CN116355937A - 双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，具体为：构建可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体；构建可以产生微细胞的大肠杆菌突变菌株；将表达载体转化至大肠杆菌突变菌株中，进行诱导培养，即可在大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞；借助离心‑超滤相结合的方法，提取并纯化产生的微细胞，即可得到双重靶向性微细胞纳米载体。本发明的微细胞纳米载体，其制备时间短、效率高、成本低，关键是其表面可同时表达两种与心衰相关的靶向性重组短肽：pHLIP和PSP1。

Description

双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法。

背景技术

目前，已有多种纳米颗粒作为药物传递系统被证实用于心脏修复或心血管重建治疗研究，包括脂质体、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、外泌体等。但这些传统的纳米颗粒都不同程度地面临系统稳定性差、制作工艺复杂、易导致体内异物聚集或引发毒性等问题。

细菌是疾病治疗的重要工具，由细菌异常分裂产生的纳米级微细胞用于癌症治疗也已有几十年的历史。细菌微细胞作为一种潜在的药物递送系统，具备生物相容性好、药物泄漏率低、毒性低以及载药量高和治疗指数高等优势。研究表明，大肠杆菌Nissle 1917(EcN)菌株可在肿瘤的坏死区和低氧区的交界面增殖并进行有效释放药物；而且，EcN不携带毒力因子，其细胞膜上的血清敏感脂多糖可保证菌株从正常器官中快速清除。因此，EcN衍生的微细胞在将药物靶向至缺氧区以发挥治疗作用方面具有潜在的适用性。pH(低)插入肽(pH low insertion peptides,pHLIP)已被证明可以将大肠杆菌微细胞靶向至病变缺氧区；此外，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)识别肽(简称PSP1，氨基酸序列：Cys-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Cys)可以与细胞受损或凋亡时细胞表面外翻暴露的PS结合；而心肌细胞缺氧、细胞凋亡又是心衰时的主要表现方式，若能实现低成本、高效构建一种以pHLIP、PSP1作为双靶向肽的微细胞，将加速微细胞作为药物载体用于心脏疾病研究。

发明内容

本发明的目的在于提供双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，通过在微细胞膜上同时表达双靶向肽pHLIP、PSP1，得到可以特异性靶向心肌缺氧病变区域的微细胞纳米药物载体。

本发明所采用的技术方案是，双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，构建可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体；

步骤2，构建可以产生微细胞的大肠杆菌突变菌株；

步骤3，将步骤1中构建的表达载体转化至步骤2构建的大肠杆菌突变菌株中，进行诱导培养，即可在大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞；

步骤4，借助离心-超滤相结合的方法，提取并纯化步骤3中产生的微细胞，即可得到双重靶向性微细胞纳米载体。

本发明的特点还在于，

步骤1中，具体为：构建包含pHLIP短肽表达基因、磷脂酰丝氨酸识别肽PSP1表达基因以及绿色荧光蛋白eGFP基因的融合基因；在该融合基因的5′端重组编码Lpp_1-29-OmpA_67-180的蛋白嵌合系统基因，用于将重组蛋白锚定在细胞膜上表达；通过基因重组方法，将以上融合基因克隆至大肠杆菌表达载体上，获得可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体。

步骤2，具体为：利用Red同源重组系统，敲除大肠杆菌Nissle1917基因组中的minCD基因，以诱导亲本细菌产生大量微细胞，构建获得的大肠杆菌菌株的基因型为EcNΔminCD::kan。

步骤4中，具体为：将步骤3诱导培养后的菌液于25℃条件下离心10分钟，弃沉淀，将上清液转移到新鲜离心管中，去除大部分亲本细菌；在25℃条件下继续离心上清液20分钟，弃上清，用新鲜的300mL LB液体培养基将沉淀重悬；将重悬后的LB液体培养基于37℃、220rpm震荡培养1小时，加入终浓度为100ug/mL的头孢曲松钠，37℃、220rpm继续震荡培养2小时后，于25℃离心10分钟，弃沉淀，以去除剩余的亲本细菌；将保留的上清液经25℃离心20分钟，弃上清；然后用明胶-蔗糖溶液将含有微细胞的沉淀重悬，重悬液用0.45um的无菌过滤器过滤，滤液经25℃离心20分钟；再用明胶-蔗糖溶液将沉淀重悬，重悬液用0.22um的无菌过滤器过滤；滤液再次经25℃离心20分钟，弃上清，用5mL的无菌PBS缓冲液将沉淀重悬，吸取重悬液涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，检测细菌的残留情况；并进一步通过显微镜观察微细胞的纯化结果，未见细菌菌落出现，证明亲本细菌已完全去除，最终获得纯化的微细胞，即为双重靶向性微细胞纳米载体。

