CN116355833A - 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用 - Google Patents

一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116355833A
CN116355833A CN202310302762.6A CN202310302762A CN116355833A CN 116355833 A CN116355833 A CN 116355833A CN 202310302762 A CN202310302762 A CN 202310302762A CN 116355833 A CN116355833 A CN 116355833A
Authority
CN
China
Prior art keywords
platform
solution
liver
bionic
liver fibrosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310302762.6A
Other languages
English (en)
Inventor
陈国宝
尹诗韵
陈偲
孙中涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing University of Technology
Original Assignee
Chongqing University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing University of Technology filed Critical Chongqing University of Technology
Priority to CN202310302762.6A priority Critical patent/CN116355833A/zh
Publication of CN116355833A publication Critical patent/CN116355833A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用，以甲基丙烯酸化透明质酸、二硫苏糖醇和不同纤维化程度的脱细胞肝基质为原材料，经过迈克尔加成交联反应和紫外光诱导自由基聚合的二次交联制得三维多孔结构的水凝胶支架，所述仿生平台具有多个相互连通的培养室且培养室间的力学刚度和生化成分可不同。本发明的力学异质性肝纤维化仿生平台不仅含有不同纤维化程度脱细胞肝基质，还拥有能使细胞更好的黏附生长以及营养物质输送和代谢废物的排出的结构，能体外真实模拟体内肝纤维化发生和发展的基质微环境，可以用于探索区域刚度与细胞外基质成分不同对肝纤维化的发生、发展甚至是逆转的机制，在肝纤维化研究领域具有良好的应用前景。

Description

一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肝纤维化机制研究技术领域，特别的涉及一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用。
背景技术
肝纤维化是致病因子导致肝脏损伤，肝脏结缔组织异常增生而引起的一种病变，它是世界范围内人口死亡率的主要原因之一。肝纤维化到晚期可发展成肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。肝纤维化发生后，肝脏内的细胞、成分、血管和微结构都会发生不同程度的变化。从组织学上来看，肝纤维化的标志就是肝结构的破坏和异常细胞外基质的沉积。然而，基质刚度的变大不仅是肝纤维化的病理结果，也是促进肝纤维化进展的重要线索之一。肌成纤维细胞是纤维化过程中产生细胞外基质、影响基质力学上升的主要效应细胞，肝星状细胞是肝内肌成纤维细胞的主要细胞来源之一，所以肝星状细胞的激活是肝纤维化中的一个重要的事件。近年来，有研究提出将基质力学作为肝纤维化治疗的新靶点，来探索肝纤维化治疗的新途径。然而，由基质力学介导的肝纤维化具体发生机制尚不明确。因此，在体外构建能够真实模拟体内肝纤维化发生和发展的基质微环境，研究不同基质刚度对肝星状细胞和肌成纤维细胞的生物行为影响，以此来探究基质刚度对肝纤维化进程的影响，这将为研究人员了解肝纤维化的病理机制和潜在的治疗靶点提供新的见解。
