CN116375661A - 一种水溶性环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水溶性环境敏感型荧光探针，以苯并噁二唑环为基本骨架，L‑谷氨酸经亲核取代连接荧光团后获得。本发明的荧光探针保留了环境敏感性特点，同时引入的羧基基团使其具备了水溶性特点，并方便后续的功能化修饰。本发明的荧光探针在与蛋白经疏水作用和静电作用结合后，可通过测量荧光强度的变化，实现蛋白的快速灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白分析的水溶性环境敏感型荧光探针及其制备方法和应用，属于蛋白质分析技术领域。
背景技术
蛋白质是人体生命活动的基本物质，它与细胞的结构、遗传物质的传递以及生物进化密切相关。蛋白质的定量分析一直是化学、生物化学、医学等研究领域的重要课题，对疾病诊断、食品药品分析以及临床分析都有重大意义。
目前用于定量测定蛋白质的分析技术已较为成熟，包括吸光光度法、共振瑞利散射法、免疫法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。其中，由于荧光分析法具有高灵敏，高选择性、动态响应范围宽等优点，在生物大分子的检测中备受青睐。荧光分析法是通过荧光探针与蛋白质的吸附或共价结合作用，影响体系的荧光信号，从而达到检测蛋白的目的。但是，大多数荧光探针含有芳环或杂环结构，水溶性差，荧光响应度低，无法达到在水溶液中检测蛋白的目的。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的不足，提出一种能用于广泛分析蛋白的水溶性环境敏感型荧光探针，并给出其制备方法和应用。
为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：
一种用于蛋白分析的水溶性环境敏感型荧光探针，其化学结构通式如下所示：
本发明提供一种有机小分子荧光探针，该荧光探针以苯并噁二唑环为基本骨架，L-谷氨酸(L-Glu)经亲核取代连接荧光团，获得水溶性环境敏感型荧光探针DBD-L-Glu。该荧光探针DBD-L-Glu既保留了环境敏感性特点，又具备了水溶性特点，在与蛋白质经疏水作用和静电作用结合后，可通过测量荧光强度的变化，实现蛋白的快速灵敏检测。因此，本发明的荧光探针可应用于标记大分子蛋白、蛋白的定量分析以及蛋白表面疏水指数的探究，且合成工艺简单易行，易于推广。
本发明的荧光探针DBD-L-Glu既保留了环境敏感性特点，在水溶液中表现出很弱的荧光，在有机溶液中表现出强荧光，同时，该染料具备了亲水性特点。蛋白中大多数的配体结合位点是疏水的，该探针与目标蛋白质的疏水配体结合域的结合使得环境敏感荧光团更接近蛋白质的疏水口袋，使得荧光团发射更强的光，相反，在没有靶蛋白存在的情况下，荧光探针将保留在水性缓冲液中，显示弱荧光。不同蛋白等电点不同，与该荧光染料表面的会存在静电吸附或排斥作用，使得染料紧密接触或远离染料，基于疏水作用和静电作用，可通过测量荧光强度的变化，实现蛋白的快速灵敏检测。
本发明提供一种水溶性环境敏感型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑溶解在乙腈中，得到溶液A；
步骤2、将四乙基碘化铵水溶液加入到溶液A中，室温下充分搅拌，得到溶液B；
步骤3、将L-谷氨酸和碳酸钠溶于水中，得到溶液C；
步骤4、将溶液B和溶液C混合，室温下充分搅拌，得到溶液D；
步骤5、溶液D经萃取，酸化，再次萃取后，干燥，过滤得到固体，即目标探针化合物。
本发明在不改变探针母体荧光基团的基础上，结合小分子氨基酸，有效地改善荧光探针的发光性质和化学性质，使其具备水溶性，拓宽了荧光探针在大分子蛋白检测方向的应用。
本发明进一步细化的技术方案如下：
本发明的水溶性环境敏感型荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将22mg 4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(DBD-F)溶解在1.2mL的乙腈中，涡旋使其完全溶解，得到混合溶液A；