明胶-蔗糖溶液包括明胶-PBS缓冲液以及蔗糖-PBS缓冲液；明胶-PBS缓冲液的浓度为0.1g/L，蔗糖-PBS缓冲液的浓度为250g/L。

本发明的有益效果为：

本发明的微细胞纳米载体，其表面可同时表达两种与心衰相关的靶向性重组短肽：pHLIP和PSP1。另外，该方法制备时间短、效率高、成本低，可为双重靶向性微细胞药物载体的研发提供有效途径。

附图说明

图1是pIG6-Lpp-ompA-pHLIP-PSP1-eGFP载体图谱；

图2是光学显微镜下微细胞生成情况图；

图3是扫描电镜下微细胞生成情况图；

图4是Western Blotting检测重组蛋白表达结果图；上层条带为eGFP蛋白，下层条带为双靶向肽重组蛋白；

图5是菌体免疫荧光检测靶向肽表达结果图；

图6是光学显微镜下纯化的微细胞图。

具体实施方式

下面根据附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述。

本发明双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，构建可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体；

具体为：构建包含pHLIP短肽表达基因、磷脂酰丝氨酸识别肽PSP1表达基因以及绿色荧光蛋白eGFP基因的融合基因；在该融合基因的5′端重组编码Lpp_1-29-OmpA_67-180的蛋白嵌合系统基因，用于将重组蛋白锚定在细胞膜上表达；通过基因重组方法，将以上融合基因克隆至大肠杆菌表达载体上，获得可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体；

步骤2，构建可以产生微细胞的大肠杆菌突变菌株；

具体为：利用Red同源重组系统，敲除大肠杆菌Nissle 1917(EcN)基因组中的minCD基因，以诱导亲本细菌产生大量微细胞，构建成大肠杆菌菌株的基因型为EcN△minCD::kan。

步骤3，将步骤1中构建的表达载体转化至步骤2构建的大肠杆菌突变菌株中，进行诱导培养，即可在大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞；

步骤4，借助离心-超滤相结合的方法，提取并纯化步骤3中产生的微细胞，即为双重靶向性微细胞纳米载体；

具体为：将步骤3诱导培养后的菌液于25℃下离心10分钟，弃沉淀，将上清液转移到新鲜离心管中，去除大部分亲本细菌；在25℃条件下离心上清液20分钟，弃上清，用新鲜的300mL LB液体培养基将沉淀重悬；将重悬后的LB液体培养基于37℃、220rpm震荡培养1小时，加入终浓度为100ug/mL的头孢曲松钠，37℃、220rpm继续震荡培养2小时后，于25℃离心10分钟，弃沉淀，以去除剩余的亲本细菌；将保留的上清液经25℃离心20分钟，弃上清；然后用明胶-蔗糖溶液将含有微细胞的沉淀重悬，重悬液用0.45um的无菌过滤器过滤，滤液经25℃离心20分钟；再用明胶-蔗糖溶液将沉淀重悬，重悬液用0.22um的无菌过滤器过滤；滤液再次经25℃离心20分钟，弃上清，用5mL的无菌PBS缓冲液将沉淀重悬，吸取重悬液涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，检测细菌的残留情况；并进一步通过显微镜观察微细胞的纯化结果，未见细菌菌落出现，证明亲本细菌已完全去除，最终获得纯化的微细胞。

明胶-蔗糖溶液包括明胶-PBS缓冲液以及蔗糖-PBS缓冲液；明胶-PBS缓冲液的浓度为0.1g/L，蔗糖-PBS缓冲液的浓度为250g/L；

大肠杆菌EcN菌株购买于北京百欧博伟生物技术有限公司。

实施例1、构建适合产生微细胞的大肠杆菌菌株

用于基因改造的原始菌株是大肠杆菌EcN，利用Red同源重组系统敲除其基因组上的minCD基因，其敲除序列如SEQ ID NO.1所示；基因敲除所用的质粒包括pKD13、pKD46，具体敲除步骤如下：