通过瞬时弹性成像评估肝脏刚度的临床研究表明，正常肝脏、早期和晚期纤维化肝脏的刚度分别为1.5～4.5kPa、4.1～12.9kPa和16.3～48kPa(Xia T,Zhao R,Liu W,Huang Q,Chen P,Waju YN,Al-Ani MK,Lv Y,Yang L.Effect of substrate stiffness onhepatocyte migration and cellular Young's modulus.J Cell Physiol.2018；233(9):6996-7006)。因此，基于纤维化病程中的肝脏刚度的不同，有许多研究人员模拟制备了基质力学不同的肝纤维化仿生平台来对其效应细胞肝星状细胞的行为进行了探究。研究人员使用双刚度(软：4kPa,硬：25kPa)的聚丙烯酰胺凝胶考察了5.5小时内肝星状细胞的迁移情况(Lachowski D,Cortes E,Robinson B,Rice A,Rombouts K,Del Río Hernández AE.FAKcontrols the mechanical activation of YAP,a transcriptional regulatorrequired for durotaxis.FASEB J.2018；32(2):1099-1107)，发现了其趋硬性的特点。在0.4kPa和25.6kPa两种刚度下，静止的肝星状细胞会在更高的刚度中形态发生显著变化，出现伪足，细胞铺展面积变大，并表达α-平滑肌肌动蛋白。这些变化代表肝星状细胞已分化为易于增殖的肌成纤维细胞(Dou C,Liu Z,Tu K,Zhang H,Chen C,Yaqoob U,Wang Y,Wen J,van Deursen J,Sicard D,Tschumperlin D,Zou H,Huang WC,Urrutia R,Shah VH,KangN.P300 Acetyltransferase Mediates stiffness-induced activation of hepaticstellate cells into tumor-promoting myofibroblasts.Gastroenterology.2018；154(8):2209-2221.e14)。此外，也有不少研究表明，基质刚度的增强可以促进肝内其他细胞(如：肝癌细胞、肝细胞等)的增殖。上述研究均表明基质刚度与肝星状细胞迁移、增殖和分化之间存在千丝万缕的关系。这些肝星状细胞行为的变化与多种机械传导途径有关。然而，目前由基质力学引发肝纤维化机械传导途径比较复杂，尚不明确。因此，需要构建一个贴近肝纤维化实际微环境的培养平台来探究肝纤维化发生、发展和逆转的机制。
目前研究肝纤维化的基质微环境培养平台，大多是由一种或多种高分子材料所复合而成的培养基底。如发明专利CN201410025039.9提供了一种不同基底刚度体外细胞培养平台的建立方法，具体步骤包括：改变单体丙烯酰胺和交联剂的比例，制备系列不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶，并在其表面包被一层I型胶原蛋白，形成不同基底刚度体外细胞培养平台。但上述方法并没有考虑到的特异性肝脏功能和原生肝的微观结构，缺乏天然肝脏细胞外基质固有的生化信号。因此，将脱细胞肝基质作为一种组织特异性生物材料仿生平台，对于研究肝纤维化微环境对肝星状细胞激活和肌成纤维细胞逆转的生物力学贡献至关重要。然而，单纯的脱细胞肝基质凝胶具有易于降解和不稳定性，不足以拥有长期的结构支持。为了克服这一限制，可以将网络状和纤维状聚合物与天然脱细胞肝基质相结合。同时为了满足肝纤维化基质力学的特点，这些聚合物可通过调节浓度、光照时间等方式改变刚度，使肝纤维化仿生平台更加接近体内肝脏真实微环境。尽管如此，目前体外模型仍然有限，在之前的大多数研究中所采用的培养基底都是刚度均匀的，这阻止了对肝纤维化中力学异质性的研究。