图4为PWM信号示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述,需要指出的是,以下所述实施例旨在便于对本发明的理解,而对其不起任何限定作用。
本发明提供一种用于生化反应的快速热循环反应器。快速热循环反应器的结构示意图如图1所示,主要包括底座、用于生化样本反应的样本容器101、用于固定样本容器的支架102、用于加热的石墨烯加热膜103、用于散热的散热风扇104和用于测温的红外温度传感器105,支架102、风扇104固定在底座上,红外温度传感器105固定在支架102上,红外温度传感器105正对样本容器101的反应区。系统的硬件结构如图2所示,包括样品容器101、石墨烯加热膜103、散热风扇104、红外温度传感器105、驱动模块、控制模块和电源模块。
样本容器101采用底部封闭的商用玻璃毛细管(100μL)。毛细管长32mm,内径和外径分别为2.3mm和3.2mm。和传统的PCR芯片相比,玻璃毛细管具有价格便宜、无蛋白吸附性、无气泡产生、受热均匀性好和密封性好的优点。本发明中,玻璃毛细管通过支架102固定在底座上,外部套有石墨烯加热膜103,可以对玻璃毛细管内样品进行加热。在玻璃毛细管外侧还设有散热风扇104,散热风扇104转动加快空气流动达到降温的目的。
石墨烯是目前为止导热系数最高的材料,导热性能非常好。可以用石墨烯加热膜103作为加热模块,代替传统的半导体加热块。本发明中采用的石墨烯加热膜103由功能层和上下绝缘层组成。功能层由包含0.5~3wt%石墨烯粉体,0.8~10wt%分散剂和10~40wt%有机树脂,余量为水的水性石墨烯导电浆料经丝网印刷而成。功能层上设有电极,电极材料为铜或银。可以通过热熔胶将铜箔粘在功能层上,或者通过丝网印刷方式将导电银浆涂抹在功能层上作为电极。电极外接导线连接加热膜的驱动电路。绝缘层分为上下两层,将功能层夹在中间。绝缘层材料为聚酰亚胺(PI)膜,厚度约为0.04mm。绝缘层的作用是增强功能层在高温环境下的绝缘性,避免短路。
石墨烯加热膜103的具体制备方法如下:在基材表面依次铺设下绝缘层、功能层、上绝缘层,在功能层上引出电极后密封抽真空、加热固化,得到上述石墨烯加热膜103。其中绝缘层尺寸略大于功能层,可以将功能层和电极完全固化在绝缘层内部,增强了功能层的绝缘性,同时也避免了功能层氧化带来的功率衰减问题。由于石墨烯加热膜103可以做到大曲率地随形加热,可以将石墨烯加热膜103加工成直径略大于毛细管外径的圆筒状,并将其贴附在玻璃毛细管外侧,通电时石墨烯加热膜103将热量快速传导至玻璃毛细管表面对其进行加热。
测温模块通过红外测温传感器MLX90614采集玻璃毛细管的温度。MLX90614是迈来芯公司的一款低成本非接触式温度传感器,其输出数据和物体温度呈线性比例,具有高精度和高分辨率。测温模块通过IIC总线将采集的温度数据发送到控制模块上,供其获取当前温度值并做输出判断。
驱动模块采用双MOS管并联方式实现大功率设备的控制。驱动模块的输入端接控制器的IO口,输出端接石墨烯加热膜和散热风扇。驱动模块的工作电压采用直流5V。
控制模块核心控制器是STM32单片机,软件流程如图3所示。首先进行系统初始化,然后等待定时器的计时时间,计时时间到开始读取当前温度值并进行PID参数计算。如果当前温度值小于设定温度值,控制模块会发出PWM信号驱动加热模块工作;如果当前温度值大于设定温度值,控制模块会发出PWM信号驱动降温模块工作。当采集的当前温度值等于设定温度值时,启动恒温计时,计时结束后开始下一轮温度控制。
