CN116350650A - 一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用。本发明中所述的核酸制剂包括至少一种能够抑制转化生长因子β1活性的第一核酸分子和至少一种能够抑制C氧化酶亚基II活性的第二核酸分子。本发明首次提出一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用，提供一种重塑或修整脂肪组织方法新思路，在由代谢紊乱等引起的有害脂肪组织重塑的患者中作为一种治疗方法可获得与现有技术同样的效果。

Description

一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用。
背景技术
由代谢紊乱、过度饮食和肥胖导致的重塑包括基质血管部位的各种细胞变化。体瘦者的脂肪组织主要由M2巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、调节性T细胞(Treg)和抑制炎症的先天淋巴细胞(ILC)组成。肥胖者的脂肪组织特征是B细胞和各种T细胞(即NK和Th1细胞)的浸润、M1巨噬细胞的极化以及Treg和ILC的减少，导致炎症增加和相关胰岛素抵抗。促炎细胞因子增加了促纤维化细胞(如ECM生成细胞)和炎症免疫细胞。
肿胀抽脂术始创于1987年，此后成为皮下脂肪组织去除术中的金标准。从那时起，许多无创和抽脂术替代酯解疗法被开发出来，包括射频、高强度聚焦超声(HIFU)、冷冻脂肪分解、非热超声和注射脂肪分解。注射脂肪分解是一种非侵入性过程，用于消除体内不需要的脂肪组织。现有重塑或修整脂肪组织方式难度高、成本高，大众接受度较低，很难推广开来。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用，所述的核酸制剂包括至少一种能够抑制转化生长因子β1(TGF-β1)活性的第一核酸分子和至少一种能够抑制C氧化酶亚基II(Cox-2)活性的第二核酸分子。
优选地，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子独立地为siRNA、shRNA或miRNA。
进一步优选地，siRNA、shRNA或miRNA分子包含偶联(共轭)分子。
优选地，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的链长独立地为17～30个核苷酸，例如17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸。
进一步优选地，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的链长独立地为24～28个核苷酸。
进一步优选地，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的链长至少为25个核苷酸及以上。
优选地，所述的第一核酸分子为能够与编码转化生长因子β1(TGF-β1)的mRNA相结合的siRNA；所述的第二核酸分子为能够与编码细胞色素C氧化酶亚基II(Cox2)的mRNA相结合的siRNA。
根据一种具体且优选地实施方式，所述的第一核酸分子有义链为：5’-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3’。
根据一种具体且优选地实施方式，所述的第二核酸分子有义链为：5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’。
优选地，所述的核酸制剂还包括用于递送所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的药学上可接受的载体。
进一步优选地，所述的载体包括含有至少一个组氨酸残基和至少一个赖氨酸的多肽聚合物。
再进一步优选地，所述的载体包括HKP和/或HKP(+H)。
优选地，所述的核酸制剂为纳米颗粒制剂。
进一步优选地，所述的纳米颗粒粒径为约100～400nm。
优选地，所述的核酸制剂通过皮内注射或静脉系统给药。
进一步优选地，所述的脂肪组织为由代谢紊乱、肥胖和过度进食所引起的有害脂肪组织。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是一种序列特异性RNA降解过程，提供了一种相对简单而直接的敲除或沉默基因表达的方法。在自然发生的RNA干扰中，双链RNA被RNase III/解旋酶蛋白Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)分子，即19-23个核苷酸(nt)的双链RNA、在3'端有2个核苷酸突出结构的序列。这些siRNA被整合到名为RNA诱导沉默复合体(RISC)的多组分核糖核酸酶中。siRNA中的一条链保留在RISC内，并将复合物引导并结合到序列与RISC中的引导单链RNA(ssRNA)互补的同源RNA上。RNA被这种siRNA介导的核酸内切酶消化并失活，即为RNA沉默现象。研究表明，使用化学合成的21-25nt长度的siRNA在哺乳动物细胞中也表现出RNAi效应，其中siRNA双链之间(末端或中间)的热力学稳定性对分子功能有重要影响。
目前还无法很准确地预测，在众多潜在靶向疾病基因mRNA的候选siRNA中，哪些能真正表现出有效的RNAi活性。特定的候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列必须在哺乳动物细胞中进行测试，才能确定是否产生了对目标基因表达的预期干扰。siRNA的独特优势使得在治疗中联合使用多个双链siRNA组合靶向多个致病基因成为可能，因为所有siRNA双链在化学上都是同质的，具有相同的来源和相同的制造工艺。
多靶标siRNA组合物
本公开内容涉及一种组合物，其中靶向促炎因子TGF-β1的siRNA和炎症促进剂Cox-2的siRNA是必需的。
进一步地，将此类双链siRNA配制成针对多个基因的多靶标siRNA组合物。进一步地，本发明提供了一种治疗方法，用于改善和治疗那些因代谢紊乱、肥胖和过度进食所引起的脂肪组织重塑患者。
