CN116348134A - 用于黏膜免疫应答的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

提供了疫苗组合物，该疫苗组合物包含冻干的基于腺病毒的表达载体，以及稳定的化合物，例如例如文石。进一步提供了包括由文石制成的用于负载和递送疫苗组合物的固体剂型的组合物。

Description

用于黏膜免疫应答的疫苗组合物

相关申请的交叉引用

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求于2020年10月23日提交的美国临时专利申请序列号63/104,770和于2020年9月24日提交的美国临时专利申请序列号63/082,907的优先权的权益，其中的每一个都通过引用并入本文。

技术领域

本披露总体上涉及疫苗组合物的领域。更特别地，本披露涉及具有改善的稳定性和容易施用性的疫苗组合物以及用于有效施用和制造的疫苗的固体剂型。

序列表的引用

本申请含有对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，这些序列已作为序列表文本文件与本申请一并同时提交，该文本文件标题为“8774-16-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt”，文件大小为30,000字节(B)，创建于2021年10月22日。前述序列表根据37C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用以其全文特此并入。

背景技术

疫苗可以通过让培养物静置来制造，从而减弱感染性生物体的毒力。然而，最近，现代重组技术已被用于生产抗原蛋白，并且生产能够表达抗原蛋白对抗多种感染性生物体的病毒载体。

无论用于生产疫苗的方法或技术如何，如何能在储存疫苗的同时保持疫苗效力是一项持续的挑战。目前，维持疫苗效力的一个重要部分依赖于昂贵的冷藏系统链。为了减轻对这种昂贵供应链的需求，制造商已尝试将化学稳定剂添加至疫苗中。然而，此类填充剂常常具有毒性并且诱导过敏反应。

除了稳定性之外，疫苗接种方案还受到与递送途径相关的问题影响。许多疫苗通过注射施用，而很多人并不喜欢这种施用方式。

传统上通过肌内、皮内或皮下注射递送疫苗。这些注射可以产生强烈的系统性免疫应答，而触发黏膜免疫应答的效力是可变的，并且通常很弱或检测不到，特别是对于亚单位疫苗。从处理注射疫苗的引流淋巴结中，抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和B细胞产生的抗体可以迁移到体内的不同器官，但由于归巢粘膜受体和趋化性不足，它们向多种黏膜组织(例如生殖器、肠道、呼吸道)的迁移通常受到限制或者不可能发生迁移。然而，还被认为是肠胃外免疫接种途径的鼻内途径可以在共享一些互连的呼吸道、生殖器和肠道中引发良好的黏膜免疫应答，如果疫苗在黏膜部位递送，则更容易获得。因此，在某些情况下，此类肠胃外疫苗可以提供针对黏膜病原体的保护。

由于大多数病原体(例如，COVID19)通过粘膜组织(口腔、呼吸道、生殖器和肠道)进入体内，并且其中许多病原体仅在黏膜组织中复制，因此黏膜疫苗接种可以通过在局部和远处黏膜部位诱导先天性(例如NK细胞)和适应性(T细胞和B细胞)免疫应答来最佳地诱导前线防御。

即使考虑到目前已批准的冠状病毒疾病2019(COVID-19)的疫苗，在快速和全球范围内的疫苗分配和施用仍然存在障碍。由于许多因素(包括制造和/或储存成本和需求)，目前已批准的疫苗仍未实现全球免疫接种。

黏膜疫苗递送(经由口颊、舌下、鼻、口服或阴道黏膜)作为诱导局部和远处抗体免疫应答以及系统性免疫应答的手段越来越受到关注。另外，黏膜疫苗递送通过固体剂型(例如，口颊/舌下片剂、口服片剂或胶囊、阴道插入物)可以提供若干优势，例如大量免疫接种的潜力、患者依从性、易用性、产品贮存期稳定性、不依赖冷链的能力。此外，黏膜疫苗递送可以适用于患有针头注射恐惧症的患者，并且在向患者进行充分解释说明后，患者可以自行施用疫苗。口颊/舌下途径多年来一直用于将药物和小分子输送到血流中，但其作为疫苗黏膜递送手段的应用尚未发展为常规。

用于药物递送的固体剂型(包括粉末、片剂或胶囊)在施用时需要崩解和释放活性成分(例如，疫苗)。同时，负载有活性成分的剂型必须在从生产到施用的运输和储存过程中保持稳定。同样，固体剂型的使用需要在其中负载的活性成分的稳定性，然后在水溶液(例如，水、唾液或黏膜液)中迅速崩解。

因此，需要具有改善的稳定性以及改善的容易施用性的疫苗组合物，从而增强疫苗覆盖有效性。另外，需要为疫苗负载提供相容平台的改善的固体疫苗剂型，在崩解(施用)前是稳定的，迅速崩解，制造成本低，并且对于有效的全球免疫接种容易施用。本披露解决了这些需求并且还提供了另外的益处。

发明内容

一个实施例涉及组合物，该组合物包含冻干腺病毒载体和含有碳酸盐矿物质的填充剂，其中该腺病毒载体包含编码异源蛋白质的至少一部分的核酸分子。

在一个方面，腺病毒载体来源于5型腺病毒，并且其中该腺病毒具有在E1、E2b和E3区域中的缺失。

在各个方面，异源蛋白质来自病毒。

在各个方面，异源蛋白质来自选自由以下组成的组的病毒：SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1和流感病毒。

在各个方面，异源蛋白质来自SARS-CoV-2。在一些方面，异源蛋白质是刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白或膜(M)蛋白。在又另一方面，异源蛋白质与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、任选地至少85％、任选地至少90％、任选地至少95％、任选地至少97％、或甚至100％同一性。

在各个方面，腺病毒载体具有0.5％与5％之间的残留水分含量。在一个方面，腺病毒载体具有小于5％的残留水分。在又另一方面，腺病毒载体具有小于3％的残留水分。

在各个方面，碳酸盐矿物质具有斜方晶格。在一个方面，碳酸盐矿物质选自由以下组成的组：文石、白铅矿、菱锶矿、碳酸钡矿和纤碳铀矿。在一个方面，碳酸盐矿物质是文石。

在各个方面，填充剂包含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。

在各个方面，填充剂缺乏选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。

在各个方面，组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖、二甲基甘氨酸、甘氨酸、甲基磺酰甲烷和酵母裂解物。

另一实施例涉及胶囊，其包含如本文所披露的组合物。在一个方面，胶囊是经肠溶包衣的。在仍另一方面，胶囊包含海藻酸盐。

另一实施例涉及用于通过疫苗组合物的口服、舌下、或口颊施用递送疫苗组合物的固体剂型，该固体剂型包含含有多个文石颗粒的文石组合物，其中用二氧化碳(CO2)浸渍该多个文石颗粒；以及与文石组合物混合的生物相容性聚合物和崩解剂；其中该固体剂型进一步包含疫苗组合物，并且其中该固体剂型是粉末、片剂或胶囊。

在一个方面，固体剂型进一步包含至少一种赋形剂并且被配制以形成锭剂。

在固体剂型的另一方面，多个文石颗粒具有100nm至1mm之间的平均粒度。

在固体剂型的各个方面，生物相容性聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺66(尼龙)、聚己内酰胺、聚己内酯、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚苯醚/硫化物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸、脂肪族聚酯例如聚羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚葡糖酸酯、聚(二噁烷酮)及其混合物。

