CN116355049A - 一种Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂及其应用，Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂的结构为多肽‑链接‑小分子，其中，多肽的序列为NH₂‑Asp‑Leu‑Glu‑Aln‑Leu‑Tyr‑Phe‑Gln‑COOH。本申请提供了Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，经过nutlin‑3a和肽复合的N‑MdmX的晶体结构分析表明，该肽起着补丁的作用，将MdmX上的配体结合口袋重建为深腔，紧密对接nutlin‑3a。本申请提供的双抑制剂表现出有效的抗癌活性，Ki值为0.75nM。

Description

一种Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体地，涉及Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂及其应用。

背景技术

异常的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)会导致许多人类疾病,是重要的药物靶点。PPI界面的特征是平浅化的口袋，对药物设计很有挑战性。目前先进的药物设计策略可以通过高通量筛选组合化学文库和虚拟化合物文库来获得有效的苗头化合物(hit)，然后通过合理药物设计提升苗头化合物(hit)的特异性。然而，合理药物设计存在着内在的局限性，因为很难根据靶标蛋白的药物的刚性结构预测配体结合口袋的构象变化以容纳高亲和力配体结构。本申请建议至少在原则上可以通过使用多肽分子作为“贴片(patching)”重新改变配体结合口袋形状，将弱化合物限制在配体结合口袋中，克服目前药物设计的这些限制。贴片多肽不仅会与配体结合口袋结合，还会与捕获的配体结合。

过表达的双微体Mdm2和MdmX是一对氨基酸序列和结构高度同源的细胞信号调节分子，通过将其N末端结构域(N-Mdm2和N-MdmX)结合p53反式激活结构域(p53p)来降低细胞p53活性。以N-Mdm2为靶点的Mdm2高效小分子抑制剂的发现是将多肽分子转化为小分子的最成功案例之一。MdmX与nutlin-3a(一种强Mdm2抑制剂但却是MdmX的弱抑制剂)复合物的晶体结构表明，nutlin-3a模拟p53肽的三个关键氨基酸与MdmX的配体结合口袋高度匹配。在这项旨在开发通用肽修补策略以有力提高弱配体结合亲和力的工作中，本申请将nutlin-3a视为伪苗头化合物(hit)，以设计高亲和力Mdm2和MdmX双重抑制剂。

发明内容

本申请提供了一种Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，所述Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂的结构为多肽-链接-小分子，其中，所述多肽的序列为NH₂-Asp-Leu-Glu-Aln-Leu-Tyr-Phe-Gln-COOH。

在一些实施例中，所述链接为-Gly-Gly-Gly-Gly-。

在一些实施例中，所述链接为-(CH₂)_n-，n＝2-8。

在一些实施例中，所述链接为-(C₂H₄)_n-，n＝2-8。

在一些实施例中，所述小分子为：

本申请还提供了上述Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用。

本申请提供的双抑制剂表现出有效的抗癌活性，Ki值为0.75nM。

附图说明

图1a至图1c示出了鉴定用于重塑N-MdmX配体结合口袋的修补肽贴片。图1a)使用噬菌体展示肽库技术鉴定的高亲和力肽贴片列表。图1b)与PMI相比，在存在或不存在TevP的情况下，FP方法测定nutlin-3滴度N-MdmX实验。图1c)在存在或不存在nutlin-3a的情况下，FP方法测定N-MdmX滴定TevP。n＝3个独立实验，数据表示为平均值±SD。

图2a至图2c示出了TevP和nutlin-3a滴定N-MdmX的15N-1H HSQC NMR图谱。图2a)代表基于N-MdmX/nutlin-3a复合物晶体结构(7C3C.pdb)对应的N-MdmX二级结构的卡通模型。图2b)比较了TevP和nutlin-3a与N-MdmX结合的15N-1H HSQC NMR图谱。N-MdmX和配体比例：黑色，1:0；红色，1:1.5(nutlin-3a)和绿色，1:1.5(TevP)。图2c)为TevP和nutlin-3a与N-MdmX结合的15N-1H HSQC交叉滴定图谱。N-MdmX、TevP和nutlin-3a比率：黑色，1:0:0；橙色，1:2:1.5和青色，1:1.5:2。

