CN116376668A - 一种全集成核酸检测芯片及其层叠结构和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种全集成核酸检测芯片及其层叠结构和检测方法。本发明提供的全集成核酸检测芯片至少包括:上端敞口的盒体;设置在所述盒体底部的器件区域,在所述器件区域内固定设置有控制板;以及固定的设置在所述控制板上方的全集成核酸检测芯片的层叠结构,所述加热电阻层和所述电极层分别电连接所述控制板。在层叠结构中具有液滴通道,在液滴通道中的温度循环区中进行循环温度处理,各循环温度阶段包括依次进行的90~95℃的第一加热阶段、40~60℃的第二加热阶段以及70~75℃的第三加热阶段。本发明实现了速度快、生产成本低、消耗量小、集成度高、模块化可组合的全集成核酸检测技术。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种全集成核酸检测芯片及其层叠结构和检测方法。
背景技术
核酸检测指核酸扩增检测技术,泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而筛查特定基因的检测技术,如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、连接酶链反应(LigaseChain Reaction,LCR)、转录依赖的扩增(Transcript-based amplification,TBA)等,其中最为常用的就是聚合酶链反应(PCR)。
PCR是一种用于在体外扩増特定DNA片段从而筛查特定基因的分子生物学检测技术。在分子生物学中,PCR将单个DNA或数个DNA模版放大数个数量级,产生数千到数百万个特定的DNA序列,以扩增的DNA用于临床诊断和检测,是一个准确性很高的检测技术,被广泛应用于传染病疾控、遗传性疾病诊断、优生指导、生物及医药学研究等领域。
但是PCR检测过程需要专业实验室技术人员操作,需要特殊的实验环境和实验设备条件进行培养和检测,前期建设费用高、专业性强、检测耗时长、检测成本高等问题,从采集、运输、扩增、检测和报告全过程,需耗时12小时至两天。
集成自动化的核酸检测技术是分子诊断技术发展的基础,可解决实验室空间要求和高昂建设成本问题,降低操作人员的专业化要求,隔绝待检样品对操作人员的危害,避免分步操作带来的潜在产物污染,压缩检测过程的等待时间,生产制作成本低廉,模块化和集成化兼备,能够推动基层医疗普及,可有效地提高临床诊断的实时性、可靠性、准确性,从而更好的利用分子诊断技术即时检测传染病病原体。
在全集成核酸检测系统的研发过程中,应根据核酸检测的需要,选择合适的样品预处理方法、核酸提取以及扩增检测方法,设计生物检测流程,优化生物反应体系,基于自动化和智能化系统检测流程,实现“采集-诊断”全流程的设计。综合考虑样品量取、顺序混合反应、核酸扩增和检测等各项功能集成到微流控芯片中的兼容和融合,优化设计配套的控制装置,实现全自动操纵。
相关现有技术的情况如下:
CN200680055030.6《基于小滴的生物化学》本发明涉及小滴微驱动器以及利用所述小滴微驱动器使用离散小滴进行多种方案的系统、装置和方法。本发明包括小滴微驱动器或小滴微驱动器系统,所述系统具有一或多个加载了用于进行生化反应的试剂的输入池,例如那些在核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、测序方案、和用于分析生物学液体的方案中所用的试剂。该专利提到了几种微液滴移动、液滴加热以及荧光检测内容的不同实施方案。但是只是概念性描述,未对每种方法的实现提出具体执行过程和方法。没有提出低成本PCB层叠结构,未提出提高检测速度方法,也未提出多种检测模块集成的多样化的医疗检测系统,更未集成检测结果发送显示方案,实现从“采集-诊断”直通;