在固体剂型的一个方面，生物相容性聚合物是PLA。在固体剂型的一个方面，生物相容性聚合物是尤特奇L30 D-55(赢创公司(Evonik))。

在固体剂型的各个方面，崩解剂选自淀粉，经修饰的纤维素胶，不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，乙醇酸淀粉酯，微晶纤维素，预胶化淀粉，羧甲基淀粉钠，低取代的羟丙基纤维素，N-乙烯基-2-吡咯烷酮、烷基-、羟基烷基-、羧基烷基-纤维素酯的均聚物，海藻酸盐，和微晶纤维素及其多晶形式。

在固体剂型的一个方面，崩解剂是豌豆淀粉。

在固体剂型的一个方面，疫苗组合物包含编码病毒蛋白或其片段的重组病毒表达构建体。在一个方面，病毒蛋白或其片段对应于冠状病毒蛋白或其片段。在仍另一方面，冠状病毒蛋白或其片段是SARS-CoV2病毒结合蛋白。在一个方面，重组ACE2蛋白与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性。在仍另一方面，重组ACE2蛋白包含SEQ ID NO:6的序列。在又另一方面，重组ACE2蛋白包含选自T27F、T27W、T27Y、D30E、H34E、H34F、H34K、H34M、H34W、H34Y、D38E、D38M、D38W、Q24L、D30L、H34A和D355L的至少一个突变。

在固体剂型的一个方面，疫苗组合物包含腺病毒表达构建体。

另一实施例涉及制备用于负载疫苗的固体剂型的方法，该方法包括提供文石组合物，该文石组合物包含用二氧化碳(CO2)浸渍的多个文石颗粒；将该文石组合物与生物相容性聚合物和崩解剂混合以形成该固体剂型；以及将该疫苗组合物添加至该固体剂型中。

在制备固体剂型的方法的一个方面，文石组合物与生物相容性聚合物和崩解剂的混合包括热熔挤出。

在制备固体剂型的方法的另一方面，固体剂型是粉末、片剂或胶囊。

在制备固体剂型的方法的仍另一方面，固体剂型是片剂，并且其中该方法进一步包括压实该固体剂型。

在制备固体剂型的方法的另一方面，文石组合物和生物相容性聚合物的重量比是在95:5至5:95之间。

在制备固体剂型的方法的又另一方面，多个文石颗粒具有100nm至1mm之间的平均粒度。

在制备固体剂型的方法的另一方面，生物相容性聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺66(尼龙)、聚己内酰胺、聚己内酯、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚苯醚/硫化物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸、脂肪族聚酯例如聚羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚葡糖酸酯、聚(二噁烷酮)及其混合物。

在制备固体剂型的方法的仍另一方面，生物相容性聚合物是PLA。在固体剂型的仍另一方面，生物相容性聚合物是尤特奇L30 D-55(赢创公司)。

在制备固体剂型的方法的又另一方面，崩解剂选自淀粉，经修饰的纤维素胶，不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，乙醇酸淀粉酯，微晶纤维素，预胶化淀粉，羧甲基淀粉钠，低取代的羟丙基纤维素，N-乙烯基-2-吡咯烷酮、烷基-、羟基烷基-、羧基烷基-纤维素酯的均聚物，海藻酸盐，和微晶纤维素及其多晶形式。

在制备固体剂型的方法的仍另一方面，崩解剂是豌豆淀粉。

在制备固体剂型的方法的一个方面，疫苗组合物包含编码病毒蛋白或其片段的重组病毒表达构建体。在一个方面，病毒蛋白或其片段对应于冠状病毒蛋白或其片段。在仍另一方面，冠状病毒蛋白或其片段是SARS-CoV2病毒结合蛋白。在一个方面，重组ACE2蛋白与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性。在仍另一方面，重组ACE2蛋白包含SEQ ID NO:6的序列。在又另一方面，重组ACE2蛋白包含选自T27F、T27W、T27Y、D30E、H34E、H34F、H34K、H34M、H34W、H34Y、D38E、D38M、D38W、Q24L、D30L、H34A和D355L的至少一个突变。

在制备固体剂型的方法的一个方面，疫苗组合物包含腺病毒表达构建体。

相对于本文所述的任何其他方法或组合物，可以采用在本文所述的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施例。因此，涉及一种方法或组合物的实施例也可以适用于其他方法和组合物。

其他目标、特征和优势将从以下详细说明中变得清楚。然而，应当理解，详细说明和特定实例在指示特定实施例的同时仅以说明的方式给出，因为根据本详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得清楚。

附图说明

图1示出了方解石、文石和球霰石各自的CaCO₃化学结构和对称性，如所指示的。

图2A是根据本披露所述的实施例，通过三维(3D)打印挤出的长丝形成的含有40％文石的生物相容性生物塑料文石组合物的照片。

图2B是根据本披露所述的实施例，通过三维(3D)打印挤出的长丝形成的含有40％文石的生物相容性生物塑料文石组合物的照片。

图3A-3D示出了将已知病毒滴度的冻干腺病毒载体(Ad5)负载至装有文石或乳糖胶囊中的结果。示出了使用以下文石或乳糖复合剂的感染单位/克(无酸(图3A)或有酸(图3C))或病毒回收率百分比(无酸(图3B)或有酸(图3D)：包衣文石(C)1(0.357g干燥粉末，pH8.81)；文石(C)5(0.425g干燥粉末，pH 8.84)；非包衣乳糖(NC)4(0.8023g，液体，pH 2.14)；文石(NC)6(0.545g，糊剂，pH 7.78)；文石(NC)7(0.629g，糊剂，pH 7.79)和文石(NC)8(0.801g，糊剂，pH 7.00)。当暴露于酸时，将与文石复合的样品在>/＝7pH下维持。每条棒是一个胶囊。

具体实施方式

以下段落更详细地描述了不同方面。除非有明确相反地指出，否则每个方面可以与一个或多个其他方面进行组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的特征的任何其他特征进行组合。

本披露的某些特征在单独的实施例的上下文中描述，但是也可以在单个实施例中组合提供。相反，在单个实施例的上下文中描述的本披露的多个特征也可单独提供或以任何合适的子组合提供。本披露实施例的所有组合明确涵盖于本披露中，并且就如同每个组合被个别且明确地披露一样披露在本文中。另外，所有子组合也明确涵盖于本披露中，并且就如同每个这种子组合个别且明确地披露一样披露在本文中。

本披露不局限于本文所述的特定实施例。本文所使用的仅用于描述特定实施例的术语不旨在具有限制性。仅提供本文所讨论的出版物在本申请的提交日期之前的披露内容。本文中的任何内容均不承认本披露无权凭借先前的披露提前公开这种出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确认。将所有本文提及的出版物通过引用并入本文以披露和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与普通疫苗科学家通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用于实施或测试本文所披露的疫苗，但是现在描述了优选的方法和材料。

如本文所披露的，将疫苗组合物以稳定的且容易施用的形式提供。更特别地，冷冻干燥基于重组病毒的疫苗，并且将疫苗与适当的稳定化合物组合生产稳定的组合物，并且可以包装用于稳定储存、运输、以及容易施用。因此，本披露的组合物可以通过冻干腺病毒载体以及将腺病毒载体与碳酸盐矿物质(例如文石)组合来生产。相应地，本披露的组合物总体上包含冻干腺病毒载体和碳酸盐矿物质(例如文石)。

主题进一步包括使用文石生产疫苗剂型以形成固体剂型(例如，粉末、片剂或胶囊)的组合物和方法，该固体剂型在储存期间是稳定的，容易施用(例如，自我施用)，并且在黏膜施用(例如，舌下或口颊施用)后或或在用于饮用的水溶液中迅速崩解。