图3a至图3b示出了nutlin-3a与N-MdmX结合的TevP增强结构机制。图3a)与nutlin-3a和TevP复合的N-MdmX的晶体结构。图中标注了对接p53p中三个关键残基的三个亚结合位点。图3b)展示重建的配体结合袋形成一个深孔结构并对接nutlin-3a。

图4中示出了TevP以不同于p53p和PMI的机制增强nutlin-3a亲和力。a)p53p、PMI和TevP的氨基酸序列。p53p和PMI的关键残基以红色给出。b)p53p、PMI和nutlin-3a的结构。关键残基用球棍模型表示。c)nutlin-3a中的三个药效团模仿p53p中的三个关键残基，但缺少PMI中的第28位的脯氨酸(P28)。d)四种不同复合物的N-MdmX结构的叠加：N-MdmX/p53p复合物、N-MdmX/nutlin-3a复合物、MdmX/nutlin-3a/TevP复合物、N-MdmX/PMI复合物。e)比较N-MdmX/nutlin-3a/TevP复合物和N-MdmX/nutlin-3a复合物的nutlin-3a分子的结构。f)比较N-MdmX/nutlin-3a/TevP复合物和N-MdmX/p53p之间的结构。g)比较N-MdmX/nutlin-3a/TevP复合物和N-MdmX/PMI复合物之间的结构。h)PMI肽引入了与N-MdmX结合的第四个关键残基(P28)。

图5a至图5c示出了Tn3a的分子结构及结合力。图5a)为Tn3a的分子结构。图5b)为FP测定Tn3a、PMI、p53p和nutlin-3a滴定N-MdmX实验。n＝3个独立实验，数据表示为平均值±SD。图5c)为FP测定Tn3a、PMI、p53p和nutlin-3a滴定N-Mdm2实验。n＝3个独立实验，数据表示为平均值±SD。

图6示出了Tn3a合成方案，其中，i)(Boc)2O、NaOH、二恶烷/水混合物；ii)NH₃、甲醇；iii)TFA-CH₂Cl₂；iii)TevP、PyBOP、Et₃N、CH₂Cl₂；iv)TFA-CH₂Cl₂；v)哌啶-CH₂Cl₂。

图7a示出了化合物2的质谱，图7b示出了化合物2的HPLC图谱。

图8a示出了化合物3的质谱，图8b示出了化合物3的HPLC图谱。

图9a示出了化合物4的质谱，图9b示出了化合物4的HPLC图谱。

图10示出了化合物5的HPLC图谱。

图11示出了化合物6的HPLC图谱。

图12a示出了化合物7的HPLC图谱，图12b示出了化合物7的质谱。

图13a至图13e用于说明Tn3a的生物活性。与nutlin-3a(阳性对照)和nutlin-3b(阴性对照)相比，通过MTT测定评估过表达Mdm2和/或MdmX的H1299p53细胞的活力受Tn3a的显着影响。空条：nutlin-3a(Mdm2抑制剂的阳性对照)；灰色条：nutlin-3b；和暗条：Tn3a。H1299p53+/Mdm2+/MdmX+细胞(d)；H1299p53+/Mdm2+/MdmX-细胞(e)；H1299p53+/Mdm2-/MdmX+细胞(f)和H1299p53+/Mdm2-/MdmX-细胞(g)。n＝3个独立实验，数据表示为平均值±SD。h)。Tn3a处理癌细胞不会诱导p53基因表达，但会特异性诱导p21基因表达。实心和空心符号分别表示p21和p53转录水平。三角形：HCT116细胞；圆形：H640细胞；方形：A549细胞。n＝3个独立实验，数据表示为平均值±SD。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

最有害的蛋白质-蛋白质相互作用之一是双微体2(Mdm2)及其同系物MdmX的过度表达损害许多癌症中的肿瘤抑制因子p53活性。Mdm2抑制剂的发现非常成功。尽管MdmX和Mdm2的结构高度相似，但Mdm2抑制剂对MdmX表现出弱亲和力，提供了Mdm2/MdmX双重抑制剂的苗头化合物(hit)。如何将弱的Mdm2抑制剂转化为高亲和力的Mdm2/MdmX双重抑制剂，标志着现代药物发现从苗头化合物(hit)开始药物设计和优化的一个共同问题。在这里，本申请提供了一种肽修补策略，以重塑MdmX上的配体结合口袋，以通过肽-苗头化合物(hit)-偶链策略(peptide-hit-conjugate，PHC)增强苗头化合物(hit)的亲和力。本申请通过将多肽展示的噬菌体文库与N-MdmX/nutlin-3a复合物中进行淘选，鉴定了一种短肽，可将nutlin-3a的结合亲和力从17.8μM增强到2.5nM。nutlin-3a可以视为是一种MdmX抑制剂设计过程中的苗头化合物(hit)。与nutlin-3a和肽复合的N-MdmX的晶体结构表明，该肽起着补丁的作用，将MdmX上的配体结合口袋重建为深腔结构，深腔结构紧密对接nutlin-3a。此外，通过将nutlin-3a与肽偶链构建了MdmX的PHC抑制剂，PHC表现出更有效的抗癌活性，Ki值为0.75nM。结果证明了一种扩展的肽-药物偶联物策略，可以通过各种高通量筛选轻松提高苗头化合物(hit)的结合亲和力，这是现有现有药物设计中的新策略。

用噬菌体展示的肽库鉴定补订肽：

使用天然N-MdmX结合肽(p53p，Kd～420nM)作为竞争剂针对N-MdmX/nutlin-3a复合物淘选了12个氨基酸肽链噬菌体展示肽文库。当p53浓度增加到1:0.5(N-MdmX:p53p)时，几个相同的序列以高频率出现，随着p53p浓度的进一步增加，这些序列变得更加富集。图1a总结了针对复合物选择出噬菌体序列。S1D2L3E4N5L6Y7F8Q9G10S11H12(PP1)氨基酸序列在1:0.5(N-MdmX:p53p)时，20个样品中出现的频率为8次，在1:1(N-MdmX:p53p)时20个样品中的出现频率为10次，也出现了另一个序列V1E2L3E4N5I6Y7F8N9G10A11D12(即PP2)。在较高的p53p浓度下(N-MdmX：p53p＝1：2)，上述序列出现频率在20个样品中分别为12次和8次。因此，可以推导出一个共有序列，即X1X2L3E4X5X6Y7F8X9X10X11X12，其中X1、X10和X11：小的疏水残基；X2和X12：负电荷残基；X5和X9：N或Q；X6：大的疏水残基。利用生物信息学方法，本申请使用PP1查询蛋白质数据库，发现PP1的氨基酸序列与Tev蛋白酶切割位点SQDLENLYFQG的氨基酸序列高度同源。因此，本申请将此肽命名为TevP。现有多肽药物设计理论还无法准确预测这种补丁肽，只能通过高通量筛选。

TevP多肽协同增强nutlin-3a对N-MdmX的结合亲和力

通过荧光偏振测定评估，本申请发现TevP显著增强了nutlin-3a与N-MdmX的结合。如图1b所示，在测定混合物中不存在TevP的情况下，nutlin-3a对荧光探针(FITC-p53p)与N-MdmX结合的抑制作用表现出非常弱的亲和力，Ki值为17.8μM(表1)，与之前的报告一致，而阳性对照PMI对N-MdmX表现出很强的结合亲和力，Ki值为2.1nM(表1)。在TevP与N-MdmX的混合比例为1:1.1的情况下，nutlin-3a的滴定显著取代了FITC-p53p，表明nutlin-3a对N-MdmX的亲和力增强，Ki值为2.5nM(表1)，并与PMI的亲和力相当。相反，TevP的存在不影响PMI对N-MdmX的结合亲和力(图1c)。表1示出了TevP和nutlin-3a对MdmX的协同结合作用。

表1

本申请进一步检查了nutlin-3a是否影响TevP与N-MdmX的结合。如图1c所示，TevP对N-MdmX表现出弱亲和力，Ki值为220.1μM。当测定溶液中nutlin-3a与N-MdmX的摩尔混合比为1:1.2(蛋白质：小分子)时，nutlin-3a的存在增强了TevP与N-MdmX的结合，Ki值为25.3μM。总之，nutlin-3a和TevP可以相互增强它们与N-MdmX的结合亲和力。

为了确定TevP作为修补肽发挥作用以增强苗头化合物nutlin-3a与MdmX结合口袋的结合亲和力的机制，本申请进行了15N-1H HSQC NMR滴定实验以监测由TevP和nutlin-3a引起的核磁共振谱扰动。N-MdmX由89个氨基酸残基组成，包含四个α-螺旋和两个β折叠元件(图2a)。在溶液状态下，15N标记的N-MdmX样品(图2b，黑色)的15N-1H HSQC NMR谱图由于其动态构象而产生的峰数量比预期的要少。尽管nutlin-3and TevP对N-MdmX的结合亲和力较弱,滴定nutlin-3a(图2b)或TevP(图2b)显著扰动15N-1H HSQC核磁谱峰。本申请还注意到，nutin-3a的滴定引起全局核磁共振谱峰扰动(图2b)，而TevP的滴定仅仅引起局部核磁共振谱峰扰动(图2b)。具体而言，如图2b所示，来自M46、Y55、G57和M101的共振峰受到TevP的显著扰动，表明TevP可能与N-MdmX上的螺旋α2和α4存在相互作用(图2a)。

本申请进一步用N15标记的N-MdmX(图2c，黑色)与TevP(图2c，青色)和nutlin-3a(图2c，橙色)的进行了交叉滴定实验。TevP滴定是在N-MdmX与nutlin-3a摩尔比为1:1.5(N-MdmX：nutlin-3a)时的条件下进行的，nutlin-3a滴定是在N-MdmX与TevP摩尔比为1:1.5(N-MdmX：TevP)的条件下进行的，如图2c所示，在两个交叉滴定实验中，TevP和nutlin-3a都显著扰动了N-MdmX的核磁共振振峰。本申请观察到，与单次滴定相比，一些共振谱峰受到相同程度的扰动，例如S91和F90(图2b)。然而，本申请也注意到TevP和nutlin-3a对许多谱峰存在着不同程度上扰动，例如H38、G57、G77和G78。这些观察表明TevP和nutlin-3a以不同的方式互相增强结合力，支持图1c中显示的数据结果，这是现有药物设计理论还无法准确预测的。

N-MdmX/TevP/nutlin-3a复合物的晶体结构

为了可视化TevP的肽片如何重塑N-MdmX上的nutlin-3a结合口袋，本申请确定了N-MdmX与TevP和nutlin-3a复合物的X射线晶体结构。复合物的晶体具有良好的衍射图

晶体结构揭示了紧凑的三组分复合物(图3a)。该三组分复合物中的N-MdmX结构具有与N-MdmX/nutlin-3a复合物中相似的折叠和表面特征。TevP形成了一个螺旋结构，链接着N-MdmX的螺旋α2和α4，TevP起到跨越L26结合位点的补丁作用(图3a)，使原本开放的口袋形成一个深孔结构(图3b)。综合起来，15N-HSQC NMR滴定实验和X射线晶体结构表明TevP贴片在N-MdmX口袋中起到了限制nutlin-3a的作用。

如图4中的a所示，从这项工作中鉴定的TevP肽与p53p和PMI不同源。P53p和PMI分别通过三个或四个关键残基与N-MdmX形成螺旋结构(图4中的b)。Nutline-3a分子具有模仿p53p肽中三个关键残基的刚性构型(图4中的c)。当将本申请新检测到的N-MdmX结构与那些与p53p(3DAB)或PMI或nutlin-3a(7C44)22复合的结构进行比较时，本申请发现这些复合物中的N-MdmX主链构象以相同的模式全局折叠(图4中的d)。与N-MdmX/nutlin-3a复合物的结构相比，N-MdmX/nutlin-3a/TevP复合物中TevP的结合不影响nutlin-3a的对接位置(图4中的e)。在这两种情况下，nutlin-3a都很好地结合在配体结合口袋中(图4中的f)，模仿p53p的三个关键残基，即F19^p53p、W23^p53p和L26^p53p(图4中的b)。与N-MdmX/PMI复合物相比，TevP肽的L3残基与PMI多肽的P28残基的位置相同(图4中的g)，其中PMI多肽的P28残基是PMI高结合亲和力的主要贡献者，这个氨基酸残基的位置是由p53p的P26残基移位产生的(图4中的h)，表明TevP除了作为补丁的功能外，还部分模仿PMI。只有通过结构测定后，才能为选择和缺点链接体程度或通过随机测试确定。

多肽-苗头化合物偶联物的设计

受TevP贴片增强nutlin-3a结合亲和力和N-MdmX/TevP/nutlin-3a复合物的紧凑结构的鼓舞，本申请设计一种多肽-苗头化合物嘔联物的MdmX抑制剂(PHC)。为了证明这一概念，由八个残基组成的TevP肽与具有聚甘氨酸链的nutlin-3a偶链，该PHC简称为Tn3a(图6)。Tn3a的合成分五步完成，包括Boc保护nutlin-3a的哌嗪基团、醇解Boc保护的哌嗪基团、Boc基团的脱保护、受保护的TevP的偶合，以及N-端和侧链残基中所有保护基团的脱保护(图7a至图12b)。

与nutlin-3a、p53p和PMI相比，本申请评估了Tn3a对N-MdmX和N-Mdm2的结合亲和力。通过荧光偏振滴定法检测(图5b)，Tn3a对N-MdmX表现出增强的结合亲和力，Ki为0.75nM(表2)。本申请的数据还显示Tn3a增强了nutline-3a对N-Mdm2的结合亲和力(图5c)，Ki为0.27nM(表2)。表2示出，与PMI、nutlin-3a和p53p相比，Tn3a对MdmX和Mdm2的都具有结合作用。

表2

Tn3a抑制癌细胞的生物学活性

本申请使用具有可通过G418诱导的p53表达的H1299细胞系(H1299p53+)进行了MTT测定。H1299细胞中过表达的Mdm2和MdmX是通过RFP标记的MdmX和Mdm2表达质粒的瞬时转染实现的。将细胞用Tn3a、nutlin-3a(阳性对照)或nutlin-3b(阴性对照)处理48小后，测量它们的细胞生长活力。结果表明，Tn3a对含有过表达Mdm2和MdmX的H1299p53+细胞的细胞活力有显著抑制作用，且抑制呈剂量依赖性。在缺乏Mdm2或MdmX时，经Tn3a处理的细胞中也观察到细胞数量显著且剂量依赖性减少。相比之下，nutlin-3a对过表达Mdm2的细胞表现出强烈的抑制作用，而nutlin-3b在任何测试细胞中均未表现出对细胞活力的抑制。缺乏Mdm2和MdmX的细胞在很大程度上不受Tn3a处理的影响。这些结果暗示Tn3a具有作为Mdm2/MdmX双重抑制剂的作用机制。

接下来，本申请通过抑制MdmX和Mdm2与p53的结合，探讨了Tn3a是否对体内的p53-MdmX/Mdm2信号轴具有特异性。本申请用Tn3a处理表达野生型p53的三种癌细胞系(即HCT116、A549和H164)8小时，并测量p53和p21基因的转录水平。p21的转录在这些细胞系中以剂量依赖性方式增加，这与其转录激活因子p53的积累一致。相反，p53基因本身的转录不受Tn3a处理的影响。上述观察表明Tn3a介导的细胞活力降低严格依赖于p53。数据还表明同时抑制两种过度表达的细胞癌细胞中的Mdm2和MdmX比单独抑制任一蛋白质更有效地减缓或预防癌细胞生长。

实施例1：蛋白质表达和纯化

人MdmX(N-MdmX，氨基酸22-110)和人Mdm2(N-Mdm2，氨基酸22-110)是根据先前描述的方案制备。在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中以组氨酸标签形式制备重组N-MdmX和N-Mdm2蛋白。His标签通过Tev蛋白酶切割去除。纯化后的N-MdmX和N-Mdm2蛋白分别浓缩至0.4～0.8mg/mL，液氮新鲜冷冻，-80℃保存。

实施例2：噬菌体肽库筛选

使用N-MdmX与nutlin-3a复合物对M13噬菌体肽文库(Ph.D.-12，来自美国新英格兰生物实验室)进行生物淘选。His标记的N-MdmX附着在Ni-NTA ELISA板孔，并在4℃下用BSA包被过夜。在nutlin-3a存在下，将噬菌体文库添加到含有N-MdmX的孔中启动淘选实验，通过用含有0.1％浓度的Tween-20的TBS缓冲液洗涤去除未结合的噬菌体，通过用2M甘氨酸-HCl(pH2.2)溶液洗脱结合的噬菌体，然后立即进行中和。洗脱的噬菌体被扩增并用于下一轮淘选。逐步增加Tween-20的浓度(即0.2、0.3、0.4、0.5、0.75和1.0％)，前后重复生物淘选五到六次。从最后三个淘选步骤中随机选择的噬菌体颗粒通过使用通用引物96gIII(NEB)进行DNA测序。使用针对M13蛋白VIII的单克隆抗体，通过ELISA评估所选肽与N-MdmX/nutlin-3a复合物的结合亲和力。

实施例3：15N-1H NMR HSQC滴定

所有NMR光谱均在25℃下在配备三重共振脉冲场梯度探头的Bruker Avance600MHz或800MHz波谱仪上收集。通过与NMR缓冲液交换缓冲液来制备蛋白质样品。蛋白复合物的浓度为0.3～0.4mM。15N-1H HSQC核磁滴定是通过将配体(高浓度)逐步添加到15N标记的N-MdmX(通常浓度为0.1-0.3mM)中进行，最终过量1-2倍。15N-1H HSQC NMR波谱以States-TPPI模式记录，用于正交检测。所有NMR样品均在含有20mM磷酸钠、200mM NaCl、2mMDTT和95％H₂O/5％D₂O(pH6.8)的缓冲液中制备。所有数据集均使用t2中的2048个复点和t1中的128个复点获取，并使用Topspin进行处理，使用NMRViewJ软件包进行图谱显示和分析。

实施例4：蛋白质结晶与优化

使用GRYPHON工作站(ARI，美国)根据6种常见的商业试剂盒筛选蛋白质结晶条件，包括IndexTM、PEGRx和CrystalScreenTM(美国汉普顿)和AmSO₄ Suite、JCSG+Suite和PEGsSuite(Qiagen，美国)。在含有20％(v/v)Tacsimate(pH7.0)、0.1M HEPES(pH7.5)、2％(v/v)聚乙二醇200的条件下，两天内出现金刚石状晶体。

进一步使用坐滴法优化蛋白质结晶。简而言之，1μL蛋白质滴由0.5μL蛋白质样品(10mg/mL)、0.5μL母液组成，液滴在18℃下孵育。此外，用悬浮在浆状母液中的碎针状晶体接种新的母液滴，通过接种方法制备大量的蛋白质晶体，2天后出现钻石状晶体。将晶体转移到含有50％(v/v)储液和25％(v/v)甘油的冷冻液保护，并在液氮中快速冷却。

实施例5：蛋白质晶体学的数据收集和细化

X射线衍射数据由HKL2000在上海同步辐射装置(SSRF)的BL17U1上使用EigerX16M探测器收集，使用Aimless的程序对数据集进行整合和缩放，数据分别由Xia2和MOLREP程序整合和积分，使用蛋白质结构6Q9W和6V4F中的MdmX结构作为N-MdmX的模板，使用CCP4i2软件包中的分子置换-PHASER构建模型，使用CCP4i2软件包中的REFMAC5进行了改进，使用COOT软件手动评估结构。

实施例6：荧光偏振(FP)测定

所有荧光偏振测定均使用黑色、低蛋白结合的96孔板(纽约康宁)进行，每孔总体积为100μL，包含20mM磷酸盐(pH6.8)、200mM NaCl和1mM DTT。将10nM荧光素-p53p(荧光素-GSGSSQETFSDLWKLLPEN、FITC-p53p)与10μM N-MdmX或1nM 5'-荧光素-pMI(5-荧光素-GSGSSTSFAEYWALLSP、FAM-pMI)与30nM N-MdmX预孵育30分钟，然后加入抑制剂，并将混合物再孵育30分钟。使用装有Gen5软件的BioTekH1多板读取器测定FP读数，激发波长为498nm和发射波长517nm。p53p肽和nutlin-3a用作阳性对照。

所有FP数据采用MicroCal Origin 2017中的剂量依赖性药理学模型模拟以获得IC50值，Ki值通过IC50＝Ki(1+[L]/Kd)的公式获得，其中Kd是FITC-p53p或FAM-PMI分别与N-MdmX或Mdm2的结合亲和力。

实施例7：多肽-nutlin-3a偶联物的合成

通过以下步骤将nutlin-3a与TevP肽偶合(图6)。nutlin-3a类似物的分子量用Thermo Scientific LC-MS TSQ Altis^TMPlus三重四极杆质谱仪的测定，多肽类似物的分子量用Bruker Autoflex U3000-Q-Exactive Speed TOF/TOF质谱仪测定。HPLC分析和纯化使用Waters 2459 HPLC系统实施。

制备化合物2：将200μl nutlin-3a(1,10mM)添加到二恶烷和水的1:1混合物中，充分搅拌。用氢氧化钠将溶液的pH调节至9～10后，加入(Boc)2O(0.6984mg,3.2μmol)，将混合物在100～150℃下搅拌孵育12小时。用氢氧化钠校准溶液的pH值至pH＝9～10，溶液在搅拌下孵育24h直至反应完成。在减压下蒸馏溶液以蒸发二恶烷，然后用乙酸乙酯萃取水相两次以纯化化合物2。化合物2的身份通过质谱法确认(图7a)。化合物2的收率和纯度通过HPLC评估(图7b)，收率为94.22％。

制备化合物3：在室温下将化合物2添加到2mL NH₃/MeOH溶液中。将溶液以100～150rpm搅拌3小时。反应完成后，减压蒸发溶剂。在蒸发过程中，间隔加入少量二氯甲烷(DCM)以共蒸发残留溶剂，得到化合物3。化合物3通过质谱法确认(图8a)。化合物3的收率和纯度通过HPLC评估(图8b)，收率为62.84％。

制备化合物4：将化合物3溶解在DCM(0.4mL)中并添加1.6mL三氟乙酸(TFA)，将混合物在室温下搅拌3小时，将溶剂蒸发至干并与DCM共蒸发数次以除去残留的TFA，得到化合物4。将化合物4溶解在乙腈中并使用C18柱(乙腈：水＝9:1)纯化。化合物4通过质谱法确认(图9a)。通过HPLC评估化合物4的产率和纯度(图9b)，产率为45.8％。

制备化合物5：在室温下将化合物4溶解在2ml DCM中并将1.25当量的PyBOP加入溶液中，滴加三乙胺(Et3N)直至溶液的pH值变为9～10，搅拌该溶液过夜活化化合物4的羧基。然后，将1.25eq的侧链保护的TevP多肽类似物加入到溶液中并进行反应4小时。减压蒸发溶剂以获得作为粗产物的化合物5。HPLC对化合物5的收率和纯度进行评价(图10)，收率为82.87％。化合物5分子量通过质谱法确认。

制备化合物6：将TFA(1.6mL)添加到化合物5在DCM(0.4mL)中的溶液中。将溶液在室温下搅拌3小时对化合物5进行脱保护，将溶剂蒸发至干并与DCM共蒸发数次以除去残留的TFA，得到化合物6。通过HPLC评估化合物6的产率和纯度(图11)，收率为53.63％。化合物6分子量通过质谱法确认。

制备化合物7：将哌啶(0.6ml)加入到化合物6在DCM(0.4mL)中的溶液中，反应在室温下进行3小时以除去Fmoc，将溶剂蒸发至干，与DCM共蒸发数次以除去残留的哌啶，并通过制备型C18-反相柱和Waters 2549HPLC纯化，得到化合物7，化合物7的产率和纯度通过HPLC评估(图12a)，收率为65.27％，化合物7分子量通过质谱法确认(图12b)。

制备TevP多肽类似物：三种类型多肽类似物，即TevP-Gly-Gly-Gly-Gly-、TevP-Gly-Gly-Gly-Gly-COOH、TevP-(CH₂)_n-COOH(n＝2-8)、TevP-(C₂H₄)_n-COOH(n＝2-8)，采用常规固相化学多肽合成技术，侧链保护为常规基团，委托第三方商业公司合成，纯度大于98.％，产率均大于85％。

实施例8：实时RT-qPCR反应

用Tn3a处理三种含野生型p53的癌细胞(HCT116、A549和H460)8小时，通过定量PCR测量转录水平的变化，与未处理对照进行比较。使用Trizol方法和Qiagen(德克萨斯州，美国)的

Mini试剂盒提取总RNA，使用Nanodrop 2000c测量RNA的浓度，使用Biorab(中国北京)的BaldStar TaqMan一步式RT-qPCR试剂盒，在BioRad CFX96 qPCR仪器(美国加利福尼亚州)上实施实时qPCR。qPCR的引物和探针是使用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems，美国)设计p21的引物序列为RT-p21-L1(5'-CTTTGTCACCGAGACACCAC-3')和p21-R1(5'-CAGGTCCACATGGTCTTCCT-3')，p21的探针序列为p21-P1(5'-ACTCATCCCGGCCTCGCCGG-3')，p53的引物序列为RT-p53-L1(5'-GTCCAGATGAAGCTCCCAGA-3')和RT-p53-R1

(5'-CAAGAAGCCCAGACGGAAAC-3')，p53的探针序列是p53-P1(5'-AGCTCCTACACCGGCGGCCC-3')，TaqMan探针用5-FAM和3-TAMRA标记，所有引物和探针均由金斯瑞(中国南京)合成。

实施例9：MTT法分析细胞增殖

使用含野生p53基因诱导型的H1299细胞，在Synergy H1多板阅读器(Biotek，美国)上进行MTT测定，p53蛋白融合有GFP蛋白标记，通过转染含有编码Mdm2或MdmX和RFP蛋白标记的全长基因的pCMV质粒实现Mdm2和MdmX过表达，细胞在Dulbecco改良培养基培养3天，该培养基添加10％血清、青霉素和链霉素(37℃和5％CO₂)然后用添加了3％FBS的RPMI1640更换培养基，细胞以1×10⁴/cm²的密度接种，2小时后，加入Tn3a、nutlin-3a和nutlin-3b24小时，添加10μl/孔MTT(5mg/ml)溶液后，将细胞在37℃的CO₂培养箱中再培养4小时，弃去上清液，用PBS洗涤细胞，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，在平板振荡器上摇动平板10分钟，然后在520nm处读取OD值，使用MicroCal Origin软件(v2017，MicroCal，美国)处理数据。

实施例10：蛋白质印迹分析

使用含有50mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton-X100、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS和0.1％蛋白质抑制剂混合物的RPMI裂解缓冲液收集和提取细胞，首先用Nanodrop-2000c在OD 280nm测量蛋白质提取物的浓度，然后用来自Proteintech(中国武汉；Cat#：HRP-60008；基因ID60)的小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体校准细胞-肌动蛋白含量，100g/ml)，稀释比为1:10000。用SDS-PAGE分离校准的蛋白质样品，同时使用标准分子量对比，每个SDS-PAGE凝胶都电转移到聚二氟乙烯膜(PVDF，Millipore，美国)，在室温下用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭每个PVDF膜1小时，然后分别与相应的一抗孵育2小时，用TBST缓冲液洗涤3次后，将膜与HRP标记的二抗孵育1小时，使用BioSharp(中国北京)的增强化学发光(ECL)试剂在Tanon 5200 Chemiliminescent Imager成像仪(中国上海)上检测PVDF膜上的蛋白质条带，重复每个印迹，直到获得高质量的图像。

用CUSABIO(德克萨斯州，美国；目录号：CSB-PA15509AORB，批号：F0912A)的兔抗TP53多克隆抗体IgG以1:4000的稀释比对细胞p53蛋白进行印迹；用Solarbio(中国北京；目录号：K20016M)的小鼠抗RFP单克隆抗体以1:10000的稀释比测定RFP标记的细胞Mdm2和MdmX蛋白；使用Elabscience(中国武汉；目录号：E-AB-40097)的兔抗p21多克隆抗体以1:500的稀释比检测细胞p21蛋白；用Beyotime(中国上海；目录号：AF1204；基因ID27113)的兔抗人PUMA单克隆抗体检测细胞PUMA蛋白，稀释比为1:1000；二抗使用稀释比为1:10000的HRP偶联山羊抗兔IgG(H+L)或HRP偶联山羊抗小鼠IgG(H+L)(Biosharp，中国广州；目录号：BL001A，0.8mg/ml)。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (6)

1.一种Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，所述Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂的结构为多肽-链接-小分子，其中，所述多肽的序列为NH₂-Asp-Leu-Glu-Aln-Leu-Tyr-Phe-Gln-COOH。

2.根据权利要求1所述的Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，其中，所述链接为-Gly-Gly-Gly-Gly-。

3.根据权利要求1所述的Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，其中，所述链接为-(CH₂)_n-，n＝2-8。

4.根据权利要求1所述的Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，其中，所述链接为-(C₂H₄)_n-，n＝2-8。

5.根据权利要求1所述的Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂，其中，所述小分子为：

6.根据权利要求1至5中任一项所述的Mdm2/MdmX多肽类似物双抑制剂在制备治疗癌症的药物中的应用。

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