CN201910349053.7《一种基于数字控制的液滴移动装置、方法及微流控芯片》本发明公开了一种基于数字控制的液滴移动装置、方法及微流控芯片,所述基于数字控制的液滴移动装置,包括基片、端口、电极组件以及电极引线;所述端口、电极组件以及电极引线设置在所述基片上,所述端口通过所述电极引线发送电压信号给所述电极组件;其特征在于:所述电极组件包括第一电极、输液电极通道以及第二电极;所述输液电极通道由电极组成,用于将液体从第一电极输送到第二电极;本发明通过输液电极通道接收端口输出的电压信号,利用液体的电浸润原理,控制第一电极的液滴移动到第二电极进行检测,无需人工操作、移动速度快、效率高,且控制精度高、液滴消耗量小。该专利详细给出了微液滴移动和液滴加热内容。未提到荧光定量检测内容,没有提出低成本PCB层叠结构,没有提出低成本PCB层叠结构,未提出提高检测速度方法,也未提出多种检测模块集成的多样化的医疗检测系统,更未集成检测结果发送显示方案,实现从“采集-诊断”直通;
CN202180015422.4《用于EWoD阵列的高频AC驱动的自适应栅极驱动》一种驱动包括薄膜晶体管的有源矩阵电介质上电浸润器件的方法,用于将推进电极的开关频率提高到超出逐行有源矩阵驱动的典型频率。通过将栅极线分组并同时将这些栅极线作为一个栅极块驱动,能够更快地完成帧更新,因此,能够明显增加推进电极处的总驱动频率。更快的驱动频率改善了电浸润器件的性能,尤其是在与具有高离子强度的水滴一起使用时。该专利仅提出了根据电湿润原理的微液滴移动的电极阵列布局和电驱动的实现方式,未提到液滴加热和荧光定量检测内容,也未集成检测结果发送单元;此外,该专利没有提及低成本PCB层叠结构;该专利所述的加热部分采用的加热块方式,交底书所述专利的加热部分采用利用PCB制成的加热电阻层,也未提出多种检测模块集成的多样化的医疗检测系统,更未集成检测结果发送显示方案,实现从“采集-诊断”直通;
CN201680078550.2《基于表面测量传感的即时核酸扩增测量装置》本发明涉及一种基于表面测量传感的即时核酸扩增测量装置,其包括:微流体芯片,具有形成为闭环形状的微流体通道;样本注入与闭合部分,与微流体通道连通且以注入模式及闭合模式运行,在注入模式中,反应样本被注入到微流体通道中,在闭合模式中,使微流体通道以其中样本已被注入到微流体通道中的状态形成闭环;流体移动产生部分,用于诱使反应样本流动以使反应样本在微流体通道内循环;多个加热部分,用于分别地将微流体通道的多个加热区加热至分别不同的温度,以使反应样本中的核酸扩增;以及表面测量传感部分,用于在微流体通道内的一个区中检测反应样本中的核酸。因此,可使用被应用微流体技术的聚合酶链式反应微流体芯片以及例如表面等离子体共振等表面测量传感技术来实现生产成本的显著降低,且通过将对试剂的使用消除或降至最低。该专利只提出了微流体移动和加热过程,未提到荧光定量检测内容,也未集成检测结果发送单元;此外,该专利没有提及低成本PCB层叠结构;该专利所述的加热部分采用的加热块方式,交底书所述专利的加热部分采用利用PCB制成的加热电阻层;
可以看出,目前便携式全集成核酸检测系统及其相关技术的发展面临如下问题:
1)分子诊断发展迅速,相关需求日益复杂。具体地讲,样品来源多样化、样品处理复杂化、分析灵敏度以及指标数因检测愈发差异化,因此单一固定的全集成核酸检测芯片以及检测工艺流程的设计难以满足复杂多样的核酸检测需求;
2)即时检测和快速诊断的需求日益增多。即使用分析仪器实现自动化操纵替代传统手工核酸提取与扩增检测流程,也难以满足多样化、快速性的核酸检测分析的需求,亟待核酸检测工艺方法与全集成核酸检测芯片设计的协同与创新;
3)全自动化、便捷化的需求不断增加。无需大型专用场所要求,无需专业人士参与的“采集-诊断”式便捷操作将成为发展的方向;
4)我国基层医疗条件有限。全集成核酸检测芯片的生产工艺要相对简单,成品率高,成本低廉,能够大规模生产并推广普及是全集成核酸检测产业核心发展的方向。
因而,为解决现有技术的不足,满足多样化、自动化、便携化、低成本、高效率的现场即时检测和基层医院普及需求,全集成核酸检测系统及其相关技术可如下发展:
1)模块化:为满足多样化核酸分析的需要,针对不同的样品预处理、核酸提取以及扩增检测模式,开发相应的标准化芯片以及控制仪器模块,再利用通用型接口,完成不同模块的灵活组合,满足相应的多样化需要;
2)快速化:借助全集成核酸检测芯片技术反应效率高和自动化操纵的优势,引入相应的核酸快速检测体系,以实现靶标核酸的快速分析;
