CN116370486A - 异甘草素联合阿霉素在治疗和/或预防三阴性乳腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供异甘草素联合阿霉素在治疗和/或预防三阴性乳腺癌中的应用，属于生物医药技术领域。本发明发现异甘草素和阿霉素联合能显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的作用，同时还能显著抑制三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭，并下调了三阴性乳腺癌细胞中迁移侵袭相关蛋白的表达，异甘草素和阿霉素联合指数小于1，具有明显的协同效应。由此可见，这种联合给药在抑制三阴性乳腺癌转移中具有应用潜力，也为其他中药单体成分联合化疗药物抑制乳腺癌转移提供参考和研究基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及异甘草素联合阿霉素在治疗和/或预防三阴性乳腺癌中的应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(TripleNegative Breast Cancer,TNBC)是一种特殊的乳腺癌亚型，在乳腺癌患者中约占15％，往往侵袭性强，是一种异质性肿瘤，较早发生局部复发和肝肺转移，其特点是复发早、浸润高、预后差。侵袭性和转移是TNBC死亡的主要原因。由于缺乏雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)和人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factorreceptor-2,HER-2)，内分泌和靶向HER-2治疗对这类患者是无效的，因此化疗是目前三阴性乳腺癌主要的治疗手段，而临床上多数TNBC患者对化疗药物敏感，因此在化疗后缺乏其他有效减危手段，一旦出现复发转移往往意味着预后不良。
目前，蒽环类药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)是治疗乳腺癌患者的一线化疗药物之一，通过破坏DNA复制链、蛋白质和细胞膜从而抑制细胞中的复制和转录发挥抗肿瘤作用机制。但是其有严重的心脏毒性，可引起迟发性严重心力衰竭，甚至有时可在停药半年后发生。有研究表明，中草药具有抑制癌细胞增殖的作用，但单独使用，药效缓慢。将蒽环类药物阿霉素联合中药成分在TNBC治疗或预防方面的应用未见相关报道。
发明内容
本发明提供了异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)联合阿霉素在制备治疗和/或预防三阴性乳腺癌药物中的应用，异甘草素和阿霉素联合指数小于1，具有明显的协同增效作用，可显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了异甘草素联合阿霉素在制备治疗和/或预防三阴性乳腺癌药物中的应用。
本发明提供了异甘草素联合阿霉素在制备抑制三阴性乳腺癌细胞活性药物中的应用。
本发明提供了异甘草素联合阿霉素在制备抑制三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭药物中的应用。
本发明提供了异甘草素联合阿霉素在制备下调三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭相关蛋白Vimentin、β-catenin表达药物中的应用。
优选的，所述异甘草素与阿霉素摩尔量比为15～25:1。
优选的，所述药物包括液注射剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次将异甘草素联合阿霉素应用到三阴性乳腺癌中，异甘草素联合阿霉素联合指数小于1，具有显著协同增效作用，能显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭，同时还可下调三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭相关蛋白Vimentin、β-catenin的表达。
本发明异甘草素联合阿霉素在抑制三阴性乳腺癌转移中具有应用潜力，也为其他中药单体成分联合化疗药物抑制乳腺癌转移提供参考和研究基础。
附图说明
图1MTT法检测ISL、LA和DOX对MDA-MB-231细胞活力的影响。
图2MTT法检测ISL和LA联合DOX对MDA-MB-231细胞活力的影响(A.ISL和DOX浓度配比；B.ISL和DOX联用的联合指数；C.LA和DOX浓度配比；D.LA和DOX联用的联合指数)。
图3ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞伤口愈合的影响。
图4ISL联合DOX抑制MDA-MB-231细胞伤口愈合的柱状统计图(数据以3个独立实验的平均值±SEM表示，与对照组比较*p<0.05，**p<0.01，与DOX组相比#p<0.05，##p<0.01，与ISL组相比^p<0.05，^^p<0.01)。
图5ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响。
图6ISL联合DOX抑制MDA-MB-231细胞迁移侵袭的柱状统计图(数据以3个独立实验的平均值±SEM表示，与对照组比较*p<0.05，**p<0.01，与DOX组相比#p<0.05，##p<0.01，与ISL组相比^p<0.05，^^p<0.01)。