本发明公开了应用RNAi技术重塑或修整患者脂肪组织的方法，所述方法通过给予有效剂量的纳米颗粒制剂给药，所述纳米颗粒制剂包含(i)至少一种抑制转化生长因子β1(TGF-β1)活性的siRNA或其他核酸和至少一种抑制细胞色素c氧化酶亚基II(Cox-2)的siRNA或其他核酸；(ii)组氨酸-赖氨酸多肽聚合物，例如HKP和/或HKP(+H)。纳米颗粒制剂可以局部给药，例如通过皮内注射，或通过系统给药。
优选地，所述siRNA或其他核酸的寡核苷酸链长度为至少25个核苷酸。
所公开的实施例描述了一种核酸，所述核酸可以是双链寡核苷酸的小干扰RNA(siRNA)分子，所述寡核苷酸靶向目标单链RNA分子中的互补核苷酸序列。所述目标单链RNA分子是一种至少编码部分肽或蛋白质的mRNA，所述肽或蛋白质具有促进炎症、创伤愈合或皮肤组织疤痕形成的活性；或是作为调节分子发挥作用的微RNA(miRNA)分子，所述微RNA具有促进炎症、脂肪组织重塑、创伤愈合或皮肤组织疤痕形成的活性。
将所述分子加入到合适的药用载体中，可得到用于受试者给药的组合物。在一个实施例中，组合物包含合适的药用载体和至少两种siRNA分子，所述的siRNA分子与mRNA分子结合，所述的mRNA分子编码影响脂肪组织重塑的不同代谢途径的基因。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明首次提出一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用，提供一种重塑或修整脂肪组织方法新思路，在由代谢紊乱等引起的有害脂肪组织重塑的患者中作为一种治疗方法可获得与现有技术同样的效果，且操作简单，顺应性好，仪器等成本降低。
附图说明
图1显示了TGF-β1siRNA和Cox-2siRNA的有义链序列，以及不同动物中的相同基因序列。TGF-β1siRNA和Cox-2siRNA序列在人类、小鼠和猴子的基因序列保持一致。除了有一个核苷酸(C-U)在猪的TGF-β1基因序列中不同，其他均相同。猪的Cox-2siRNA基因序列也与人、小鼠和猴子保持一致。
图2显示了病变的皮肤癌细胞呈剂量依赖性方式得到消除。STP705的用药使患者皮肤疤痕基本或完全得到修复，这对于外形的美观非常重要，因为这类病变经常发生在如面部和颈部这样的外露部位，当前治疗手段(手术等疗法)非常容易在这些部位产生疤痕。
图3显示了在给予包含HKP的siRNA纳米颗粒制剂(称为STP705的组合物)后，对靶基因的基因沉默效应，以及对包括α-SMA、Col1A1和Col3A1在内的选择靶标的下游效应(Zhou,et al.Oncotarget.2017；8(46):80651-80665.)。
图4显示了患者给药STP705后TGF-β1蛋白表达显著降低。所有治疗患者都提供了组织样本，应用免疫组织化学技术对患者组织样本的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。
图5显示了患者给药10～30μg的STP705后Cox-2蛋白表达降低。所有治疗患者都提供了组织样本，应用免疫组织化学技术对患者组织样本的蛋白表达情况进行分析，并由具备资质的病理学医生组成的委员会进行半定量评估。
图6所示为20P-SNC-001猪皮肤的平均组织病理学评分。结果以组平均值±均值标准误差表示。在接受测试的所有分组中均可见肉芽肿炎症和纤维化/纤维增生(图中右侧部分)；在STP705高剂量组(200μg/ml)中，这两个特征的分值最高，而在动物中给予单独的TGF-β1siRNA，其平均分普遍较低。浅表皮肤/表皮炎症和结痂形成很轻微(图中左侧部分)，这似乎与动物个体差异有关，而不是受给药的试验品影响。
图7所示为20P-SNC-001猪皮肤的角质层下平均脂肪测量。结果以组平均值±均值标准误差表示。使用STP705、单独的TGF-β1siRNA和NS siRNA，可发现皮肤与最浅表筋膜层之间的脂肪厚度减少；上述现象与样本脂肪坏死的纤维化和炎症相关。在这项研究中，表皮下脂肪的全厚度变化更大。
图8显示两只动物经过不同处理后不同区域/位点的H&E染色结果。(a)动物1001，未处理区域，皮肤位点2，未处理皮肤的捕捉区域显示真皮(图中D)和角质层下脂肪(SC)的正常形态。三角箭头表示最浅表的角质层下筋膜面。(b)动物1001，区域3，位点B(STP705，200μg/ml)皮肤，SC表示筋膜表面的角质层下脂肪(三角箭头)变窄，包含多个区域的肉芽肿性炎症、坏死脂肪(黑色实线箭头)和纤维化(虚线+箭头)，D代表真皮层。(c)动物1001，区域4，位点A(NS siRNA对照，相当于200μg/ml剂量)皮肤，与区域3(b)相似，表层(筋膜上方；三角箭头)角质层下脂肪(SC)轻微变窄，含有肉芽肿炎症(实线+箭头)和纤维化(虚线+箭头)，D代表真皮层。(d)动物2001，未处理区域，皮肤位点2，该区域未经治疗的皮肤组织学上无明显变化。图中D代表真皮，SC为角质层下脂肪，三角箭头所指为最浅表筋膜层。(e)动物2001，区域3，位点A(单独的TGF-β1siRNA，100μg/ml)，角质层下脂肪出现肉芽肿炎症区域(实线+箭头)，周围有少量的胶原沉积/纤维化。图示三角箭头代表浅表筋膜层，D代表真皮。(f)动物2001，区域4，位点A(NS siRNA对照，相当于100μg/ml剂量)，角质层下脂肪(SC)可见一小块肉芽肿性炎症(实线+箭头)伴纤维化(虚线+箭头)，该层轻微变窄。图示三角箭头代表浅表筋膜层，D代表真皮。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
发明内容详细说明
本发明提供了治疗由饮食诱导产生的脂肪组织代谢紊乱的方法。
根据实施例，所述方法包括向患者给予至少一种抑制TGF-β1活性的siRNA和至少一种抑制Cox-2活性的siRNA。进一步的，将siRNA与含组氨酸-赖氨酸多肽聚合物，例如HKP和/或HKP(+H)，一起制备成纳米颗粒制剂。所述制剂可以通过皮内注射给药或通过静脉(全身)给药。
TGF-β1在肥胖的发病机制中起了重要作用，影响炎症介质的释放，促进脂肪组织的重塑和胶原沉积(Sousa-Pinto,et al.J.Nutro.Biochem.2016；38:107-15.)。由于沉积物增加和细胞外基质(ECM)的降解或新陈代谢减少，以及ECM纤维的交联增加和硬化，饮食过度能引起脂肪组织的负向重塑。这些因素最终导致脂肪细胞功能障碍、脂肪生成能力降低和纤维化。以上各因素都可能影响全身代谢功能障碍，例如2型糖尿病和心血管并发症(Jones,et al.Sci Rep.2020；10:2380.)。