3)集成化:集相关产业发展的优势,推动全集成核酸检测系统在模块化、小型化、自动化、多功能和智能化方向的发展;
4)低成本:降低成本、提高效率、高通量产出、延长使用寿命、提高可回收重复利用率,促进全集成核酸检测系统快速发展。
发明内容
针对生物医学检测需要,服务于即时检测和临床诊断,面向生物医药基础研究和基层医疗普及,本发明提出了一种全集成核酸检测芯片及其层叠结构和检测方法。
本发明所提供的技术方案如下:
一种全集成核酸检测芯片的层叠结构,包括:
翅片层;
固定在所述翅片层上的第一PCB板,其最上层设置有加热电阻层;
设置在所述第一PCB板上的第二PCB板,其最上层设置有电极层;
以及自下而上依次设置的下介电层、下疏水层、上疏水层、上介电层和导电玻璃层,所述下介电层设置在所述电极层上,所述下疏水层和所述上疏水层之间设置有液滴运行层。
上述技术方案运用电浸润原理,采用多层层叠结构设计,能够短时间内实现靶核酸的数量指数倍增,可进一步的通过对靶核酸的检测和分析,为实现一种速度快、生产成本低、消耗量小、集成度高、模块化可组合的全集成核酸检测系统提供基础。
具体的:
所述液滴运行层具有液滴通道,其包括依次连通的进液区、进液通道、温度循环区、出液通道和检测区,所述进液通道伸入到所述进液区内,出液通道伸入到所述检测区;
所述电极层包括覆盖所述进液通道和所述出液通道的条形电极布置区,以及覆盖所述温度循环区的矩阵电极布置区,构成所述电极层的各电极片均并联设置;
所述加热电阻层覆盖所述温度循环区。
基于上述技术方案,可基于电浸润原理,实现样液液滴在液滴通道内的移动,以及在温度循环区中的移动和加热,并在其中完成PCR扩增。其中,液滴在温度循环区中可实现环绕运动,使得液滴加热效果更均匀、更稳定、更精确,提升PCR扩增效果。
具体的,第一PCB板的下层为第一绝缘层,所述第一PCB板的上层包括所述的加热电阻层,以及填充该层其他区域的第二绝缘层、
具体的,第二PCB板的下层为第三绝缘层,所述第二PCB板的上层为所述的电极层、
具体的,所述下介电层的下部嵌入到所述第二PCB板的上层中,并占据所述电极层所处的区域以外的其他区域、
具体的,所述液滴通道由左右两侧的疏水材料壁、所述下疏水层和所述上疏水层合围而成。
具体的,所述进液通道连通有贯穿所述上疏水层、所述上介电层和所述导电玻璃层的样液注入口。
上述技术方案实现叠层结构,集成度高,模块化可组合。
本发明还提供了一种全集成核酸检测芯片,包括:
上端敞口的盒体;
设置在所述盒体底部的器件区域,在所述器件区域内固定设置有控制板;
以及固定的设置在所述控制板上方的所述的全集成核酸检测芯片的层叠结构,所述加热电阻层和所述电极层分别电连接所述控制板。
上述技术方案运用电浸润原理,采用多层层叠结构设计,能够短时间内实现靶核酸的数量指数倍增,可进一步的通过对靶核酸的检测和分析,实现了一种速度快、生产成本低、消耗量小、集成度高、模块化可组合的全集成核酸检测系统。
具体的,所述控制板至少包括:
单机控制器;
电连接所述单机控制器的温度控制模块,所述温度控制模块电连接所述加热电阻层;
以及电连接所述单机控制器的电极驱动模块,所述电极驱动模块电连接所述电极层。
进一步的,在所述第一PCB板的第一绝缘层内的下部设置有红外温度传感器的测温点,其电连接所述温度控制模块。
进一步的,在所述器件区域内设置有对所述翅片层降温的风扇,所述风扇电连接所述温度控制模块。
进一步的,所述检测区还设置有光源,其电连接光源控制模块,所述光源控制模块电连接所述单机控制器。
进一步的,所述检测区还设置有显微镜相机,其依次电连接图像采集模块和A/D采集模块,所述A/D采集模块电连接所述单机控制器。
进一步的,所述检测区还设置有荧光探测器,其依次电连接荧光强度测量模块和A/D采集模块,所述A/D采集模块电连接所述单机控制器。
进一步的,所述单机控制器通信连接组控制器,所述组控制器通过数据发送模块连接结果显示终端。
上述技术方案中:
温度控制模块的功能:根据红外温度传感器反馈的温度数值,单机控制器通过调节风扇对翅片散热,或者调节加热电阻层来调整液滴的实际温度,完成恒温和温度循环,实现靶核酸数量扩增和检测。
