CN116343919B - 一种全基因组图谱绘制测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全基因组图谱绘制测序方法，该方法包括如下步骤：S1：对全基因组进行测序，并进行组装；S2：进行stLFR测序，得到高通量NGS的长读长映射数据；S3：判断是否有参考序列，若有参考序列，则进行有参组装；若无参考序列，则进行无参组装。本发明可实现高效率、高准确度、低成本的全基因组基因图谱绘制。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种全基因组图谱绘制测序方法。
背景技术
当前基因测序技术高速发展，人民收入水平与生活质量快速提升，对于个体基因检测与精准医疗需求凸显。同时，对于更多物种基因破解工作也逐步进入了爆发期，对于无参基因组装的需求激增。随着分子育种、基于基因组学的中药资源保护工作的持续推进，对于高质量全基因组图谱需求市场逐渐扩大。
当前基因图谱绘制基本采用完全高深度测序后统一组装分析，数据浪费严重，经济效益差，分析难度大。NGS测序一般需进行PCR，导致扩增后各read序列含量不一，测序时部分序列无法有效覆盖，故需进行靶向测序以减少基因图谱出现断点。一般深度测序对于部分特殊性序列测序深度难以达到4X以上，需在实验流程中设计以提高有效覆盖率，保证顺利完成变异分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种全基因组图谱绘制测序方法，以解决如何提高全基因组绘制效率，避免测序数据浪费，以及基于OLC或DBG方法组装的基因错误，提高基因测序准确率的技术问题。
本发明是采用以下技术方案实现的：一种全基因组图谱绘制测序方法，包括如下步骤：
S1：对全基因组进行测序，并进行组装；
S2：进行stLFR测序，得到高通量NGS的长读长映射数据；
S3：判断是否有参考序列，若有参考序列，则进行有参组装；若无参考序列，则进行无参组装。
进一步的，步骤S1具体为：进行高通量NGS或中短读长测序，测序深度为n-100nX，其中n为物种染色体数目。
进一步的，采用DNAParse短读长组装算法或NGS组装算法进行粗略组装。
进一步的，所述有参组装包括如下子步骤：
S311：进行靶向测序和Denovo组装，得到scaffold；
S312：将得到的scaffold与参考序列进行比对，并还原到原始位置；
S313：定制探针/引物，进行基因补测，完成组装并输出相关数据。
进一步的，步骤S311包括如下子步骤：
S3111：运用预先设置的捕获探针对测序序列进行捕获，并进行高通量NGS高深度靶向测序；
S3112：运用预先设置的捕获探针对多碱基变异区域进行捕获，并进行长读长的靶向测序；
S3113：运用DNAParse短读长组装算法，和/或DNAParse NGS长读长算法，和/或DNAParse长读长组装算法进行Denovo组装，得到scaffold。
进一步的，步骤S313包括如下子步骤：
S3131：通过步骤S312得到gap区间，并定制特异化探针/引物；
S3132：运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测；
S3133：根据补测数据填补现有基因组gap区间，得到高质量、低gap的全基因组图谱。
进一步的，所述无参组装包括如下子步骤：
S321：进行长读长测序及组装，得到基因骨架；
S322：进行高通量NGS序列与长读长序列比对，并进行Hi-C测序和Bionano测序；
S323：进行基因组装与染色体挂载，并定制探针/引物，进行基因补测，完成组装并输出相关数据。
进一步的，步骤S321包括如下子步骤：
S3211：运用长读长测序进行高深度测序；
S3212：运行DNAParse长读长组装算法进行Denovo组装，得到基因骨架。
进一步的，步骤S322包括如下子步骤：
S3221：运用DNAParse NGS长读长组装算法进行Denovo组装，得到实际scaffold序列；
S3222：进行高深度Hi-C测序，对无参基因组的三维基因结构进行测序；
S3223：进行Bionano测序，用于辅助基因组装与纠错。
进一步的，步骤S323包括如下子步骤：
S3231：运用步骤S322的数据完成染色体挂载与组装，并得到gap区间；
S3232：通过步骤S3231得到gap区间，并定制特异化探针/引物；
S3233：运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测；
S3234：根据补测数据填补现有基因组gap区间，得到高质量、低gap的全基因组图谱。
本发明的有益效果在于：本发明基于Sanger测序、NGS测序、Pacbio测序、Nanopore测序、Bionano测序、Hi-C测序等相结合实现了高效率、高准确度、低成本的全基因组基因图谱绘制，为其他重要的科研、医学、产业应用，如精准医疗、动植物保护、药物研发、中药挖掘、分子育种等开展提供了基础。
本发明与DNAParse算法高度结合，先使用NGS数据得到各read建基本的网络状图（应重复序列较多，因此此时的图复杂度极高互相牵连），然后运用stLFR技术，有效将数百至数千条read解开，快速解图。既解决了NGS测序较短导致重复序列过多难以解决的问题，也发挥了stLFR技术优势。
本发明针对于无参基因组，运用高错误率的长读长数据数据搭建骨架，结合DNAParse算法优势，搭建了易于计算、效率更高的基因骨架，实现了stLFR数据的快速匹配。
本发明运用了探针/引物，有效减少了gap区间，提高了基因组质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
参见图1，一种全基因组图谱绘制测序方法，包括两种情况，第一，有参考序列的情况下；第二，无参考序列的情况下。
有参考序列的情况下：
步骤一，进行高通量NGS或其余中短读长测序（测序长度不超过100KB）测序。测序深度为n-100nX（n为该物种染色体数目，一般采用10X深度测序，优先采用PCR-free方式建库以消除PCR偏好引起的测序深度误差）。完成测序后运用DNAParse短读长组装算法或其余NGS组装算法进行粗略组装。（DNAParse短读长组装算法即基于数值化特征表达的组装算法；其余NGS组装算法包括OLC算法和DBG算法在内的基因组装算法等）
步骤二，进行stLFR测序，得到NGS的长读长映射数据。
步骤三，运用预先设置好的捕获探针对难测序序列进行捕获，并进行NGS高深度靶向测序，进一步补充序列的各类变异情况，并对数据进行校准。
步骤四，运用预先设置好的捕获探针针对多碱基变异区域进行捕获，并进行长读长的靶向测序（如Pacbio、Nanopore、Sanger等中长读长测序技术）。
步骤五，将上述四个步骤的数据运用DNAParse短读长组装算法、DNAParse NGS版长读长算法、DNAParse长读长组装算法等算法进行Denovo组装，得到scaffold。（DNAParseNGS版长读长算法指基于stLFR测序方法组装长片段的方法，DNAParse长读长组装算法指基于小波变换的长读长测序组装方法）
步骤六，将得到的scaffold与参考序列比对，并还原到原始位置。
步骤七，得到gap区间，并按需定制特异化探针/引物。
步骤八，运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测。（第七步与第八步需根据实际基因组组装情况及实验要求进行多轮）
步骤九，根据补测数据填补现有基因组gap区间，从而得到高质量、低gap的全基因组图谱。
无参考序列的情况下：
步骤一，进行高通量NGS或其余中短读长测序（测序长度不超过100KB）测序。测序深度为n-100nX（n为该物种染色体数目。一般采用10X深度测序，优先采用PCR-free方式建库以消除PCR偏好引起的测序深度误差）。完成测序后运用DNAParse短读长组装算法或其余NGS组装算法进行粗略组装。
步骤二，进行stLFR测序，得到NGS的长读长映射数据。
步骤三，运用运用长读长测序（如Pacbio、Nanopore等长读长测序技术）手段进行高深度测序（一般为20-30X）。
步骤四，运用DNAParse长读长组装算法等算法进行Denovo组装，得到基因骨架。
步骤五，将上述第一、第二和第三步骤的数据运用DNAParse NGS版长读长组装算法等算法进行Denovo组装，得到实际scaffold序列。
步骤六，进行高深度Hi-C测序（一般为100X），对无参基因组的三维基因结构进行测序。
步骤七，进行Bionano测序，用于辅助基因组装与纠错。
步骤八，运用第五至第七步的三个步骤的数据完成染色体挂载与进一步组装，并得到gap区间。
步骤九，得到gap区间，并按需定制特异化探针/引物。
步骤十，运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测。（第九步与第十步需根据实际基因组组装情况及实验要求进行多轮）
步骤十一，根据补测数据填补现有基因组gap区间，从而得到高质量、低gap的全基因组图谱。
基于上述实施例，本发明至少具有以下技术效果：
1、大幅降低了基因组从头测序成本，助力了高质量基因图谱的绘制工作。
2、充分利用现有各测序手段的技术优势，提高了基因组装效果。
3、避免了不必要的测序深度浪费，节约实验成本。
4、所组装的基因较传统方法较易达到T2T级或近T2T级。
5、可以有效完成多倍体基因组装。
6、算力成本大幅下降，充分利用算法与冯诺依曼计算机架构优势。
7、实验流程较为简化，有利于标准化自动化实验，进一步降低实验误差和实验人员培训难度。
8、基因组装的准确率高，错误Read比例低于0.1%，较传统方法大幅提升。
9、充分利用率stFLR测序优势，解决了二代数据因重复序列过多导致的长度难以有效延申的问题。
10、本发明可以不用ONT测序而只用stLFR测序。
需要说明的是，对于前述的实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某一些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例属于优选实施例，所涉及的动作并不一定是本申请所必须的。
上述实施例中，描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对全基因组进行测序，并进行组装；步骤S1具体为：进行高通量NGS或中短读长测序，测序深度为n-100nX，其中n为物种染色体数目，并采用DNAParse短读长组装算法或NGS组装算法进行粗略组装；
S2：进行stLFR测序，得到高通量NGS的长读长映射数据；
S3：判断是否有参考序列，若有参考序列，则进行有参组装；若无参考序列，则进行无参组装；所述有参组装包括如下子步骤：
S311：进行靶向测序和Denovo组装，得到scaffold；
S312：将得到的scaffold与参考序列进行比对，并还原到原始位置；
S313：定制探针/引物，进行基因补测，完成组装并输出相关数据；
所述无参组装包括如下子步骤：
S321：进行长读长测序及组装，得到基因骨架；
S322：进行高通量NGS序列与长读长序列比对，并进行Hi-C测序和Bionano测序；
S323：进行基因组装与染色体挂载，并定制探针/引物，进行基因补测，完成组装并输出相关数据。
2.如权利要求1所述的一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，步骤S311包括如下子步骤：
S3111：运用预先设置的捕获探针对测序序列进行捕获，并进行高通量NGS高深度靶向测序；
S3112：运用预先设置的捕获探针对多碱基变异区域进行捕获，并进行长读长的靶向测序；
S3113：运用DNAParse短读长组装算法，和/或DNAParse NGS长读长算法，和/或DNAParse长读长组装算法进行Denovo组装，得到scaffold。
3.如权利要求1所述的一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，步骤S313包括如下子步骤：
S3131：通过步骤S312得到gap区间，并定制特异化探针/引物；
S3132：运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测；
S3133：根据补测数据填补现有基因组gap区间，得到高质量、低gap的全基因组图谱。
4.如权利要求1所述的一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，步骤S321包括如下子步骤：
S3211：运用长读长测序进行高深度测序；
S3212：运行DNAParse长读长组装算法进行Denovo组装，得到基因骨架。
5.如权利要求1所述的一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，步骤S322包括如下子步骤：
S3221：运用DNAParse NGS长读长组装算法进行Denovo组装，得到实际scaffold序列；
S3222：进行高深度Hi-C测序，对无参基因组的三维基因结构进行测序；
S3223：进行Bionano测序，用于辅助基因组装与纠错。
6.如权利要求1所述的一种全基因组图谱绘制测序方法，其特征在于，步骤S323包括如下子步骤：
S3231：运用步骤S322的数据完成染色体挂载与组装，并得到gap区间；
S3232：通过步骤S3231得到gap区间，并定制特异化探针/引物；
S3233：运用特异化探针/引物基于各类测序平台进行高深度补测；
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| 全基因组测序技术研究及其在木本植物中的应用;刘海琳等;南京林业大学学报(自然科学版)(第05期);全文 * |
| 刘海琳等.全基因组测序技术研究及其在木本植物中的应用.南京林业大学学报(自然科学版).2018,(第05期),全文. * |
| 长读长测序技术在宏基因组学研究中的应用;孙丹等;生命科学(第08期);全文 * |
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