根据大肠杆菌EcN基因组上minCD基因簇两侧碱基序列及pKD13上卡那霉素抗性基因两侧碱基序列设计两对敲除引物，分别为：

del minCD F1：5ˊ-tgcatgaggcagaacctaaggttatccatcaggcgctgggataagctgtcaaacatgag-3ˊdel minCD R1：5ˊ-ctcttcttcaatgaagcggaaaggacgttcttctcccaagtgtaggctggagctgcttc-3ˊdel minCD F2：5ˊ-aaaggcagtagcttcactttatctgtggttcatctgcatgaggcagaacctaaggtta-3ˊ

del minCD R2：5ˊ-tcctccgaacaagcgtttgaggaagcctttcttctcttcttcaatgaagcggaaagg-3ˊ

先以pKD13为模板，以del minCD F1、del minCD R1为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次的PCR获得产物为模板，以del minCD F2、del minCD R2为引物，进行第二次PCR扩增，得到上下游两端分别有72bp、73bp与minCD基因簇两端的基因组序列同源且带有卡那霉素抗性基因的PCR片段。PCR片段经电泳、切胶回收后转化进入携带pKD46质粒的EcN菌株中，通过pKD46表达的同源重组酶将PCR片段整合至基因组中替换minCD基因。将转化子涂布于含有卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养基平板上，30℃培养过夜。利用鉴定引物JD minCDF(序列：5ˊ-atgtcaaacacgccaatcgagct-3ˊ)与JD minCD R(序列：5ˊ-tcctccgaacaagcgtttgagga-3ˊ)对长出的单克隆菌落进行菌落PCR扩增鉴定，并通过基因测序进一步确定minCD基因簇被敲除。

为去除温度敏感型质粒pKD46，挑取鉴定成功后的单克隆菌落至含卡那霉素(15μg/mL)的LB液体培养基中，42℃连续培养12小时。然后，将菌液涂布于含卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，于分别含氨苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(15μg/mL)的LB固体培养基平板上进行抗性筛选，只在含卡那霉素的LB固体培养基平板上生长而在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上不生长的菌落证明其质粒pKD46已丢失。获得缺失minCD基因后的大肠杆菌菌株为EcNΔminCD::kan。

LB固体培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，加ddH₂O配制而成，高压除菌；

LB液体培养基的配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，加ddH₂O配制而成，高压除菌。

实施例2、构建微细胞膜表面双靶向肽蛋白表达载体

本实施例中，选取大肠杆菌脂蛋白(lipoprotein，Lpp)的前29个N端氨基酸(protein ID：QUR90296.1)与外膜蛋白A(outer membrane protein A，ompA，protein ID：QUR89604.1)的67-180氨基酸残基融合而成Lpp-ompA蛋白嵌合系统，其序列如SEQ ID No.2所示；利用常规的基因重组技术，按照大肠杆菌密码子偏好性，将编码Lpp-ompA蛋白嵌合系统的碱基序列、编码pHLIP的碱基序列、编码PSP1的碱基序列以及编码绿色荧光蛋白eGFP的碱基序列克隆至大肠杆菌表达载体pIG6。其中，eGFP蛋白用于微细胞检测追踪；同时在PSP1、eGFP的下游分别引入编码6个组氨酸标签序列，用于重组蛋白的检测。最终，获得可以在细胞膜表面表达的双靶向肽蛋白表达载体pIG6-Lpp-ompA-pHLIP-PSP1-eGFP，该载体如图1所示，其序列如SEQ ID No.3所示。

实施例3、重组大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞

将载体pIG6-Lpp-ompA-pHLIP-PSP1-eGFP转化进入大肠杆菌菌株EcNΔminCD::kan，获得携带双靶向肽蛋白表达载体的重组大肠杆菌菌株。

将转化子接种至含有卡那霉素(15μg/mL)、氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。筛选出单克隆后，将其接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的3mLLB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养。次日，按1:100的比例将菌液接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的1000mL LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下培养至OD_600nm达到0.4，添加终浓度为0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷。于28℃、220rpm条件下诱导表达至OD_600nm达到1.0时，吸取菌液5mL，用于形态学及重组蛋白的表达检测。接着，于28℃、220rpm条件下连续培养约15小时。在此过程中，大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞。

通过光学显微镜及扫描电镜观察微细胞生成情况，结果如图2及图3所示，可见产生了微细胞；采用赛默飞公司生产的鼠抗6x-His标签单克隆抗体作为一抗、Solarbio公司生产的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，Western Blotting检测重组蛋白表达情况，并以赛默飞公司生产的6x-His标签单克隆抗体作为一抗、Invitrogen公司生产的Cy3耦联的山羊抗小鼠IgG抗体作为荧光二抗，通过菌体免疫荧光检测靶向肽表达，图4证实了可溶性蛋白Lpp-ompA-pHLIP-PSP1和eGFP蛋白在大肠杆菌菌株EcNΔminCD::kan中的表达；图5显示明显的红色荧光，表明EcNΔminCD::kan菌株表面pHLIP、PSP1短肽的存在。