电极驱动模块的功能:由单机控制器控制电极驱动模块,驱动电极层的各电极工作,实现对液滴运动的控制。控制器控制电源正负极与电极之间的MOS管的开关,改变液滴通电频率和极性,利用在液滴表面产生的电场力,驱使液滴向预设的方向、以预设的速度移动。
光源控制模块的功能:由单机控制器控制,根据荧光测量需求,执行对光源的开关和亮度进行调节。
图像采集模块的功能:图像采集模块将由显微镜相机拍摄检测靶核酸的特征图像数据,通过AD采集通道传输给单机控制器并进一步用于检测结果判定。
荧光强度测量模块的功能荧光强度测量模块从荧光探测器获取的荧光强度数据,通过AD采集通道传输给单机控制器,结合预设的阈值,用于检测结果判定。
A/D采集模块的功能:A/D采集模块功能分两部分,一个图像采集模块的;另一个是荧光强度测量模块的,功能根据检测对象和核酸检测需求组合应用。根据检测对象和核酸检测需求可组合应用图像采集模块的数据和/或荧光强度测量模块的数据。
检测结果发送功能:单机控制器把检测结果通过无线通讯网络或蓝牙这样的数据发送模块将图像采集模块的数据和/或荧光强度测量模块的数据发送给移动通讯客户端这样的结果显示终端,完成检测结果的通讯和显示。也可以将n个按各自地址编号的单机控制器编成一个组,把每个单机检测的结果转送给组控制器,再利用无线通讯网络或蓝牙将结果发送出去,并将结果显示到各自的终端。
本发明还提供了一种全集成核酸检测方法,采用本发明所提供的全集成核酸检测芯片进行检测,并至少包括以下步骤:
控制覆盖所述进液通道的条形电极布置区中的各电极依次工作,让样液进入到所述的温度循环区;
控制覆盖所述温度循环区的矩阵电极布置区中的各电极以单向环绕的顺序依次工作,对样液加热;
控制覆盖所述出液通道的条形电极布置区中的各电极依次工作,让样液进入到检测区中,并接收检测。
具体的,所述的对样液加热的过程包括至少一次的循环温度阶段,各所述循环温度阶段包括依次进行的90~95℃的第一加热阶段、40~60℃的第二加热阶段以及70~75℃的第三加热阶段。
PCR方法依赖于热循环,由重复的加热-冷却-加热的循环反应周期组成。随着PCR扩增的不断进行,复制产生的DNA本身又可以作为模版用于复制,继而将DNA模板指数放大的链式反应。尽管PCR不涉及切割和粘贴DNA,只扩増现有的序列,但PCR仍然是一种重要DNA扩増方法。TaqDNA聚合酶是一种应用于PCR方法的耐热DNA聚合酶,能替代人体内复制时的DNA聚合酶,用合成的引物替代DNA。通过上述循环的三个温度步骤交替加热和冷却PCR样品。
90~95℃的第一加热阶段,变性阶段。DNA双螺旋的两条链在一个叫做DNA变性的过程中在高温下被分离。即模版DNA变性,模版加热至95℃左右,一段时间后DNA双链之间的氢键断裂,分离成为两条单链,以便引物进行结合。即
40~60℃的第二加热阶段,退火阶段。变成两条单链以后的两条DNA单链在湿度降低后便与引物通过碱基互补配对的原则相结合,称为退火过程。退火温度一般为40℃到60℃。
70~75℃的第三加热阶段,衍生阶段。这两个DNA链在DNA聚合酶的作用下,DNA模版上的引物按照碱基互补配对的半保留复制原则dNTP为原料合成一条新的与模版DNA互补的链。衍生温度一般为70℃到75℃。
三个阶段每循环完成一次,模版DNA总量增加一倍,上述一个过程便称作一个PCR扩增循环。而每循环一次,DNA总量增加一倍,模版DNA的总量就指数倍数扩增。所以PCR反应中理论上模版DNA总量就以2的指数倍增长,表达式为
Nn=N0*2n
式中N0为反应中的初始模板数,n为循环次数,N为扩增总量。
具体的,所述单机控制器设置有荧光阈值,所述单机控制器对接收到的荧光强度数据与荧光阈值进行比较,并发出比较结果;
具体的,所述单机控制器接收并发送图像数据到所述的结果显示终端,以供对图像的处理或分析。
本发明的有益效果:
本发明的技术应用能够变更引物或其他PCR试剂,实现对不同靶核酸的检测,能够根据检测种类或规模,根据不同检测目的进行全集成检测芯片的结构重组和功能重组,既实现模块化,又实现多样集成化。
全集成核酸检测装置的检测对象是以uL或mL为单位的微量液滴,样本的消耗量低,因此,采集样本量小,病患痛苦少。
全集成核酸检测装置生产材料和制造成本低,且易于批量生产,能够实现基层医疗大规模普及。