代谢紊乱、过度饮食和肥胖导致的重塑包括基质血管部位的各种细胞变化。体瘦者的脂肪组织主要由M2巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、调节性T细胞(Treg)和抑制炎症的先天淋巴细胞(ILC)组成。肥胖者的脂肪组织特征是B细胞和各种T细胞(即NK和Th1细胞)的浸润、M1巨噬细胞的极化以及Treg和ILC的减少，导致炎症增加和相关胰岛素抵抗。促炎细胞因子增加了促纤维化细胞(如ECM生成细胞)和炎症免疫细胞。
我们前期研究表明，TGF-β1siRNA和Cox-2siRNA可以诱导T细胞渗透到特定区域，引起基因沉默和胶原蛋白表达减少(Zhou,et al.Oncotarget.2017；8(46):80651-80665.)。这些观察结果有助于解释为什么更高剂量的STP705能使受试患者的组织重塑。Jones等人(2017)证实，在20和34周高脂肪饮食后，脂肪细胞上调了小鼠体内的几个ECM相关基因，包括TGF-β1、inhba(抑制素βA)、itga5(整合素α5)和ctgf(结缔组织生长因子)，胶原蛋白(collal和col6a3)、弹性蛋白(eln)、纤连蛋白(fn1)和其他TGF-β家族成员。与Wnt信号相关的基因表达也升高；研究显示Wnt信号在真皮纤维化中发挥了一定作用。TGF-β1通过信号传导或转录因子途径进一步调节基因表达，包括SMAD、JNK、ERK和MRTFA/SRF。MRTFA被认为是通过促进纤维生成而不是脂肪生成，在饮食诱导的脂肪组织代谢失调中发挥作用。
我们证实了将siRNA同时递送至细胞内，可使TGF-β1和Cox-2基因沉默，并诱导人成纤维细胞凋亡。将HKP与siRNA制成纳米颗粒，可保护siRNA在体内给药时不被降解，还可以同时将两种siRNA摄入到同一细胞中。用HKP作为载体将siRNA递送到人类增生性疤痕中，可使增生性疤痕显著减小。进一步地，这一药物治疗缩小了移植到小鼠皮下的人类皮肤移植物的大小，其机理是药物的抗纤维化作用。该应用纳米颗粒制剂解决创伤愈合和疤痕组织消退的方法已经通过美国专利申请US20200392507公开和发表。
随着研究的深入，我们发现针对TGF-β1和Cox-2的siRNA疗法似乎可模拟脂肪组织重塑效果，在患有由代谢紊乱等引起的有害脂肪组织重塑的患者中作为一种治疗方法可获得与现有脂肪组织消除或重塑方法同样的效果。
根据本发明，siRNA靶向结合两个靶基因TGF-β1和Cox-2，使两个靶基因沉默，可缓解或治疗由于过量饮食、肥胖和/或其他代谢紊乱，如2型糖尿病和心血管疾病所引起的有害负向重塑的脂肪组织，使之得以重塑或修整。在一些实施例中，将siRNA或其他核酸分子与含有至少一个组氨酸残基和至少一个赖氨酸残基的多肽聚合物组合制备成纳米颗粒制剂。优选地，在一些实施例中，所述多肽聚合物是HKP或HKP(+H)。
根据本发明的实施例，STP705包括TGF-β1siRNA和Cox2 siRNA的有义链序列，以及不同动物中的相同基因序列，如图1所示。TGF-β1的siRNA序列除了有一个核苷酸(C-U)在猪的TGF-β1基因序列中不同，在人类、小鼠和猴子的基因序列保持完全一致。而Cox-2的siRNA序列在人类、小鼠、猴子和猪的基因序列保持完全一致。
如图2所示，病变的皮肤癌细胞以剂量依赖性方式消除。STP705的用药使患者皮肤疤痕基本或完全得到修复，这对于外形美观非常重要，因为这类病变经常发生在如面部/颈部这样的外露部位，当前治疗手段(手术或刮除术和电干燥)非常容易在这些部位产生疤痕。
如图3所示，将包含HKP的siRNA纳米颗粒制剂(STP705)给药导致靶基因沉默以及对包括α-SMA、Col1A1和Col3A1在内的选定靶标的下游效应(Zhou,etal.Oncotarget.2017；8(46):80651-80665.)。
如图4所示，在早期研究中STP705用药可使鳞状细胞癌患者的TGF-β1蛋白表达显著降低。如图5所示，10～30μg的STP705用药可使患者的Cox-2蛋白表达降低。
本发明中，所述的核酸或核酸分子可以是小干扰RNA(siRNA)分子，包括双链寡核苷酸，其中寡核苷酸以序列完全互补的方式靶向特定单链(ss)靶RNA分子。ss靶标RNA分子是至少编码部分肽或蛋白质的mRNA，所述肽或蛋白质具有促进炎症、脂肪组织重塑或修整、创伤愈合或皮肤组织疤痕形成的活性；或是作为调节分子发挥作用的微RNA(miRNA)，具有促进炎症、脂肪组织重塑或修整、创伤愈合或皮肤组织疤痕形成的活性。在一些实施例中，以这样的方式制备得到的siRNA序列，可以靶向和抑制至少来自于人和小鼠，或非人灵长类动物的相同基因。在另一些实施例中，siRNA分子以100％、或少一些的互补性与mRNA分子结合，所述miRNA分子编码至少一种蛋白质。在另一些实施例中，siRNA分子与编码至少一种人蛋白质的mRNA分子结合。在另一些实施例中，siRNA分子结合人mRNA分子和同源小鼠mRNA分子，即编码各自物种中相同或相似蛋白质的mRNA。
在一些实施例中，siRNA分子或其它核酸的长度为19-27个核苷酸碱基对；在另一些实施例中，siRNA分子或其它核酸的长度为20-30个碱基对；在另一些实施例中，siRNA分子或其它核酸的长度为24-28个碱基对。所述核酸分子可以在两端具有平末端，或者在两端具有黏性末端，或者各具其一。siRNA分子可能包括单个核苷酸水平或寡核苷酸骨架水平的化学修饰，也可能没有修饰。
本发明中，所述核酸制剂加入到合适的药用载体中，得到可用于受试者给药的组合物。优选地，受试者是人类。
在一些实施例中，组合物包含合适的药用载体，以及至少两种siRNA分子，其中每种siRNA分子结合一种mRNA分子，所述mRNA分子编码的基因选自于促炎途径基因、促血管生成途径基因和促细胞增殖途径基因。在另一个实施例中，每种siRNA鸡尾酒包含至少三个不同的靶向基因序列的siRNA双链。优选地，每个基因选自不同的信号通路。包含多种siRNA分子混合物的组合物可称为“鸡尾酒”。
本发明中，公开的实施例提供了用于增强siRNA鸡尾酒递送到疾病组织和细胞中的药学上有效的药用载体，即药学上可接受的载体。