因此，若开发一种力学异质性仿生平台，即可为肝纤维化疾病的发生、发展和逆转的机制研究具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供了一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用，解决目前细胞培养仿生平台缺乏体内真实肝纤维组织的化学微环境，并且对肝纤维化中力学异质性的研究存在空白等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种力学异质性肝纤维化仿生平台，所述仿生平台是以甲基丙烯酸化透明质酸、二硫苏糖醇和不同纤维化程度的脱细胞肝基质溶液为原材料，经过迈克尔加成交联反应和紫外光诱导自由基聚合的二次交联制得三维多孔结构的水凝胶支架；所述仿生平台由若干个横截面为六边形蜂巢状结构的培养室相互连接而成，任意相邻的两个培养室相连通使待培养的细胞可在不同培养室间迁移且任意两个培养室的力学刚度和生化成分可以相同也可以不同。这样，使用了不同纤维化程度的脱细胞肝脏基质，该原料使研究平台各自含有不同的生物化学信号更加贴近体内真实微环境。脱细胞肝脏基质与其他物质主要是以氢键结合的形式混合在一起，脱细胞肝脏基质被交联体系包裹在内，均匀分布在平台内部。
进一步，所述甲基丙烯酸化透明质酸与二硫苏糖醇质量比为5～15：0.7～2.1。
进一步，所述六边形培养室的每条边的长度为10～12mm。
进一步，所述脱细胞肝基质溶液采用以下步骤制得：将肝脏剪碎，再将其反复冻融多次，然后放入1％聚乙二醇辛基苯基醚/0.1％氢氧化铵溶液中，充分振荡24～48h，经去离子水清洗、冷冻、干燥，再将得到的粉末溶于胃蛋白酶溶液中，消化完成后，调节溶液pH值为7，盐浓度为0.5mg/mL PBS，即获得所述脱细胞肝基质溶液。所述胃蛋白酶溶液是由0.5M乙酸溶液制成浓度为10mg/mL，pH值为3～4。该条件下，能使肝基质受到的破坏更小，并且保持胃蛋白酶依然具有较好的消化能力。
进一步，所述甲基丙烯酸化透明质酸采用以下步骤制得：向1％的透明质酸溶液中滴加甲基丙烯酸酐溶液，调节溶液pH值为8，4℃下搅拌4～8h，室温透析3～5天，然后冷冻、干燥后，即得到甲基丙烯酸化透明质酸。
进一步，所述透明质酸的分子量为40～100kDa；所述透明质酸溶液与甲基丙烯酸酐溶液的体积比为100:2.4～4.8。
本发明的另一个目的还在于，提供了上述力学异质性肝纤维化仿生平台的制备方法，包括以下步骤：
1)将甲基丙烯酸化透明质酸加入PBS缓冲液中，室温下搅拌2～4h，再分别加入不同纤维化程度的脱细胞肝基质溶液和光引发剂继续搅拌得到若干种含有不同纤维化程度脱细胞肝基质的混合溶液；
2)向步骤1)制得的若干种混合溶液中分别加入二乙醇胺溶液和二硫苏糖醇，调节溶液pH值为9，然后将其分别快速转移至具有多个六边形蜂巢状结构模具的不同区域中，使溶液初步成胶形成不同培养室，再经紫外灭菌，即得到所述力学异质性肝纤维化仿生平台。
进一步，所述混合溶液中PBS缓冲液与脱细胞肝基质溶液的体积比为1:1。
进一步，所述引发剂为I2959光引发剂、1-羟基环己基苯基甲酮或2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮；步骤2)中所述成胶是将所述溶液先置于37℃中0.5h，再置于4℃中过夜即可。
本发明的另一个目的还在于，提供了上述力学异质性肝纤维化仿生平台或上述方法制备的力学异质性肝纤维化仿生平台在刚度力学微环境下肝纤维化的发生、发展甚至是逆转的机制研究中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备的力学异质性肝纤维化仿生平台，以不同浓度的甲基丙烯酸化透明质酸和不同纤维化程度的脱细胞肝基质为原材料，配合六边形蜂窝状模型的使用，经过迈克尔加成交联反应和紫外光诱导自由基聚合的二次交联，最终制备出具有多个相互连通的培养室且培养室间力学刚度和生化成分不同的肝纤维化仿生平台。其中不同纤维化程度脱细胞肝基质具有良好的生物相容性，一方面它使该平台含有了目前大多数仿生平台所缺乏的肝纤维化病理生物化学信号，能够更真实模拟体内肝纤维化发生和发展的基质微环境，另一方面不同纤维化程度肝基质的使用对仿生平台刚度性能的调控起到了一定促进作用。甲基丙烯酸化透明质酸同样具有良好的生物相容性，改性前的透明质酸属于纤维化肝脏的主要成分之一，甲基丙烯酸化透明质酸的使用让仿生平台更容易调控出所需的纤维化刚度环境。此外，甲基丙烯酸化物质的化合物配合光引发剂和紫外光照射，使整个凝胶化的过程易于人为控制与调节，更易于制备出力学异质性肝纤维化仿生平台。