步骤2、将69mg四乙基碘化铵(TEAI)溶解在200μL的去离子水中，涡旋使其完全溶解，再向其中加入混合溶液A，室温下充分搅拌3h，得到黄色混合溶液B；
步骤3、将80mg L-谷氨酸(L-Glu)和86mg碳酸钠溶于2.2mL的水中，涡旋使其完全溶解，得到混合溶液C；
步骤4、将混合溶液B和混合溶液C混合，室温下充分搅拌12h，得到深黄色溶液D；
步骤5、在溶液D中加入乙酸乙酯，萃取两次，取水层，用50％的盐酸酸化；酸化后，再用乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层，用无水硫酸镁干燥，过滤，用甲醇作为溶剂，利用薄层色谱分析纯化，蒸馏，最后得到橙黄色固体，即目标探针化合物。
本发明还提供一种水溶性环境敏感型荧光探针作为荧光指示剂在蛋白质分析中的应用。该荧光探针对蛋白的检测具有普适性。
上述的应用中，所述荧光探针具有良好的水溶性和环境敏感型，在不同pH值的缓冲溶液或/溶剂中具有不同的荧光响应值。
上述溶剂包括但不限于水、乙醚、正辛烷、甲酸、二甲亚砜、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N’N-二甲基甲酰胺。
上述缓冲溶液包括强酸性溶液、强碱性溶液、弱酸性溶液和弱碱性溶液。
上述应用中，以pH＝7.4的PBS缓冲溶液作为蛋白检测溶剂，其检测评价时的检测条件为：激发波长为430nm，在480-660nm之间进行荧光发射光谱的检测。
本发明的荧光探针保留了环境敏感性特点，同时引入的羧基基团使其具备了水溶性特点，并方便后续的功能化修饰。本发明的荧光探针在与蛋白经疏水作用和静电作用结合后，可通过测量荧光强度的变化，实现蛋白的快速灵敏检测。
本发明的荧光探针，具有环境敏感性的特点，其具体特点包括：
(1)本发明的荧光探针在水、乙醚、正辛烷、甲酸、二甲亚砜、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N’N-二甲基甲酰胺等不同的溶剂中呈现不同的紫外吸收和荧光强度。
(2)本发明的荧光探针在强酸性缓冲溶液中荧光强度较高，在弱酸至弱碱缓冲溶液中荧光强度差别不大，在强碱缓冲溶液中荧光强度较弱。
(3)本发明的荧光探针不受温度变化的影响。
(4)本发明的荧光探针，在水溶液中，没有蛋白存在时，几乎没有荧光强度；当有蛋白存在时，蛋白和荧光探针之间存在静电和疏水作用，使得荧光强度增加。
(5)本发明的荧光探针应用于蛋白的分析评价时，具体测定方法为：将待测样品加入到含有荧光探针的pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，以测定溶液的荧光强度作为蛋白浓度的评价指标。
(6)上述的用于蛋白分析的新型荧光探针能应用于多种蛋白的分析评价。评价时的条件为：pH＝7.4的PBS缓冲溶液作为溶剂，激发波长为430nm，在480-660nm之间进行荧光发射光谱的检测。
本发明的荧光探针具有环境敏感性和水溶性，在480-660nm条件下具有良好的荧光发射光谱特性；用于检测蛋白的荧光探针可经化学合成工艺获得，合成工艺简单易行，易于推广。总之，本发明所述的荧光探针可普适性应用于大分子蛋白的检测，尤其是非酶蛋白的检测，首次实现了在水溶液中对多种蛋白的定量、定性分析和标记，提高了苯并噻唑类染料生命分析中的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
图1是本发明荧光探针的合成路线图；
图2是本发明荧光探针的红外光谱图；
图3是本发明荧光探针的质谱图；
图4是本发明荧光探针在几种有机溶剂中的紫外光谱图和荧光光谱图；图中A是荧光探针在几种有机溶剂中的紫外光谱图，B是荧光探针在几种有机溶剂中的荧光光谱图；
图5是本发明荧光探针在不同pH的缓冲溶液中的荧光强度图；
图6是本发明荧光探针在加热、不加热条件下的荧光光谱图；
图7是本发明荧光探针与牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG)、溶菌酶结合的荧光谱图；图中A是荧光探针与牛血清白蛋白结合的荧光光谱图，B是荧光探针与牛免疫球蛋白结合的荧光光谱图，C是荧光探针与溶菌酶结合的荧光光谱图；