图7ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响(数据以3个独立实验的平均值±SEM表示，与对照组比较*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式
本发明提供了异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)联合阿霉素(Doxorubicin,DOX)在制备治疗和/或预防三阴性乳腺癌药物中的应用。本发明所述异甘草素联合阿霉素显著抑制三阴性乳腺癌细胞活性，所述异甘草素联合阿霉素显著抑制三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭，所述异甘草素联合阿霉素显著下调三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭相关蛋白Vimentin、β-catenin的表达。本发明所述异甘草素和阿霉素的来源没有特殊限定，可为本领域技术人员熟知的市售商品，也可经现有技术公开的制备方法获得。
在本发明中，所述异甘草素与阿霉素摩尔量比为15～25:1，优选为18～22:1，更优选为20:1。本发明所述异甘草素与阿霉素采用适宜的摩尔量比例，联合指数小于1，对三阴性乳腺癌细胞具有显著的协同增效作用。
在本发明中，所述药物包括异甘草素和阿霉素以及与异甘草素和阿霉素相适应的药物辅料，以制成有利于给药的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。本发明所述药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1MTT法检测异甘草素和阿霉素对MDA-MB-231细胞活力的影响并计算联合指数
1.实验材料
异甘草素(ISL，批号B21525)、甘草查尔酮A(LA、批号B20409)、阿霉素(DOX、批号S17092)均购自上海源叶生物科技有限公司。
人乳腺癌细胞MDA-MB-231，购自中国科学院上海细胞库。
胎牛血清(批号16140071，Gibco公司)；L-15培养基(批号11415064，Gibco公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，批号M8180，北京索莱宝科技有限公司)、细胞级二甲基亚砜(批号D2650，sigma)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号P0012，碧云天)；β-Actin(批号81115-1-RR)、Vimentin(批号10366-1-AP)、β-catenin(批号51067-2-AP)、ECL发光试剂盒(批号PK10002，proteintech)。
2.MTT法检测ISL和DOX对MDA-MB-231细胞活力的影响
收集MDA-MB-231对数期细胞，接种到96孔板(1.5×104个/孔)中，待细胞贴壁后，加入不同浓度梯度的ISL(20、40、60、80和100μM)、LA(5、10、15和30μM)、DOX(1、2、5、10、20和40μM)继续培养24h、48h观察细胞形态，向孔中加入10μLMTT溶液，避光孵育4h后，弃掉上清液，向每个孔中加入100μL的二甲基亚砜溶解甲瓒结晶。最后，使用酶标仪在490nm测量吸光度值，按照如下公式计算细胞活力。结果见图1。
细胞活力＝[处理组OD值-空白组OD值]/[对照组OD值-空白组OD值]×100％。
如图1所示，MDA-MB-231细胞活力随ISL、LA和DOX作用浓度和时间的增加而降低，ISL、LA和DOX作用24h的半数抑制浓度(IC50)分别为51.47±4.16、8.78±1.27和32.70±11.13μM，48h的IC50分别为49.40±2.36、7.87±1.65和4.79±1.21μM，表明ISL、LA和DOX均能抑制MDA-MB-231细胞活力。
3.MTT法检测ISL、LA联合DOX对MDA-MB-231细胞活力的影响并计算联合指数
MTT法测定ISL(10、20、30和40μM)、LA(4、6和8μM)分别与DOX(0.5、1和2μM)联合作用48h的MDA-MB-231细胞活力，采用CompuSyn软件计算联合用药作用之后的联合指数CI值，当CI＜1时表示两药有协同作用，CI＝1时表示加性作用，CI＞1时表示两药有拮抗作用。结果见图2。
如图2所示，两药联合与单药作用相比，更能抑制细胞活力(图2A、C)，ISL与DOX所有浓度组合均表现出协同作用，对应的CI值均小于1(图2B)，其中，在DOX浓度为1μM的组合中，ISL浓度为20μM时CI值最小，为0.62；LA与DOX所有浓度组合均表现出拮抗作用，对应的CI值均大于1(图2D)，基于以上结果，选择ISL:DOX＝20:1的浓度比进行后续的研究。
实施例2划痕实验检测ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞划痕愈合的影响
将所需用品于超净台中紫外照射30min，同时将PBS、L-15培养基、胰酶等置于室温中恢复常温。消化MDA-MB-231细胞前，用Marker笔和直尺在六孔板背后均匀画三条横线，横穿过孔。以8×105个/孔的密度将MDA-MB-231细胞种于六孔板中，细胞在37℃，无CO2培养箱中过夜贴壁后，用无菌200μL枪头垂直于横线在每孔内划痕。用PBS溶液清洗孔内被划下的细胞，对照组加入2mL的L-15培养基，给药组依次加入终浓度为1μM DOX、20μM ISL及两药联用(ISL:DOX＝20:1)的2mL溶液，在倒置显微镜下观察0h划痕的宽度并拍照。在37℃，无CO2培养箱中培养48h后再次观察细胞划痕愈合情况并拍照。使用Image J软件分析获得0h及48h各孔划痕面积，如下公式计算细胞迁移率，每组实验组重复三次。结果见图3-4。