2、本发明提供的力学异质性肝纤维化仿生平台拥有三维多孔的结构，孔隙相互连通，孔隙上覆盖了薄薄的一层细胞外基质，这种结构保证了复合水凝胶拥有较高的含水量和较大的比表面积，能使细胞更好的黏附生长以及营养物质输送和代谢废物的排出，细胞之间信息的交换更加容易。该平台在体外真实模拟体内肝纤维化发生和发展的基质微环境，以便于研究人员探究基质刚度对肝纤维化进程的影响，可为研究人员了解肝纤维化的病理机制和潜在的治疗靶点提供新的见解，具有良好的应用前景。
3、本发明制备的力学异质性肝纤维化仿生平台，方法简易快捷，成本较低，易于操作，实现在同一平台具有不同区域力学刚度不同，可用于研究区域刚度与细胞外基质成分不同在肝星状细胞激活和肌成纤维细胞逆转中的影响，因此本发明的力学异质性肝纤维化仿生平台是一种理想的肝纤维化发生、发展和逆转机制研究的新型细胞培养平台材料。同时也解决了目前肝纤维化病理机制研究平台，力学均一性、成分均一性的缺点，弥补了对肝纤维化中力学异质性研究的空白。
附图说明
图1为实施例4中具有六边形蜂巢状结构模具的结构示意图。
图2为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台的力学性能图；A为应力-应变曲线；B为杨氏模量。
图3为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台的照片，从左到右依次是实施例1、实施例2和实施例3。
图4为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台的红外光谱图。
图5为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台的SEM图。
图6为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台的降解性能图；A为降解照片；B为失重率。
图7为实施例1～3制备的力学异质性的肝纤维化仿生平台对细胞活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。一、一种力学异质性肝纤维化仿生平台的制备方法
取同一批次的4周龄雌性SD大鼠(体重200±20g)，将正常大鼠随机均分成三组，分别为Normal对照组，试验组1和试验组2。然后将Normal对照组，试验组1和试验组2分别注射0周、4周和8周的四氯化碳溶液(将四氯化碳与橄榄油以2:3的体积比混合)，一周两次，每次每只的注射量为每200g注射0.5mL，最终获得健康、早期肝纤维化和晚期肝纤维化模型大鼠。
实施例1
1)取健康模式大鼠处死，取出肝脏；将大鼠肝脏剪碎，并将其在-80℃和37℃之间冻融循环三次，然后放入1％聚乙二醇辛基苯基醚/0.1％氢氧化铵溶液中，以200rmp的速度的振荡48h，经水洗、冷冻、干燥后，即得到脱细胞肝基质粉末；再将300mg脱细胞肝基质粉末溶于30mL的10mg/mL胃蛋白酶溶液(由100mg胃蛋白酶加入到10mL的0.5M乙酸中获得)中，使用1M稀盐酸调节pH值为3～4的范围，消化72h，消化完成后使用氢氧化钠调节溶液pH值为7，盐浓度为0.5mg/mL PBS，即获得脱细胞肝基质溶液。
2)在100mL的1％透明质酸中滴加2.4mL的甲基丙烯酸酐溶液，4℃下搅拌8h得到改性溶液，然后将改性溶液倒入透析袋(分子量为8000～14000Da)中，室温透析4天，然后冷冻、干燥，即得到甲基丙烯酸化透明质酸粉末。
3)取100mg步骤2)获得的甲基丙烯酸化透明质酸粉末溶解在20mL的PBS缓冲液中，室温下搅拌2～4h直至完全溶解，然后加入20mL步骤1)获得的脱细胞肝基质溶液，再加入10mg的I2959光引发剂，室温搅拌0.5h，得到混合溶液。
