CN116367861A - PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）配体在制备药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体α)配体在制备药物中的应用，所述的药物单独或任意组合的具有如下功能，(1)激活T细胞内的活化信号；(2)激活T细胞；(3)促进T细胞分化；(4)调节DC的代谢状态；(5)恢复DC对T细胞的调控功能；(6)提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果；(7)提高抗肿瘤疫苗的治疗效果。

Description

PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体α)配体在制备药物中的应用 技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及PPARα(过氧化物酶体增殖剂激活受体α)配体在制备药物中的应用。
背景技术
肿瘤生长过程中，肿瘤细胞会采用多种免疫逃逸策略规避T细胞的免疫监视，例如：抵抗T细胞对肿瘤细胞的杀伤、高表达死亡受体诱导T细胞死亡、通过免疫检查点信号或免疫抑制性因子(TGF-β、PGE2等)抑制T细胞活化以及诱导产生大量抑制性免疫细胞亚群(调节性T细胞或髓样来源的抑制性细胞)。简而言之，肿瘤免疫逃逸的主要问题是肿瘤组织中浸润的T细胞无法被充分激活以及无法产生持久的记忆性T细胞。因此，提高或改善肿瘤微环境中T细胞的活化与存活，并产生记忆性T细胞以维持长期的抗肿瘤活性将是开发肿瘤免疫疗法的核心任务。
T细胞活化会启动一系列细胞内信号级联反应，并根据激活信号的强度和持续时间，最终引起T细胞增殖、执行免疫功能或死亡等不同的生物学事件。T细胞的完全激活需要两个互相独立的信号：第一信号是抗原特异性信号，由T细胞膜表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)与抗原呈递细胞表面的抗原-MHC复合物结合，引起下游酪氨酸激酶的活化；第二信号是通过细胞因子或抗原呈递细胞表面的共刺激分子，诸如B7.1(CD80)和B7.2(CD86)介导产生。如果只接受第一信号会导致T细胞失能，而单独激活第二信号也不会引起T细胞的活化。因此两个信号之间的协同作用对T细胞发挥免疫功能具有重要的意义。第一信号和第二信号的充分激活，将引起NF-κB和MAPK(JNK，p38和ERK)等重要的激酶磷酸化，并激活下游的转录因子，促进T细胞活化。而T细胞活化后，在细胞因子，例如IL-2、IL-7和IL-15的作用下，上述激酶进一步被活化，则会启动T细胞的增殖以及向记忆性T细胞分化 1,2 。有研究表明TAK1(TGF-β激活激酶1)能够整合引起T细胞发育、活化、存活等功能的信号，处于T细胞功能调控的核心位置 3 。
PPARα与TAK1之间存在相互作用，例如小鼠的肝细胞中敲除TAK1后发现，不仅PPARα的mRNA水平降低，相应的PPARα下游控制脂代谢和脂肪酸氧化相关的基因表达量也降低，同时遏制了肝细胞的脂肪酸氧化能力，导致肝细胞中脂类沉积 5 ，说明TAK1的活化可以上调PPARα的胞内表达量。以及PPARα敲除小鼠中发现T细胞中的TAK1下游的NF-κB和JNK通路被选择性活化，并导致更多的IFN-γ，TNF-α和IL-2等细胞因子的产生 6 。此外PPARα在激活剂存在的情况下能够抑制NF-κB细胞通路，说明PPARα在T细胞中是一个重要的负调控因子。但是，基于现有的理论和固有思路之限制，对于PPARα抑制剂是否能够起到同样的T细胞调节效果，目前未见报道。
尽管原有观点认为PPARα的激活剂具有抗炎作用，可以通过抑制NF-κB的转录活性抑制T细胞的活化。但是最近有研究显示，使用PPARα选择性激活剂Fenofibrate预处理过的CD8+T细胞在过继性T细胞治疗中显示出更优异的抗肿瘤效果 8 。而且泛PPAR激动剂Bezafibrate配合免疫检查点抑制剂的联用策略使肿瘤得到很好的控制，荷瘤小鼠生存期显著延长 9 。上述研究均支持我们的理论推断，但是它们的分析认为该效应得益于PPARα对T细胞代谢状态的调节而非PPARα直接影响了T细胞活化相关的信号通路。
通过系统的研究，我们前期发现，PPARα作为T细胞的胞内激活信号检查点分子，通过PPARα的配体分子与其结合，来释放被PPARα掩藏的TAK1激酶，增加下游NF-κB和JNK激酶的活化，提高T细胞的敏感性，强化T细胞活化，促进T细胞分泌更多的细胞因子(如IL-2和IFN-γ)促进自身的增殖与抗肿瘤活性(图13)。而且在与免疫治疗(包括免疫检查点抑制剂和抗肿瘤治疗性疫苗)联用中，能够增强免疫治疗对肿瘤生长的控制，更能够促进记忆性T细胞的产生，防止肿瘤的复发。
此外，由于T细胞发挥抗肿瘤活性往往需要DC的辅助，例如呈递肿瘤相关抗原、提供共刺激分子等 信号。因此，成功的抗肿瘤反应中DC的功能是不可或缺的。但是，肿瘤微环境中，免疫细胞在与肿瘤细胞高度竞争营养物质，例如葡萄糖、脂肪酸和氨基酸的过程中出与劣势。所以免疫细胞，例如DC，通常处于营养极度匮乏状态，无法达到完全活化或成熟状态。因此，DC的代谢状态能够反映其活化状态与功能。目前的研究表明DC胞内线粒体活性升高、脂肪酸氧化增强等事件会引起DC的免疫功能紊乱，使其无法充分激活T细胞，而抑制脂肪酸氧化可以重塑DC的胞内代谢途径，恢复其对T细胞的激活能力 10,11 。PPARα作为II型核激素受体超家族成员，能够接受内源性和外源性脂类分子配体的激活 12 。这些脂类分子包括饱和脂肪酸(棕榈树、硬脂酸)、不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、花生四烯酸)、2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(16:0/18:0GPC)、十六酰胺乙醇(PEA)等 13 。PPARα对脂肪酸的感应很敏感，可以被迅速激活而启动转录，调控脂肪酸β氧化和脂代谢相关基因的表达 14,15 。通过PPARα的配体对DC细胞的代谢水平进行调控可以改善免疫微环境对DC造成的免疫抑制，进而改善T细胞的抗肿瘤活性。