核酸检测现有技术需要经过采集、运输、扩增、检测和报告等环节,扩增、检测和报告环节需要大量的专业人员工作,全集成核酸检测装置根据现有核酸检测专业人员的检测流程精准地设计全集成核酸检测装置的核酸检测过程,执行时间精度到ms甚至us,可以节省大量的人员成本;将大型专业的实验工作,集成在体积小功能全的全集成核酸检测装置中,可以节省大量的专业实验室建设经费和人员费用。
现有核酸检测过程需要人员干预,存在病毒外溢的风险,也存在样本污染的风险,全集成核酸检测装置将核酸检测过程集中在全集成芯片上,实现人员与样本的完全物理隔离,既提高了检测人员的安全性,又增加了检测结果的准确性。
全集成核酸检测装置具有体积小、便携、可灵活组合等特点,可以实现分布式检测,实现“采集—结果”一站式检测方式,节省了大量检测时间,以传染病检测为例,可以增强疫病防护的响应能力。
全集成核酸检测装置可以持续进行技术迭代,进一步提高产品可靠性和检测速度。
全集成核酸检测装置的检测结果可以利用无线通讯网络或蓝牙通讯,发送到无线网络客户端预设的小程序并显示给医护人员或患者本人,辅助医护人员的临床诊断工作。
附图说明
图1是本发明所提供的全集成核酸检测芯片的层叠结构的结构示意图。
图2是本发明所提供的全集成核酸检测芯片的区域划分图。
图3是本发明所提供的全集成核酸检测芯片的层叠结构中的加热电阻层的结构示意图。
图4是本发明所提供的全集成核酸检测芯片的层叠结构中的电极的微流控的原理图。
图5是本发明所提供的全集成核酸检测芯片的电控系统图。
图6是本发明所提供的全集成核酸检测方法的流程图。
附图1-6中,各标号所代表的结构列表如下:
111、翅片层,121、第一绝缘层,122、第二绝缘层,123、加热电阻层,131、第三绝缘层,132、电极层,141、下介电层,142、下疏水层,143、上疏水层,144、上介电层,153、导电玻璃层,161、液滴;
2、全集成核酸检测芯片,210、进液区,220、进液通道,230、温度循环区,240、出液通道,250、检测区;
3、供电单元;
4、单机控制器,400、温度控制模块,401、风扇,403、红外温度传感器,410、电极驱动模块,420、光源控制模块,421、光源,430、A/D采集模块,431、图像采集模块,432、显微镜相机,433、荧光强度测量模块,434、荧光探测器;
5、连接组控制器,500、数据发送模块,510、结果显示终端。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
在一个具体实施方式中,如图1所示,全集成核酸检测芯片的层叠结构包括:翅片层111;固定在翅片层111上的第一PCB板;在第一PCB板上的第二PCB板;以及自下而上依次设置的下介电层141、下疏水层142、上疏水层143、上介电层144和导电玻璃层153,下介电层141设置在电极层132上,下疏水层142和上疏水层143之间设置有液滴运行层。第一PCB板的下层为第一绝缘层121,第一PCB板的上层包括加热电阻层123,以及填充该层其他区域的第二绝缘层122。第二PCB板的下层为第三绝缘层131,第二PCB板的上层为电极层132。下介电层141的下部嵌入到第二PCB板的上层中,并占据电极层132所处的区域以外的其他区域。
最底层的翅片层是铝合金材料,是全集成芯片结构支撑。翅片层上层是第一PCB板,该第一PCB板分为两层。其中,第一绝缘层是由PP材料构成的绝缘层,PP由玻璃布和环氧树脂构成。其第二层包括加热电阻层,与加热电阻层同层的其他部分由PP材料填充形成了第二绝缘层。再上一层是第二PCB板,该PCB板分也为两层,由第三绝缘层和电极层组成,电极层包含若干电极。
各介电层起绝缘作用,各疏水层紧贴液滴,为液滴提供疏水工作面。最顶层是导电玻璃层,作为铜材质电极相对应的另一个电极,形成通电回路,在液滴表面产生电场。
实施例1
在上述具体实施方式的基础上,如图2所示,液滴运行层具有液滴通道,其包括依次连通的进液区210、进液通道220、温度循环区230、出液通道240和检测区250,进液通道220伸入到进液区210内,出液通道240伸入到检测区250。加热电阻层123覆盖温度循环区230。液滴通道由左右两侧的疏水材料壁、下疏水层142和上疏水层143合围而成。进液通道220连通有贯穿上疏水层143、上介电层144和导电玻璃层153的样液注入口。加热电阻层结构如图3所示,由蛇形铜片构成,对外有正负两个供电节点,通电时即产生热量,为移动到加热电阻层上方的液滴加热。