4)向步骤3)获得的混合溶液中滴加微量的0.2M二乙醇胺溶液和14mg二硫苏糖醇粉末，并调节溶液pH值为9，然后将上述水凝胶溶液快速转移至普通24孔板模具中，将模具先置于37℃中0.5h，后置于4℃中过夜，使溶液初步成胶；最后将得到的凝胶用紫外光照射10min，即得到低刚度肝纤维化仿生平台。
实施例2
1)取早期肝纤维化模式大鼠处死，取出肝脏；将大鼠肝脏剪碎，并将其在-80℃和37℃之间冻融循环三次，然后放入1％聚乙二醇辛基苯基醚/0.1％氢氧化铵溶液中，以200rmp的速度的振荡48h，经水洗、冷冻、干燥后，即得到脱细胞肝基质粉末；再将300mg脱细胞肝基质粉末溶于30mL的10mg/mL胃蛋白酶溶液(由100mg胃蛋白酶加入到10mL的0.5M乙酸中获得)中，使用1M稀盐酸调节pH值为3～4的范围，消化72h，消化完成后使用氢氧化钠调节溶液pH值为7，盐浓度为0.5mg/mL PBS，即获得脱细胞肝基质溶液。
2)在100mL的1％透明质酸中滴加2.4mL的甲基丙烯酸酐溶液，4℃下搅拌8h得到改性溶液，然后将改性溶液倒入透析袋(分子量为8000～14000Da)中，室温透析4天，然后冷冻、干燥，即得到甲基丙烯酸化透明质酸粉末。
3)取200mg步骤2)获得的甲基丙烯酸化透明质酸粉末溶解在20mL的PBS缓冲液中，室温下搅拌2～4h直至完全溶解，然后加入20mL步骤1)获得的脱细胞肝基质溶液，再加入10mg的I2959光引发剂，室温搅拌0.5h，得到混合溶液。
4)向步骤3)获得的混合溶液中滴加微量的0.2M二乙醇胺溶液和28mg二硫苏糖醇粉末，并调节溶液pH值为9，然后将上述水凝胶溶液快速转移至普通24孔板模具中，将模具先置于37℃中0.5h，后置于4℃中过夜，使溶液初步成胶；最后将得到的凝胶用紫外光照射10min，即得到中刚度肝纤维化仿生平台。
实施例3
1)取晚期肝纤维化模式大鼠处死，取出肝脏；将大鼠肝脏剪碎，并将其在-80℃和37℃之间冻融循环三次，然后放入1％聚乙二醇辛基苯基醚/0.1％氢氧化铵溶液中，以200rmp的速度的振荡48h，经水洗、冷冻、干燥后，即得到脱细胞肝基质粉末；再将300mg脱细胞肝基质粉末溶于30mL的10mg/mL胃蛋白酶溶液(由100mg胃蛋白酶加入到10mL的0.5M乙酸中获得)中，使用1M稀盐酸调节pH值为3～4的范围，消化72h，消化完成后使用氢氧化钠调节溶液pH值为7，盐浓度为0.5mg/mL PBS，即获得脱细胞肝基质溶液。
2)在100mL的1％透明质酸中滴加2.4mL的甲基丙烯酸酐溶液，4℃下搅拌8h得到改性溶液，然后将改性溶液倒入透析袋(分子量为8000～14000Da)中，室温透析4天，然后冷冻、干燥，即得到甲基丙烯酸化透明质酸粉末。
3)取300mg步骤2)获得的甲基丙烯酸化透明质酸粉末溶解在20mL的PBS缓冲液中，室温下搅拌2～4h直至完全溶解，然后加入20mL步骤1)获得的脱细胞肝基质溶液，再加入10mg的I2959光引发剂，室温搅拌0.5h，得到混合溶液。
4)向步骤3)获得的混合溶液中滴加微量的0.2M二乙醇胺溶液和42mg二硫苏糖醇粉末，并调节溶液pH值为9，然后将上述水凝胶溶液快速转移至普通24孔板模具中，将模具先置于37℃中0.5h，后置于4℃中过夜，使溶液初步成胶；最后将得到的凝胶用紫外光照射10min，即得到高刚度肝纤维化仿生平台。
实施例4
将实施例1～3制备的水凝胶溶液分别快速转移至如图1所示的模具中不同的培养室1，该模具具有三个横截面为正六边形蜂巢状结构的培养室相互连接，每个正六边形的内边长为10mm，相邻培养室间设置有活动隔板，再将模具先置于37℃中0.5h，后置于4℃中过夜，使溶液初步成胶，然后去掉培养室之间的活动隔板2；最后将得到的凝胶用紫外光照射10min，即得到力学异质性肝纤维化仿生平台。
二、性能检测
1、使用长春机械科学研究院有限公司的微机控制力学试验机(DNS20型)对实施例1～3得到的三组材料进行力学性能检测，结果如图2所示。
从图中可以看出，实施例1～3制得的肝纤维化仿生平台的平均压缩杨氏模量分别为2.18±1.11kPa，6.89±1.64kPa和20.42±6.44kPa，分别与临床上正常肝脏、早期和晚期纤维化肝脏的刚度相对应。可见，本发明可以通过改变甲基丙烯酸化透明质酸的浓度和不同纤维化程度肝基质溶液来对力学异质性肝纤维化仿生平台的刚度进行调控。