图8是本发明荧光探针与BSA结合后，除去未结合的荧光探针，结合物在四氢呋喃中的荧光光谱标准曲线图；
图9是本发明荧光染料在不同pH下用于蛋白表面疏水指数探究的图，图中A是pH＝3.2时用于牛血清白蛋白表面疏水指数探究的图，B是pH＝5.3时用于牛血清白蛋白表面疏水指数探究的图，C是pH＝7.4时用于牛血清白蛋白表面疏水指数探究的图，D是pH＝9.2时用于牛血清白蛋白表面疏水指数探究的图，E是pH＝11时用于牛血清白蛋白表面疏水指数探究的图，F是指在不同pH条件下牛血清白蛋白蛋白表面疏水指数的图。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明，本发明中所涉及的“溶液”如无特殊说明均为各物质溶于去离子水形成的水溶液。
实施例1检测蛋白的荧光探针的制备
(1)取5mL的棕色反应瓶，将4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑(DBD-F；22mg；CAS：98358-90-8)溶解在1.2mL的乙腈中，涡旋使其完全溶解，得到溶液A；
(2)将四乙基碘化铵(TEAI；69mg；CAS：68-05-3)溶解在200μL的去离子水中，涡旋使其完全溶解，再向其中加入溶液A，室温下充分搅拌3h，得到黄色混合溶液B；
(3)将L-谷氨酸(L-Glu；80mg；CAS：56-86-0)和碳酸钠(Na2CO3；86mg；CAS：497-19-8)溶于2.2mL的水中，涡旋使其完全溶解，得到混合溶液C；
(4)混合溶液B和溶液C，室温下充分搅拌12h，得到深黄色溶液D；
(5)在混合溶液D中加入乙酸乙酯，萃取两次，取水层，用50％的盐酸酸化。酸化后，再用乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层，用无水硫酸镁干燥，过滤，用甲醇作为溶剂，利用薄层色谱分析纯化，蒸馏，最后得到橙黄色固体，即目标探针化合物DBD-L-Glu，具体的合成路线见图1。探针的化学结构通式如下所示：
实施例2检测蛋白的荧光探针的红外光谱表征
选用KBr(溴化钾)作为固体分散介质，将其充分研细，获得粉末状KBr，备用。将实施例1所制备的荧光探针粉末研细，再分散在粉末状的KBr中，然后用压片器压成透明的薄片后测定红外光谱表征。实施例1所合成的荧光探针最明显的变化即为仲胺基团的形成，如图2所示，在3328cm-1附近有单峰，表示有仲胺基团的存在。
实施例3荧光探针的质谱表征
利用HRMS的负离子源模式对荧光探针进行质谱表征。由于荧光探针的物质的量理论值为372.07392，在负离子源模式下，减去氢离子的理论测量值后为371.0669，而检测到的荧光探针的精准分子量为371.0694，与理论值相当，其质谱图见图3。
实施例4荧光探针在不同溶剂中的紫外光谱图和荧光光谱
分别将荧光探针溶于水、乙醚、正辛烷、甲酸、二甲亚砜、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N’N-二甲基甲酰胺等溶液中，使得荧光探针的终浓度均为167.1μM，然后进行荧光测定，结果见表1。
表1不同溶剂中的荧光响应
图4中A表示，DBD-F-L-Glu在不同的溶剂中有不同强度的紫外吸收，并且对应的波长不同。图4中B表示，DBD-F-L-Glu在不同的溶剂中呈现不同的荧光强度。其中，在四氢呋喃溶液中，DBD-F-L-Glu具有最强发射。水溶液中，DBD-F-L-Glu具的紫外吸收峰位置在430nm左右，DBD-F-L-Glu的激发波长在430.5nm左右，其发射波长大约在596nm。
实施例5荧光探针在不同pH缓冲溶液中的荧光光谱
预先准备好不同pH的缓冲溶液(包括pH＝3.2的柠檬酸/柠檬酸钠溶液、pH＝5.3的柠檬酸/柠檬酸钠溶液、pH＝7.4的PBS缓冲溶液、pH＝9.2的Tris：HCl溶液、pH＝11的NaHCO3/Na2CO3溶液)，将荧光探针分别溶于上述不同pH值的缓冲溶液中，固定荧光探针的浓度均为50μM。如图5所示，在强酸条件下，荧光探针的荧光强度增加，在弱酸性至碱性条件下，pH条件对荧光探针的荧光强度的影响较小，在强碱条件下，荧光探针的荧光强度较弱。缓冲溶液的pH跟探针的荧光响应值的线性关系为y＝-6.05638x+120.79585，其中y是指荧光响应值，x是指pH值。因此，对荧光探针后续的应用适合在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行。