实施例4、纯化提取携带双靶向肽的微细胞

将上述诱导培养后的菌液于2000×g、25℃离心10分钟，弃沉淀，将上清液转移到新鲜离心管中，去除大部分亲本细菌；10000×g、25℃离心上清液20分钟，弃上清，用新鲜的300mL LB液体培养基将沉淀重悬；将重悬后的LB液体培养基于37℃、220rpm震荡培养1小时，加入终浓度为100ug/mL的头孢曲松钠，37℃、220rpm继续震荡培养2小时后，于2000×g、25℃离心10分钟，弃沉淀，以去除剩余的亲本细菌；将保留的上清液经10000×g、25℃离心20分钟，弃上清；然后用120mL的明胶-蔗糖溶液将含有微细胞的沉淀重悬，重悬液用0.45um的无菌过滤器过滤，滤液经10000×g、25℃离心20分钟；再用30mL的明胶-蔗糖溶液将沉淀重悬，重悬液用0.22um的无菌过滤器过滤；滤液再次经10000×g、25℃离心20分钟，弃上清，用5mL的无菌PBS缓冲液将沉淀重悬。吸取500uL重悬液涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，检测细菌的残留情况；并进一步通过显微镜观察微细胞的纯化结果，结果如图6所示，未见细菌菌落出现，证明亲本细菌已完全去除，最终获得纯化的微细胞。

明胶-蔗糖溶液配方为：0.1g/L明胶，250g/L蔗糖，用PBS缓冲液配制而成，过滤除菌。

根据以上具体实施例可得出结论，本发明双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，工艺简单、快速、高效且生产成本低，为进一步生产双重靶向性微细胞药物载体建立技术平台。

Claims (5)

1.双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，构建可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体；

步骤2，构建可以产生微细胞的大肠杆菌突变菌株；

步骤3，将步骤1中构建的表达载体转化至步骤2构建的大肠杆菌突变菌株中，进行诱导培养，即可在大肠杆菌体内生产携带双靶向肽的微细胞；

步骤4，借助离心-超滤相结合的方法，提取并纯化步骤3中产生的微细胞，即可得到双重靶向性微细胞纳米载体。

2.根据权利要求1所述的双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，具体为：构建包含pHLIP短肽表达基因、磷脂酰丝氨酸识别肽PSP1表达基因以及绿色荧光蛋白eGFP基因的融合基因；在该融合基因的5′端重组编码Lpp_1-29-OmpA_67-180的蛋白嵌合系统基因，用于将重组蛋白锚定在细胞膜上表达；通过基因重组方法，将以上融合基因克隆至大肠杆菌表达载体上，获得可以在大肠杆菌膜表面展示双靶向肽的表达载体。

3.根据权利要求1所述的双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2，具体为：利用Red同源重组系统，敲除大肠杆菌Nissle 1917基因组中的minCD基因，以诱导亲本细菌产生大量微细胞，构建成大肠杆菌菌株的基因型为EcNΔminCD::kan。

4.根据权利要求1所述的双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，具体为：将步骤3诱导培养后的菌液于25℃下离心10分钟，弃沉淀，将上清液转移到新鲜离心管中，去除大部分亲本细菌；在25℃条件下离心上清液20分钟，弃上清，用新鲜的300mL LB液体培养基将沉淀重悬；将重悬后的LB液体培养基于37℃、220rpm震荡培养1小时，加入终浓度为100ug/mL的头孢曲松钠，37℃、220rpm继续震荡培养2小时后，于25℃离心10分钟，弃沉淀，以去除剩余的亲本细菌；将保留的上清液经25℃离心20分钟，弃上清；然后用明胶-蔗糖溶液将含有微细胞的沉淀重悬，重悬液用0.45um的无菌过滤器过滤，滤液经25℃离心20分钟；再用明胶-蔗糖溶液将沉淀重悬，重悬液用0.22um的无菌过滤器过滤；滤液再次经25℃离心20分钟，弃上清，用5mL的无菌PBS缓冲液将沉淀重悬，吸取重悬液涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，检测细菌的残留情况；并进一步通过显微镜观察微细胞的纯化结果，未见细菌菌落出现，证明亲本细菌已完全去除，最终获得纯化的微细胞，即为双重靶向性微细胞纳米载体。

5.根据权利要求4所述的双重靶向性微细胞纳米载体的制备方法，其特征在于，明胶-蔗糖溶液包括明胶-PBS缓冲液以及蔗糖-PBS缓冲液；明胶-PBS缓冲液的浓度为0.1g/L，蔗糖-PBS缓冲液的浓度为250g/L。

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