2、对实施例1～3分别制得的肝纤维化仿生平台进行观察，结果如图3所示。
从图中可以看出，三组仿生平台随着甲基丙烯酸化透明质酸的浓度变大和脱细胞肝基质溶液纤维化严重程度加深，颜色越来越深。说明该材料随着甲基丙烯酸化透明质酸的浓度变大和脱细胞肝基质溶液纤维化严重程度加深越来越稳定。
3、利用美国Perkin Elmer公司的傅立叶变换红外光谱仪对实施例1～3制得的肝纤维化仿生平台进行红外光谱分析，结果如图4所示。
从图中可以看出，在3290～3350cm-1左右谱带区域的明显的宽峰，这是拉伸振荡氢键结合而产生的O-H；在1630～1650cm-1左右谱带区域的尖峰，这是由酰胺I带的振动引起的；在1400～1410cm-1左右谱带区域的窄尖峰，这是O-H的面内变形振荡吸收峰；在1000-1050cm-1左右谱带区的单峰，这是C-OH的伸缩振荡吸收峰。对比实施例1～3，可以看出在3300cm-1、1400cm-1和1000cm-1左右谱带区域随着甲基丙烯酸化透明质酸含量的增加尖峰越来越钝、强度越来越弱，说明可能由于甲基丙烯酸化透明质酸含量的增加造成了自由基交联增加，使氢键结合的强度减小。
4、为了方便电镜观察，将实施例1～3得到的三组不同刚度的肝纤维化仿生平台进行干燥处理后，然后分别在扫描电子显微镜下观察各组样品的截面，结果如图5所示。
从图中可以看出，各组样品中均呈现三维多孔的结构，孔隙相互连通，孔隙上覆盖了薄薄的一层细胞外基质(干燥处理前细胞外基质是以一种均匀分布的方式包含平台内部，干燥处理后细胞外基质部分包裹在孔隙上)，这种结构保证了复合水凝胶拥有较高的含水量和较大的比表面积，能使细胞更好的黏附生长，细胞之间信息的交换更加容易。随着甲基丙烯酸化透明质酸浓度的增大，样品表面的孔隙越来越多，但孔径越来越小，说明其交联的密度更大。
5、将实施例1～3得到的三组不同刚度的肝纤维化仿生平台放置于PBS缓冲液中进行14天的降解实验，结果如图6所示。
从图中可以看出，在14天的降解过程中，实施例3的降解始终最为缓慢，而其他两组的降解速度比较接近。结果说明：甲基丙烯酸化透明质酸的加入使复合凝胶交联更加紧密，体系更加稳定，更不易降解，该凝胶能够为细胞研究实验提供的稳定平台。
6、将肝星状细胞分别置于实施例1～3制备的仿生平台的表面和内部培养7天后，采用FDA/PI染色试剂盒检测实施例1～3制备的肝纤维化仿生平台对细胞活性上的影响，结果如图7所示。
从图中可以看出，三组不同刚度的肝纤维化仿生平台中几乎没有存在死亡的细胞，活细胞形态良好，都聚集在了一起，说明本发明制备的不同力学肝纤维化仿生平台均有利于肝星状细胞的黏附和生长，因此本发明实施例4所制备的力学异质性肝纤维化仿生平台亦有利于肝星状细胞的黏附和生长。
综上，虽然实施例1～4制备的仿生平台都可以用于肝星状细胞的黏附和生长，但实施例1～3所用的普通24孔模具只能做均一力学和成分的培养基底；而本发明巧妙借助六边形蜂窝状模具，不仅实现培养基底在力学性能和生化成分上区域不同，可用于研究区域刚度与细胞外基质成分不同在肝星状细胞激活和肌成纤维细胞逆转中的影响，而且该模具的尺寸和大小符合天然肝脏的基本微结构，每一个六边形对应一个肝小叶单位，因此本发明的力学异质性肝纤维化仿生平台是一种理想的肝纤维化发生、发展和逆转机制研究的新型细胞培养平台材料。从以上性能检测结果可以看出，这种通过六边形蜂巢模具制备的力学异质性平台是可行的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述仿生平台是以甲基丙烯酸化透明质酸、二硫苏糖醇和不同纤维化程度的脱细胞肝基质溶液为原材料，经过迈克尔加成交联反应和紫外光诱导自由基聚合的二次交联制得三维多孔结构的水凝胶支架；所述仿生平台由若干个横截面为六边形蜂巢状结构的培养室相互连接而成，任意相邻的两个培养室相连通使待培养的细胞可在不同培养室间迁移且任意两个培养室的力学刚度和生化成分可以相同也可以不同。
2.根据权利要求1所述力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述甲基丙烯酸化透明质酸与二硫苏糖醇质量比为5～15：0.7～2.1。
3.根据权利要求1所述力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述六边形培养室的每条边的长度为10～12mm。