实施例2
在实施例1的基础上,如图2所示,电极层132包括覆盖进液通道220和出液通道240的条形电极布置区,以及覆盖温度循环区230的矩阵电极布置区,构成电极层132的各电极片均并联设置。电极的具体数量和布局可根据实际的需要进行调整。各条形电极布置区可由多块电机组成,例如电极B到电极F,电极A1到电极D1。矩阵电极布置区也可由多块电极组成,例如电极W到电极L。
电极驱动液体运动,如图4所示,液滴在电极E上方,当电极F加电,与顶层导电玻璃形成回路,其他电极A、B、C、D、E、G、H、I不加电,液滴沿虚线箭头方向移动到F上方;当电极H加电,与顶层导电玻璃形成回路,其他电极A、B、C、D、E、F、G、I不加电,液滴沿实线箭头方向移动到H上方;当电极B加电,与顶层导电玻璃形成回路,其他电极A、C、D、E、F、G、H、I不加电,液滴沿虚线箭头反方向移动到B上方;当电极D加电,与顶层导电玻璃形成回路,其他电极A、B、C、E、F、G、H、I不加电,液滴沿实线箭头反方向移动到D上方。以此类推,通过电浸润原理,对液滴加电,在液滴表面产生电场力,推动液滴移动。
在另一个具体的实施方式中,如图5所示,全集成核酸检测芯片2包括:上端敞口的盒体;设置在盒体底部的器件区域,在器件区域内固定设置有控制装置;固定的设置在控制装置上方的的全集成核酸检测芯片的层叠结构;以及向各负载供电的供电单元3。控制装置至少包括:单机控制器4;电连接单机控制器4的温度控制模块400,温度控制模块400电连接加热电阻层123;以及电连接单机控制器4的电极驱动模块410,电极驱动模块410电连接电极层132中的各电极。基于此技术方案,可实现系统的自动检测运行。
实施例3
在上述具体实施方式的基础上,如图5所示,在第一PCB板的第一绝缘层121内的下部设置有红外温度传感器403的测温点,其电连接温度控制模块400。基于此技术方案,可实现对温度循环区内温度的调节。
实施例4
在实施例3的基础上,如图5所示,在器件区域内设置有对翅片层111降温的风扇401,风扇401电连接温度控制模块400。基于此技术方案,可进一步的增加对温度循环区内温度调节的效率和精确度。
实施例5
在上述具体实施方式的基础上,如图5所示,检测区250还设置有荧光探测器434,其依次电连接荧光强度测量模块433和A/D采集模块430,A/D采集模块430电连接单机控制器4。基于此技术方案,可直接获取检测区内被测式样的荧光强度信息,为检测结果或诊断提供直接的信息。
实施例6
在上述具体实施方式的基础上,如图5所示,检测区250还设置有显微镜相机432,其依次电连接图像采集模块431和A/D采集模块430,A/D采集模块430电连接单机控制器4。基于此技术方案,可直接获取检测区内被测式样的光学图像,为检测结果或诊断提供有效的信息。该方式可与荧光检测等方式组合使用。
实施例7
在实施例6或7的基础上,如图5所示,检测区250还设置有光源421,其电连接光源控制模块420,光源控制模块420电连接单机控制器4。基于此技术方案,可以在外界或外置光源并不充足的情况下为荧光检测、图像获取等检测手段提供充足的光照。
实施例8
在上述具体实施方式的基础上,如图5所示,单机控制器4通信连接组控制器5,组控制器5通过数据发送模块500连接结果显示终端510。基于此技术方案,可方便的在结果显示终端获取检测数据或图像。
实施例9
在实施例8的基础上,如图5所示,若干全集成核酸检测芯片的单机控制器分别通信接组控制器。基于此技术方案,可方便的在结果显示终端获取若干个全集成核酸检测芯片所获得的检测数据或图像。
在另一个具体的实施方式中,如图6所示,全集成核酸检测方法包括以下步骤:
S100样本采集。通过人工干预采集包含靶核酸的被检测血液样体,其中靶核酸是诊断用核酸,即临床诊断的判断依据。其中,被检样本也可是全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰液、脑脊液、羊水、精液、阴道排液、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸水、渗出液、分泌物、囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便等。采集样本后,将含有靶核酸的被测样本混合在PCR试剂中,充分混合后,作为全集成核酸检测装置的检测对象备用。其中,典型的PCR试剂包括引物、核苷酸,聚合酶、特异性信标和缓冲液。
S200试剂融合。将采集样本融合在检测试剂中,形成样本液。其中,试剂液包括,且不只包括缓冲物、引物、核苷酸、聚合酶以及其他核酸扩增试剂。
S300液滴分离。被检液体加注到样液注入口,在样液注入口底部,由根据实际需要设计布置数量和走向的微电极阵列的,微电极外包络尺寸不大于3×3mm,微电极间隔不大于30um,电极为铜皮材料,为了实现绝缘,电极表面覆盖不大于500nm的介电层,介电层表面覆盖不大于200nm的疏水层,提供液滴运动时的疏水工作平面。通过第N单机控制器控制电极的加电顺序和通电时间,实现液滴的分离。
S400液滴移动。根据电浸润的原理,第N单机控制器通过电极层中各电极的配合,控制被分离液滴的移动。
S500若干温度循环。液滴移动到温度循环区,开始若干次温度循环的第一次循环,液滴先被移动到加热区,进行S510第一温度阶段90℃~95℃的温度控制,即变性阶段,利用PWM驱动方式连通供电电源与加热电极层的两极之间的MOS管,把液滴加热到目标温度95℃,若红外测温反馈的温度超过目标温度时,通过第N单机控制器控制开启风机,空气在贴合于PCB加热电阻层的翅片空隙加速流通,将多余热量带走,维持液滴温度在目标温度,完成模版DNA变性,双链之间的氢键断裂,分离成为两条单链,温度持续时间不长于1min;增加风机转速,加速液滴降温,进入S520第二温度阶段45℃~55℃的温度控制,即退火阶段,同样温度控制方法,持续稳定第二温度阶段的温度,此时,两条DNA单链在温度降低后便与引物通过碱基互补配对的原则相结合,完成退火,一般退火时间不少于4min;待退火完成后,进入S530第三温度阶段70℃~75℃的温度控制,即衍生阶段,两个DNA链在聚合酶的作用下,DNA模版上的引物按照碱基互补配对的半保留复制原则dNTP为原料合成一条新的与模版DNA互补的链,实现了靶核酸扩展和衍生。如此往复,通过若干次的温度循环,完成变性、退火、衍生的反复循环,增加靶核酸数量,包含新增靶核酸的液滴移动到下一工作区。
S600数据采集。利用荧光探测器和/或显微镜相机进行,通过荧光定量测量或其他测量方法获得数据。
S700数据比较和数据分析。
S800检测结果输出。
S900临床诊断或实验判断。荧光定量测量在PCR试剂中随引物加入荧光探针或其他特异性信标,并随变性、退火、衍生三个阶段进行反复循环。起始阶段,荧光探针结合在一个任意单链上,PCR扩增后报告荧光基团和淬灭荧光基团分离;荧光探测器收到荧光信号,即每扩增一个链,就有一个荧光分子的形成,荧光信号与PCR产物形成完全同步,实现了荧光定量检测。其中,适合用于特异性信标还包括,Green反应探针、分子信标探针、蝎型探针(scorpion probe)、LightUp探针等。医护或研究人员根据S800检测结果,来进行临床诊断或实验判断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种全集成核酸检测芯片的层叠结构,其特征在于,包括:
翅片层(111);
固定在所述翅片层(111)上的第一PCB板,其最上层设置有加热电阻层(123);
设置在所述第一PCB板上的第二PCB板,其最上层设置有电极层(132);
以及自下而上依次设置的下介电层(141)、下疏水层(142)、上疏水层(143)、上介电层(144)和导电玻璃层(153),所述下介电层(141)设置在所述电极层(132)上,所述下疏水层(142)和所述上疏水层(143)之间设置有液滴运行层。
2.根据权利要求1所述的全集成核酸检测芯片的层叠结构,其特征在于:
所述液滴运行层具有液滴通道,其包括依次连通的进液区(210)、进液通道(220)、温度循环区(230)、出液通道(240)和检测区(250),所述进液通道(220)伸入到所述进液区(210)内,出液通道(240)伸入到所述检测区(250);