本发明中，药学上可接受的载体包含一种或多种成分，选自于盐溶液、糖溶液、聚合物、脂质、乳膏、凝胶或胶束材料。进一步地，具体包括聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物和配体官能化亲水聚合物接枝聚合物、可生物降解的聚酯，例如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸，PGA)和聚(乳酸-乙醇酸共聚物，PLGA)、PEG-PEI(聚乙二醇和聚乙烯亚胺)，聚精胺(Spermidine)和聚酰氨基胺(PAMAM)树枝状聚合物。
根据实施例，载体是组氨酸-赖氨酸共聚物，可形成包含siRNA分子的纳米颗粒，其中纳米颗粒粒径为约100-400nm，用甲基纤维素凝胶制备成局部给药的制剂。
本发明中，药用载体是指治疗药物给药时所用的载体，典型的载体包括盐溶液、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。对于口服给药的药物，药用载体包括但不限于药用赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，玉米淀粉和褐藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可能包括淀粉和明胶，如果有润滑剂，通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以按需使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之类的材料包衣，以延缓在胃肠道中的吸收。所述公开的dsRNA组合物的药用载体可以是胶束结构，例如脂质体、衣壳、聚合物纳米胶囊或聚合物微胶囊。
聚合物纳米胶囊或微胶囊可帮助封装或结合的dsRNA转运释放到细胞中。它们含有聚合物和单体材料，特别是含有聚氰基丙烯酸丁酯。关于材料和制造方法的概述已经发表(Kreuter et al.,U.S.patent application Ser.No.08/203,326and PCT/EP 95/00724corresponding to WO95/22963.)。在聚合过程/纳米颗粒生成步骤中，由单体和/或低聚前体合成的聚合物材料本身是现有技术已知的，制备纳米颗粒的技术人员可根据通常的技能合理地选择聚合物材料的分子量和分子量范围。
本发明中，siRNA分子可通过以下步骤进行鉴定：
1)设计一组siRNA双链分子，用于靶向单链RNA分子中的互补核苷酸序列，其中所述siRNA分子的靶向链包含多种核苷酸序列；
2)选择对所述靶分子表现出最高体外预期活性的siRNA分子；
3)在动物伤口模型中评估选定的siRNA分子；
4)选择在模型中表现出最好药效的siRNA分子。
可以将药用载体和经步骤(2)选定的每个siRNA分子混合到一起以形成药物组合物，在动物伤口模型中评估每种药物组合物的效果。由于靶向基因可能在疾病组织的不同细胞类型中表达，因此siRNA鸡尾酒的药效需要在细胞和动物疾病模型中都得到测试和确认。优选地，选用siRNA鸡尾酒进行治疗，其治疗收益优于单个siRNA的治疗收益。
成功的siRNA介导疗法不但取决于对靶标的识别和活性siRNA分子序列的鉴定，还取决于能否有效地将siRNA递送至体内的靶组织和细胞中。
本发明中，术语“siRNA”是指双链核苷酸，其中每条链包含RNA类似物或RNA和DNA。通常siRNA的反义链可与指定的靶序列充分互补。
双链RNA(dsRNA)分子也可与其它已知治疗手段相组合以治疗、抑制、减少或预防受试者或生物体中的有害脂肪重塑。
本发明中，实施例中的双链RNA制剂可缀合(例如，在其5'或3'末端的正义或反义链的末端)或不缀合其他的官能团(例如，非核酸官能团如肽)，或有机化合物(例如染料，胆固醇等类似物)。与相应的未缀合双链RNA制剂相比，以上述方式改性的双链RNA制剂可以改善或增强所得双链RNA制剂衍生物的细胞靶向活性，改性的双链RNA制剂也可用于追踪细胞中的双链RNA制剂衍生物或改善其稳定性。
本发明中，术语“核酸”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或修饰的核苷酸和聚合物。该术语囊括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键合的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸类似的结合性质和代谢方式。这些类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、手性-甲基膦酸盐、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)和非锁核酸(UNA，Jensen et al.Nucleic AcidsSymposium Series52:133-4)及其衍生物。
本发明中，“核苷酸”包括了作为本领域公认的天然(标准)碱基，以及本领域所熟知的改性碱基。这种碱基通常位于核苷酸糖官能团的1'位置。核苷酸通常包含一个碱基、一个糖基和一个磷酸基团。可以在核苷酸的糖基、磷酸基和/或碱基上实施非修饰或修饰(也可互换作为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸和其它核苷酸，Usman and McSwiggen,supra；Eckstein,et al.,International PCT Publication No.WO92/07065；Usman et al,International PCT Publication No.WO 93/15187；Uhlman&Peyman。在此所有内容通过引用而全部并入)。若干实施例中，存在本领域已知的核酸碱基修饰(参见Limbach等，Nucleic Acids Res.22:2183,1994.)。在一些非限制性实施例中，可将碱基修饰引入核酸分子中，包括次黄嘌呤、嘌呤、吡啶-4-1、吡啶-2-1、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿素、萘基、氨基苯基、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基脲嘧啶(例如，核糖胺酰胺)、5-卤啶(例如，5-溴脲)或6-氮杂吡啶或6-烷基吡啶啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔和其它(Burgin,et al.,Biochemistry 35:14090,1996；Uhlman&Peyman，如前述)。在这方面，“改性碱基”的意思是指在1'位置或其等价物除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基。
本发明中，“修饰的核苷酸”是指涉及对核苷、核酸核苷、戊糖环或磷酸基团的一种或多种修饰的核苷酸。例如，修饰的核苷酸排除那些包含一磷酸腺苷、一磷酸鸟苷、一磷酸尿苷、一磷酸胞苷的核苷酸，以及包括脱氧一磷酸腺苷、脱氧一磷酸鸟苷、脱氧一磷酸胸苷和脱氧一磷酸胞苷的脱氧核糖核苷酸。修饰包括那些天然存在的由核苷酸修饰酶例如甲基转移酶促进的修饰。修饰核苷酸还包括合成或非天然存在的核苷酸。核苷酸的合成或非天然发生的修饰包括2'修饰，例如2'-甲氧基乙氧基、2'-氟、2'-烯丙基、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基]、4'-巯基、4'-CH2-O-2'-桥、4'–(CH2)2-O-2'-桥、2'-LNA或其他双环或“桥接”核苷类似物，以及2'-O-(N-甲基氨基甲酸酯)或含碱基类似物。
本发明中，所述的2'-修饰的核苷酸，“氨基”的意思是指2'-NH2或2'-O-NH2，可以进行修饰或不进行修饰。这些修饰的基团在以下文献中被描述，例如Eckstein et al.,U.S.Pat.No.5,672,695和Matulic-Adamic et al.,U.S.Pat.No.6,248,878。本发明所公开实施例中的“修饰的核苷酸”还可以包括如上所述的核苷酸类似物。
本发明中，所述的核酸分子，这些分子可以对标准的双链核糖核酸(dsRNA)的一条或两条链进行修饰。
抗TGF-β1siRNA或抗Cox-2siRNA是至少具有25个核苷酸的双链RNA分子。在某些实施例中，siRNA的第一和第二寡核苷酸序列或其它核苷酸存在于分开的寡核苷酸链上，这些寡核苷酸链是可以且通常能被化学合成的。在实施例中，两条链核苷酸的长度为25个核苷酸，是完全互补且具有平末端的结构。在实施例中，抗TGF-β1的siRNA或抗Cox-2的siRNA存在于分开的RNA寡核苷酸(链)。在一些实施例中，一种或两种寡核苷酸链能够被作为Dicer酶的底物。在其他实施例中，至少存在一种可促进Dicer酶结合双链RNA结构的修饰，使在抑制基因表达方面，双链RNA的结构有效性得以最优化。在某些实施例中，抗TGF-β1siRNA或抗COx-2siRNA制剂由两个不同长度的寡核苷酸链组成，其中在第一链(正义链)3'末端具有一个平末端和第二链的3'末端(反义链)具有一个3'悬垂突出末端。siRNA还可以含有一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)碱基对核糖核酸进行替换。
合适的siRNA组合物含有两个单独的寡核苷酸，两者可以通过化学连接基团在其退火区域外部实现连接。本领域中，拥有许多已知的可用并合适的化学链接基团。所谓合适的基团，是指它不会阻断Dicer酶结合siRNA的活性，也不会干扰siRNA对从靶基因转录出来的RNA的定向破坏。或者两个单独的寡核苷酸可以通过第三寡核苷酸连接，以使得构成siRNA组合物的两种寡核苷酸在退火后产生发夹结构。发夹结构不会阻断Dicer酶结合siRNA的活性，不会干扰siRNA对从靶基因转录出来的RNA的定向破坏。
本发明中，双链RNA分子可直接添加，或可与脂质(例如阳离子脂质)复合，包裹在脂质体内，或以其他方式递送至靶细胞或组织。核酸或核酸复合物，无论是否结合到生物聚合物中，都可以通过立体方式应用到皮肤上，或者通过透皮应用或注射，实现在体内外相关组织局部给药。
根据特定的靶基因序列和递送的双链RNA材料的剂量，该方法可以引起靶基因功能部分或完全的丧失。比如，靶细胞表达的减少或丧失(靶基因表达或编码的多肽表达)是指至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高程度的降低。靶基因水平或表达的抑制是指在靶基因水平或靶基因编码蛋白的缺失(或可观察到的降低)。特异性是指抑制靶基因的能力而不对细胞的其他基因展现出效应。通过检查细胞或生物的外部性质，或通过RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、微阵列监测基因表达、抗体结合，酶联免疫测试、Western印迹体结合、放射免疫测定(RIA)和荧光活性细胞分析(FACS)等生化技术，可以证实抑制的效果。本发明所公开实施例的双链RNA制剂对靶基因序列的抑制效果，还可以通过测试双链RNA制剂对靶基因相关疾病或失常的发展或进程的影响，例如由于肥胖、营养过剩或代谢紊乱以及肿瘤的形成、生长、转移等导致的体内外有害脂肪组织重塑。
在一些实施例中，包含了一种dsRNA药物的组合物。dsRNA药物样品配制成合适的制剂，通过任何方式进入细胞环境中，所述的方式应该允许足够量的样品进入细胞以诱导基因沉默。许多dsRNA制剂是本领域的已知技术，因此可以用于dsRNA进入靶细胞以使其起效。可参见美国公开专利申请号2004/0203145A1和2005/0054598A1。例如，所公开实施例的dsRNA药物可以配制在如磷酸盐缓冲盐溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。dsRNA药物与阳离子脂质组合物制剂可促进dsRNA药物转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质，如lipofectin(美国专利号5,705,188)，阳离子甘油衍生物，聚阳离子分子，如聚赖氨酸(公开PCT国际申请WO 97/30731)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，所述这些试剂根据制造商的说明书进行操作。
将药物组合物配制成可用于预期给药途径的制剂。给药途径包括肠胃外，例如静脉、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下的药物溶液或悬浮液可包括以下成分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸等；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及张力调节剂，如氯化钠或葡萄糖。pH值可以用酸碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外给药制剂可以封装在安瓿、一次性注射器、玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于注射给药的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性药物)或分散体和临用时制备成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL.，BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流动和易于注射的。它在制造和储存条件下应该是稳定的，必须能够防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用诸如卵磷脂之类的包合、通过控制分散剂所需粒度、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来控制微生物生长繁殖。在许多情况下，组合物还可以包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可以通过在组合物中加入延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将一定量的活性化合物按需加入到上述列举的一种或多种成分的选定溶剂中，然后除菌过滤来制备。分散体一般是通过将活性化合物加入到无菌载体制备得到，所述载体包括基本的分散介质和来自上文列举的其他成分。供注射用无菌粉末，优选的制备方法有真空干燥和冷冻干燥，得到的粉末中含有活性成分及任何来自上述无菌过滤溶液的成分。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。对于口服给药途径，活性化合物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊剂例如明胶胶囊的形式给药。还可以使用用于漱口水的液态载体来制备口腔组合物。组合物中还可以加入药学相容的粘合剂和/或佐剂材料。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖等；崩解剂如海藻酸、Primogel(普拉莫胶)、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香精。
全身给药也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中加入适合带渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的，包括例如用于经粘膜给药的清洗剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂给药。对于透皮给药，将活性化合物制备成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
化合物还可以通过本领域已知的转染或感染方法给药，包括但不限于以下文献所描述的方法：McCaffrey,et al.Nature.2002；418(6893):38-39(hydrodynamictransfection)；Xia,et al.Nature Biotechnol.2002；20(10):1006-1010(viral-mediated delivery)；Putnam(1996),Am.J.Health Syst.Pharm.53(2),151-160。
化合物也可以通过适合核酸药物，例如DNA疫苗给药的方式给药。这些方法包括基因枪、生物注射器和皮肤贴片以及无针方法，例如美国专利号6194389中公开的微粒DNA疫苗技术，以及美国专利号6168587中公开的哺乳动物经皮无针接种粉末形式疫苗。此外，如Hamajima等人所述，鼻内递送也是可能的(Hamajima,et al.Clin ImmunolImmunopathol.1998；88(2):205-210.)。还可以使用脂质体(例如美国专利号6472375中所述)和微囊化技术。还可以使用可生物降解的靶向微粒递送系统(例如美国专利号6471996中所述)。
在一个实施例中，活性化合物与旨在保护化合物从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可使用生物降解、生物相容性的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可使用标准技术制备。这些材料也可以从商业公司Alza Corporation(阿尔扎公司)和NovaPharmaceuticals,Inc.获得。脂质体悬浮液(包括靶向感染细胞的具病毒抗原单克隆抗体的脂质体)也可以用作药用载体。以上均可通过本领域技术人员已知的方法来制备，例如美国专利号4,522,811中所述。
可利用从细胞培养测试和动物研究中获得的数据，制定人用的剂量范围。这些化合物剂量最好在血浆循环浓度的范围内，该血浆循环浓度包括少毒或无毒的ED50浓度。根据所用的剂型和采用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于所公开实施例的方法中使用的化合物，可以从最初的细胞培养测试中估计治疗有效剂量。在动物模型中，制定的剂量可以确定包括IC50(即可抑制一半症状所需的最大测试化合物的浓度)的血浆循环浓度范围，正如在细胞培养测试中一样。这些信息可用于更准确地确定人用有益剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中化合物的水平。