我们的研究表明，PPARα的配体可以降低DC的脂肪酸氧化/氧化磷酸化水平，提高糖酵解水平，恢复DC对CD8+T细胞，特别是抗原特异性CD8+T细胞的功能，同时减少CD4+调节性T细胞的产生，极大的缓解了肿瘤微环境的免疫抑制，从而达到更好的抗肿瘤活性。
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发明内容
本发明首先涉及PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体α)配体在制备药物中的应用，所述药物的功能包括如下功能的任意一种或多种，
(1)激活T细胞内的活化信号，所述的活化信号是指JNK磷酸化水平上升，所述的T细胞优选为CD8+T细胞；
(2)激活T细胞，所述的激活T细胞指使T细胞分泌更多的IFN-γ和IL-2且同时增加T细胞的存活时间，所述的T细胞优选为CD8+T细胞，更优选的，为肿瘤浸润性CD8+T细胞；
(3)促进T细胞分化，所述的分化指促进T细胞分化为记忆性T细胞；
(4)调节树突状细胞(Dendritic Cell，DC细胞)的代谢状态，所述的调节代谢是指：下调DC细胞的脂肪酸氧化/氧化磷酸化水平，并上调糖酵解水平；所述的DC为骨髓来源的DC，更优选的，为浸润在肿瘤微环境中的DC；
(5)恢复DC对T细胞的调控功能，所述的恢复DC的调控功能指：下调CD4+T细胞转变为调节性T细胞的比例、增加肿瘤杀伤性CD8+T细胞的比例、激活肿瘤杀伤性CD8+T细胞的功能；所述的激活肿瘤杀伤性CD8+T细胞指：使肿瘤杀伤性CD8+T细胞分泌更多的IFN-γ和IL-2且同时增加肿瘤杀伤性CD8+T细胞的存活时间；
(6)提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果，所述的免疫检查点抑制剂优选为PD-L1/PD-1抗体，优选的，所述的肿瘤为免疫检查点抑制剂治疗有效的肿瘤；
(7)提高抗肿瘤疫苗的治疗效果，所述的抗肿瘤疫苗优选为通过PEG2000-DSPE胶束装载多肽/蛋白肿瘤抗原的纳米疫苗。
所述的PPARα配体优选为PPARα的抑制剂，更优选的，所述的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
本发明还涉及一组PPARα的抑制剂，所述的抑制剂为ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，所述的方法为，同时给予治疗有效量的免疫检查点抑制剂和PPARα配体；
优选的，所述的肿瘤为免疫检查点抑制剂治疗有效的肿瘤，所述的免疫检查点抑制剂为PD-L1/PD-1抗体；
优选的，所述的PPARα配体优选为PPARα的抑制剂，更优选的，所述的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，所述的方法为，同时给予治疗有效量的抗肿瘤疫苗和PPARα配体；
优选的，所述的抗肿瘤疫苗优选为通过PEG2000-DSPE胶束装载多肽/蛋白肿瘤抗原的纳米疫苗，所述的胶束的制备方法可参照CN201410570624的记载；
优选的，所述的PPARα配体优选为PPARα的抑制剂，更优选的，所述的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
本发明还涉及一种抗肿瘤联用制剂，所述的制剂包含：
(1)治疗有效量PPARα配体；
(2)治疗有效量的免疫检查点抑制剂或治疗有效量的抗肿瘤疫苗；
(3)必要的药用辅料。
优选的，所述的免疫检查点抑制剂为PD-L1/PD-1抗体；
优选的，所述的抗肿瘤疫苗优选为通过PEG2000-DSPE胶束装载多肽/蛋白肿瘤抗原的纳米疫苗；
优选的，所述的PPARα配体优选为PPARα的抑制剂，更优选的，所述的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
附图说明
图1、T细胞中PPARα抑制剂GW6471增强T细胞活化相关激酶的磷酸化【体外实验】。
图2、PPARα抑制剂GW6471增强CD8+T细胞的存活及功能【体外实验】。
图3、PPARα抑制剂GW6471增强PD-L1抗体对MC38-OT I的抗肿瘤效果。
图4、PPARα抑制剂GW6471延长PD-L1抗体治疗的MC38-OT I荷瘤小鼠生存期。
图5、PPARα抑制剂GW6471增强PD-1抗体(PD-1 mAb)对MC38的抗肿瘤效果
图6、PPARα抑制剂GW6471对肿瘤浸润性T淋巴细胞功能及活性的影响。
图7、PPARα抑制剂GW6471增加PD-L1抗体诱导产生的记忆性CD8+T细胞比例。
图8、PPRAα抑制剂GW6471的抗肿瘤作用主要依赖于CD8+T细胞。
图9、PPARα抑制剂GW6471联合PD-L1抗体的抗肿瘤作用主要依赖于DC细胞。
图10、PPARα-/-DC的抗肿瘤作用。
图11、PPARα抑制剂GW6471增强肿瘤浸润性DC对CD8+T细胞的活化。
图12、PPARα-/-的肿瘤浸润性DC增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的比例和活性。
图13、PPARα抑制剂GW6471对DC代谢状态的调控【体外实验】。
图14、PPARα抑制剂GW6471抑制肿瘤外泌体对调节性T细胞的诱导【体外实验】。
图15、PPARα抑制剂GW6471恢复DC对CD8+T细胞的活化能力【体外实验】。
图16、PPARα抑制剂GW6471增强E7疫苗对TC-1的抗肿瘤效果。
图17、PPARα抑制剂GW6471延长E7疫苗治疗的TC-1荷瘤小鼠生存期。
图18、T细胞中PPARα与TAK1相互作用机制图。
图19、qRT-PCR检测GW6471及其结构类似物对PPARα控制的下游靶基因Cpt1a表达的影响。
具体实施方式
小鼠模型：
1、CD11c-DTR小鼠模型，该模型的特点是该小鼠的CD11c基因(该基因为DC细胞的表面标志物)前面嵌入了一个白喉毒素响应原件(DTR，DT：白喉毒素，R：响应原件)，在腹腔注射该毒素的情况下，小鼠骨髓来源的CD11c阳性DC细胞将会被清除。构建该模型是因为DC的删除实验中，使用抗体的方法效率很低，故采取转基因小鼠的方式。