实施例6荧光探针加热前后的荧光光谱
将荧光探针溶于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，固定荧光探针的浓度为50μM，然后置于25℃室温和80℃水浴中保温15min，测量荧光强度。如图6所示，温度对荧光探针没有影响。
实施例7荧光探针和牛血清白蛋白、牛免疫球蛋白、溶菌酶结合后的荧光光谱
结合荧光探针本身的环境敏感性和亲水性，预先准备pH＝7.4的PBS缓冲溶液，对牛血清白蛋白、牛免疫球蛋白、溶菌酶进行分析。固定牛血清白蛋白的浓度为2.82μM，将DBD-L-Glu的浓度从2μM变化到240μM；固定牛免疫球蛋白的浓度为6.67μM，将DBD-L-Glu的浓度从2μM变化到300μM；固定溶菌酶的浓度为357μM，将DBD-L-Glu的浓度从4μM变化到290μM，分别测定不同浓度DBD-L-Glu与牛血清白蛋白、牛免疫球蛋白、溶菌酶结合的荧光强度。结果见图7，图7中A表示DBD-L-Glu与牛血清白蛋白结合时，发射波长在570nm的荧光强度随荧光探针浓度的变化曲线，图7中B表示DBD-L-Glu与牛免疫球蛋白结合时，发射波长在590nm的荧光强度随荧光探针浓度的变化曲线，图7中C表示DBD-L-Glu与溶菌酶结合时，发射波长在585nm的荧光强度随荧光探针浓度的变化曲线。由图7可知，随着DBD-L-Glu浓度的增加，荧光值逐渐增加，DBD-L-Glu浓度到达一定值后，荧光强度保持稳定，与牛血清白蛋白结合时，DBD-L-Glu在140μM处达到饱和；与牛免疫球蛋白结合时，DBD-L-Glu在210μM处达到饱和；与溶菌酶结合时，DBD-L-Glu在195μM处达到饱和。继续增加DBD-L-Glu浓度，荧光探针的聚集会导致荧光强度衰减。利用荧光探针与蛋白结合后可以增强荧光的特性可以对蛋白进行定量分析。
实施例8检测蛋白的荧光探针用于定量检测牛血清白蛋白
固定荧光探针的浓度为50μM，在pH＝7.4的PBS缓冲溶液，加入牛血清白蛋白，牛血清白蛋白的终浓度为0nM，0.5nM，10nM，50nM，100nM，200nM，300nM，400nM，500nM，600nM，700nM，800nM，900nM，1000nM。准备14个30Kd的超滤管，在14000G下超滤8min，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液重复洗涤两次，最后将荧光探针与牛血清白蛋白的结合物重新分散在四氢呋喃溶液中，测量荧光强度，得到关于牛血清白蛋白的标准曲线，结果如图8所示，牛血清白蛋白的检测限为50nM。
结合实施例7和实施例8，本发明所述荧光探针具有以下特点：
(1)当化学环境和物理环境稳定时，发射光的荧光信号和大分子蛋白的浓度成正比，因此，DBD-L-Glu可以应用于溶菌酶，牛血清白蛋白等大分子蛋白的定量分析；
(2)大分子蛋白的疏水腔可能会包裹荧光染料，并且显现出更强的荧光信号，因此，DBD-L-Glu可以用于水溶液中标记蛋白。
实施例9检测蛋白的荧光探针用于不同pH值下蛋白表面疏水指数(So)的探究
DBD-L-Glu中两个羧基的存在决定了该荧光探针属于阴离子型荧光探针，在利用该探针探究蛋白表面疏水指数时，应当首先考虑pH的影响，以确定合适的pH体系。在不同pH的缓冲溶液中(pH＝3.2、5.3、7.4、9.2、11.0)，固定DBD-L-Glu的浓度为160μM，变化溶液中牛血清白蛋白的浓度。在pH＝3.2的缓冲溶液中，牛血清白蛋白的浓度从1μM变化至5μM；pH＝5.3的缓冲溶液中，牛血清白蛋白的浓度从0.5μM变化至11.5μM；pH＝7.4的缓冲溶液中，牛血清白蛋白的浓度从0.5μM变化至10.5μM；pH＝9.2的缓冲溶液中，牛血清白蛋白的浓度从0.5μM变化至15μM；pH＝11的缓冲溶液中，牛血清白蛋白的浓度从0.5μM变化至73μM。然后测量不同pH条件下不同浓度的牛血清蛋白在430nm的激发下的荧光强度。结果如图9所示，随着牛血清白蛋白浓度的增加，荧光强度增加，以570nm处的发射光强度对牛血清白蛋白的浓度作图，得到在不同pH条件下中，荧光强度随牛血清白蛋白浓度变化的曲线，各个曲线的斜率为不同pH条件下牛血清白蛋白的So。如图9的F所示，pH＝3.2，牛血清白蛋白的So＝104；pH＝5.3，牛血清白蛋白的So＝57；pH＝7.4，牛血清白蛋白的So＝63；pH＝9.2，牛血清白蛋白的So＝36；pH＝11，牛血清白蛋白的So＝1。