划痕愈合率(％)＝(原面积-闭合面积)/原面积×100％。
如图3-4所示，对照组向划痕边缘迁移的速度相对较迅速，划痕基本愈合，愈合率为82.10±1.61％，与对照组相比，ISL和DOX单独作用，对细胞伤口愈合有抑制作用，细胞的划痕愈合率降低，分别为68.13±2.32％、66.42±3.03％(p<0.05)，联用组抑制作用更明显，划痕愈合率降至32.63±8.90％(p<0.01)，且与单独作用相比均具有显著性。
实施例3Transwell实验检测ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响
将所需用品于超净台中紫外照射30min，同时将PBS、L-15培养基、胰酶等置于室温中恢复常温。将细胞胰酶消化后用L-15完全培养基收集于离心管中，800rpm离心后弃去上清，加入L-15不完全培养基重悬，进行细胞计数，将细胞悬液稀释成浓度为2×105个/mL；向24孔板中加入L-15完全培养基800μL，将小室放于上方；对照组向小室中加入100μL的L-15培养基，给药组依次加入终浓度为1μM DOX、20μM ISL及两药联用(ISL:DOX＝20:1)的100μL溶液，分别向对照组及给药组加入细胞悬液100μL；在37℃，无CO2培养箱中继续培养48h后，取出24孔板，小心吸去小室中及下层的培养基，用PBS清洗小室并用4％多聚甲醛固定细胞20min，加入0.1％结晶紫，染色30min，洗去多余染液，用棉签轻轻擦去小室内层的细胞，放回干净的24孔板中，于显微镜下观察拍照。通过Image J软件，如下公式计数迁移细胞数量，每组实验组重复三次。结果见图5-6。
相对迁移率(％)＝给药组/对照组×100％
由图5-6所示，对照组跨越室膜的MDA-MB-231细胞数量最多，与对照组相比，ISL和DOX单独作用均能抑制细胞的迁移侵袭，抑制率分别为65.69±10.82％、67.80±5.28％(p<0.01)，两药联用后抑制细胞迁移侵袭效果更明显，迁移侵袭率降至41.79±2.45％(p<0.01)，且与单独作用相比均具有显著性。
实施例4Westernblotting检测ISL联合DOX对MDA-MB-231细胞中迁移侵袭相关蛋白表达的影响
将MDA-MB-231细胞用L-15培养基，1μM DOX、20μM ISL及两药联用处理48h后，预冷的PBS清洗两遍在冰浴条件下加入高效蛋白裂解液裂解30min，BCA法定量测定蛋白浓度，用10％SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，转移至PVDF膜，置于5％脱脂奶粉中封闭1.5h，加入蛋白特异性一抗在4℃条件下孵育过夜，加入二抗孵育2h，ECL工作液显色曝光并拍照，用ImageJ软件分析蛋白条带并计算灰度值(以β-Actin为内参蛋白)。结果见图7。
如图7所示，在MDA-MB-231细胞中，ISL联合DOX降低了Vimentin、β-catenin蛋白的表达，表明异甘草素联合阿霉素通过抑制EMT从而抑制TNBC细胞的迁移侵袭。
综上结果表明，ISL联合DOX显著抑制了MDA-MB-231细胞增殖和细胞迁移侵袭，下调迁移侵袭相关蛋白Vimentin、β-catenin的表达，ISL联合DOX具有明显的协同增效作用，ISL在化疗药物的增效减毒方面显示了良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.异甘草素联合阿霉素在制备治疗和/或预防三阴性乳腺癌药物中的应用。
2.异甘草素联合阿霉素在制备抑制三阴性乳腺癌细胞活性药物中的应用。
3.异甘草素联合阿霉素在制备抑制三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭药物中的应用。
4.异甘草素联合阿霉素在制备下调三阴性乳腺癌细胞迁移侵袭相关蛋白Vimentin、β-catenin表达药物中的应用。
5.如权利要求1～4任意一项所述应用，其特征在于，所述异甘草素与阿霉素摩尔量比为15～25:1。
6.如权利要求1～4所述应用，其特征在于，所述药物包括注射剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂。
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| CN104887650A (zh) * | 2014-03-03 | 2015-09-09 | 陈建萍 | 异甘草素及衍生物的新用途 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| N. WANG，等: "AOSP41 DIETARY COMPOUND ISOLIQUIRITIGENIN INCREASES BREAST CANCER CHEMOSENSITIVITY BY LIMITING CANCER STEM CELLS VIA β-CATENIN SIGNALLING", EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, vol. 49, no. 1, 31 March 2013 (2013-03-31), pages 21 * |
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