4.根据权利要求1所述力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述脱细胞肝基质溶液采用以下步骤制得：将肝脏剪碎，再将其反复冻融多次，然后放入1％聚乙二醇辛基苯基醚/0.1％氢氧化铵溶液中，充分振荡24～48h，经去离子水清洗、冷冻、干燥，再将得到的粉末溶于胃蛋白酶溶液中，消化完成后，调节溶液pH值为7，盐浓度为0.5mg/mL PBS，即获得所述脱细胞肝基质溶液。
5.根据权利要求1所述力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述甲基丙烯酸化透明质酸采用以下步骤制得：向1％的透明质酸溶液中滴加甲基丙烯酸酐溶液，调节溶液pH值为8，4℃下搅拌4～8h，室温透析3～5天，然后冷冻、干燥后，即得到甲基丙烯酸化透明质酸。
6.根据权利要求5所述力学异质性肝纤维化仿生平台，其特征在于，所述透明质酸的分子量为40～100kDa；所述透明质酸溶液与甲基丙烯酸酐溶液的体积比为100:2.4～4.8。
7.如权利要求1～6任一项所述力学异质性肝纤维化仿生平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将甲基丙烯酸化透明质酸加入PBS缓冲液中，室温下搅拌2～4h，再分别加入不同纤维化程度的脱细胞肝基质溶液和光引发剂继续搅拌得到若干种含有不同纤维化程度脱细胞肝基质的混合溶液；
2)向步骤1)制得的若干种混合溶液中分别加入二乙醇胺溶液和二硫苏糖醇，调节溶液pH值为9，然后将其分别快速转移至具有多个六边形蜂巢状结构模具的不同区域中，使溶液初步成胶形成不同培养室，再经紫外灭菌，即得到所述力学异质性肝纤维化仿生平台。
8.根据权利要求7所述力学异质性肝纤维化仿生平台的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中PBS缓冲液与脱细胞肝基质溶液的体积比为1:1。
9.根据权利要求7所述力学异质性肝纤维化仿生平台的制备方法，其特征在于，所述引发剂为I2959光引发剂、1-羟基环己基苯基甲酮或2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮；步骤2)中所述成胶是将所述溶液先置于37℃中0.5h，再置于4℃中过夜即可。
10.如权利要求1～6任一项所述力学异质性肝纤维化仿生平台或权利要求8～9任一项所述方法制备的力学异质性肝纤维化仿生平台在刚度力学微环境下肝纤维化的发生、发展甚至是逆转的机制研究中的应用。
CN202310302762.6A 2023-03-27 2023-03-27 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用 Pending CN116355833A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310302762.6A CN116355833A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310302762.6A CN116355833A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116355833A true CN116355833A (zh) 2023-06-30

Family

ID=86914056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310302762.6A Pending CN116355833A (zh) 2023-03-27 2023-03-27 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116355833A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108653809B (zh) 一种基于黑磷和明胶的复合水凝胶及其在骨组织工程方面的应用