特别地，本发明主题涉及由多个文石颗粒制成的文石组合物，其中这些文石颗粒能够负载有疫苗组合物，从而得到呈粉末、片剂或胶囊形式的固体剂型疫苗。在示例性实施例中，疫苗组合物针对冠状病毒产生免疫。更特别地，疫苗组合物是用于表达对相关感染/疾病的相应抗原的重组病毒表达构建体。优选地，重组构建体是表达抗原性冠状病毒蛋白或蛋白片段的腺病毒构建体。

值得注意的是，如本文进一步详述的，在目前考虑的固体剂型中使用文石允许成本有效地制造和容易施用稳定的疫苗组合物。因此，目前考虑的呈粉末、片剂或胶囊形式的疫苗可以大量生产并且易于运输。此外，固体剂型的快速崩解(例如，30秒或更短)允许自我施用。例如，呈粉末形式的疫苗可以以个别剂量包装进行包装。粉末剂量形式的示例性包装与

茶包的包装相似。可以将疫苗粉末打开并且在饮用的水或适合的液体饮料(例如，从饮用器皿或滴管)中溶解，从而口服施用在液体中释放的疫苗。另外，对于呈任何粉末、片剂、或胶囊形式的疫苗，考虑到与水性流体接触后剂型的崩解，在舌下或口颊施用后，人的唾液将崩解剂型，从而将疫苗组合物在用于吸收的口服黏膜中释放。在另外的实施例中，片剂可以由压缩的疫苗粉末形成。片剂可以压缩成任何适合的形状，例如，圆形或立方体。片剂形式也可以用另外的赋形剂(例如调味剂和明胶)形成锭剂。

文石(例如，鲕状文石)是天然沉淀的碳酸钙的最纯净形式之一。参考图1，文石具有斜方、双锥、特征性针状晶体的晶体形态，因此与方解石和球霰石不同。文石可以被加工以重结晶和/或重整为各种形状，从而它可以用于利用碳酸钙矿物的机械和化学性质的各种目的。如本文所披露的文石颗粒是具有规则(例如球形或卵形)或不规则形状的固体物质。如本文所用，文石颗粒具有100nm至1mm的平均粒度。用于研磨文石颗粒的方法描述于U.S.16/858,548，PCT/US20/29949中，其全部内容通过引用并入本文。例如，披露了用于在规则最大尺寸(clean top size)情况下研磨具有2.5至3.5微米尺寸的文石颗粒的方法。规则最大尺寸意味着当使用所披露的研磨方法(分级器设置在2.5至3.5微米尺寸范围)生产时，很少有颗粒大于3.5微米尺寸。因此，如本文所披露的使用U.S.16/858,548，PCT/US20/29949的方法的文石颗粒具有比常规GCC更规则的最大尺寸。

文石的吸附能力是三个参数的函数：(1)表面电荷(又称“ζ(zeta)电位”)；(2)表面积/空隙率；和(3)颗粒溶解度。通过准确测量这三个参数，可以确定在给定条件下哪些材料会吸附到文石颗粒表面。值得注意的是，文石的ζ电位增加了表面活性剂(如甘油和山梨糖醇)的稳定性。

此外，文石在直径小于2nm的颗粒中具有大量可测量的孔隙(即具有高“微孔率”)。参见，例如，EP 2719373。因此，文石平台将活性成分颗粒牢固地夹在一起，从而允许将负载的文石配制成固体剂型—例如粉末、片剂或胶囊。

有利的是，未经处理的文石具有中性pH(7.8至8.2)、天然亲水性、电子电荷(ζ电位)，并已与氨基酸和蛋白质产生含氮配对。不受任何一种理论的束缚，文石的这些有利特性使得文石在环境条件下是亚稳态的。更具体地说，文石颗粒天然包含约2％-3％的氨基酸含量，其中大部分是天冬氨酸(约25％至30％)和谷氨酸(约8％至10％)，使文石表面具有亲水性。参见，例如，Mitterer,1972,Geochimic et Cosmochimica Acta[地球化学与宇宙化学学报],36:1407-1422。因此，在一些实施例中，将疫苗组合物(例如重组腺病毒)直接偶联至文石颗粒的天然未处理表面。

目前，市场上使用的碳酸钙被作为以下或从以下加工：研磨的碳酸钙(GCC)、沉淀的碳酸钙(PCC)(合成)和/或石灰石生产。生产的产品是具有不同属性的商品等级。为了获得规则粒度分布(PSD)最大粒度和低保留，大多数公司采用湿法研磨工艺(无论是高固体或低固体)。然而，产品和这些工艺既不是生物性的，也不是对环境有利的。如本文所用，文石是指天然存在的文石，其具有与GCC、PCC和石灰石不同的斜方晶、双锥体和特征性针状晶体的结晶形态。

一个实施例是一种组合物，该组合物包含以下或由其组成：冻干腺病毒载体；和含有碳酸盐矿物质或由其组成的填充剂，其中该腺病毒载体包含编码异源蛋白质的至少一部分的核酸分子。“腺病毒载体”是腺病毒，其基因组缺乏在未经修饰的哺乳动物细胞中复制腺病毒所需的一个或多个基因。“腺病毒”(简称“Ad”)是指一组来自腺病毒科的非包膜的双链DNA病毒，直径大约为60-110nm。本文所披露的腺病毒载体可以来源于腺病毒科的四种属(例如，禽腺病毒属、哺乳动物腺病毒属、胸腺病毒属和唾液腺病毒属)中的任一种的腺病毒，以及每个物种的任何血清型。在人中，大多数腺病毒感染是无症状性的并且与肿瘤性疾病不相关。特征最广泛的Ad血清型是血清型2(Ad2)和血清型5(Ad5)。在一个方面，本文所用的腺病毒载体是Ad2载体。在另一方面，腺病毒载体是Ad5载体。

腺病毒dsDNA基因组的长度大约为36kb。基因组包含两组基因：早期区域基因E1A、E1B、E2、E3和E4，在DNA复制前被转录；以及晚期区域基因L1–L5，在DNA复制开始后被转录并以高水平表达。早期区域基因是激活其他病毒区域的转录、改变宿主细胞环境以增强病毒复制以及病毒DNA复制所必需的。E1A转录单元编码参与病毒转录调控的两个主要E1a。两个主要E1b参与刺激病毒mRNA运输，阻断E1A诱导的细胞凋亡并且阻断宿主mRNA运输。E2b基因编码病毒聚合酶和末端蛋白前体。

如本文所用，“活性”、“功能”等是指分子做某事的能力。例如，腺病毒E2a结合许多细胞因子并调节其活性，从而驱动宿主细胞进入S期。结合细胞因子、调节其活性、并且驱动细胞进入S期中的每一个可以被认为是E1a活性。由于缺乏一种或多种活性，腺病毒载体不可以在未经修饰的哺乳动物细胞中复制(“复制缺陷”)。如本文所用，“未经修饰的”哺乳动物细胞缺乏编码腺病毒蛋白的DNA。复制缺陷腺病毒载体可以在辅助细胞中复制。辅助细胞是具有编码蛋白质的DNA的哺乳动物细胞，该蛋白质以反式提供腺病毒载体中缺少的腺病毒复制所需的一种或多种活性。