如本文所定义，核酸分子的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的核酸。例如，在约1pg至1000mg的范围内，可以施用单剂量的双链RNA(或，例如，用于这种双链RNA的载体)；在一些实施例中，可以施用10、30、100或1000pg，或10、30、100或1000ng，或10、30、100或1000pg，或10、30、100或1000mg。在一些实施例中，可以施用1-5g组合物。组合物可以每天施用一次或每天多次施用或每周施用一次或每周多次或每隔一天施用一次。熟练的技术人员将意识到某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或失常的严重程度、既往治疗、受试者的一般健康程度和/或年龄、以及其他存在的疾病情况。此外，通过有效剂量的核酸(例如双链RNA)、蛋白质、多肽或抗体来治疗受试者，可包括单一治疗，或者最好包括一系列治疗。
显然，将双链RNA引入细胞环境中的方法取决于细胞的类型和组成细胞的环境。例如，当细胞处于液体环境时，用脂质制剂如一种最优制剂lipofectamine，可以将双链RNA直接加入含细胞的液体环境中。脂质制剂也可以施用于动物，例如通过静脉内、肌肉内或腹膜内注射，或口服、吸入、或通过本领域已知的其他方法给药。当制剂适合于施用哺乳动物和更进一步用于人类时，此制剂应是药学上可接受的。用于治疗性寡核苷酸的药学上可接受的制剂是已知和可用的。在一些情况下，最好在缓冲液或盐水溶液中配制双链RNA，并将配制的双链RNA试剂直接注射到细胞中，如在卵母细胞的研究中。也可以进行直接注射双链RNA双链体。导入双链RNA的合适方法，可参见美国专利申请No.2004/0203145A1。
双链RNA可以配制成药物组合物，其包含药理学中有效量的双链RNA和药学上可接受的载体。药理学或治疗中的有效剂量是指可产生预期药理学治疗或预防效果的双链RNA制剂的量。短语“药理学有效量”和“治疗有效量”或简单的“有效量”是指有效地产生预期药理学、治疗或预防效果的RNA的量。例如，如果在临床治疗时，认为在与疾病或失常相关的可测量参数减少至少20％时被认定为有效量，则用于治疗这种疾病或失常药物的治疗有效量必需是使该可测量参数至少降低20％的剂量。
本公开实施例中所述的药物组合物，可以通过本领域已知的方法给药，例如通过肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、直肠、阴道和局部(包括颊和舌下)给药。在一些实施例中，药物组合物通过静脉输液/注射或腹腔输液/注射进行给药。
通常情况下，合适剂量单位是0.001至0.25毫克/千克体重/天，或在0.01至20微克/千克体重/天，或者0.001至5微克/千克体重/天，或者1至500纳克/千克体重/天，或0.01至10微克/千克体重/天，或者0.10至5微克/千克体重/天，或者0.1至2.5微克/千克体重/天的范围内。包含双链RNA的药物组合物可以每日施用一次。但是，治疗剂也可按剂量单元给药，可包含当天以适当的间隔施用两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量给药。在这种情况下，每个子剂量中含有的双链RNA必须相应地减小，以达到每日总剂量单元。剂量单元也可以在几天内组合为单一剂量，例如，使用常规的缓释制剂，其在几天内双链RNA可持续和一致的释放。在本领域中缓释制剂是众所周知的。在该实施例中，剂量单元含有每日剂量的对应倍数。无论制剂如何，药物组合物必须含有足以抑制动物或人类靶基因表达量的双链RNA。可以使药物组合物以这样的方式组合，即含多个剂量单元的双链RNA总量均达到足够的剂量。
关于预防性和治疗性的处理方法，基于从药物基因组学领域获得的知识，这些治疗可以被特异性订制或修改。如本文所用，“药物基因组学”是指对临床开发和市场上的药物，开展诸如基因序列、统计遗传学和基因表达分析等基因组学技术。更具体地，该术语是指患者基因如何决定他或她对药物的反应研究(例如，患者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。因此，本发明所公开实施例的另一方面提供了根据个体药物反应基因型，用靶TGF-β1和Cox-2基因或调控元件，来定制个体预防或治疗的方法。药物基因组学可让临床医生或医生在治疗中，对最有可能受益的患者开展预防性或治疗，以避免患者在治疗中经受药物相关的副毒作用。
可以在选定的动物模型中测试治疗剂。例如，如本文所述的双链RNA制剂(或相同的转基因编码物)，可施用于动物模型中，以确定用所述药剂处理的功效、毒性或副作用。或者将试剂(如治疗剂)施用于动物模型中，以确定这种药剂的作用机制。
双链体的制备
单链RNA(ssRNA)寡聚物可被重悬，例如，在100μM浓度下，可在由100mM乙酸钾、30mM Hepes组成的双组分缓冲液(pH＝7.5)中重悬。互补链和反义链以等摩尔量混合，获得诸如含50μM双链体的最终溶液。在RNA缓冲液(IDT)中，将样品加热至100℃维持5分钟，并在使用前冷却至室温。将双链RNA寡聚物储存在-20℃。将单链RNA寡聚物冻干储存或在-80℃下，储存于不含核酸酶的水中。
本发明中所公开实施例和要求保护的实施例，不受本发明所引用的特定优选实施例的范围限制，因为这些实施例旨在被作为示例，而对本发明不构成限制。任何等效的实施例皆被要求在本发明的范围内，且所公开实施例不是相互排斥的。实际上，除了本文所示和描述的那些实施例之外，前述描述中对实施例的各种修改，对本领域技术人员而言是显而易见的。这些修改也皆在本发明所附权利要求的范围内。
除非本文另有规定，否则所使用的所有术语具有与本领域普通技术人员共同理解的含义相同的含义。这里使用的术语应该被解释为具有与相关技术的背景下的含义一致的含义。
本发明中，涉及任意的项目、组合物、制剂、装置、方法、工艺、系统等定义或描述的元素，术语“包括”或“包含”或“组成”或“包含”旨在是包容性或开放的结尾，即包含这些指定的元素或其等价物。可以包括其它元素，并且仍属于已定义的项目、组成等的范围或定义内。
本发明中，术语“约”或“大约”表示由本领域普通技术人员观察的特定值，在可接受误差范围内；这部分地取决于如何基于测量系统的限制来测量或确定该值。
本发明中，“共同施用”或“共递送”是指使用相同或不同的给药方式，在受试者血液或其他液体中，同时给予两种药物制剂。药物制剂可以利用相同的药物载体或不同的药物载体，同时或依次施用。
本发明中，术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用。
具体实施例：
实施例1.