2、小鼠CD11c-DTR/PPARα-/-嵌合骨髓转移模型，即在第一个模型的基础上进一步敲除小鼠基因组中的PPARα，其特点是，同时转移等量的CD11c-DTR骨髓细胞和PPARα-/-骨髓细胞之后，小鼠经白喉毒素处理时，体内将只剩下PPARα-/-的DC细胞，而没有野生型PPARα功能的DC细胞。在这种情况下，无需抗体或小分子药物治疗，仅观察肿瘤的生长便可以考察DC细胞中PPARα信号通路对肿瘤生长、以及在抗肿瘤免疫中起到的作用。
实施例一：T细胞中PPARα抑制剂GW6471增强T细胞活化相关激酶的磷酸化
细胞培养及处理方法：
(1)野生型C57BL6小鼠处死后，取脾脏细胞，裂解红细胞，之后用CD8磁珠(StemCell公司)分离CD8+T细胞。
(2)使用不同浓度的Fenofibrate(20μM)或GW6471(10μM)处理CD8+T细胞20分钟后，再使用2.5ug/ml anti-CD3抗体和0.5ug/ml anti-CD28抗体激活T细胞20分钟。收集CD8+T细胞，并用Lysis Buffer冰上裂解细胞，提取胞内蛋白，进行WesternBlot实验，考察PPARα、JNK磷酸化和I-kB降解的变化。
结果如图1所示，与单独anti-CD3和anti-CD28抗体激活组相比，GW6471(结构如下式1所示)和Fenofibrate预处理组的T细胞胞内呈现出更强的JNK磷酸化水平，而I-kB的降解并未变的更强烈。同时胞浆中PPARα的含量显著降低，说明经GW6471和Fenofibrate预处理后，PPARα很有可能发生构象改变，脱离与TAK1的物理结合，转而与共刺激因子/共抑制因子形成转录调控复合物进入细胞核中，并行使其它的功能。该结果很好的证实了我们的推测，即PPARα的配体处理能够解除PPARα与TAK1的物理结合，进而释放TAK1，激活其下游激酶的功能，促进T细胞活化、存活甚至向记忆性T细胞分化。
Figure PCTCN2021117407-APPB-000001
实施例二：PPARα抑制剂GW6471和激动剂Fenofibrate增强CD8+T细胞的存活和功能
细胞培养及处理方法：
(1)野生型C57BL6小鼠处死后，取脾脏细胞，裂解红细胞，之后用CD8a磁珠(StemCell公司)分离CD8+T细胞。
(2)使用不同浓度的Fenofibrate(20μM)或GW6471(10μM)处理CD8+T细胞24、48、72小时后，收取细胞，并再使用0.5ug/ml anti-CD3抗体和0.1ug/ml anti-CD28抗体激活CD8+T细胞72小时后，收取细胞培养上清，ELISA检测上清中IFN-γ和IL-2的水平。
(3)使用不同浓度的Fenofibrate、GW6471、类似物处理CD8+T细胞24小时后，收取细胞，并使用Trizol法抽提mRNA，反转录之后，进行qRT-PCR检测Cpt1a的表达量。
如图2的结果显示，通过预处理GW6471之后，CD8+T细胞的状态得到调整，经过再刺激后，能够分泌更多的IFN-γ和IL-2。特别是预处理24小时组的CD8+T细胞，能分泌3倍于未经预处理然后再刺激组CD8+T细胞所产生的IFN-γ，而预处理72小时组的CD8+T细胞能够被激活并产生更多维持T细胞存活的IL-2。而预处理Fenofibrate 24、48和72小时之后的CD8+T细胞能够产生更多的IFN-γ，但是没有更多的IL-2产生。
进一步的，我们使用了一组GW6471化合物的结构类似物(表1)对CD8+T细胞重复上述刺激试验。结果显示，GW6471及其部分类似物的处理既能够增强CD8+T细胞的功能，还能够促进其长时间存活，而Fenofibrate处理能够增强CD8+T细胞的功能，但不影响CD8+T细胞的增殖和存活(表2)。此外，为了验证GW6471的结构类似物(表1)是否具有与GW6471类似的功能，我们使用qRT-PCR的方法检测了这些结构类似物(表1)如何影响PPARα控制的下游靶基因Cpt1a的表达，其中Fenofibrate为PPARα激动剂对照，GW6471为PPARα抑制剂对照。如图19所示，GW6471的结构类似物(表1)均能够抑制Cpt1a的表达，显示它们能够通过与GW6471类似的机制抑制PPARα的活性及改变PPARα与TAK1物理结合的能力。
表1、GW6471结构类似物的结构示意图
Figure PCTCN2021117407-APPB-000002
Figure PCTCN2021117407-APPB-000003
Figure PCTCN2021117407-APPB-000004
Figure PCTCN2021117407-APPB-000005
Figure PCTCN2021117407-APPB-000006
表2、PPARα配体对CD8+T细胞的影响
PPARα配体名称/编号 IC 50 EC 200
GW6471 34.61uM 0.0022uM
Fenofibrate >40uM 0.0076uM
ZM0282 31.49uM 0.0058uM
ZM0283 0.3537uM 0.0087uM
ZM0284 7.495uM 0.0258uM
ZM0285 0.1303uM 0.7892uM
ZM0286 12.71uM 致死剂量以内无法达到
ZM0325 30.9uM 致死剂量以内无法达到
ZM0326 2.417uM 致死剂量以内无法达到
ZM0329 40.96uM 致死剂量以内无法达到
ZM0330 8.423uM 致死剂量以内无法达到
ZM0332 >40uM 致死剂量以内无法达到
ZM0333 >40uM 致死剂量以内无法达到
EC 200：与不处理组相比，使IFN-γ产量加倍的最小剂量
IC 50：半数致死剂量。
实验例三：典型的PPARα抑制剂GW6471增强PD-1/PD-L1抗体对MC38-OT I的抗肿瘤效果、激活肿瘤浸润性T淋巴细胞的功能，增加记忆性T细胞比例并延长小鼠的存活期
细胞培养及动物模型建模方法：
(1)MC38-OT I细胞(自带抗原ovalbumin257-264，便于检测能够识别肿瘤抗原特异性T淋巴细胞)的复苏及培养：使用DMEM培养基(含10％胎牛血清)。将MC38-OT I肿瘤细胞冻存管从液氮保存罐中取出，立即放入37℃水浴中快速溶解，然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心桶中，900rpm离心5分钟后去除上清，用新鲜培养基重悬后，将细胞转移到细胞培养瓶中，加入10-15ml培养基混悬沉淀细胞，调整细胞浓度后，置于37℃、体积分数5％CO 2饱和湿度培养箱中培养。在维持培养过程中，每天观察细胞状态并及时更换新鲜培养基。当细胞贴壁生长至90％汇合度时，用0.05％胰酶消化，按照1:3的比例进行传代培养。实验当天，将生长状态良好，汇合度达到90％的细胞胰酶消化后，用新鲜培养基中和胰酶，900rpm离心，弃上清后加入无菌PBS重悬，计数，将细胞悬液的密度调整为5×10 6/ml待用。