所述电极层(132)包括覆盖所述进液通道(220)和所述出液通道(240)的条形电极布置区,以及覆盖所述温度循环区(230)的矩阵电极布置区,构成所述电极层(132)的各电极片均并联设置;
所述加热电阻层(123)覆盖所述温度循环区(230)。
3.根据权利要求2所述的全集成核酸检测芯片的层叠结构,其特征在于:
第一PCB板的下层为第一绝缘层(121),所述第一PCB板的上层包括所述的加热电阻层(123),以及填充该层其他区域的第二绝缘层(122);
第二PCB板的下层为第三绝缘层(131),所述第二PCB板的上层为所述的电极层(132);
所述下介电层(141)的下部嵌入到所述第二PCB板的上层中,并占据所述电极层(132)所处的区域以外的其他区域;
所述液滴通道由左右两侧的疏水材料壁、所述下疏水层(142)和所述上疏水层(143)合围而成;
所述进液通道(220)连通有贯穿所述上疏水层(143)、所述上介电层(144)和所述导电玻璃层(153)的样液注入口。
4.一种全集成核酸检测芯片,其特征在于,包括:
上端敞口的盒体;
设置在所述盒体底部的器件区域,在所述器件区域内固定设置有控制板;
以及固定的设置在所述控制板上方的权利要求2或3所述的全集成核酸检测芯片的层叠结构,所述加热电阻层(123)和所述电极层(132)分别电连接所述控制板。
5.根据权利要求4所述的全集成核酸检测芯片,其特征在于,所述控制板至少包括:
单机控制器(4);
电连接所述单机控制器(4)的温度控制模块(400),所述温度控制模块(400)电连接所述加热电阻层(123);
以及电连接所述单机控制器(4)的电极驱动模块(410),所述电极驱动模块(410)电连接所述电极层(132)。
6.根据权利要求5所述的全集成核酸检测芯片,其特征在于:
在所述第一PCB板的第一绝缘层(121)内的下部设置有红外温度传感器(403)的测温点,其电连接所述温度控制模块(400);
在所述器件区域内设置有对所述翅片层(111)降温的风扇(401),所述风扇(401)电连接所述温度控制模块(400)。
7.根据权利要求6所述的全集成核酸检测芯片,其特征在于:
所述检测区(250)还设置有荧光探测器(434),其依次电连接荧光强度测量模块(433)和A/D采集模块(430),所述A/D采集模块(430)电连接所述单机控制器(4);和/或
所述检测区(250)还设置有光源(421),其电连接光源控制模块(420),所述光源控制模块(420)电连接所述单机控制器(4);和/或
所述检测区(250)还设置有显微镜相机(432),其依次电连接图像采集模块(431)和A/D采集模块(430),所述A/D采集模块(430)电连接所述单机控制器(4)。
8.根据权利要求7所述的全集成核酸检测芯片,其特征在于:
所述单机控制器(4)通信连接组控制器(5),所述组控制器(5)通过数据发送模块(500)连接结果显示终端(510);
所述全集成核酸检测芯片还设置有向各负载供电的供电单元(3)。
9.一种全集成核酸检测方法,其特征在于,采用权利要求7或8所述的全集成核酸检测芯片进行检测,并至少包括以下步骤:
控制覆盖所述进液通道(220)的条形电极布置区中的各电极依次工作,让样液进入到所述的温度循环区(230);
控制覆盖所述温度循环区(230)的矩阵电极布置区中的各电极以单向环绕的顺序依次工作,对样液加热;
控制覆盖所述出液通道(240)的条形电极布置区中的各电极依次工作,让样液进入到检测区(250)中,并接收检测。
10.根据权利要求9所述的全集成核酸检测方法,其特征在于:
所述的对样液加热的过程包括至少一次的循环温度阶段,各所述循环温度阶段包括依次进行的90~95℃的第一加热阶段、40~60℃的第二加热阶段以及70~75℃的第三加热阶段;
所述单机控制器(4)设置有荧光阈值,所述单机控制器(4)对接收到的荧光强度数据与荧光阈值进行比较,并发出比较结果;
所述单机控制器(4)接收并发送图像数据到所述的结果显示终端(510)。
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