本发明所述的用于诱导脂肪组织重塑的siRNA组合物(STP705)，其序列如图1所示。
在一项临床研究中，基于两名原位鳞状细胞癌(isSCC)患者的病理报告，我们注意到这种重塑脂肪组织的治疗方法的潜力。在临床试验中，采用10、20、30、60μg的剂量，直接注射纳米制剂到肿瘤中，对患者进行治疗。每周每个肿瘤进行6次给药。该临床试验的结果证明在减少肿瘤体积方面，表现出明显的剂量依赖性效果，且每剂量为30μg、60μg和120μg的量的15例患者中，有13例(87％)的肿瘤得到临床组织学清除(图2)。
给药后，对肿瘤活组织检查中回收的样品进行IHC(免疫组化)染色后，结果表明，通过在同一制剂中同时给予TGF-β1和Cox-2siRNA可增加疗效，并导致募集到实体瘤中CD4+和CD8+T细胞的增加。通过减少肿瘤组织周围的TGF-β1浓度来增强这种效果，并且已经有报道证明TGF-β1可抑制T细胞渗透到肿瘤中(Daniele,et al.Nature.2018；554:538-546；Mariathasan,et al.Nature.2018；554:544-548.)。在抑制针对肿瘤活性T细胞募集过程中，升高的Cox-2也发挥着重要作用(Gao,et al.Digestion.2009；79:169-176.)。抑制肿瘤微环境内的Cox-2表达，预期可抑制活性T细胞转化为调节性T细胞(Treg)，从而增强募集的T细胞的活性。因此，在募集T细胞方面，上述的治疗组合拥有令人惊讶和巨大的效果，并保持T细胞对抗非自我细胞(例如肿瘤细胞)的能力。
令人意外的是，在最高剂量(120μg)STP705的两名患者中，表现出的皮肤改变(在治疗区域的皮肤轻微提升)，即与脂膜炎的表现一致，出现了皮下脂肪组织炎症。从这些患者皮肤和表皮层的检查中，发现未显示出炎症的迹象或在皮下脂肪组织中所见的效果。当对脂膜炎不定期进行检测时，观察到STP705可以使得该区域脂肪组织减少。用纳米颗粒制剂处理的产生这种重塑效果，可导致脂肪细胞含量和分布的变化，并且让人相信其可用于改善脂肪过剩，例如用于颌下或腹部脂肪组织重塑或用于由代谢紊乱等引起的有害脂肪组织的重塑。
总之，这些观察结果和数据支持在单个纳米颗粒输送系统中施用siRNA可实现对TGF-β1和Cox-2的抑制(图3-5)。在同样的细胞中，皮内同时递送含两种siRNA的制剂，可导致皮肤的必要变化以引起脂肪改造/重塑。
实施例2
我们在HistoTox实验室进行了深入研究，收集了36份甲醛固定的皮肤样品(包括30分全层皮肤样品以及从两只尤卡坦小型猪的6份穿刺解剖样品)。解剖样品收集前，待测组动物在第0、7和14天皮下注射药物，第56天处死动物。制作切片后进行H&E染色，并由具有资质的兽医病理学家组成的委员会采用光学显微镜进行评估。组织学损伤根据严重程度分级(0＝无；1＝极小的；2＝轻微；3＝中等；4＝显著；5＝严重)。同时采用Aperio AT2切片扫描仪对全切片进行扫描，采用Aperio Image Scope校准软件进行分析。每个样品测定10个位点的皮下脂肪厚度(μm)，即在真皮深缘和最浅筋膜层之间测量五个位点，在真皮的深部与骨骼肌/载玻片上捕获的脂肪组织的最深部分之间测量五个位点。
形态病理学(H&E)
每一待测组给药后均存在肉芽肿性炎症、皮下组织脂肪坏死和皮下组织纤维化/纤维增生等现象。肉芽肿性炎症的特征在于巨噬细胞、多核巨细胞、少量的中性粒细胞的浸润/聚集，以及淋巴细胞经常形成紧密的聚集。炎症细胞周围通常是坏死的脂肪细胞，且发生不同程度的矿化。纤维化/纤维增生的特征在于脂肪细胞通常被松散排列的纤维结缔组织/胶原蛋白取代，并带有散在的成纤维细胞、毛细血管轮廓和一些浸润性炎症细胞。这两者主要见于浅表皮下组织，位于第一筋膜平面层的表面。
检测表明，病理学改变现象主要发生在STP705、单独的TGF-β1siRNA、或不针对任何靶标的无意义siRNA对照，STP705效果明显高于单独的TGF-β1siRNA和无意义siRNA对照(图6)。
其它零星发生的现象，包括皮肤炎症细胞浸润和表皮表面的血清细胞结痂，表明猪的皮肤存在不同程度的典型的背景细胞浸润。
皮下厚度测量
由于样品结构(如骨骼肌)的可变性和样品厚度的不同，为确保客观准确，对两个区域进行测量：真皮深缘和最浅筋膜层之间，以及真皮深缘与深层骨骼之间肌肉边界或组织的深层组织边缘之间。不同采样部位和治疗方法之间的皮下脂肪组织全厚度差异很大(图7)；然而，与未处理或给药前样品相比，测试药品处理的样品中皮下厚度(直至浅筋膜)显著减少。这种减少的皮下厚度与该区域中存在炎症和纤维增生相对应(图8)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
cccaagggcu accaugccaa cuucu 25
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
ggucuggugc cuggucugau gaugu 25

Claims (10)

1.一种核酸制剂在重塑或修整脂肪组织中的应用，其特征在于，所述的核酸制剂包括至少一种能够抑制转化生长因子β1活性的第一核酸分子和至少一种能够抑制C氧化酶亚基II活性的第二核酸分子。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子独立地为siRNA、shRNA或miRNA；
和/或，所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的链长独立地为17～30个核苷酸，优选为24～28个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的第一核酸分子为能够与编码转化生长因子β1(TGF-β1或TGF-B)的mRNA相结合的siRNA；所述的第二核酸分子为能够与编码细胞色素C氧化酶亚基II(Cox2)的mRNA相结合的siRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的第一核酸分子有义链为：5’-CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU-3’，和/或，所述的第二核酸分子有义链为：5’-GGUCUGGUGCCUGGUCUGAUGAUGU-3’。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的核酸制剂还包括用于递送所述的第一核酸分子和所述的第二核酸分子的药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的载体包括含有至少一个组氨酸残基和至少一个赖氨酸的多肽聚合物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的载体包括HKP和/或HKP(+H)。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的核酸制剂为纳米颗粒制剂。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的核酸制剂通过皮内注射或静脉系统给药。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脂肪组织为由代谢紊乱、肥胖和过度进食所引起的有害脂肪组织。
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