(2)接种肿瘤细胞：皮下接种雌性野生型C57小鼠，每只小鼠0.1ml(每只小鼠接种50×10 4个MC38-OTI细胞)。
实验方案(一)：PPARα抑制剂GW6471增强PD-L1抗体(PD-L1 mAb)对MC38-OT I的抗肿瘤效果及延长了小鼠的存活期
(1)采用鼠源结肠癌细胞系MC38-OT I(自带抗原ovalbumin257-264，便于检测能够识别肿瘤抗原特异性T淋巴细胞)，对C57小鼠进行皮下接种，约在5天左右可测量到肿瘤形成(平均肿瘤体积约为50mm 3)。
(2)荷瘤小鼠组别设计，试验共分4组，分别为
a)荷瘤小鼠对照组(CTR)；
b)荷瘤小鼠抗体治疗组(PD-L1 mAb)；
c)荷瘤小鼠给药组(GW6471)；
d)荷瘤小鼠联合治疗组(GW6471+PD-L1 mAb)；
试验荷瘤小鼠共4组，每组6只。
(3)治疗方案：如图3a所示，按接种为0天计算，在接种后第7，10和17天对小鼠进行PD-L1抗体治疗，200ug每只小鼠，腹腔注射(PD-L1 mAb稀释于PBS中，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。与此同时，在接种后第11天开始对小鼠给与GW6471治疗，10mg/kg，腹腔注射，隔一天给与一次GW6471，共10次(GW6471储液为25mg/ml溶解于DMSO中，待给药前，稀释于55℃预热的PBS中至完全溶解，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。
(4)肿瘤生长及生存期统计：在给药期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，记录小鼠死亡情况。
结果如图3b所示，相比于对照组，GW6471治疗组小鼠肿瘤生长趋势有轻微的减缓，但是效果并不显著。PD-L1抗体组小鼠肿瘤体积虽然也得到缓解，但在此治疗的基础上，联合GW6471可显著减缓MC38-OT I肿瘤的生长。与此同时如图4所示，联合GW6471和PD-L1抗体对小鼠生存期的增长也有显著的改善。
实验方案(二)：PPARα抑制剂GW6471增强PD-1抗体(PD-1 mAb)对MC38-OTI的抗肿瘤效果
(1)采用鼠源结肠癌细胞系MC38-OT I(自带抗原ovalbumin257-264，便于检测能够识别肿瘤抗原特异性T淋巴细胞)，对C57小鼠进行皮下接种，约在5天左右可测量到肿瘤形成(平均肿瘤体积约为50mm 3)。
(2)荷瘤小鼠组别设计，试验共分3组，分别为
a)荷瘤小鼠对照组(CTR)；
b)荷瘤小鼠抗体治疗组(PD-1 mAb)；
c)荷瘤小鼠联合治疗组(GW6471+PD-1 mAb)；
试验荷瘤小鼠共3组，每组7只。
(3)治疗方案：按接种为0天计算，在接种后第8和11天对小鼠进行PD-1抗体治疗，50ug每只小鼠，腹腔注射(PD-1 mAb稀释于PBS中，浓度为0.5mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。与此同时，在接种后第5天开始对小鼠给与GW6471治疗，30mg/kg，每天灌胃给药。GW6471使用研钵研碎，稀释并混悬于0.3％CMC-Na溶液中，达到3mg/ml浓度并置于4℃保存，每天给药前将药物取出，平衡到室温后进行灌胃给药。
(4)肿瘤生长及生存期统计：在给药期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。到接瘤后第28天时，统计肿瘤体积的变化趋势，即将每只小鼠第28天的肿瘤体积与第8天的肿瘤体积对比，计算出变化倍数。如果变化倍数为0，说明小鼠肿瘤已经消除；如果变化倍数大于0小于1，说明小鼠肿瘤得到控制，体积并未进一步增长；变化倍数大于1，说明小鼠肿瘤没有得到控制，继续进展。
结果如图5a所示，相比于对照组，PD-1抗体组和PD-1抗体联合GW6471组的小鼠肿瘤生长趋势显著减缓。而PD-1抗体组小鼠平均肿瘤体积在接瘤后第28天显示出一定的复发趋势，而联用组对肿瘤体积的控制依然很好，体现出显著的疗效优势。可以从图5b中观察到类似的趋势，即PD-1抗体联合GW6471可显著减缓MC38-OT I肿瘤的生长。
实验方案(三)：PPARα抑制剂GW6471增强肿瘤浸润性T淋巴细胞功能及活性
(1)构建MC38-OT I荷瘤小鼠模型，待模型构建完毕，分为4组，每组6只小鼠，并分别给与PD-L1抗体和GW6471治疗。此方法完全同实验方案(一)。
(2)在接种后第21天，取各组小鼠肿瘤组织。利用手术剪将组织剪碎后置于2mg/ml的胶原酶Ⅳ中37℃，220rpm消化1h。然后在滤网上对组织进行研磨过滤，离心弃上清后，用PBS重悬，制备成单细胞悬液。
(3)细胞染色：将上述细胞悬液进行荧光染色，配色方案为APC-CD45，PE/Cy7-CD3，APC/Cy7-CD8，PE-Perforin，FITC-Granzyme B，Percp/Cy5.5-IFNγ，BV421-Ki67。其中CD45，CD3和CD8为针对表面抗原的抗体，直接在4℃避光染色30min。其余为针对细胞内抗原的抗体，需将细胞固定过夜后，透膜后进行染色。待染色完成后，清洗细胞后重悬进行流式细胞检测。
结果如图6所示，在PD-L1抗体治疗的基础上， GW6471可以显著提高肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞分泌 perforin、Granzyme B和IFNγ的能力即杀伤肿瘤细胞的功能，同时增强了CD8+T细胞的活性(Ki67)。
实验方案(四)：PPRAα抑制剂GW6471增加PD-L1抗体诱导产生的记忆性CD8+T细胞比例
(1)构建MC38-OT I荷瘤小鼠模型，待模型构建完毕，同上分为四组，每组6只小鼠，并分别给与PD-L1抗体和GW6471治疗。此方法完全同实验方案(一)。