导致腺病毒载体产生的对腺病毒基因组的修饰(也称为突变)可以在基因组中的任何一个或多个位置处进行，只要修饰消除在未经修饰的细胞中的复制所需的至少一个功能。优选的修饰导致消除可以在辅助细胞中以反式提供的功能。对腺病毒基因组有用的修饰包括导致至少部分或全部的腺病毒基因的缺失的那些，使得所得腺病毒载体不能生产具有复制所需的活性的功能性蛋白。缺乏与蛋白质相关的活性的腺病毒载体被称为该蛋白质或活性“无效”，并且可以表示为[蛋白质-](例如，[E2b-])。

在未经修饰的哺乳动物细胞中复制所需的示例性腺病毒蛋白包括但不限于，E1a、E1b、E2a和E2b。在一个方面，腺病毒载体包含在编码E1a的序列中的修饰。在一个方面，腺病毒载体包含在编码E1b的序列中的修饰。在一个方面，腺病毒载体包含在编码E2a的序列中的修饰。在一个方面，腺病毒载体包含在编码E2b的序列中的修饰。在一个方面，腺病毒载体包含在E1基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E1a基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E1b基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E2基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E2a基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E2b基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在E1基因区域中和在E2基因区域中的缺失。在一个方面，腺病毒载体包含在选自由以下组成的组的一个或多个基因区域中的缺失：E1a基因区域、E1b基因区域、E2a基因区域、和E2b基因区域。在一个方面，腺病毒载体缺乏与E1a相关的一种或多种活性。在一个方面，腺病毒载体缺乏与E1b相关的一种或多种活性。在一个方面，腺病毒载体缺乏与E2a相关的一种或多种活性。在一个方面，腺病毒载体缺乏与E2b相关的一种或多种活性。在一个方面，腺病毒载体缺乏与选自由以下组成的组的一个或多个蛋白质相关的一种或多种活性：E1a、E1b、E2a和E2b。在一个方面，腺病毒载体是[E1a-]和/或[E1b-]和/或[E2a-]和/或[E2b-]。

如本文所用，“异源”是指来自与其所参照的生物体不同的生物体的分子，或来自与其表达相同类型的生物体的蛋白质，但其中异源蛋白质的表达程度与表达它的组织环境不同。分子可以是蛋白质或核酸序列(即，RNA或DNA)。例如，重组病毒载体中的异源核酸序列是指异源核酸序列来自用于构建重组病毒载体的基础病毒以外的生物体。作为另外的实例，腺病毒载体中的异源核酸序列是指异源核酸序列来自腺病毒以外的生物体。相似地，对腺病毒载体异源的蛋白质是指异源蛋白质来自腺病毒以外的生物体。

在一个方面，异源蛋白质的至少一部分是免疫原性部分。如本文所用，“免疫原性”是指特定蛋白质部分引发对特定蛋白质的免疫应答的能力，或对包含与异源蛋白质具有高度同一性的氨基酸序列的蛋白质。根据本披露，具有高度同一性的氨基酸序列包含至少80％同一性、至少85％同一性、至少87％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的连续氨基酸序列。异源蛋白质可以选自由以下组成的组：新表位、病毒蛋白和细菌蛋白。异源蛋白质可以来自选自由以下组成的组的病毒：腺病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、嗜肝DNA病毒、细小病毒、星状病毒、杯状病毒、小RNA病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、肝病毒、逆转录病毒、正粘病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、副粘病毒、弹状病毒、呼肠孤病毒、流感和痘病毒。

在某些实施例中，蛋白质是冠状病毒蛋白。α冠状病毒和β冠状病毒仅感染哺乳动物。γ冠状病毒和δ冠状病毒感染鸟类，但它们中的一些也可以感染哺乳动物。α冠状病毒和β冠状病毒通常导致人类呼吸系统疾病以及动物胃肠炎。高病原性病毒(SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2)导致人类严重呼吸系统综合征，并且其他四种人类冠状病毒(HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1)诱导免疫功能正常的宿主轻度上呼吸系统疾病，尽管它们中的一些可以导致婴儿、幼儿和老年人的严重感染。

冠状病毒是最大的单正链RNA病毒，其中基因组为27–32kb。基因组被包装在由核衣壳蛋白(N)形成的螺旋衣壳内，并进一步被包膜包围。与病毒包膜相关的是至少三种结构蛋白：参与病毒组装的膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)、以及介导病毒进入宿主细胞中的刺突蛋白(S)。一些冠状病毒还编码与包膜相关的血凝素酯酶蛋白(HE)。在这些结构蛋白中，S从病毒表面形成大的突起，使冠状病毒看起来像冠。除了介导病毒进入外，S还确定宿主范围和组织嗜性。S还诱导宿主免疫应答。

由于N、M、E和S蛋白位于病毒颗粒的外部，因此是开发抗冠状病毒疫苗的良好候选物。在一个方面，异源蛋白质来自选自由以下组成的组的冠状病毒：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、和HCoV-OC43、HKU1。在一个方面，异源蛋白质来自SARS-CoV-2。在一个方面，异源蛋白质来自SARS。在一个方面，异源蛋白质来自MERS。

在一个方面，异源蛋白质是来自选自由以下组成的组的冠状病毒的N：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1。在一个方面，异源蛋白质是SARS-CoV-2N。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS的N。在一个方面，异源蛋白质是来自MERS的N。

在一个方面，异源蛋白质是来自选自由以下组成的组的冠状病毒的M：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS-CoV-2的M。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS的M。在一个方面，异源蛋白质是来自MERS的M。

在一个方面，异源蛋白质是来自选自由以下组成的组的冠状病毒的E：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS-CoV-2的E。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS的E。在一个方面，异源蛋白质是来自MERS的E。

在一个方面，异源蛋白质是来自选自由以下组成的组的冠状病毒的S：SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS-CoV-2的S。在一个方面，异源蛋白质是来自SARS的S。在一个方面，异源蛋白质是来自MERS的S。

在一个方面，异源蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4组成的组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％同一性的氨基酸序列。在一个方面，至少一个异源蛋白质包含选自由SEQ ID NO:1–4组成的组的氨基酸序列。在一个方面，异源蛋白质的至少一部分包含来自选自由SEQ IDNO:1–4组成的组的氨基酸序列的至少六个(6)连续氨基酸残基。

可以从中获得异源蛋白质的病毒的另一实例是流感病毒。针对流感病毒的保护性免疫应答主要涉及病毒血凝素(HA)蛋白，即病毒表面负责与宿主细胞受体相互作用的糖蛋白。流感病毒HA蛋白是有吸引力的靶标，通过疫苗接种诱导免疫应答。异源蛋白质可以来自流感病毒例如，但不限于，人流感病毒和禽流感病毒。异源蛋白质可以是流感HA、其表位、其免疫原性部分或其变体。任何流感HA、其表位、其部分、或其变体可以用于本披露所述的腺病毒载体，只要HA蛋白、其表位、其部分或其变体诱导免疫应答，并且优选地针对流感病毒的保护性免疫应答。可用于流感HA蛋白、其表位、其部分、和其变体的实例披露于US 2010/0074916、US 2011/0171260、US 2011/0177122、和US 2014/0302079中，其全部内容通过引用并入本文。

在一个方面，异源蛋白质是治疗性蛋白质。治疗性蛋白质的实例包括，但不限于抗体、Fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形成蛋白、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素和溶栓蛋白。

