CN112899149B - 连续流微流控pcr实时定量检测装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种连续流微流控PCR实时定量检测装置及方法，该装置中的连续流PCR芯片置于连续流PCR芯片的样品槽内，并紧贴左右分布的温控模块上方，连续流PCR芯片的样品槽下面连接进样模块，进样模块的平头螺丝置于连续流PCR芯片的样品槽下方，并与步进电机连接；连续流PCR芯片上方设置光学检测模块，下方设置光源模块，光源模块中的光源经芯片下方滤光片，激发连续流PCR芯片中的荧光基团，经芯片上方滤光片后，通过光学检测模块中的图像传感器和软件分析模块进行实时监测。本发明与传统PCR方法相比，操作简单，实验试剂损耗小，超快速实现PCR反应，并且可进行定量分析，满足实时化、现场化的检测需要。

Description

连续流微流控PCR实时定量检测装置及方法
技术领域
本发明涉及一种分子生物监测技术，具体涉及一种连续流微流控PCR实时定量检测装置及方法，可实现临床医学疾病的诊断和生物分子的检测分析。
背景技术
聚合酶链式反应技术，又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的生物技术。该技术目前已广泛应用于生物学、生物化学、医学、环境与食品等领域。PCR反应过程主要由高温变性、低温退火、中温延伸三个过程构成。每经历一个温度循环DNA数目扩增一倍，经历30个循环可以扩增数亿倍，从而实现微量级DNA数目骤增。目前核酸扩增主要在PCR热循环仪内完成，其核心部件是通过对放有DNA的样品槽反复变温实现。然而当前的PCR技术主要存在(1)传统PCR仪设备体积大：携带性差；(2)PCR反应时间长：30-40个循环约1小时；(3)生物试剂消耗量大：实验成本高；(4)对于扩增后的PCR产物需要离线的平板凝胶电泳或毛细管电泳等方式检测完成，这对实验室的硬件条件和实验人员的操作水平都提出了比较高的要求。为此，如何实现快速PCR以及简化PCR产物检测流程，是当前研究的一个方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种连续流微流控PCR实时定量检测装置及方法，以解决上述技术问题。
本发明所采用的技术解决方案是：一种连续流微流控PCR实时定量检测装置，包括连续流PCR芯片、进样模块、温控模块、光源模块、光学检测模块、电路控制系统、软件分析模块，所述连续流PCR芯片置于连续流PCR芯片的样品槽内，并紧贴左右分布的温控模块上方，所述连续流PCR芯片的样品槽下面连接进样模块；所述连续流PCR芯片上方设置光学检测模块，下方设置光源模块，所述光源模块中的光源经芯片下方滤光片，激发连续流PCR芯片中的荧光基团，经芯片上方滤光片后，通过光学检测模块中的图像传感器和软件分析模块进行实时监测，所述电路控制系统连接进样模块、温控模块、光源模块和光学检测模块。
进一步，所述光源模块中的光源置于装置的最底层，自下往上依次设置芯片下方滤光片、温控模块、连续流PCR芯片、芯片上方滤光片、图像传感器置于该检测装置最上方。
进一步，所述进样模块包括步进电机和平头螺丝，所述平头螺丝置于连续流PCR芯片的样品槽下方，并与步进电机连接；所述电路控制系统控制步进电机转速，控制并调节温控模块温度，为光源模块供电，调节光学检测模块。
进一步，所述软件分析模块与光学检测模块相连接，提取微流控通道中的光强特征，计算浓度曲线，实现定量分析。
进一步，所述连续流PCR芯片由透明材料制作，采用微流控芯片的PCR反应通道，即一条曲折的通道，包括直线部分和弯曲部分，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连；所述PCR反应通道的起始端设有用作进样的样品槽，末端设有用作废液池的凹槽。
进一步，所述进样模块采用基于压力传感的微型进样装置，通过调节步进电机的转动速度来控制PCR反应液在连续流PCR芯片中的流动速度，使PCR反应液匀速流经两个温区。