(2)在接种后第15天，取各组小鼠肿瘤组织。利用手术剪将组织剪碎后置于2mg/ml的胶原酶Ⅳ中37℃，220rpm消化1h。然后在滤网上对组织进行研磨过滤，离心弃上清后，用PBS重悬，制备成单细胞悬液。
(3)细胞染色：将上述细胞悬液进行荧光染色，配色方案为BV605-CD45，APC/Cy7-CD8，PE-CD62L，FITC-CD44，Percp/Cy5.5-CD3，APC-KLGR1。上述所有抗体均为针对表面抗原的抗体，直接在4℃避光染色30min。待染色完成后，清洗细胞后重悬进行流式细胞检测，并将CD45+CD3+CD8+CD44+KLRG1-CD62L+的细胞视为记忆性CD8+T细胞类群。
结果如图7所示，与对照组相比，单独使用GW6471不能提高肿瘤组织中记忆性CD8+T细胞比例，而PD-L1抗体和GW6471联用PD-L1抗体组均能够显著调高该比例。更重要得是， 在PD-L1抗体治疗的基础上， GW6471可以进一步显著提高肿瘤组织中记忆性CD8+T细胞比例，使荷瘤小鼠长期获益，同时支持了图4的结果，即GW6471与PD-L1抗体联用显著延长荷瘤小鼠的生存期。
实验方案(五)：PPRAα抑制剂GW6471的抗肿瘤作用主要依赖于CD8+T细胞
(1)同上构建MC38-OT I荷瘤模型。
(2)荷瘤小鼠组别设计，试验共分4组，分别为
a)荷瘤小鼠对照组(CTR)；
b)荷瘤小鼠联合治疗组(GW6471+PD-L1 mAb)；
c)荷瘤小鼠删除CD4组(GW6471+PD-L1 mAb+α-CD4 Ab)
d)荷瘤小鼠删除CD8组(GW6471+PD-L1 mAb+α-CD8 Ab)
试验荷瘤小鼠共4组，每组6只。
(3)治疗方案：按接种为0天计算，在接种后第7，10和17天对小鼠进行PD-L1抗体治疗，200ug每只小鼠，腹腔注射(PD-L1 mAb稀释于PBS中，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。与此同时，在接种后第11天开始对小鼠给与GW6471治疗，10mg/kg，腹腔注射，隔一天给与一次GW6471，共10次(GW6471储液为25mg/ml溶解于DMSO中，待给药前，稀释于55℃预热的PBS中至完全溶解，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。
(4)肿瘤生长统计：在给药期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。
结果如图8所示， 删除CD8+T细胞后肿瘤生长和对照组相同，显著抵消了PD-L1抗体和GW6471的联 合治疗效果，而相比之下删除CD4+T细胞效果并没有那么明显。以上则说明GW6471同PD-L1抗体的联合治疗效果主要依赖于CD8+T细胞。
实施例四：典型PPARα抑制剂GW6471联合PD-L1抗体的抗肿瘤作用主要依赖于DC细胞，特别是PPARα-/-DC
动物模型建模和细胞培养方法：
(1)CD11c-DTR和CD11c-DTR/PPARα-/-嵌合小鼠模型构建：首先将野生型C57小鼠(雌)进行10Gy全身辐照10分钟杀死骨髓细胞。第二天，取CD11c-DTR小鼠骨髓细胞，按照5×10 6每只小鼠的细胞数量尾静脉注射到辐照小鼠体内。若构建CD11c-DTR/PPARα-/-嵌合小鼠需将CD11c-DTR小鼠和PPARα-/-小鼠骨髓细胞1：1混合后尾静脉注射到辐照小鼠体内。之后给与抗生素氨苄两周，观察其生活情况，两个月后方可进行实验。
(2)MC38-OT I细胞的复苏及培养：复苏细胞前预先将细胞培养室内超净台进行紫外照射30min，DMEM培养基(含10％胎牛血清)放置室温备用。待准备工作结束后，将肿瘤细胞冻存管从液氮保存罐中取出，立即放入37℃水浴中快速溶解，然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心桶中，900rpm离心5分钟后去除上清，用新鲜培养基重悬后移入细胞培养瓶中，加入10-15ml培养基混悬沉淀细胞，调整细胞浓度后，置于37℃、体积分数5％CO 2饱和湿度培养箱中培养。在维持培养过程中，每天观察细胞状态并及时更换新鲜培养基。当细胞贴壁生长至90％汇合度时，用0.05％胰酶消化，按照1:3的比例进行传代培养。实验当天，将生长状态良好，汇合度达到90％的细胞胰酶消化后，用新鲜培养基中和胰酶，900rpm离心，弃上清后加入无菌PBS重悬，计数，将细胞悬液的密度调整为5×10 6/ml待用。
(3)接种肿瘤细胞：利用1ml无菌注射器皮下接种上述构建的模型小鼠，每只小鼠0.1ml(即每只小鼠接种50×10 4个MC38-OT I细胞)。注意每次吸取细胞悬液前将细胞混合均匀。
实验方案(一)：PPARα抑制剂GW6471联合PD-L1抗体的抗肿瘤效果主要依赖于DC细胞
(1)采用鼠源性结肠癌细胞系MC38-OT I(自带抗原ovalbumin257-264，便于检测特异性T淋巴细胞)，对构建的CD11c-DTR小鼠进行皮下接种，约在5天左右可看到约50mm 3的肿瘤形成。
(2)荷瘤小鼠组别设计
试验共分3组，分别为
a)荷瘤小鼠对照组(CTR)；
b)荷瘤小鼠注射DT组(CTR(DT))；
c)荷瘤小鼠抗体治疗组(GW6471+PD-L1 mAb)；
d)荷瘤小鼠联合治疗DT组(GW6471+PD-L1 mAb(DT))；
试验荷瘤小鼠共4组，每组5只。
(3)治疗方案：按接种日为第0天计算，在接种后第6天，每只b)组和d)组的小鼠腹腔注射500ng DT，隔一天给一次以便删除DC。第7，10和17天对小鼠进行PD-L1抗体治疗，200ug每只小鼠，腹腔注射(PD-L1 mAb稀释于PBS中，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射0.1ml)。与此同时，在接种后第8天开始对小鼠给与GW6471治疗，10mg/kg，腹腔注射，隔一天给与一次GW6471(GW6471储液为25mg/ml溶解于DMSO中，待给药前，稀释于55℃预热的PBS中至完全溶解，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射1ml)。
(4)肿瘤生长及生存期统计：在给药期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，记录小鼠死亡情况。