冻干是使用冷冻温度和低压从物质(例如腺病毒载体)中除去水的工艺。在示例性冻干中，待冻干的材料被冷却到其三重点以下，通常在-50℃和-80℃之间。一旦材料被冷冻，周围的气压就会降低，并添加足够的热量来升华冰。在第二个干燥阶段，添加另外的热量以除去未冷冻的水分子。完成后，冻干材料具有小于5％，通常小于3％，并且典型地在约0.5％至约3％的残余水分含量的范围内。冻干方法描述于US 7,888,097中，将其披露内容通过引用并入本文。在一个方面，本披露的冻干组合物具有小于5％、约小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％的残留水分。在一个方面，本披露的冻干组合物具有约0.5％与约5％之间的残留水分。在一个方面，本披露的冻干组合物具有约0.5％与约3％之间的残留水分。在一个方面，本披露的冻干组合物具有约0.5％与约1％之间的残留水分。如本文所用，关于残留水分含量，“约”是指在参考数量中不超过10％的变化。

如本文所用，“填充剂”是添加至组合物中的一种或多种化合物，以增加组合物的质量或体积。典型地用于向人类和动物施用的示例性填充剂包括，但不限于乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇、植物纤维素等。因为一些个体对某些化合物敏感，在本披露的组合物中存在的填充剂可以缺乏选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。在一个方面，组合物缺乏乳糖。在一个方面，组合物缺乏甘露醇。在一个方面，组合物缺乏山梨醇。在一个方面，组合物缺乏淀粉。

考虑到上文所讨论的敏感性问题，碳酸盐矿物质具有期望的特性，并且因此是优秀的填充剂。碳酸盐矿物质含有碳酸根离子，CO₃ ^2-。碳酸盐填充剂的实例包括，但不限于方解石、球霰石、文石、白铅矿、菱锶矿、碳酸钡矿和纤碳铀矿。在一个方面，填充剂包含选自由以下组成的组的化合物或由其组成：方解石、球霰石、文石、白铅矿、菱锶矿、碳酸钡矿和纤碳铀矿。在一个方面，填充剂包含具有斜方晶格的碳酸盐矿物质。在一个方面，填充剂包含选自由以下组成的组的化合物或由其组成：文石、白铅矿、菱锶矿、碳酸钡矿和纤碳铀矿。在一个方面，填充剂包含文石或由其组成。在一个方面，填充剂包含白铅矿或由其组成。在一个方面，填充剂包含菱锶矿或由其组成。在一个方面，填充剂包含纤碳铀矿或由其组成。

除了前述成分之外，本披露的组合物可以(但不需要)包含另外的作为例如以下的成分：稳定剂、甜味剂、缓冲剂、粘合剂、载剂、稀释剂、佐剂、以及药学活性化合物。另外的成分的实例包括，但不限于氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖、聚甲基甘氨酸、甲基磺酰甲烷和酵母裂解物。在一个方面，组合物包含稳定剂、甜味剂、缓冲剂、粘合剂、载剂、稀释剂、佐剂、以及药学活性化合物中的一个或多个。在一个方面，组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖、聚甲基甘氨酸、甲基磺酰甲烷、柠檬酸三乙酯(TEC)和酵母裂解物。

本披露涵盖为容易施用于个体而配制的组合物。相应地，本披露的一个实施例是本文所披露的胶囊包含组合物。在一个实施例中，胶囊含有一种组合物，该组合物包含冻干腺病毒载体或由其组成、和含有碳酸盐矿物质或由其组成的填充剂，其中该腺病毒载体包含编码异源蛋白质的至少一部分的核酸序列。胶囊可以由包括但不限于以下的一种或多种材料制成：纤维素、明胶、海藻酸盐。在一个方面，胶囊包含纤维素。在一个方面，胶囊包含海藻酸盐。在一个方面，胶囊包含明胶。在一个方面，胶囊是经肠溶包衣的。

一个实施例是一种组合物，该组合物包含冻干腺病毒载体和含有文石的填充剂，其中该腺病毒载体缺乏E1和E2b活性，因此具有复制缺陷，其中该腺病毒载体包含编码蛋白质的至少一部分的核酸分子，该蛋白质来自选自由以下组成的组的冠状病毒：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1，并且其中该冠状病毒蛋白选自由以下组成的组：冠状病毒N蛋白、冠状病毒M蛋白、冠状病毒E蛋白、和冠状病毒S蛋白。

一个实施例是制备本文所披露的组合物的方法。在一个方面，该方法包括：将腺病毒载体冻干，该腺病毒载体包含编码异源蛋白质的至少一部分的核酸分子；以及将该腺病毒载体与包含碳酸盐矿物质或由其组成的填充剂组合。

在另外的实施例中，将组合物封装在适用于向个体施用的胶囊中。在一个方面，腺病毒载体来源于腺病毒科的四种属(例如，禽腺病毒属、哺乳动物腺病毒属、胸腺病毒属和唾液腺病毒属)中的任一种的腺病毒，以及每个物种的任何血清型。在一个方面，腺病毒载体来自血清型2腺病毒。在一个方面，腺病毒载体来自血清型5腺病毒。

在一个方面，冻干腺病毒载体具有小于5％、约小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％的残留水分。在一个方面，冻干腺病毒载体具有约0.5％与约5％之间的残留水分。在一个方面，冻干腺病毒载体具有约0.5％与约3％之间的残留水分。

在一个方面，填充剂包括选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。在一个方面，填充剂缺乏选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。在一个方面，填充剂缺乏乳糖。在一个方面，填充剂缺乏甘露醇。在一个方面，填充剂缺乏山梨醇。在一个方面，填充剂缺乏淀粉。

在一个方面，组合物包含稳定剂、甜味剂、缓冲剂、粘合剂、载剂、稀释剂、佐剂、以及药学活性化合物中的一个或多个。在一个方面，组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖、聚甲基甘氨酸、甲基磺酰甲烷和酵母裂解物。

在一个方面，胶囊包含选自由以下组成的组的一种或多种材料：纤维素、明胶和海藻酸盐。在一个方面，胶囊包含纤维素。在一个方面，胶囊包含海藻酸盐。在一个方面，胶囊包含明胶。在一个方面，胶囊是经肠溶包衣的。

本文披露了针对感染性生物体对个体进行疫苗接种的方法。这些方法包括向个体施用一次或多次本文所披露的组合物或包含本文所披露的组合物的胶囊。在一个方面，组合物包含冻干腺病毒载体和含有碳酸盐矿物质或由其组成的填充剂，其中该腺病毒载体包含编码来自感染性生物体的异源蛋白质的至少一部分的核酸序列。在一个方面，个体处于暴露于感染性生物体的风险中。此类个体可以是可能在某个时候暴露于感染原或以前暴露过但尚未出现感染症状的个体。

本文所述的组合物和包含组合物的胶囊的施用途径和频率以及剂量会根据个体、疾病的不同而不同，并可易于使用标准技术来建立起来。一般而言，组合物可以通过包括以下的施用途径来施用：静脉内、口服、肠胃外、动脉内、经皮、皮下、肌内、局部、颅内、眶内、经眼、玻璃体内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气溶胶、中枢神经系统(CNS)施用、和通过栓剂(用于阴道或直肠递送)施用。一般而言，口服施用包含本文所披露的组合物的胶囊。

施用本披露的组合物的方法将取决于例如被治疗患者的年龄、体重和身体状况以及所治疗的疾病或病症等因素。因此，技术人员将能够逐个病例地选择最适合患者的施用方法。

一个实施例是试剂盒。试剂盒可以包括，例如，本披露的腺病毒载体、用于构建本披露的腺病毒载体的核酸分子、本披露的填充剂、本披露的组合物和/或本披露的胶囊。试剂盒还可以包含相关的组分，例如，但不限于培养基、缓冲剂、标签、容器、小瓶、注射器和使用试剂盒的说明书。