进一步，所述温控模块包括用于实现反应液的高温变性、低温退火的94℃和55℃恒温的两块加热块、加热片；所述加热片贴合在连续流PCR芯片的单面或两面，连续流PCR芯片的中间位置的延伸区为72℃中温延伸区。
进一步，所述加热片的排列方向与PCR反应通道的直线部分的排列方向垂直且放置在连续流PCR芯片通道弧形部分，且不能遮挡住芯片通道直线部分。
进一步，所述光源模块包括由均光板和特定波长的LED阵列组成的平行光源和芯片下方滤光片；所述LED阵列组成的平行光源位于装置底端，照射范围覆盖整个连续流PCR芯片。
一种连续流微流控PCR实时定量检测，采用连续流微流控PCR实时定量检测装置，其步骤为：首先，将配制好的PCR反应液注入连续流PCR芯片的样品槽并密封，通过调节进样模块的步进电机的转速控制PCR反应液在连续流PCR芯片中的流速，使PCR反应液依次反复通过温控模块的两个温区，从而实现连续流PCR；底部光源经芯片下方滤光片，激发连续流PCR芯片中的荧光基团，经芯片上方滤光片过滤杂光后，用图像传感器进行实时监测，随着PCR反应的进行，通道中产物不断增加，荧光强度变大，通过荧光强度的变化，进行实时定量分析，得到目标DNA片段的含量和检测报告信息。
本发明的有益效果在于：(1)采用微流控技术以及连续流PCR方法，快速实现PCR反应；(2)进样装置系统通过设置步进电机转动速度可以稳定地控制生物样品在连续流微流控芯片内的流动速度，解决了管道中出现断流以及气泡的问题；(3)利用实时荧光检测技术结合图像传感器实现对PCR的实时定量。与传统PCR方法相比，本发明操作简单，实验试剂损耗小，超快速实现PCR反应，并且可进行定量分析，满足实时化、现场化的检测需要。
附图说明
图1是本发明的连续流微流控PCR实时定量装置结构立体示意图；
图2是本发明的连续流微流控PCR实时定量装置结构主视图；
图3是本发明的连续流微流控PCR实时定量装置结构俯视图；
图4是本发明的连续流微流控PCR实时定量装置结构侧视图；
图5是连续流微流控PCR过程中荧光强度和DNA浓度的关系图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。
如图1至图4所示，一种连续流微流控PCR实时定量检测所装置，包括连续流PCR芯片1、进样模块2、第一、二温控模块3、4、光源5、光学检测模块、电路控制系统9。
光学检测模块包括芯片下方滤光片6、芯片上方滤光片7、图像传感器8、软件分析模块。连续流PCR芯片1置于连续流PCR芯片1的样品槽内，并紧贴左右分布的第一、二温控模块3、4上方，连续流PCR芯片1的样品槽下方连接进样模块2。进样模块2包括步进电机和平头螺丝，平头螺丝置于连续流PCR芯片1的样品槽下方，平头螺丝连接步进电机，通过调节步进电机的转动速度来控制PCR样品在芯片通道中的流动速度，样品依次反复流经两温区，从而实现DNA扩增。
光源5置于装置的最底层，自下往上依次是芯片下方滤光片6、第一、二温控模块3、4、连续流PCR芯片1、芯片上方滤光片7、图像传感器8置于该检测装置最上方。光源5经芯片下方滤光片6，激发PCR反应体系中的荧光基团，经芯片上方滤光片7后，通过图像传感器8进行实时监测，随着PCR反应的进行，通道中产物不断增加，荧光强度变大，通过荧光强度的变化，进行实时定量分析，得到目标DNA片段的含量和其它检测报告信息等。电路控制系统9置于装置外围用以控制步进电机、温控模块、光源和光学检测模块。
连续流PCR芯片1采用一次性微流控芯片的牙周病病原菌快速检验试剂盒(授权公告号：CN 204039409 U)中微流控芯片的PCR通道部分，即一条曲折的通道，包括直线部分和弯曲部分，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连；PCR反应通道的起始端设有用作进样的样品槽，末端设有用作废液池的凹槽。芯片必须使用透明材料以便观测。
进样模块2采用基于连续流聚合酶链式反应芯片微型进样装置(授权公告号：CN206580832 U)的，是一个基于压力传感的微型进样装置，适用于微量试样进样要求，可以通过调节步进电机的转动速度来控制样品在微流控芯片中的流动速度，使反应液匀速流经两个温区，并且不会出现反应液不连续以及有很多气泡的现象。