结果如图9所示，相比于GW6471+PD-L1 mAb治疗组， 给与DT(即删除DC)后小鼠肿瘤体积失去控 制，同对照组一样，说明该联合治疗方案依赖于DC细胞的参与。
实验方案(二)：PPARα -/-DC在抗肿瘤作用中占据重要地位
(1)在野生型C57小鼠上接种MC38-OT I细胞，待模型构建完毕，分为3组，每组9只小鼠，即荷瘤对照组(CTR)，野生型DC治疗组(WT DC)和PPARα敲除DC治疗组(PPARα -/-DC)。
(2)治疗方案：按接种为0天计算，在接种后第6、13、20天对小鼠进行DC注射治疗，每只小鼠靠近接瘤处的皮下注射5×10 6个DC细胞。其中野生型DC治疗组和PPARα敲除DC治疗组所接受的DC分别来自野生型C57小鼠和PPARα敲除小鼠。取出的骨髓细胞经体外分化成为成熟的DC后，经过2mg/ml OVA抗原的刺激过夜，再收集DC，计数，进行注射治疗。
(3)肿瘤生长统计：肿瘤生长期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。
结果如图10所示，与对照组相比，野生型DC治疗组能够有效控制肿瘤生长。而PPARα敲除DC治疗组的治疗效果显著优于野生型DC治疗组，从而进一步体现了PPARα -/-DC在抗肿瘤中的重要地位。
实验方案(三)：GW6471和PPARα敲除对DC激活T细胞功能的影响
(1)野生型小鼠接种MC38-OTI肿瘤细胞后，小鼠分为两组：荷瘤对照组和GW6471给药组。GW6471给药组从接瘤后第7天开始腹腔注射10mg/kg GW6471，每两天给药一次，共给药6次。在接瘤后第22天，处死小鼠，手术取出肿瘤组织，研磨、消化后获得肿瘤组织细胞。
(2)体外处理：通过流式细胞分选的方法分选出肿瘤浸润性DC(CD45+MHCII+CD11c+F4/80-)，与2mg/ml OVA抗原孵育48小时，之后洗去抗原，与从OTI转基因小鼠脾脏中通过磁珠分选的方法获得的OTICD8+T细胞(CFSE预染色)按照1：8的比例进行共孵育，3天后检测OTI CD8+T细胞的增殖状况和分泌IFN-γ的水平。
(3)检测方法：流式细胞仪检测CFSE稀释倍数，以此确定OTI CD8+T细胞的分裂状态。通常来说细胞增殖约明显，CFSE稀释倍数越多，平均荧光强度越低。OTI CD8+T细胞分泌的IFN-γ的水平也可以通过ELISA试剂盒来检测，来说明OTI CD8+T细胞的激活状态。
结果显示，相对于接瘤对照组，GW6471给药组的小鼠肿瘤浸润性DC能够更有效的激活OTI CD8+T细胞——增殖更强烈(图11a)，且分泌更多的IFN-γ(图11b)
实验方案(四)：PPARα敲除对DC激活T细胞功能的影响
(1)野生型和PPARα敲除小鼠分别接种MC38-OTI肿瘤细胞。接瘤后第20天，处死小鼠，手术取出肿瘤组织，研磨、消化后获得肿瘤组织细胞。
体外处理：在分离小鼠肿瘤内T细胞的前一天在ELISPOT板中预孵育anti-mouse IFN-γ抗体，作用浓度为5μg/ml，4℃孵育过夜，次日弃去抗体，加入封闭液(含10％胎牛血清、1％青霉素链霉素和β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基)室温封闭2h。随后将分离得到的小鼠肿瘤T细胞按照3×105每孔加入板中，并孵育15μg/ml OVA257-264抗原肽，37℃培养箱培养48h。48h后弃培养液，加入去离子水裂解细胞，5min/次，共2次。用PBST(含0.05％Tween-20的1×PBS)溶液洗3遍，随后加入生物素标记的anti-mouse IFN-γ抗体，室温孵育2h。PBST溶液洗4遍，随后加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)，室温孵育1 h。最后1×PBS洗3遍后加入AEC底物显色5-60min，加入去离子水终止反应，继续冲洗干净后将ELISPOT板子吹干。
细胞染色：将上述细胞悬液进行荧光染色，配色方案为APC-CD45，PE/Cy7-CD3，APC/Cy7-CD8，PE-Tetramer(Tet)，抗体与细胞混合后，在4℃避光染色30min。之后用含有2％FBS的PBS溶液清洗一次，终止染色。
(2)检测方法：Ellispot结果通过荧光酶斑点分析仪CTL analyzer LLC进行扫描和计数分析。另外一部分肿瘤组织单细胞悬液直接进行细胞染色，由于我们使用的PE-Tetramer(Tet)抗体能够直接识别T细胞表面能够与肿瘤相关抗原配对的T细胞受体，因此这种分析方法可以直接检测得到肿瘤抗原特异性Tet+CD8+T细胞的比例。
结果显示，与野生型小鼠相比，PPARα敲除小鼠的肿瘤组织中含有更高比例的抗原特异性Tet+CD8+T细胞比例(图12a)，而且这些细胞能够产生强的IFN-γ信号(图12b)。这些结果说明PPARα敲除小鼠的肿瘤浸润性DC具有更强的抗原呈递和激活CD8+T细胞的能力。
实验例五：PPARα抑制剂GW6471对DC代谢状态的调控，进而调控DC的功能
细胞培养及处理方法：
骨髓来源DC的获取：取6-8周龄C57BL/6小鼠，解剖获取长骨和胫骨，将骨髓吹出，红细胞裂解液2ml处理1min裂解红细胞，无血清培养基中和后离心，重悬获得小鼠骨髓细胞悬液，以3×10 6细胞/皿种于10cm培养皿中。完全培养基(含10％FBS、50μM巯基乙醇的RPMI 1640)加入20ng/ml mGM-CSF(重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子)培养按第0天计算，第3天补加10ml完全培养基(含20ng/ml mGM-CSF)。培养至第6天，收集未贴壁细胞为未成熟的BMDCs。经流式鉴定CD11c+的DCs纯度达90％以上，可用于后续实验。
肿瘤外泌体(Tumor-derived Exosomes，TDE)的获取：肿瘤细胞培养在含有10％已去除外泌体的胎牛血清(100,000g，2h)的培养基中48h后，收集上清。首先，4000rpm离心2h去除上清中的细胞碎片。然后，利用100kDa的超滤管以4000rpm、30min/次的速度收集上清中大于100kDa的组份。收集的组份以5:1(v:v)加入外泌体提取试剂(EXOTC10A-1，SBI)，充分混合后4℃放置至少12h。待12h后沉淀出现，3000rpm离心30min，分离出沉淀物，即为外泌体。PBS按照一定的体积重悬后，BCA测定蛋白含量以标定外泌体的含量，分装后置于-80℃保存，备用。