控制模块主要通过发出PWM信号,调节PWM信号的占空比来控制升温或降温的速度。控制原理如图4所示,在一个PWM周期Tc内,控制模块通过调节高电平的时间与整个周期时间的比例进而实现对输出电压的模拟控制。假设高电平是5V,低电平是0V,当PWM信号的占空比是100%时,得到的电压就是5V;当PWM信号的占空比是50%时,得到的电压就是2.5V;当PWM信号的占空比是0%时,得到的电压就是0V。在本发明中,当驱动石墨烯加热膜的PWM信号占空比为100%,驱动散热风扇的PWM信号占空比为0%时,石墨烯加热膜满功率工作,散热风扇不工作,此时升温速度最快;当驱动散热风扇的PWM信号占空比为100%,驱动石墨烯加热膜的PWM信号占空比为0%时,散热风扇满功率工作,石墨烯加热膜不工作,此时降温速度最快。
电源模块的作用给整个系统供电,保证系统内各个模块的正常工作。系统中主要用到的直流电压是12V和3.3V,其中石墨烯加热膜和散热风扇的驱动电压是12V,控制器的供电电压是3.3V。
本发明所述的快速热循环反应器使用方法如下:
将PCR反应液50μL充分混匀后装入玻璃毛细管,封口;
将玻璃毛细管固定在支架上,启动热循环;
热循环结束后,取下玻璃毛细管,将其顶部折断,用吸球将扩增后的PCR产物取出直接加入琼脂糖凝胶电泳,进行PCR结果分析。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于生化反应的快速热循环反应器,其特征在于,包括:
底座;
玻璃毛细管,其内部为PCR反应腔室;
支架,固定在底座上,用于固定玻璃毛细管;
加热套,具有由石墨烯加热膜围成的供玻璃毛细管插入的套筒,用于对玻璃毛细管进行加热;
散热风扇,固定在底座上,通电后转动使得玻璃毛细管周围的空气流动,便于玻璃毛细管上的热量对流扩散,对玻璃毛细管进行降温;
控制单元,根据预设程序驱动加热套或散热风扇对玻璃毛细管进行升温或降温。
2.根据权利要求1所述的快速热循环反应器,其特征在于,石墨烯加热膜包括功能层和包覆在功能层两侧的绝缘层;所述的功能层上设有电极,所述的电极通过外接导线与控制单元电连接。
3.根据权利要求2所述的快速热循环反应器,其特征在于,所述的功能层通过石墨烯导电浆料经丝网印刷而成;所述的石墨烯导电浆料包括0.5~3wt%石墨烯粉体、0.8~10wt%分散剂和10~40wt%有机树脂,余量为水。
4.根据权利要求1所述的快速热循环反应器,其特征在于,所述的控制单元包括:
电源模块,将外部输入的电压转化成控制电路各模块所需电压值;
测温模块,实时采集玻璃毛细管内部的温度并传输给控制器;
控制器,基于预设程序及玻璃毛细管内部的温度,向驱动模块输出驱动信号;
驱动模块,根据控制器的驱动信号控制加热套和散热风扇的启闭,对玻璃毛细管进行加热和降温。
5.根据权利要求4所述的快速热循环反应器,其特征在于,所述的测温模块为红外测温传感器。
6.根据权利要求1或4所述的快速热循环反应器,其特征在于,所述的预设程序为:
当玻璃毛细管当前温度值小于设定温度值时,控制器发出驱动信号驱动加热套工作,对玻璃毛细管进行加热;
当玻璃毛细管当前温度值大于设定温度值时,控制器发出驱动信号驱动散热风扇工作,对玻璃毛细管进行降温;
当玻璃毛细管当前温度值等于设定温度值时,启动恒温计时,恒温计时结束后开始下一轮温度控制。
7.根据权利要求4所述的快速热循环反应器,其特征在于,控制器发出的驱动信号为PWM信号,调节PWM信号的占空比来控制升温或降温的速度。
8.一种采用如权利要求1-7任一项所述的快速热循环反应器进行PCR反应的方法,其特征在于,包括:
将PCR反应液充分混匀后装入玻璃毛细管中,封口;
将玻璃毛细管固定在支架上并插入加热套中,启动控制器,根据预设程序对玻璃毛细管进行热循环;
热循环结束后,取下玻璃毛细管,取出扩增后的PCR产物,进行PCR结果分析。
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