温控模块包括94℃和55℃两个恒温加热块实现反应液的高温变性、低温退火，加热片应贴合在微流控芯片的单面或两面，而中温延伸的72℃则通过芯片的中间位置的延伸区实现，不需要加热片。加热片的排列方向与PCR反应通道的直线部分的排列方向垂直且放置在芯片通道弧形部分，不能遮挡住芯片通道直线部分。加热块包括但不仅限于铝块等金属块，还包括所有导热且能加工的材料。
光源模块包括由均光板和特定波长的LED阵列组成的平行光源5和芯片下方滤光片6。光源模块位于仪器底端，照射范围覆盖整个PCR芯片。
使用实时荧光检测技术结合图像传感器8从而实现对PCR的实时定量，实时荧光检测技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。光源5经滤光片6透过PCR芯片后，通过芯片上方的滤光片7，经图像传感器8进行图片采集，可由通道中反应液的亮度得出样品的扩增量。所述图像传感器包括但不仅限于CCD、CMOS等，还包括所有采集图像的器件。
电路控制系统控制步进电机转速，控制并调节温控模块温度，为光源模块供电，调节光学检测模块。
软件分析模块与光学检测模块相连接，提取微流控通道中的光强特征，计算浓度曲线，实现定量分析。
一种连续流微流控PCR实时定量检测方法，其步骤为：首先将配制好的PCR反应液注入连续流PCR芯片的样品槽并密封，再通过调节步进电机的转动速度来控制样品在微流控芯片中的流动速度，使反应液依次反复通过温控模块的两个温区，从而实现连续流PCR，利用光源模块激发PCR反应体系中的荧光基团，同时可通过光学检测模块进行实时监测，随着PCR反应的进行，通道中产物不断增加，荧光强度变大，通过荧光强度的变化，进行实时定量分析，得到目标DNA片段的含量(见图5)和其它检测报告信息等。
实例：运用连续流微流控PCR实时定量检测方法对牙龈卟啉菌(PorphyromonasGingivalis，Pg)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola,Td)、福赛拟杆菌(Tre-ponemadenticola,Tf)进行PCR扩增以及实时定量检测。
(1)使用吸潮纸尖(天津达雅鼎医疗器械有限公司)插入牙周袋约1.0分钟，将吸潮纸尖移至盛有100μL PBS(美国Sigma-Aldrich公司)的离心管中放置约3分钟，之后将离心管高速(10000rpm)离心约10分钟，最后取0.7μL上清液做为牙周菌样品供PCR反应。
(2)配置50μLPCR反应液，其主要成份包括:5μl 10×Fast Buffer I,4μl dNTPmixture(2.5μM),1μl primer1(5’-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3’)and 1μl primer 2(5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’),0.25μl Speed-STAR HS DNA Polymerase,4μl PVP(10％),2μl Tween和31.75μl pure water。
(3)将牙周菌DNA样品与PCR反应液混合均匀后放入PCR芯片进样槽，并用双面胶以及弹性膜将其密封，然后将两螺丝帽与芯片上两槽口对准；
(4)通过电脑上开发好的软件，设置步进电机转速，启动步进电机。此时Z轴平台在步进电机带动下，使螺丝缓慢上升，挤压高弹性生物膜，生物样品在挤压做用下，缓慢进入微流控芯片通道；
(5)反应液依次反复通过温控模块的两个温区，从而实现连续流PCR。
(6)激发光源经滤光片透过PCR芯片后，通过芯片上方的滤光片，经光学检测模块进行图片采集，可由通道中反应液的亮度得出样品的扩增量，从而进行实时定量监测；
(7)PCR反应结束，通过电脑设置参数，使步进电机反向旋转，使Z轴平台复原到初始高度；