肿瘤外泌体的处理可以改变骨髓来源DC的代谢状态和功能，模拟肿瘤微环境的影响。
实验方案(一)：GW6471对DC代谢状态的调控
(1)考察DC细胞的氧化磷酸化水平：
细胞处理：Seahorse(总体细胞代谢水平检测试剂盒，购自安捷伦)的Seahorse XF24细胞培养板利用Corning TM Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive试剂(促进悬浮细胞黏附到细胞培养板底面)3.5μg/cm 2进行贴壁预处理后，经过外泌体或GW6471预处理48h的骨髓来源的DCs按照30万每孔接种于培养板中，每组五个复孔，0.5ml体系，细胞贴壁4h。
Seahorse海马生物能量测定(总体细胞代谢水平)：探针板水化过夜。在检测之前，细胞更换为预热的525μl XF Base培养基(Seahorse Bioscience)培养，该基础培养基中另加入10mM葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠，并用NaOH调至PH为7.4过滤后可用。Oligomycin(寡霉素)，FCCP(三氟甲氧基苯腙羰基氰化物)，Rotenone(魚藤酮)和Antimycin A(抗霉素A)分别用XF基础培养基稀释为1mM，1.5mM，100nM和1mM，体积为75μl加入到探针板A，B，C孔中(Rotenone和antimycin-A混合配置一起加入C孔)。待准备完毕即可上机检测细胞氧化磷酸化水平。
(2)考察DC细胞的脂肪酸氧化水平：
细胞处理：Seahorse XF24细胞培养板利用Corning TM Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive试剂3.5μg/cm 2进行贴壁预处理后，经过外泌体或GW6471预处理48h的骨髓来源的DCs按照30万每孔接种于培养板中，每组五个复孔，0.5ml体系，细胞在底物限制性培养基(仅含有0.5mM葡萄糖，1.0mM L-谷氨酰胺，0.5mM肉碱and 1％FBS的DMEM)中培养过夜。
Seahorse海马生物能量测定(脂肪酸氧化水平)：探针板水化过夜。在上机检测前45min，细胞更换为预热的450μl FAO assay medium(脂肪酸氧化检测培养基，含111mM NaCl,4.7mM KCl,2mM MgSO 4,1.2mM Na 2HPO 4,2.5mM葡萄糖,0.5mM肉碱and 5mM HEPES磺酸缓冲盐溶液)中培养。并利用该培养基配置100μM的Etomoxir(简称ETO，肉碱棕榈酰基转运蛋白1的抑制剂)75μl，加入探针板A孔中。待准备完毕即可上机检测脂肪酸氧化程度。
(3)考察DC细胞的乳酸分泌水平：
细胞处理：骨髓来源的DC按照30万每孔接种于24孔细胞培养板中，经过外泌体或GW6471预处理48h后，收集上清。
检测方式：使用比色法乳酸检测试剂盒(Lactate Colorimetric Assay Kit，Biovision)检测上清中的乳酸含量，并读取570nm处吸光值进行定量分析。
结果显示，肿瘤外泌体(TDE)能够显著增加DC细胞的耗氧量(OCR)——细胞氧化磷酸化水平的标志(图13a)，以及脂肪酸氧化水平(图13b)，同时降低了乳酸的分泌量(图13c)——细胞糖酵解水平的标注。因此，肿瘤外泌体在体外能够模拟肿瘤微环境对DC代谢状态的调控。在此基础上，GW6471能够显著降低DC的氧化磷酸化水平、脂肪酸氧化水平，并恢复糖酵解水平(图13)，而且GW6471引起的代谢状态改变有助于DC功能的恢复。
实验方案(二)：GW6471对DC诱导产生调节性T细胞的影响
小鼠模型介绍：
Foxp3-GFP转基因小鼠的特点是通过基因编辑手段，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的基因置于负责CD4+调节性T细胞发育的转录因子Foxp3的启动子之后。因此，我们可以方便的通过荧光检测的方法(GFP阳性即为Foxp3阳性)，而非以往比较复杂的胞内蛋白染色的方法，来考察小鼠体内或体外CD4+T细胞转变成调节性T细胞的状况。
OTI(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J)转基因小鼠的特点是通过基因编辑手段，使该小鼠的CD8+T细胞的T细胞受体能够特异性识别OVA蛋白的第257-264位多肽的结构，并被激活、增殖。该转基因小鼠常用于考察抗原特异性免疫反应的研究中。
(1)细胞处理：首先将BMDCs用外泌体以及15uM GW6471预处理48h。另外，取Foxp3-GFP转基因小鼠的脾细胞，通过磁珠分选出CD4+细胞，离心后计数。然后，将以上预处理的DCs(2×10 4)与CFSE(羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯，常用来标记并监控细胞的增殖状态)标记的取自OTI转基因小鼠脾脏的CD8+T细胞(2×10 5)以1：10的比例共培养与U型底96孔板中。第四天时加入100U/孔重组小鼠IL-2细胞因子促进T细胞存活。
(2)检测方式：共培养7天后，细胞通过流式分析CD4+Foxp3+细胞的比例。
结果显示，肿瘤外泌体预处理的DC能够诱导更多的调节性T细胞(CD4+Foxp+)产生(图14)，而GW6471可以显著降低调节性T细胞，使之恢复到未经处理的对照组水平(图14)。
实验方案(三)：GW6471恢复DC对CD8+T细胞的活化作用
(1)细胞处理：首先将BMDCs用外泌体和2mg/ml OVA抗原，以及15uM GW6471共同孵育48h。另外，取OT I转基因小鼠的脾细胞，通过磁珠分选出CD8+细胞，离心后计数。然后，将以上预处理的DCs(5×10 4)与OTI CD8+T细胞(4×10 5)以1：8的比例共培养与U型底96孔板中。
(2)检测方式：共培养3天后，收集上清，通过ELISA的方法检测OTI CD8+T细胞分泌的IFN-γ。