疫苗组合物的固体剂型：

如本文所披露的，剂型(也称为固体剂型)包括具有其本质上稳定的特性的文石，其能够与疫苗组合物直接偶联。在示例性实施例中，所考虑的剂型包括在添加疫苗组合物之前用二氧化碳(CO2)浸渍的(即偶联的)文石。参见，例如，EP 2719373和US 2020/0155458。在另外的实施例中，所考虑的剂型在添加疫苗组合物之前包括具有生物相容性聚合物和/或与文石混合和加工的崩解剂的文石。典型地，在添加疫苗组合物之前，文石用CO2浸渍并与生物相容性聚合物和崩解剂混合。更典型地，文石用CO2浸渍，与生物相容性聚合物和崩解剂混合，并在添加疫苗组合物之前形成(例如压缩)为固体形式。参见，例如，EP2719373和US 2020/0155458。

将疫苗组合物在如本文所披露的文石的所考虑的固体剂型(例如，任选地用CO2、生物相容性聚合物和/或崩解剂浸渍)上负载(例如，与其混合)。在负载疫苗组合物之前或之后，可以将所考虑的固体剂型压缩。典型地，在将疫苗组合物负载在固体剂型上之前，将固体剂型压缩(例如，压实)。在示例性实施例中，将在固体剂型上负载疫苗组合物的压缩的(即，压实的)固体剂型研磨以形成粉末、片剂或胶囊。

关于在疫苗组合物负载之前或之后使用5至500kN之间的压缩力进行固体剂型的压实。优选地，在疫苗组合物负载之前或之后使用6至300kN之间的，最优选地8至200kN之间的压缩力进行固体剂型的压实。更优选地，在疫苗组合物负载之前或之后使用8至100kN、8至50kN、或8至28kN之间的压缩力进行固体剂型的压实。

在示例性实施例中，将CO2偶联的文石与至少一种生物相容性聚合物混合。典型地，CO2偶联的文石比生物相容性聚合物的重量比为约95:5至5:95。在另外的实施例中，生物相容性聚合物是热熔挤出的生物相容性聚合物。示例性的生物相容性聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺66(尼龙)、聚己内酰胺、聚己内酯、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚苯醚/硫化物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸、脂肪族聚酯例如聚羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚葡糖酸酯、聚(二噁烷酮)及其混合物。优选地，生物相容性聚合物树脂是PLA。优选地，生物相容性聚合物是尤特奇L30 D-55(赢创公司)。

在特定实施例中，多个文石颗粒(即，具有或不具有二氧化碳的文石组合物)与生物相容性聚合物的重量比约是95:5至5:95。优选地，多个文石颗粒与生物相容性聚合物的重量比约是80:20至20:80，更优选地70:30至30:70并且最优选地60:40至40:60。例如，多个文石颗粒与生物相容性聚合物的重量比约是50:50。

在另外的实施例中，CO2偶联的文石和生物相容性聚合物还包括在其中混合(例如，加工)的崩解剂。适合的崩解剂的实例包括淀粉(例如，豌豆淀粉)，经修饰的纤维素胶，不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，乙醇酸淀粉酯，微晶纤维素，预胶化淀粉，羧甲基淀粉钠，低取代的羟丙基纤维素，N-乙烯基-2-吡咯烷酮、烷基-、羟基烷基-、羧基烷基-纤维素酯的均聚物，海藻酸盐，和微晶纤维素及其多晶形式。

使用任何常规热熔挤出方法进行多个文石颗粒与生物相容性聚合物以及任选地崩解剂的混合。例如，热熔挤出可以使用带穿孔模的双螺杆热熔挤出机(例如，Three-Tec公司，ZE9 20602，瑞士)进行。用于文石和生物塑料组合物的复合和挤出方法(包括长丝生产)描述于例如，PCT/US20/45451中，其全部内容通过引用并入本文。另外，使用3D打印可以将由生物塑料、文石以及任选地崩解剂制成的挤出的长丝组合物形成有用的或适合的形状。参考图2A和2B，将示例性生物塑料文石(具有40％文石)组合物复合并挤出以制成长丝，然后使用3D打印加工以形成如图所示的文石结构。

根据制造和包装需要，还可以将另外的赋形剂添加到固体剂型中。其他赋形剂可包括离子交换树脂、树胶、甲壳质、壳聚糖、粘土、结冷胶、交联的波拉克林(polacrillin)共聚物、琼脂、明胶、糊精、丙烯酸聚合物、羧甲基纤维素钠/钙、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、虫胶或其混合物、润滑剂、内相润滑剂、外相润滑剂、抗冲改性剂、增塑剂、蜡、稳定剂、颜料、着色剂、香味剂、掩味剂、调味剂、甜味剂、口感改进剂、粘合剂、稀释剂、成膜剂、粘附剂、缓冲剂、吸附剂、气味掩蔽剂及其混合物。

值得注意的是，所考虑的固体剂型负载有用于口服、舌下或口颊施用的疫苗组合物。将疫苗组合物负载或混合至固体剂型(例如，CO2偶联的文石已经与生物相容性聚合物和崩解剂混合)可以通过任何常规方法进行。例如，可以将疫苗组合物负载到混合器(例如翻滚混合器)或掺混器中的固体剂型上。

在示例性实施例中，所考虑的固体剂型负载有用于诱导针对病毒的免疫力的疫苗组合物。如本领域技术人员将容易理解，根据待免疫的疾病/感染(例如病毒)，有多种疫苗类型。例如，其中病原性病毒是冠状病毒(例如，SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及人冠状病毒NL63/HCoV-NL63)，疫苗可以是编码所有或部分冠状病毒ACE2蛋白的重组表达载体。另一方面，其中病原性病毒是脊髓灰质炎病毒，疫苗可以是编码所有或部分CEA蛋白的重组表达载体。在又另一实例中，其中病原性病毒是HIV病毒，疫苗可以是编码所有或部分gp120的重组表达载体。当然，相似的考虑适用于所有其他类型的病原性病毒(例如，流感病毒、鼻病毒、肠病毒、埃可病毒、疱疹病毒等)。

在示例性实施例中，疫苗组合物是SARS-CoV2疫苗(例如，腺病毒构建体)，包括与免疫球蛋白Fc部分偶联的可溶性ACE2蛋白，形成还可以包括J-链部分的ACE2-Fc杂合构建体，如U.S.16/880,804和U.S.63/016,048中披露的，两者的全部内容通过引用并入本文。在其他示例性实施例中，SARS-CoV2疫苗(例如，腺病毒构建体)包括重组可溶性ACE2蛋白(例如，SEQ ID NO:6)的突变变体，其中该突变变体具有至少一个突变的氨基酸残基(例如，通过取代)，其赋予ACE2蛋白对SARS-CoV2刺突蛋白的RBD蛋白结构域的增加的结合亲和力，如U.S.63/022,146中披露的，其全部内容通过引用并入本文。在另一个示例性实施例中，SARS-CoV2疫苗(例如，腺病毒构建体)包括与内体靶向序列融合的CoV2核衣壳蛋白或CoV2刺突蛋白(N-ETSD)，如U.S.16/883,263和U.S.63/009,960所披露，两者的全部内容通过引用并入本文。

优选地，所考虑的剂型负载有疫苗组合物，该疫苗组合物包含编码重组ACE2蛋白的重组表达载体(例如，腺病毒)，如披露于例如U.S.16/880,804中，其全部内容通过引用并入本文。在典型的实施例中，疫苗组合物是与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的重组人ACE2蛋白。