(8)通过以上方法，牙周病原菌样品经3分16秒流经连续流PCR微流控芯片，并成功实现PCR反应。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种连续流微流控PCR实时定量检测装置，包括连续流PCR芯片、进样模块、温控模块、光源模块、光学检测模块、电路控制系统、软件分析模块，其特征在于：所述连续流PCR芯片置于连续流PCR芯片的样品槽内，并紧贴左右分布的温控模块上方，所述连续流PCR芯片的样品槽下面连接进样模块，所述连续流PCR芯片上方设置光学检测模块，下方设置光源模块，所述光源模块中的光源经芯片下方滤光片，激发连续流PCR芯片中的荧光基团，经芯片上方滤光片后，通过光学检测模块中的图像传感器和软件分析模块进行实时监测，所述电路控制系统连接进样模块、温控模块、光源模块和光学检测模块；所述光源模块中的光源置于装置的最底层，自下往上依次设置芯片下方滤光片、温控模块、连续流PCR芯片、芯片上方滤光片、图像传感器置于该检测装置最上方；所述温控模块包括用于实现反应液的高温变性、低温退火的94℃和55℃恒温的两块加热块以及加热片；所述加热片贴合在连续流PCR芯片的单面或两面，连续流PCR芯片的中间位置的延伸区为72℃中温延伸区。
2.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述进样模块包括步进电机和平头螺丝，所述平头螺丝置于连续流PCR芯片的样品槽下方，并与步进电机连接；所述电路控制系统控制步进电机转速，控制并调节温控模块温度，为光源模块供电，调节光学检测模块。
3.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述软件分析模块与光学检测模块相连接，提取微流控通道中的光强特征，计算浓度曲线，实现定量分析。
4.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述连续流PCR芯片由透明材料制作，采用微流控芯片的PCR反应通道，即一条曲折的通道，包括直线部分和弯曲部分，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连；所述PCR反应通道的起始端设有用作进样的样品槽，末端设有用作废液池的凹槽。
5.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述进样模块采用基于压力传感的微型进样装置，通过调节步进电机的转动速度来控制PCR反应液在连续流PCR芯片中的流动速度，使PCR反应液匀速流经两个温区，并且不会出现反应液不连续以及有很多气泡的现象。
6.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述加热片的排列方向与PCR反应通道的直线部分的排列方向垂直且放置在连续流PCR芯片通道弧形部分，且不能遮挡住芯片通道直线部分。
7.根据权利要求1所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于：所述光源模块包括由均光板和特定波长的LED阵列组成的平行光源和芯片下方滤光片；所述LED阵列组成的平行光源位于装置底端，照射范围覆盖整个连续流PCR芯片。
8.一种连续流微流控PCR实时定量检测，采用权利要求1-7任一所述的连续流微流控PCR实时定量检测装置，其特征在于，其步骤为：首先，将配制好的PCR反应液注入连续流PCR芯片的样品槽并密封，通过调节进样模块的步进电机的转速控制PCR反应液在连续流PCR芯片中的流速，使PCR反应液依次反复通过温控模块的两个温区，从而实现连续流PCR；底部光源经芯片下方滤光片，激发连续流PCR芯片中的荧光基团，经芯片上方滤光片过滤杂光后，用图像传感器进行实时监测，随着PCR反应的进行，通道中产物不断增加，荧光强度变大，通过荧光强度的变化，进行实时定量分析，得到目标DNA片段的含量和检测报告信息。
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