实验结果表明，利用DBD-L-Glu测定蛋白表面疏水指数，pH是关键参数，对蛋白构象影响较大。牛血清白蛋白的等电点为4.7，当蛋白处于pH＝3.2的缓冲溶液中时，牛血清白蛋白表面呈正电，DBD-L-Glu与牛血清白蛋白除疏水结合外，静电作用增强，因此荧光强度较大，So偏大；当蛋白处于pH＝5～9的缓冲溶液中时，So的变化不明显；蛋白处于pH＝11的缓冲溶液中时，BSA表面呈负电荷增加，与DBD-L-Glu产生静电排斥作用，So急剧下降。因此，BSA的中性条件下结构较为稳定。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种水溶性环境敏感型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构通式如下所示：
2.如权利要求1所述一种水溶性环境敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑溶解在乙腈中，得到溶液A；
步骤2、将四乙基碘化铵水溶液加入到溶液A中，室温下充分搅拌，得到溶液B；
步骤3、将L-谷氨酸和碳酸钠溶于水中，得到溶液C；
步骤4、将溶液B和溶液C混合，室温下充分搅拌，得到溶液D；
步骤5、溶液D经萃取，酸化，再次萃取后，干燥，过滤得到固体，即目标探针化合物。
3.根据权利要求2所述一种水溶性环境敏感型荧光探针的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、将22mg 4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并恶二唑溶解在1.2mL的乙腈中，涡旋使其完全溶解，得到混合溶液A；
步骤2、将69mg四乙基碘化铵溶解在200μL的去离子水中，涡旋使其完全溶解，再向其中加入混合溶液A，室温下充分搅拌3h，得到黄色混合溶液B；
步骤3、将80mg L-谷氨酸和86mg碳酸钠溶于2.2mL的水中，涡旋使其完全溶解，得到混合溶液C；
步骤4、将混合溶液B和混合溶液C混合，室温下充分搅拌12h，得到深黄色溶液D；
步骤5、在溶液D中加入乙酸乙酯，萃取两次，取水层，用50％的盐酸酸化；酸化后，再用乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层，用无水硫酸镁干燥，过滤，用甲醇作为溶剂，利用薄层色谱分析纯化，蒸馏，最后得到橙黄色固体，即目标探针化合物。
4.如权利要求1至3任一项所述水溶性环境敏感型荧光探针作为荧光指示剂在蛋白质分析中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荧光探针在不同pH值的缓冲溶液或/溶剂中具有不同的荧光响应值。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶剂包括但不限于水、乙醚、正辛烷、甲酸、二甲亚砜、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N’N-二甲基甲酰胺。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述缓冲溶液包括强酸性溶液、强碱性溶液、弱酸性溶液和弱碱性溶液。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，以pH＝7.4的PBS缓冲溶液作为蛋白检测溶剂，其检测评价时的检测条件为：激发波长为430nm，在480-660nm之间进行荧光发射光谱的检测。
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