结果显示，肿瘤外泌体预处理的DC能够抑制CD8+T细胞的活化，而GW6471显著提高了OTI CD8+T细胞分泌的IFN-γ水平(图15)，充分说明GW6471恢复了DC对CD8+T的活化。
实验例六：PPARα抑制剂GW6471增强E7疫苗对TC-1的抗肿瘤效果并延长小鼠的生存期
(一)、细胞培养及动物模型建模方法：
(1)TC-1细胞的复苏及培养：复苏细胞前预先将细胞培养室内超净台进行紫外照射30min，RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)放置室温备用。待准备工作结束后，将肿瘤细胞冻存管从液氮保存罐中取出，立即放入37℃水浴中快速溶解，然后将细胞悬液移入含10ml培养基的离心桶中，900rpm离心5分钟后去除上清，用新鲜培养基重悬后，转移入细胞培养瓶中，加入10-15ml培养基混悬沉淀细胞，调整细胞浓度后，置于37℃、体积分数5％CO 2饱和湿度培养箱中培养。在维持培养过程中，每天观察细胞状态并及时更换新鲜培养基。当细胞贴壁生长至90％汇合度时，用0.05％胰酶消化，按照1:3的比例进行传代培养。实验当天，将生长状态良好，汇合度达到90％的细胞胰酶消化后，用新鲜培养基中和胰酶，900rpm离心，弃上清后加入无菌PBS重悬，计数，将细胞悬液的密度调整为5×10 5/ml待用。
(2)接种肿瘤细胞：利用1ml无菌注射器皮下接种雌性野生型C57小鼠，每只小鼠0.1ml(即每只小鼠接种5×10 4个TC-1细胞)。注意每次吸取细胞悬液前将细胞混合均匀。约在7天左右可看到约50mm 3的肿瘤形成。
(二)、治疗方案：
(3)荷瘤小鼠组别设计
试验共分4组，分别为
d)荷瘤小鼠对照组(CTR)；
e)荷瘤小鼠疫苗治疗组(E7 vaccine)(制备方法可参见CN201410570624)；
f)荷瘤小鼠给药组(GW6471)；
g)荷瘤小鼠联合治疗组(GW6471+E7 vaccine)；
试验荷瘤小鼠共4组，每组10只。
(3)治疗方案：按接种为0天计算，在接种后第7，14和21天对小鼠进行E7疫苗治疗(疫苗的制备参见本实验室在先工作：CN201410570624.7)，E7(20)/MPLA/PEG-PE(20/10/1000w/w/w)/每只小鼠，皮下注射。与此同时，在接种后第8天开始对小鼠给与GW6471治疗，10mg/kg，腹腔注射，隔一天给与一次GW6471，共10次(GW6471储液为25mg/ml溶解于DMSO中，待给药前，稀释于55℃预热的PBS中至完全溶解，浓度为2mg/ml，每只小鼠腹腔注射1ml)。
(4)肿瘤生长及生存期统计：在给药期间，每周进行两次测量各组小鼠肿瘤生长情况，按照长×宽×宽/2计算出肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，记录小鼠死亡情况。
结果如图16所示，相比于E7疫苗治疗组，联合GW6471可进一步显著减缓TC-1的肿瘤生长。与此同时如图17所示，联合GW6471和E7疫苗对小鼠生存期的增长也有显著的改善。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对保护范围的限定。

Claims (7)

  1. PPARα配体在制备药物中的应用，所述的药物的功能包括如下功能的任意一种或多种：
    (1)激活T细胞的活化信号，所述的活化信号是使JNK磷酸化水平上升，所述的T细胞优选为CD8+T细胞；
    (2)激活T细胞，
    所述的激活T细胞指使T细胞分泌更多的IFN-γ和IL-2且同时增加T细胞的存活时间，
    所述的T细胞优选为CD8+T细胞，更优选的，为肿瘤浸润性CD8+T细胞；
    (3)促进T细胞分化，所述的分化指促进T细胞分化为记忆性T细胞；
    (4)调节树突状细胞(Dendritic Cell，DC细胞)的代谢状态，
    所述的调节代谢是指：下调DC细胞的脂肪酸氧化/氧化磷酸化水平，并上调糖酵解水平；
    所述的DC为骨髓来源的DC，更优选的，为浸润在肿瘤微环境中的DC；
    (5)恢复DC对T细胞的调控功能，
    所述的恢复DC的调控功能指：下调CD4+T细胞转变为调节性T细胞的比例、增加肿瘤杀伤性CD8+T细胞的比例、激活肿瘤杀伤性CD8+T细胞的功能；
    所述的激活肿瘤杀伤性CD8+T细胞指：使肿瘤杀伤性CD8+T细胞分泌更多的IFN-和IL-2且同时增加肿瘤杀伤性CD8+T细胞的存活时间；
    (6)提高免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果，所述的免疫检查点抑制剂优选为PD-L1/PD-1抗体，优选的，所述的肿瘤为免疫检查点抑制剂治疗有效的肿瘤；
    (7)提高抗肿瘤疫苗的治疗效果，所述的抗肿瘤疫苗优选为以PEG2000-DSPE胶束装载多肽/蛋白肿瘤抗原的纳米疫苗。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的PPARα配体为PPARα的抑制剂，优选的，所述的PPARα的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
  3. 一组PPARα的抑制剂，所述的抑制剂为ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
  4. 一种抗肿瘤联用制剂，所述的制剂包含：
    (1)治疗有效量PPARα配体；
    (2)治疗有效量的免疫检查点抑制剂或治疗有效量的抗肿瘤疫苗；
    (3)必要的药用辅料。
  5. 根据权利要求4所述的联用制剂，其特征在于，所述的PPARα配体为PPARα的抑制剂，优选的，所述的PPARα的抑制剂为GW6471分子及其结构类似物ZM0282、ZM0283、ZM0284、ZM0285、ZM0286、ZM0325、ZM0326、ZM0329、ZM0330、ZM0332、ZM0333。
  6. 根据权利要求4或5所述的联用制剂，其特征在于，所述的免疫检查点抑制剂为PD-L1/PD-1抗体。
  7. 根据权利要求4或5所述的联用制剂，其特征在于，所述的抗肿瘤疫苗为以PEG2000-DSPE胶束装载多肽/蛋白肿瘤抗原的疫苗。
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