在另外的或可替代的实施例中，相对于SEQ ID NO:2，所考虑的剂型负载有疫苗组合物，该疫苗组合物包含编码重组可溶性ACE2蛋白(例如，SEQ ID NO:6)的重组表达载体(例如，腺病毒)或包括T27F、T27W、T27Y、D30E、H34E、H34F、H34K、H34M、H34W、H34Y、D38E、D38M、D38W、Q24L、D30L、H34A和/或D355L的重组ACE2变体突变体。

在替代的实施例中，文石颗粒表面可以被处理以修饰结合表面。例如，用硬脂酸(即十八烷酸)处理提供疏水表面，如U.S.16/858,548和PCT/US20/29949中所披露。对于蛋白质负载，用磷酸处理文石形成层状结构。用于将反应性基团偶联到文石的氨基酸表面的另外的缀合技术在本领域中是已知的，例如在Bioconjugate Techniques[生物缀合技术],第三版,Greg T.Hermanson,Academic Press[学术出版社],2013中所披露的。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。例如，核酸分子是指一个或多个核酸分子。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。相似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。权利要求书可以经撰写以排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。

实例

实例1

此实例显示了非包衣文石配制品产生良好的病毒回收率(pH稳定性和坚固性的保留(即，糊剂))，然而非包衣乳糖配制品具有较低的病毒回收率，并且因此转换成液体并变成酸性。

胶囊配制品：

将已知病毒滴度的冻干腺病毒载体(Ad5)以1x 10⁹感染单位(IU)/胶囊负载至胶囊中。将乳糖或文石负载至550mg/胶囊的最终总重量。将胶囊在水分控制的条件下密封，并且任选地用阴离子共聚物L30D-55和柠檬酸三乙酯(TEC)包衣。

感染滴度通过Hexon测定来确定：

将E.C7细胞以大约5.0x 10⁵个细胞/孔接种至12孔板，并且在37±2℃下孵育至少2小时。将hAd5构建体在1X DMEM(杜氏改良的伊格尔培养基)中连续稀释。在接种后两至四小时，每孔以一式三份接种100μL稀释的供试品。来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的腺病毒5型(Ad5)参考材料是阳性对照，并且以相同方式处理。阴性对照是单独的100μL稀释剂，并且接种至四个孔中。将板在37℃±2℃下孵育42小时。

Hexon免疫染色：

然后将板用冷甲醇固定10分钟，用1X DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)冲洗，然后通过Hexon免疫染色测定。将小鼠抗Hexon抗体溶液(0.5mL)添加至每个孔中，并且在37℃±2℃下孵育60±6分钟。将板洗涤，并且然后将0.5mL的大鼠抗小鼠抗体溶液添加至孔中，并且在37℃±2℃下孵育60±6分钟。洗涤后，添加新鲜制备的DAB(二氨基联苯胺)工作溶液并且在室温下孵育10分钟。将DAB吸出并且将1.0mL的1X PBS(磷酸盐缓冲液)添加至每个孔中。

使用10倍物镜的光学显微镜在底物显色4小时后可视化染色细胞，捕获和计数整个孔的图像。计算每个孔阳性细胞/菌落的平均数量，并且通过以下式确定感染滴度：

感染单位/mL＝(平均阳性细胞/孔)x稀释因子x 10。

结果显示在图3A-3D中。数据显示使用文石或乳糖复合剂的感染单位/克(无酸(图3A)或有酸(图3C))或病毒回收率百分比(无包封后酸处理(图3B)或有包封后酸处理(图3D)。当暴露于酸时，将与文石复合的样品在>/＝7pH下维持。回收的样品质量(g)在下表1中显示。最终结果是粉末、液体或糊剂。重悬后2分钟并读取三次确定pH。

表1：回收的样品质量

复合剂	回收的样品质量(g)	形式	pH
				文石(C)1	0.357	干燥粉末	8.81
文石(C)5	0.425	干燥粉末	8.84
				乳糖(NC)4	0.8023	液体	2.14
文石(NC)6	0.545	糊剂	7.78
				文石(NC)7	0.629	糊剂	7.79
文石(NC)8	0.801	糊剂	7.00

如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念以提供其他实施例，则可修改实施例的各方面。

可根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，不应将所使用的术语解释为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这些权利要求所享有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本披露的限制。

将本文引用的每个出版物和专利都通过引用以其全文并入本文。

序列表

<110> 南特控股知识产权有限责任公司（Nant Holdings IP, LLC）

南特赛尔公司（NantCell Inc.）

Soon-Shiong, Patrick

Gabitzsch, Elizabeth

Peykov, Victor

<120> 用于黏膜免疫应答的疫苗组合物

<130> 8774-16-PCT

<140> 尚未指定

<141> 2021-10-22

<150> 63/104,770

<151> 2020-10-23

<150> 63/082,907

<151> 2020-09-24

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2病毒

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Lys Arg Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2病毒

<400> 2

Met Ala Gly Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe

85 90 95

Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile

115 120 125

Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile

130 135 140

Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

145 150 155 160

Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu

165 170 175

Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr

195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln

210 215 220

<210> 3

<211> 75

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2病毒

<400> 3

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

65 70 75

<210> 4

<211> 1273

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2病毒

<400> 4

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

Tyr Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 5

<211> 805

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

500 505 510

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

515 520 525

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

530 535 540

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

545 550 555 560

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

565 570 575

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

580 585 590

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

610 615 620

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

625 630 635 640

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

645 650 655

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

660 665 670

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

675 680 685

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

690 695 700

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

705 710 715 720

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

725 730 735

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

740 745 750

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

755 760 765

Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

770 775 780

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

785 790 795 800

Val Gln Thr Ser Phe

805

<210> 6

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 可溶性ACE2突变构建体

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> 可以是Gln或Leu

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> 可以是Thr、Phe、Trp或Tyr

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (10)..(10)

<223> 可以是Asp、Glu、Leu

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> 可以是His、Glu、Phe、Lys、Met、Trp、Tyr或Ala

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (18)..(18)

<223> 可以是Asp、Glu、Met或Phe

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (335)..(335)

<223> 可以是Asp或Leu

<400> 6

Ile Glu Glu Xaa Ala Lys Xaa Phe Leu Xaa Lys Phe Asn Xaa Glu Ala

1 5 10 15

Glu Xaa Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp Lys

35 40 45

Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr Pro

50 55 60

Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala Leu

65 70 75 80

Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg Leu

85 90 95

Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys Val

100 105 110

Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly Leu

115 120 125

Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp Ala

130 135 140

Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu Tyr

145 150 155 160

Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His Tyr

165 170 175

Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly Val

180 185 190

Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu His

195 200 205

Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr Val

210 215 220

Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile Gly

225 230 235 240

Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp Thr

245 250 255

Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile Asp

260 265 270

Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile Phe

275 280 285

Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met Thr

290 295 300

Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val Gln

305 310 315 320

Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Xaa Phe

325 330 335

Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala

340 345 350

His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln

355 360 365

Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val

370 375 380

Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys Ser

385 390 395 400

Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu Ile

405 410 415

Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe

420 425 430

Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu Ile

435 440 445

Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile

450 455 460

Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp Pro

465 470 475 480

Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr Tyr

485 490 495

Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln Ala

500 505 510

Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser Thr

515 520 525

Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser Glu

530 535 540

Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met Asn

545 550 555 560

Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp Leu Lys

565 570 575

Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser Pro

580 585 590

Tyr Ala

Claims (53)

1.一种组合物，该组合物包含冻干腺病毒载体和含有碳酸盐矿物质的填充剂，其中该腺病毒载体包含编码异源蛋白质的至少一部分的核酸分子。

2.如权利要求1所述的组合物，其中该腺病毒载体来源于5型腺病毒，并且其中该腺病毒具有在E1、E2b和E3区域中的缺失。

3.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该异源蛋白质来自病毒。

4.如权利要求3所述的组合物，其中该异源蛋白质来自选自由以下组成的组的病毒：SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HKU1和流感病毒。

5.如权利要求4所述的组合物，其中该异源蛋白质来自SARS-CoV-2。

6.如权利要求5所述的组合物，其中该异源蛋白质是刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白或膜(M)蛋白。

7.如权利要求6所述的组合物，其中该异源蛋白质与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4具有至少80％、任选地至少85％、任选地至少90％、任选地至少95％、任选地至少97％、或甚至100％同一性。

8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该腺病毒载体具有0.5％与5％之间的残留水分含量。

9.如权利要求8所述的组合物，其中该腺病毒载体具有小于5％的残留水分。

10.如权利要求9所述的组合物，其中该腺病毒载体具有小于3％的残留水分。

11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该碳酸盐矿物质具有斜方晶格。

12.如权利要求11所述的组合物，其中该碳酸盐矿物质选自由以下组成的组：文石、白铅矿、菱锶矿、碳酸钡矿和纤碳铀矿。

13.如权利要求12所述的组合物，其中该碳酸盐矿物质是文石。

14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该填充剂包5含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。

15.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该填充剂缺乏选自由以下组成的组的一种或多种化合物：乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、0葡萄糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、右旋糖、麦芽糖糊精、麦芽糖醇和植物纤维素。

16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中该组合物包含选自由以下组成的组的一种或多种化合物：氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠、磷酸钠、蔗糖、二甲基甘氨酸、甘氨酸、甲基磺酰甲烷和酵母5裂解物。

17.一种胶囊，该胶囊包含如前述权利要求中任一项所述的组合物。

18.如权利要求17所述的胶囊，其中该胶囊是经肠溶包衣的。

19.如权利要求17或18所述的胶囊，其中该胶囊包含海藻酸0盐。

20.一种用于通过口服、舌下或口颊施用疫苗组合物来递送该疫苗组合物的固体剂型，该固体剂型包含：

含有多个文石颗粒的文石组合物，其中用二氧化碳(CO2)浸渍该多个文石颗粒；以及

5与该文石组合物混合的生物相容性聚合物和崩解剂；

其中该固体剂型进一步包含该疫苗组合物，并且

其中该固体剂型是粉末、片剂或胶囊。

21.如权利要求20所述的固体剂型，其中该固体剂型进一步包含至少一种赋形剂并且被配制以形成锭剂。

22.如权利要求20所述的固体剂型，其中该多个文石颗粒具有100nm至1mm的平均粒度。

23.如权利要求20-22中任一项所述的固体剂型，其中该生物相容性聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺66(尼龙)、聚己内酰胺、聚己内酯、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚苯醚/硫化物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸、脂肪族聚酯例如聚羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚葡糖酸酯、聚(二噁烷酮)及其混合物。

24.如权利要求23所述的固体剂型，其中该生物相容性聚合物是PLA。

25.如权利要求20-24中任一项所述的固体剂型，其中该崩解剂选自淀粉，经修饰的纤维素胶，不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，乙醇酸淀粉酯，微晶纤维素，预胶化淀粉，羧甲基淀粉钠，低取代的羟丙基纤维素，N-乙烯基-2-吡咯烷酮、烷基-、羟基烷基-、羧基烷基-纤维素酯的均聚物，海藻酸盐，和微晶纤维素及其多晶形式。

26.如权利要求25所述的固体剂型，其中该崩解剂是豌豆淀粉。

27.如权利要求20-26中任一项所述的固体剂型，其中该粉末、该片剂和该胶囊在不到30秒内在水溶液中崩解。

28.如权利要求20-27中任一项所述的固体剂型，其中该疫苗组合物包含编码病毒蛋白或其片段的重组病毒表达构建体。

29.如权利要求28所述的固体剂型，其中该病毒蛋白或其片段对应于冠状病毒蛋白或其片段。

30.如权利要求29所述的固体剂型，其中该冠状病毒蛋白或其片段是SARS-CoV2病毒结合蛋白。

31.如权利要求30所述的固体剂型，其中该SARS-CoV2病毒结合蛋白包含重组ACE2蛋白。

32.如权利要求31所述的固体剂型，其中该重组ACE2蛋白与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性。

33.如权利要求32所述的固体剂型，其中该重组ACE2蛋白包含SEQ ID NO:6的序列。

34.如权利要求33所述的固体剂型，其中该重组ACE2蛋白包含选自T27F、T27W、T27Y、D30E、H34E、H34F、H34K、H34M、H34W、H34Y、D38E、D38M、D38W、Q24L、D30L、H34A和D355L的至少一个突变。

35.如权利要求20-34中任一项所述的固体剂型，其中该疫苗组合物包含腺病毒表达构建体。

36.一种制备用于负载疫苗的固体剂型的方法，该方法包括：

提供文石组合物，该文石组合物包含用二氧化碳(CO2)浸渍的多个文石颗粒；

将该文石组合物与生物相容性聚合物和崩解剂混合以形成该固体剂型；以及

将疫苗组合物添加至该固体剂型中。

37.如权利要求36所述的方法，其中将该文石组合物与该生物相容性聚合物和崩解剂的混合包括热熔挤出。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中该固体剂型是粉末、片剂或胶囊。

39.如权利要求38所述的方法，其中该固体剂型是片剂，并且其中该方法进一步包括将该固体剂型压实。

40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中该文石组合物和该生物相容性聚合物的重量比是在95:5至5:95之间。

41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中该多个文石颗粒具有100nm至1mm的平均粒度。

42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中该生物相容性聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺66(尼龙)、聚己内酰胺、聚己内酯、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚苯醚/硫化物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乳酸、脂肪族聚酯例如聚羟基丁酸酯、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚葡糖酸酯、聚(二噁烷酮)及其混合物。

43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中该生物相容性聚合物是PLA。

44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中该崩解剂选自淀粉，经修饰的纤维素胶，不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，乙醇酸淀粉酯，微晶纤维素，预胶化淀粉，羧甲基淀粉钠，低取代的羟丙基纤维素，N-乙烯基-2-吡咯烷酮、烷基-、羟基烷基-、羧基烷基-纤维素酯的均聚物，海藻酸盐，和微晶纤维素及其多晶形式。

45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其中该崩解剂是豌豆淀粉。

46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物包含编码病毒蛋白或其片段的重组病毒表达构建体。

47.如权利要求46所述的方法，其中该病毒蛋白或其片段对应于冠状病毒蛋白或其片段。

48.如权利要求47所述的方法，其中该冠状病毒蛋白或其片段是SARS-CoV2病毒结合蛋白。

49.如权利要求48所述的方法，其中该SARS-CoV2病毒结合蛋白包含重组ACE2蛋白。

50.如权利要求49所述的方法，其中该重组ACE2蛋白与SEQ ID NO:5具有至少85％序列同一性。

51.如权利要求50所述的方法，其中该重组ACE2蛋白包含SEQ ID NO:6的序列。

52.如权利要求51所述的方法，其中该重组ACE2蛋白包含选自T27F、T27W、T27Y、D30E、H34E、H34F、H34K、H34M、H34W、H34Y、D38E、D38M、D38W、Q24L、D30L、H34A和D355L的至少一个突变。

53.如权利要求36-52中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物包含腺病毒表达构建体。

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