Negrini et al. Tissue-mimicking gelatin scaffolds by alginate sacrificial templates for adipose tissue engineering
WO2023024202A1 (zh) 光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架
Zhang et al. Three-dimensional gelatin and gelatin/hyaluronan hydrogel structures for traumatic brain injury
Xu et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing
CN112321778B (zh) 一种双蛋白水凝胶的制备方法
CN102293688B (zh) 一种蚕丝支架及其制备与应用
CN110585483A (zh) 一种可多重方法交联的新型生物墨水及其制备方法
CN110885455A (zh) 一种活性氧响应水凝胶的制备及应用
Zhao et al. Digestion degree is a key factor to regulate the printability of pure tendon decellularized extracellular matrix bio-ink in extrusion-based 3D cell printing
CN111407924B (zh) 一种具有各向异性表面的复合补片及其制备方法和应用
CN110305338B (zh) 用于肿瘤微球入侵检测的双网络水凝胶的制备与应用方法
Zhu et al. A versatile 3D-printable hydrogel for antichondrosarcoma, antibacterial, and tissue repair
CN106668950A (zh) 一种可用于中枢神经修复的丝素三维支架
CN115887772A (zh) 一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3d打印生物墨水及其应用
Hu et al. 3D printing GelMA/PVA interpenetrating polymer networks scaffolds mediated with CuO nanoparticles for angiogenesis
Wang et al. Hybrid hydrogel composed of hyaluronic acid, gelatin, and extracellular cartilage matrix for perforated TM repair
Wang et al. Silk fibroin hydrogel membranes prepared by a sequential cross-linking strategy for guided bone regeneration
CN117959489A (zh) 新的骨材料替代合成配方、制备方法和使用方法
CN116355833A (zh) 一种力学异质性肝纤维化仿生平台及其制备方法和应用
CN112111162B (zh) 可快速固化的双网络水凝胶及其制备方法与应用
WO2020223778A1 (pt) Matriz 3d de nanocelulose para cultura de células humanas e animais in vitro
CN111529755A (zh) 一种poss增强水凝胶及其制备方法和用途
WO2023087523A1 (zh) 一种多孔气凝胶支架及其制备方法与应用
Yu et al. Evaluation of natural protein-based nanofiber composite photocrosslinking hydrogel for skin wound regeneration

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination