CN116334083A - 花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用 - Google Patents

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乔利仙
李晶晶
黄建斌
刘文平
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Dongying Qingnongda Saline Alkali Land High Efficiency Agricultural Technology Industry Research Institute
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Abstract

本发明公开了一种花生U6启动子及其在花生CRISPR‑Cas9基因编辑中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明的花生U6启动子为AhA3U6或AhB9U6，核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。将启动子AhA3U6和AhB9U6替换pBGK041‑GmU6载体中的GmU6启动子，对花生PEPC1基因进行基因编辑，结果表明，采用含有花生U6启动子的基因编辑载体的编辑效率显著高于GmU6启动子，且AhA3U6优于AhB9U6，因此，采用AhA3U6启动子为进一步提高花生的编辑效率，构建花生高效基因编辑系统奠定基础。

Description

花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用。
背景技术
CRISPR/Cas9编辑系统是目前使用最广泛的基因编辑工具，利用该系统可以实现对目标基因的定点编辑，进而改变相关表型性状。运用该技术目前已经在水稻、小麦、玉米三大作物上实现了高效精确的单碱基定点突变，并显著提高了水稻白叶枯病抗性等相应表型性状。利用该技术首先需要构建有效的编辑载体，载体中含有根据靶基因序列设计的sgRNA(guide RNA)以及Cas9蛋白编码序列，Cas9蛋白在sgRNA的引导下可实现对目的基因的精确修饰，因此sgRNA(guide RNA)的转录水平以及Cas9蛋白的翻译水平直接影响到靶基因的编辑效率。
目前针对单子叶植物的编辑载体主要使用OsU3、AtU6、ZmU6等启动子来驱动sgRNA的转录，而双子叶植物则主要使用AtU3、GmU6等启动子驱动sgRNA的转录。将目前含有常用启动子如OsU3、GmU6等编辑载体转入其它异源受体植物，在受体物种中外源启动子驱动的sgRNA的转录水平可能会受到一定程度的抑制，并进一步影响到靶基因的编辑效率。因而针对于特定的受体物种，选择高效率的启动子并设计包含该启动子的编辑载体，是提高受体物种编辑效率的有效手段。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用。
一种花生U6启动子，所述花生U6启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
核酸序列如SEQ ID NO:1所示的启动子AhA3U6或核酸序列如SEQ ID NO:2所示的启动子AhB9U6在提高花生CRISPR-Cas9基因编辑效率中的应用。
一种花生CRISPR-Cas9基因编辑载体，所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中的启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个具体的实施例中，所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体是将pBGK041-GmU6载体中的GmU6启动子替换为AhA3U6或AhB9U6获得。
上述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体在花生基因编辑中的应用。
一种花生CRISPR-Cas9基因编辑的方法，步骤如下：
将目标基因靶位点的核酸序列构建到上述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒；将CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒转化到农杆菌中，制备侵染液，侵染花生，筛选阳性转化株，实现花生目标基因的CRISPR-Cas9基因编辑。
在一个具体的实施例中，所述农杆菌侵染花生的方法为发根农杆菌转化法或花粉管通道转化法。
在一个具体的实施例中，所述发根农杆菌转化法中采用的农杆菌为发根农杆菌，所述花粉管通道转化法中采用的农杆菌为根癌农杆菌。
一种花生PEPC1基因的编辑方法，设计花生PEPC1基因的靶位点序列，将靶位点的核酸序列构建到权利要求3或4所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒；将CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒转化到农杆菌中，制备侵染液，侵染花生，筛选阳性转化株，实现花生目标基因的CRISPR-Cas9基因编辑。
在一个具体的实施例中，所述花生PEPC1基因的靶位点序列是根据Aradu.A52DW和Araip.RUX3H基因序列设计的，两者共有的一段碱基序列；其中，所述Aradu.A52DW基因的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述Araip.RUX3H基因的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
一种快速验证花生CRISPR-Cas9基因编辑效率的方法，步骤如下：
将靶位点的核酸序列构建到花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得花生CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒，将重组质粒转化到发根农杆菌中，以发根农杆菌转化法侵染切除下胚轴及根的花生苗，侵染完成后，将花生苗置于Basta浓度为0.75mg/L的水溶液中培养长出新根；切取新长出的发根提取DNA，用于转基因阳性的筛选和基因编辑效率的检测；切去发根的花生苗诱导愈伤组织后置于Basta浓度为4.5mg/L的水溶液中培养，发根再生。
本发明技术方案的优点
本发明克隆获得两个花生自身U6启动子AhA3U6和AhB9U6，将花生的U6启动子替换原载体中的GmU6启动子，构建含有花生自身启动子驱动的sgRNA的编辑载体。采用含有花生U6启动子AhA3U6和AhB9U6的CRISPR-Cas9基因编辑载体对花生PEPC1基因进行基因编辑，结果表明，采用含有花生U6启动子的CRISPR-Cas9基因编辑载体进行基因编辑的效率显著高于GmU6启动子，且AhA3U6优于AhB9U6，因此，采用AhA3U6启动子为进一步提高花生的编辑效率，进而构建花生高效基因编辑系统奠定基础。
附图说明
图1CRISPR-Cas9载体图谱和重组载体构建基本流程；
图2CRISPR-Cas9重组载体的鉴定(其中，M：DL2000 marker；1：H2O；2：pBGK041-GmU6-AhPEPC1；3：pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1；4：pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1)；
图3花生发根Basta筛选压的确定；
图4花生发根遗传转化步骤(其中，A：花生籽仁水培10d的小苗；B：切掉下胚轴及根部的小苗上部；C：发根农杆菌侵染悬浮液侵染10-15分钟；D：暗培养一夜；E：在0.75mg/LBasta水溶液中培养10d后的未转基因对照植株；F：在0.75mg/L Basta水溶液中培养10d后的转基因植株；G-H：放大图)；
图5CRISPR-Cas9载体转化花育23发根的PCR阳性电泳图(其中，M：DL2000 marker；1：pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1质粒；2：WT；3：pBGK041-GmU6-AhPEPC1；4：pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1；5：pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中，
花育23号由青岛农业大学花生分子育种研究室保存；
线性载体pBGK041-GmU6购自百格生物公司；
发根农杆菌Ar.1193、根癌农杆菌(GV3101)购自唯地生物公司(上海)；
Basta(草铵膦，PPT)购于生工生物公司(Sangon Biotech，上海)。
实施例1
花生U6启动子的克隆
提取花育23号的基因组DNA，作为PCR模板，采用特异性引物PCR克隆花生U6启动子。PCR产物经凝胶电泳法分离，回收和纯化目的条带；纯化后连接到TaKaRa的pMD18-T载体中，即得pMD 18-T Vector-AhA3U6和pMD 18-T Vector-AhB9U6；再转化到DH5α，挑取单克隆后进行PCR鉴定。提取阳性克隆的质粒；酶切验证后，送生工生物公司进行测序。
所克隆获得的启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1(5’→3’)
CCTTGGTGAAATATTATCCATCGTGGACTGGTTTTCCTTGATAGATGATGTTCATATGCTGGCAAGGCTTTGGTTTTTATTTCTTCCAACTTATAAATGAGGTATGATTCAAATGTATCCTTTCTTGGTAGAGCCTTAATAATGGGAAGATCTATTAGAAATATACACATGTTCCCTAGCTACAATGTTCTCTTCTCATTCTTCTAATTCATAGATATGGAGATTGATGTAAAATGATTTCATAAATATTGAAATTATATCAAAATGTTTGATACATTCTGGCTAGCAAATCATCTGCTTCTGAGAGAAAGGTGATGCCTCTGGTTCTCCATTATTTGGTTTCATGAAGGTGATTCCAATTATTTTCAGCTGAGTGGAAGGTAGAACTTGACCCAAAAATGTATGATATCCTCCTTATTTTGTGCTGTGGGTTTCAAAAGAAGCTCTTTTAGAAGTACCACATCGAGTAGTATTACGTCCCTCTGACAGAATATATGGCAGAGGGAGCATAGAAGGCTT
SEQ ID NO:2(5’→3’)
GTCAAAAGTCAAAACGCTTTTAATTTATGACATAATTGCAACAAATTAAACACCTTATAGCATGAGTCAGATTTTGATTGTTTCTGGTGAGACATATTGACAGTGGTGTACATTTGCAAATAATTGATTATTTTATTATGTGAAAAATTTTATATTTGATTATATTTATAGGATAATTTGAAGTTGCTTATGTTGGTTGTTGGAGGACAATTTCTATTAATTATAACCTTTTCATTCTATTTACTAGTTACTAATTTGTCTTGTTCATTCATAAAAAAATGAGAGCAGTAGGAATAATAGAAGGATAACCTGAAATGGCTATGCATGCAACCACCAACAAGGCAGAACCACCGAAATGAACACAGAAACCACACAACTAGTTGTATCCCCTCCTTCATTTTTCATAAAGCGAGGTTGAGAACTTGTTGATATTCTTCAGCTGCTCTCAATGGCAAACAAGTCTCACATCGCCCAAGTTTTGAGAAACCAATAATTTATATATAAGAGGCGAATGCAAAGGCTC
所采用的特异性引物的核酸序列如下：
A3-F:5′-CCTTGGTGAAATATTATCCA-3′(SEQ ID NO:3)；
A3-R:5'-AAGCCTTCTATGCTCCCTC-3'(SEQ ID NO:4)；
B9-F:5'-GTCAAAAGTCAAAACGCTTT-3'(SEQ ID NO:5)；
B9-R:5'-GAGCCTTTGCATTCGCCTCT-3'(SEQ ID NO:6)。
实施例2
花生CRISPR-Cas9基因编辑载体的构建
以下以Aradu.A52DW和Araip.RUX3H的CRISPR-Cas9基因编辑载体的构建为例，进行说明：
将Aradu.A52DW和Araip.RUX3H基因序列的CDS区输入到CRISPR-Cas9靶位点设计网站(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/SCORE)，注意CDS输入应按照实际CDS序列在基因中的分段分别输入网站中。在给出的靶位点序列中，试验所选靶位点应按照score尽可能的高(最低>0.5)，CG范围在40％-60％，尽可能的都在CDS部分，尽可能靠近5′上游等原则进行选择。确定靶位后，进行比对，保证靶位点在目的基因中是连续的，在其它同源基因中是不含有该序列的，符合这些条件即可初步选定为靶位点。另外，本实施例所选择的靶位点是两个靶基因所共有的一段碱基序列。
其中，所述Aradu.A52DW基因的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，Araip.RUX3H基因的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7(5’→3’)
ATTAGTTTCACATGCCGTTTCCAAGCACACTCTCCTCTTCTCTGTGTGTCTTTCCGTGATAATAGGAGTTTCTTTCAGTTACTAATAACTCTATCAGCTTCTTCTTCTTTTCTTTTCTATGCACTTTCTCGTGCCCACATCGTAAGCACCCTTCTAGCAACAACATCTTTCATCTACGGTGTGTCACGGGATTAATCTCTCTCACTCTCTGTAGTATTCTTTTTTCTTTTAATAGATTAATTTTCTGAGGTCACTGTTATACAGTAACAAGAAATAGATTGTTGTGAAGCTTTGTGGGGTCATACATATATTTATTTGCATGAATTGAATTGTTGTTATAATACAGATATAAAAATAGAACAAAGAAACGCACATAGTTTTTTGTGAGGAAGGACTAAGATGGCAGCTACTAGTAGGAACATTGAGAAGATGGCTTCAATTGATGCTCAGCTGAGGTTGCTGGCACCAAGGAAGGTTTCTGATGATGACAAGCTTGTTGAGTATGATGCTTTGTTGCTTGATCGATTCCTTGACATTCTTCAGGATTTGCATGGTGAAGATATCAGGCAAACGGTAATTCACCTCAATTTTCTATCAAGGACTTTACTTTTGGTTTAATTTTAGCTGATTTCTTAAACCCCATTTCGAATTTCATGGAAAGATTAATCCTTGTTGGTGTTTGGACGTTTCCCTTTTGATTTGTATGGTAGTGTGTCCCCTGGATTTGAGAAATTTTCACTTTTCCAATCTTTAGTTGAATATACAGTTTTCAAATTACTCTGTAGATTTTTGCTCTGTGTCACTATCATGGTAGTACTTCAATGTTTCAGCTGCATTTACTCGTAATTTTTCTTCAATTGTAGCAATTGGAATGCAAGAGAAACGTTAATCTAGAACCAGGGGCCTTTACTCTTTTTGATTTTGTTTTAGAGCCATAAGTAAATGCAAACTCTTAAGTAAATAAATTCAGTTCCACTTTGATATGATGCACAAAATCTGCTCCTTTTTTTCTTTCCTGGTAATATTTTGATCTATTGACTCTAGAAAAGAGGGGAGAAGTTTAATATGCACAAGTACTCTCAAACATGTTACATACTAAGGATTGGCACTGACTCAAAAAGAGGAACCAAATATTCCGCTTTGTTTTGTAATTTTTTCTTTCTTTGTTATTTTCCTGTTGTGGCTTATAGTTTCAACAATTTGATGCTTAATAGGTTCAAGATTGTTATGAGCTTTCAGCTGAGTATGAAGGGAAGCATAAGACTGAGAAGTTGGAGGAACTTGGGAATATGCTAACTGGTCTTGATGCTGGGGATTCTATTGTCATTGCCAAATCATTTTCCCACATGCTTAATTTGGCTAACTTGGCAGAAGAAGTCCAAATTGCCTACCGAAGAAGGATTAAGCTATTAAAGAAGGGCGATTTTGCTGATGAGAACTCTGCCATCACTGAATCTGACATTGAAGAAACCTTCAAGAGGCTTGTGACTGAACTGAAGAAGTCCCCACAGGAAGTGTTTGATGCTTTGAAGAACCAAACTGTAGATTTGGTCCTAACTGCTCATCCCACTCAGTCCATTCGTCGATCTCTGCTGCAAAAGCATGGAAGGTTTGTCACTGGACTCGGGAATAATTATAGTCCATTAACTGCGAATTCAATTCACCAGAATCTGGAAATCATTGATCTCATTGGTAATCATTGTCCTCTTTTTTCAGGATAAGGAACTGTCTGACACAGTTGTATGCGAAAGACATAACACCGGATGATAAGCAGGAACTTGATGAGGCTCTCCAAAGAGAGGTGCATTCTTGATTCTGTGTACTGTTATGCATTTCGGTTTCTTTTCTTATTTGTTGTCAGCTGTATATGATTTCTATTACCATTTCCCTTTGATATGTCAGTAAATTTTATGGTTTCAAATTTTTGGTTACATATATGTGGCTATGTTTATGGTAAAGCAATGGCTCTAAAGATGTTTCTCTCATGCAGATTCAAGCTGCATTTCGCACAGATGAAATTCGAAGGAGTCCTCCAACACCACAAGATGAGATGAGGGCAGGAATGAGCTACTTTCATGAGACAATATGGAAAGGTGTACCAAAGTTTTTGCGCCGTGTTGACACAGCTCTGAAGAACATCGGAATAAATGAGCGTGTCCCATACAATGCCCCTCTTATTCAATTCTCTTCTTGGATGGGAGGAGATCGTGATGGTACCTTACTTTTTTTTCCCAAAAATTAGCACACAAACTTATTTCTCGTTAAATCTCAAACTTAATTATCTTCAAAGTATTCATGTGGCATGGATTTAAAATATCTTAACCTCATCCATGATGCTTCGCTATTTCTTTGTTTGTTTTTCTTTTGAGTTTTGATTCTCAGCTTCATATGTATAATGTCCATTACAGGTAACCCTAGGGTAACCCCTGAAGTTACAAGGGATGTGTGTTTGCTGGCTAGAATGATGGCTGCTAATTTATACTTCTCTCAGATAGAAGATCTCATGTTTGAGGTATCAAATATGCTGCTATTATAACAATGTATTTGGTATGTAATTTTGTGAAAGCATTAAAAGCATGATTCTTAAATTATTGATTCTATCTGCATTTTTAGTTGTCTATGTGGCGCTGCAATGATGAGCTTCGTGTTCGTGCTGATGAACTCCATGTGTCCTCAAGGAGAGATGCAAAACATTACATTGGTATGTTCTACTTTTCTCTGAACTGCATAATGAACTATTGAAATCTTCATTGGAATCTACAAAACTGAACTGTTCACACCTATTGATTCATTTAGAGTTGAATACTTGGCAAGTAAAATTCAGTTGCTCTTGAATGTCATTCATTGTAATAATTTCTTCATTCCCTCAGAATTTTGGAAGCAGATTCCTCCAAATGAGCCATATCGTGTTATTCTTGGTGATGTGAGGGACAAACTATACAATACACGCGAACGTGCTCGCCAGTTATTAGCCAATGGAACCTCTGACATCCCCGAAGAGACAACCTTCACAAATGTTGAGCAGGTATTGTCCTCAGAACAGCCCTATAAACTGCAATCACCTTATGGTTTGTAGTCACATACTGAGTTCCTTCTTTACCGTGGTACTTTCTAATTTTTATGGACACTTATAATTACCTATATCATACATATTTATGTTGCTCCTTAAAATTGATTTCTTATGTTTTTTATTTCATTCAGAGTAGTAAATCCATGATTCACAAAGGACAATACAAAATGCATGGCAATATATGTTAAAACACTATTTGACTCCAATTCATTTCTTGCAGTTCCTGGAGCCCCTTGAACTCTGCTATAGATCACTCTGCGCATGTGGTGATCGACCAATAGCAGATGGTAGCCTTCTTGATTTCTTGCGGCAAGTTTCCACATTTGGACTCTCAATGGTAAGACTCGACATTCGTCAAGAGTCAGACCGGCACACTGATGTCATGGATGCCATTACCAAACACTTGGAGATTGGATCATACCGAGAGTGGTCTGAGGAACGCAGGCAGGAATGGCTTCTGTCAGAGCTCAGTGGAAAGCGCCCTCTGTTCGGCCCTGATCTTCCCAAAACAGAAGAGATCGCCGATGTTCTGGAAACCTTCCATGTCATTGCAGAACTTCCCTCAGACAACTTTGGTGCCTACATAATCTCAATGGCAACAGCACCGTCTGATGTGCTTGCTGTTGAGCTCTTACAACGGGAATGCCATGTGAAGCAACCGCTAAGGGTCGTGCCATTGTTTGAAAAGCTTGCTGATCTTGAGTCTGCTCCTGCTGCAGTGGCGCGGCTTTTCTCTATTGATTGGTACAGAAACCGAATCAATGGGAAGCAAGAAGTTATGATAGGATACTCAGACTCAGGAAAAGATGCCGGTCGTCTTTCTGCGGCTTGGGCGCTGTACAAGGCTCAAGAGGAGCTCATAAAGGTTGCAAAGGATTTCGGTGTTAAGCTGACAATGTTCCATGGCAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAGGCGGCCCCACTCACCTTGCTATATTATCTCAGCCACCAGAAACCATTCATGGCTCACTTCGGGTGACAGTTCAAGGTGAAGTTATTGAACAATCCTTTGGAGAGGAGCACTTGTGCTTTAGAACTCTCCAGCGATTCACTGCTGCTACACTTGAGCACGGAATGCACCCTCCCGTGTCACCCAAACCGGAATGGCGAGTGCTGCTAGATGAGATGGCTGTCATTGCAACGAAGGAGTATCGCTCCATTGTTTTCCAGGAACCCCGTTTTGTTGAATACTTCCGATGTGTAAGTATTATCTACACTCAATCTTGATTTATTAACCTAGATATAGAAGATGATAGCCTTGGAAGAAAATATATAGCAATTTAGGTGGTATTCTTCATTAAGTAAAAATTTGCTGAGATTTCATTGATAATGTTCATAACAAATGCTTATGTAACATTAATTTTATAGTTTTTCAAATAATTTGATATTAAGCATTACTTTTCTTCTTTATTTATGATTATTATTGTGATCTGCAGGCTACCCCTGAGTTGGAGTATGGACGAATGAACATTGGAAGTCGTCCATCAAAGAGAAAGCCGAGTGGAGGAATCGAATCACTGCGTGCTATTCCATGGATTTTTGCTTGGACACAAACAAGGTTTCATTTGCCAGTGTGGCTTGGCTTTGGTTCTGCATTTAAGCATGCAATTGAGAAGGATCCAAAGAATCTCCTAATGCTTCAAGATATGTACAACCAGTGGCCTTTCTTCAGGGTCACCCTGGACTTGATCGAGATGGTGTTCGCCAAGGGAGACCCGGGGATCGCTTCCCTGTACGACAAACTCCTAGTGTCAGAAGAGCTGTTGCCATTCGGAGAGCGCTTGAGGACTAAATATGAAGAAACCAAGAGTTTTCTCCTTCAGGTAATTCATTACTTGCTGTAACATCGTGATAAAATATATCTATAAATTTGAATGAAACTTATCATGGCACTTTAACTTGCCAAACTTTGTACTTCAACATCTTTTGTGTATATTGTAGGTTGCTGGGCACAGGGATCTTCTTGAAGGTGACCCCTACTTGAAGCAAAGGCTTCGTCTCCGCGATTCATACATCACAACCCTGAATGTGTTACAAGCCTACACGTTGAAGAGAATCCGCGACCCCGACTACCATGTCAAGTTGAGGCCACATTTGTCAAAGGAATTCATGGAATCAAGCAAGCCAGCTGCAGAACTTGTTAAACTCAACCCAAAAAGTGAGTATGCTCCTGGTTTGGAGGACACACTTATCTTGACAATGAAGGGTATTGCTGCTGGCATGCAAAACACAGGTTAAGAAGCTGAAAAAAATTGGCATTTTTTTTTTGTTATGTCAGTGGATATGTAAACATTGTATAACCTATTCTATGATGTCTGCTGGATATTTAGATCAGCATCATATGACTGTGTCGCTAATACTATTGTTATTTATATAATAAGACTTCGATCCTTTATTATGGCATATTTGGTTATATAAAA
SEQ ID NO:8（5’→3’）
TTTCACATGCCGTTTCCAAGCACACTCTCCTCTTCTCTGTGTGTGTGTCCGTGATAATAGGAGTTTCTTTCAGTTATTAATAAGTCTTTCAACTTGTTCCACCCTATCAGCTTCTTCTTCTTTTCTTTTCTATGCACTTTCTCGTGCCCACATCGTCAGCACCCTTCTAGCAACAACATCTTTCATCTACGGTGTGTCACGGGATTAATCTCTCTCACTCTCTCTAGTATTCTTTTTTCTTTTAATAGATTAATTTTCTGAGGTCACTGTTATACAGTAACAAGAAATAGATTGTTGTGAAGCTTTGTGGGGTCATACATATATTTATTTGCATGAATTGAATTGTTGTTATAATACAGATATAAAAATAGCACATAGTTTTTTGTGAGGAAGGACTAAGATGGCAGCTACTAGTAGGAACATTGAGAAGATGGCTTCAATTGATGCTCAGCTGAGGTTGCTGGCACCAAGGAAGGTTTCTGATGATGACAAGCTTGTTGAGTATGATGCTTTGTTGCTTGATCGATTCCTTGACATTCTTCAGGATTTGCATGGTGAAGATATCAGGCAAACGGTAATTCACCTCAATTTTCTATCAAGGACTTTACTTTTGGTTTAATTTTAGCTGATTTCTTAAACCCCATTTCGAATTTCATGGAAAGATTAATCCTTGTTGGTGTTTGGACGTTTCCCTTTTGATTTGTATGGTAGTGTGTCCCCTGGATTTGAGAAATTTTCACTTTTCCAATCTTTAGTTGACTATACAGTTTTCAAATTACTCTGTGTCACTATCATGGTAGTACTTCAATGTTTCAGCTGCATTTACTCGTAATTTTTCTTCAATTGTAGCAATTGGAATGCAACAGAAACGTTAATCTAGAACCAGGGGCCTTTACTCTTTTTGATTTTGTTTTAGAGCCATAAATAAATGCAAACTCTTAAGTAAATAAATTCAGTTCCACTTTGATGTGATGCACAAAATCTGATCCTTTTTTTCTTTCCTGGTAATATTTTGATCTATTGACTCTAGAAAAGAGGGGAGAAGTTTAATATGCACAAGTACTCTCAAACATGTTACATACTATGGATTGGCACTGACTCAAAAAGAGGAACCAAATATTCCGCTTTGTTTTGTAATTTTTTCTTTCTTTGTTATTTTCCTGTTGTGGCTTATAGTTTCAACAATTTGATGCTTAATAGGTTCAAGATTGTTATGAGCTTTCAGCTGAGTATGAAGGGAAGCATAAGACTGAGAAGTTGGAGGAACTTGGGAATATGCTAACTGGTCTTGATGCTGGGGATTCTATTGTCATTGCCAAATCATTTTCCCACATGCTTAATTTGGCTAACTTGGCAGAAGAAGTCCAAATTGCCTACCGAAGAAGGATTAAACTATTAAAGAAGGGCGATTTTGCTGATGAGAACTCTGCCATCACTGAATCTGACATTGAAGAAACCTTCAAGAGGCTTGTGACTGAACTGAAGAAGTCCCCACAGGAAGTGTTTGATGCCTTGAAGAACCAAACTGTAGATTTGGTCCTAACTGCTCATCCCACTCAGTCCATTCGTCGATCTCTGCTGCAAAAGCATGGAAGGTTTGTCACTGGACTCAGGAATAATTATAGTCCATTAACTGCGAATTTATCGTTTCAATTCACCAGAATCTGGAAATCATTGATCTCATTGGTAATCATTGTCCTCTTTTTTCAGGATAAGGAACTGTCTGACACAGTTGTATGCAAAAGACATAACACCGGATGATAAGCAGGAACTTGATGAGGCTCTCCAAAGAGAGGTGCATTCTTGATTCTGTGTACTGTTATGCATTTGGGTTTCTTTTCTTATTTATTGTCAGCTGTGTATGATTTCTATTACCATTTCCCTTTGATATGTCAGTAAATTTTATGGTTTCAAATTTGTGGTTACATATATGTGGCTATGTTTATGGTAAAGCAATAGCTCTAAAGATGTTTCTCTCATGCAGATTCAAGCTGCATTTCGCACAGATGAAATTCGAAGGAGTCCTCCGACACCACAAGATGAGATGAGGGCAGGAATGAGCTACTTTCATGAGACAATATGGAAAGGTGTACCAAAGTTTTTGCGCCGTGTTGACACAGCTCTGAAGAACATCGGAATAAATGAGCGTGTCCCATACAATGCCCCTCTTATTCAATTCTCTTCTTGGATGGGAGGAGATCGTGATGGTACCTTACTTTTTTTTTTCCCAAAAATTAGCACACAAACTTATTTCTCGTTAAATCTCAAACTTAATTATCTTCAAAGTATTCATGTGGAATGGATTTAAAATATCTTCACCTCATCCATGATGCTTCGCTATTTCTTTGTTTGTTTTTCTTTTTGAGTTTTGATTCTCAGCTTCATATGTATAATGTCCATTACAGGTAACCCTAGGGTAACCCCTGAAGTTACAAGGGATGTGTGTTTGCTGGCTAGAATGATGGCTGCTAATTTATACTTCTCTCAGATAGAAGATCTCATGTTTGAGGTATCAAATATGCTGCTATTATAACAATGTATTTGGTATGTAATAATTTTGTGAAAGCATTAAAAGCATGATTCTTAAATTATTGATTCTATCTGCATTTTTAGCTGTCTATGTGGCGCTGCAATGATGAGCTTCGTGTTCGTGCTGATGAACTCCATGTGTCCTCAAGGAGAGATGCAAAACATTACATTGGTATGTTCTACTTTTCTCTGAACTGCATAATGAACTATTGAAATCTTCATTGGAATCTACAAAACTGAACTGTTCACACCTATTGATTCATTTAGAGTTGAATACTTGGCAAGTAAAATTCAGTTGCTCTTGAATGTCATTCATTGTAATAATTTCTTCATTCCTTCAGAATTTTGGAAGCAGATTCCTCCAAATGAGCCATATCGTGTTATTCTTGGTGATGTGAGGGACAAACTATACAATACACGCGAACGTGCTCGCCAGTTATTAGCCAATGGAACCTCTGACATCCCCGAAGAGACAACCTTCACAAATGTTGAGCAGGTATTGTCCTCAGAACAGCCCTATAAACTGCAATCACCTTATGGTTTGTAGTCACATACTGAGTTCCTTCTTTACCGTGGTACTTTCTAATTTTTGTGGACACTTATAATTACCTATATCATACATATTCTTCAGGTTTATCCACGGTGGTTTTGGAGCAGTAAATATTTATGTTGCTCCTTAAAATTGATTTCTTATGTTTTTTATTTCATTCAGAGTAGCAAATCCATGATTCACAAAGGACAATACAAAATGCATGGCAATATATGTTAAAACACTATTTGACTCCAATTCATTTCTTGCAGTTCCTGGAGCCCCTTGAACTCTGCTATAGATCACTCTGCGCATGTGGTGACCGACCAATAGCAGATGGTAGCCTTCTTGATTTCTTGCGGCAAGTTTCCACATTTGGACTCTCAATGGTAAGACTCGACATTCGTCAAGAGTCAGACCGGCACACTGATGTCATGGATGCCATTACCAAACACTTGGAGATTGGATCATACCGAGAGTGGTCTGAGGAACGCAGGCAGGAATGGCTTCTGTCAGAGCTCAGTGGAAAGCGCCCTCTGTTCGGCCCTGATCTTCCCAAAACAGAAGAGATCGCCGATGTTCTGGAAACCTTCCATGTCATTGCAGAACTTCCCTCAGACAACTTTGGTGCCTACATAATCTCAATGGCAACAGCACCGTCTGATGTGCTTGCTGTTGAGCTCTTACAACGGGAATGCCATGTGAAGCAACCGCTAAGGGTTGTGCCATTGTTTGAAAAGCTTGCTGATCTTGAGTCTGCTCCTGCTGCAGTGGCGCGGCTTTTCTCTATTGATTGGTACAGAAACCGAATCAATGGGAAGCAAGAAGTTATGATAGGATACTCAGACTCAGGAAAAGATGCCGGTCGTCTTTCTGCGGCTTGGGCGCTGTACAAGGCTCAAGAGGAGCTCATAAAGGTTGCGAAGGATTTCGGTGTTAAGCTGACAATGTTCCATGGCAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAGGCGGCCCCACTCACCTTGCTATATTATCTCAGCCACCAGAAACCATTCATGGCTCACTTCGGGTGACAGTTCAAGGTGAAGTTATTGAACAATCCTTTGGAGAGGAGCACTTGTGCTTTAGAACTCTCCAGCGATTCACTGCTGCTACACTTGAGCACGGAATGCACCCTCCCGTGTCACCCAAACCGGAATGGCGAGTGCTGCTAGATGAGATGGCTGTCATTGCAACGAAGGAGTATCGCTCCATTGTTTTCCAGGAACCCCGTTTTGTTGAATACTTCCGATGTGTAAGTATTATCTACACTCGATCTTGATTTATTAACCTAGATATAGAAGATGATAGCCTTGGAAGAAAATATATAGCAAATTAGGTGGTATTCTTCATTAAGTAAAAATTTGCTGAGATTTCATTGATAATGTTCATAACAAATGCTTATGTAACATTAGTTTTATAGTTTTTAAAATAATTTGATATAAAGCATTACTTTTCTTCTTTATTTATGATTATTATTGTGATCTGTAGGCTACCCCTGAGTTGGAGTATGGACGAATGAACATTGGAAGTCGTCCATCAAAGAGAAAGCCGAGTGGAGGAATCGAATCACTGCGTGCTATTCCATGGATTTTTGCTTGGACACAAACAAGGTTTCATTTGCCAGTGTGGCTTGGCTTTGGTTCTGCATTTAAGCATGCAATTGAGAAGGATCCAAAGAATCTCCTAATGCTTCAGGATATGTACAACCAGTGGCCTTTCTTCAGGGTCACCCTGGACTTGATCGAGATGGTGTTCGCCAAGGGAGACCCGGGGATCGCTTCCCTGTACGACAAACTCCTAGTGTCAGAAGAGCTGTTGCCATTCGGAGAGCGCTTGAGGACTAAATATGAAGAAACCAAGAGTTTTCTCCTTAAGGTAATTCATTACTTGCTGTAACATCATGATAAATTATATCTATAAATTTGAATGAAACTTATCATGGCACTTTAACTTGCCAAATTTTGTACTTCAACATCTTTTGTGTATATTGTAGGTTGCTGGGCACAGGGATCTTCTTGAAGGTGACCCCTACTTGAAGCAAAGGCTTCGTCTCCGCGATTCATACATCACAACCCTGAATGTGTTACAAGCCTACACGTTGAAGAGAATCCGCGACCCCGACTACCATGTCAAGTTGAGGCCACATTTGTCAAAGGAATTCATGGAATCAAACAAGCCAGCTGCAGAACTTGTTAAACTCAACCCAAAAAGTGAGTATGCTCCTGGTTTGGAGGACACACTTATCTTGACAATGAAGGGTATTGCTGCTGGCATGCAAAACACAGGTTAAGAAGCTGAAAAAAATTGGCATTTTTTTTTGGTTATGTCAGTGGATATGTAAACATTGTATAACCTATTCTATGATGTCTGCTGGATATTTAGATCAGCATCATATGACTGTGTCGCTAATACTATTGTTATTTATATAATAAGACTTTGATCCTTTATGATGGCATATTTGGTTATATAAAA
靶位点的核酸序列如下：
sgRNA-p:5'-CAAATCCTGAAGAATGTCA-3'(SEQ ID NO:9)；
将上述设计好的靶位点输入到百格生物公司网站(http://biogle.cn/index/excrispr)，在线生成Oligo序列。如下：
sgRNA-F:5'-GGGTTGCAAATCCTGAAGAATGTCA-3'(SEQ ID NO:10)；
sgRNA-R:5'-AAACTGACATTCTTCAGGATTTGCA-3′(SEQ ID NO:11)。
上述序列由生工生物公司合成。
然后将靶位点序列与线性载体pBGK041-GmU6(购自百格生物公司)连接，如图1所示，即得花生CRISPR-Cas9基因编辑载体pBGK041-GmU6-AhPEPC1。
实施例3
含有花生U6启动子的CRISPR-Cas9基因编辑载体的构建，步骤如下：
(1)采用花生中的AhA3U6和AhB9U6启动子对pBGK041-GmU6-AhPEPC1载体中的启动子替换。用限制性内切酶HindⅢ和SmaⅠ将载体中含靶位点、sgRNA骨架序列和GmU6启动子序列的部分切除，获得线性载体。
(2)设计含有靶位点、sgRNA骨架序列的插入片段，该片段的正向序列和反向序列如下所示：
正向序列：5′-AACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCAAATCCTGAAGAATGTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3′(SEQ ID NO:12)；
反向序列：5′-CCACCATGTTGACCTGCAGGCCCGGGGCCATTTGTCTGCAGAATTG
-3′(SEQ ID NO:13)；
采用Vazyme无缝克隆试剂盒，将上述插入片段连接到步骤(1)获得的线性载体中，获得中间载体。
(3)设计AhA3U6启动子和AhB9U6启动子的扩增引物，引物序列如下：
A3U6-F:5′-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCCTTGGTGAAATATTATC-3′(SEQ ID NO:14)；
A3U6-R:5′-TGCTATTTCTAGCTCTAAAACTGACATTCTTCAGGATTTG-3′(SEQ ID NO:15)；
B9U6-F:5′-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGTCAAAAGTCAAAACGC-3′(SEQ ID NO:16)；
B9U6-R:5′-TGCTATTTCTAGCTCTAAAACTGACATTCTTCAGGATTTG-3′(SEQ ID NO:17)；
分别以实施例1构建的pMD 18-T Vector-AhA3U6和pMD 18-T Vector-AhB9U6载体为模板进行扩增，获得AhA3U6启动子和AhB9U6启动子的扩增产物。
(4)将步骤(2)获得的中间载体用HindⅢ酶切，再把酶切产物分别与步骤(3)AhA3U6启动子和AhB9U6启动子的扩增产物连接构成含有花生U6启动子的CRISPR-Cas9基因编辑载体pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1、pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1。
分别以实施例2和实施例3构建的CRISPR-Cas9基因编辑载体pBGK041-GmU6-AhPEPC1、pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1、pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1为模板，根据序列差异设计引物如SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:23所示，其中反向引物包含靶位点的序列，用于判断载体构建成功。
设计引物序列如下：
GmU6-F:5′-CCAGTGCCAAGCTTTAGTCTTAATC-3′(SEQ ID NO:18)；
GmU6-R:5′-CTGACATTCTTCAGGATTTGC-3′(SEQ ID NO:19)；
A3U6T-F:5′-CAGTGCCAAGCTTCCTTGGTG-3'(SEQ ID NO:20)；
A3U6T-R:5'-CTGACATTCTTCAGGATTTGC-3'(SEQ ID NO:21)；
B9U6T-F:5'-CCAGTGCCAAGCTTGTCAAAAGTC-3'(SEQ ID NO:22)；
B9U6T-R:5'-CTGACATTCTTCAGGATTTGC-3'(SEQ ID NO:23)；
扩增结果如图2所示，PCR片段GmU6T(565bp)、A3U6T(553bp)和B9U6T(558bp)大小均与目的片段吻合，可初步判断重组载体构建成功。然后，将PCR产物进行Sanger测序确定该序列与目标序列完全一致，即重组载体构建成功。
实施例4
含有花生U6启动子的CRISPR-Cas9基因编辑载体在花生基因编辑中的应用——发根农杆菌转化法
本实施例中以花生PEPC1基因编辑为例进行说明，在实际应用中，也可以用于编辑花生中的其他基因。在进行花生其他基因编辑时只需要将上述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中的靶位点替换为想要编辑的基因的靶位点序列即可。
(1)花生发根Basta筛选压的确定
将花育23的种子于30℃水培养箱中催芽1天，将长出芽的种子放到水培箱的塑料板上，并放置到28℃光照培养室中培养，大约10天左右长成小苗。选取生长状态较好且一致的花生小苗，切去下胚轴及根，将上部小苗放到灭菌的培养瓶中，每瓶一棵。设置不同浓度的Basta溶液，每组设置3个重复，每天换Basta溶液，观察到Basta浓度恰好达到某个值时花生不生根，该浓度即为花育23水培的发根Basta筛选压。
结果如图3所示，在Basta溶液中培养的第7天，发现当Basta浓度为0.75mg/L时，花生小苗未长出发根(图3)，此浓度记为花育23发根水培的Basta筛选压。
(2)重组质粒转化发根农杆菌
①将-80℃中保存的Ar.1193发根农杆菌感受态融化，然后插入冰中。
②每100μL感受态分别加入0.01-1μg的pBGK041-GmU6-AhPEPC1、pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1质粒，加入后剧烈拨打管底混匀或用移液枪吹吸混匀，依次放于冰上5分钟；液氮中5分钟；37℃恒温水浴锅中5分钟；冰上5分钟。
③加入850μL LB培养液。28℃200rpm条件下培养2小时。
④6000rpm离心2分钟，去上清；加入100μL新LB，轻轻吹打重悬菌块，涂布到含Kana抗生素的LB平板上；在28℃培养箱中倒置培养2-3天。
(3)花生发根遗传转化方法
菌液准备：
①目测步骤(2)转化有重组质粒的发根农杆菌菌液达到OD600值介于0.8-1.0之间时停止摇菌。
②每100mL的LB液体培养基中加入浓度为100μmol/mL AS 0.1mL，1mmol/mL MES1mL和1mmol/mL MgCl2 1mL。并加入10μL的10000×Silwet L-77混匀，即得侵染悬浮液。
③将菌液加入到离心管中。5500rpm离心12分钟，倒掉上清液。根据第一步测的OD600值加入相应的步骤②制备的侵染悬浮液调整OD600值介于0.8-1.0之间，重悬菌体，即得侵染液。
侵染步骤，如图4所示：
①将花生种子浸泡三天，泡沫板打洞，将花生种子胚朝下塞到泡沫板中，放入水中漂浮培养一周长根(图4中A)。
②从长出根的花生下胚轴中间偏下部位切除下部的下胚轴及根(图4中B)，每组侵染15棵花生小苗，将切口浸泡到装有侵染液的培养皿中10-15分钟(图4中C)；同时设置空白对照(没有加发根农杆菌的侵染悬浮液)。
③向底部铺有棉花的灭菌培养瓶中加入适量侵染液，小心地将花生苗放入培养瓶中，切口朝下与棉花接触，共培养过夜(图4中D)。
④将共培养的花生苗重新置于泡沫板上，培养于Basta浓度为0.75mg/L的水溶液中10天左右，长出新根(图4中F)。
(4)转基因阳性发根的检测
取步骤(3)新长出的发根分别置于2mL的离心管中，用CTAB法提取发根DNA；
根据载体中Cas9基因的一段特异序列(779bp)设计引物，通过PCR鉴定是否为阳性转基因发根。所设计序列如下：
YANG-F:5′-TGACCCTGACACTGTTTGAG-3′(SEQ ID NO:24)；
YANG-R:5′-CTTCATCTTCTTCACGACCTC-3′(SEQ ID NO:25)；
阳性检测结果电泳图如图5所示，根据花生发根PCR检测结果，pBGK041-GmU6-AhPEPC1载体、pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1载体、pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体转化发根的阳性率分别为78.4％(58/74)、83.5％(71/85)、83.0％(77/93)。由此可见，花生发根的转化效率比较理想，能够确保CRISPR-Cas9编辑效率的检测样本数量。
发根的阳性率＝(阳性发根个数/所检测发根总个数)×100％/检测的总根数
(5)花生发根的基因编辑检测
将阳性转基因发根的DNA样品进行PCR扩增，扩增片段为包含靶位点且两基因共有的序列，PCR所用的引物如下：
Ar-F：5′-GGAGTGAGTACGGTGTGCGTTGAGTATGATGCTTTGTTGC-3′(SEQ ID NO:26)；
Ar-R：5′-GAGTTGGATGCTGGATGGGAAACATTGAAGTACTACCATGATAG-3′(SEQ ID NO:27)；
PCR反应结束后，取少量PCR产物进行检测。
将检测正确的PCR扩增产物送往Hi-TOM平台(中国水稻研究所，杭州)进行高通量测序，分析编辑结果。
结果如表1所示：pBGK041-GmU6-AhPEPC1载体(原载体)的转基因发根DNA样品中中检测到有1个A碱基的插入，该突变发生在Aradu.A52DW；pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1载体的转基因发根DNA样品中发现3个突变位点，其中一个序列缺失3个碱基CAT，发生在Araip.RUX3H，另外两个突变为碱基替换，分别是碱基T变为碱基C，碱基A变为碱基C，这两个突变均发生在Aradu.A52DW基因中；pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体的转基因发根DNA样品中检测到2个突变位点，都发生在Araip.RUX3H基因中。其中1个是碱基A变为碱基G，另一个缺失了2个碱基AC。
表1重组CRISPR-Cas9载体的发根转化率和编辑情况
Figure BDA0004093389570000131
(6)愈伤组织筛选压的确定
花生发根的再生需要借助组培的方式进行，而组培容易产生转基因嵌合体，解决方式是进行筛选培养。因而确定花生愈伤组织的筛选压，可为花生发根再生提供一定的参考依据。本实施例中用的CRISPR-Cas9载体筛选标记基因为Bar，因此，需要确定花育23的Basta筛选浓度。具体是对花育23发根诱导获得花生发根的愈伤组织，将得到的愈伤组织放到含不同Basta浓度的MSB5固体培养基中，观察其生长状态变化。当愈伤组织出现褐化并凋亡时，此刻所用的浓度即为花育23发根愈伤组织的Basta筛选压。
具体步骤如下：
(1)灭菌：将花生发根依次放入75﹪酒精中20秒；放入0.1％升汞中6分钟；用灭菌水冲洗，再用灭菌水浸泡10分钟。
(2)转移到含滤纸的灭菌培养皿中，用灭菌的镊子按住花生发根，用手术刀将其切成均匀小段。
(3)将切好的发根小段转移到诱导愈伤的MSB5固体培养基中，培养4-8周长出愈伤组织。
(4)再将诱导出的愈伤组织转移到含Basta的筛选培养基中培养，直到出现表型差异。
经过不同Basta浓度梯度的筛选，发现在筛选培养基中低浓度Basta生长状况较好。培养到第7天时，Basta浓度为4.5mg/L的愈伤组织出现褐化，在第31天时完全褐化并停止生长。因此，花育23愈伤组织的Basta筛选压为4.5mg/L。
实施例5
含有花生U6启动子的CRISPR-Cas9基因编辑载体在花生基因编辑中的应用——花粉管通道转化法
(1)重组质粒转化根癌农杆菌
①取出GV3101感受态，恰好完全融化时放到冰盒中。
②每100μLGV3101感受态分别加入0.01-0.5μg的pBGK041-GmU6-AhPEPC1、pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1质粒，混匀后依次放到冰上5分钟；液氮中5分钟；37℃恒温水浴锅中5分钟；然后冰上静置5分钟。
③加入850μL LB培养液。28℃，200rpm条件下培养2小时。
④6000rpm离心2分钟，倒掉上清。加入新的培养液100μL，移液枪轻轻吹打混匀，随后涂布于含Kana抗生素的LB平板中，28℃培养箱中培养2天左右。
(2)花粉管通道法遗传转化
将所要种植的花生籽仁提前催芽，把发芽状况较好且整齐的籽仁挑出，每4粒种到一盆中。出苗后，每盆去除生长状况较差的两棵植株。从最初开花起，每天早晨8点前摘除花蕾，持续摘花10天左右。到盛花期后，可以进行注射转化，即花粉管通道法。注射需提前准备好农杆菌菌液，即将适量菌液加入到液体培养基中；在摇菌10h左右后，检测OD600值；待其OD600为0.6-0.8时，可先吸出1mL菌液保存于4℃冰箱，其余菌液5000rpm离心后弃上清；向菌体中加入侵染悬浮液，即得侵染液，充分振荡后可进行侵染转化。在上午8点之前完成侵染转化。具体方法是，用注射器吸取菌体悬浮液，注入到花生的龙骨瓣中，需连续注射10天左右。随后摘花约10天，将长出的果针绑绳标记，收获时便可直接收取这些标记的荚果进行后续试验。
(3)CTAB法提取花生籽仁的DNA，采用PCR法检测转基因阳性籽仁，测定籽仁的转化效率和基因编辑情况，方法同实施例4.
PCR检测结果显示，pBGK041-GmU6-AhPEPC1、pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1和pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体所对应的籽仁转化效率分别为30.0％(65/217)、33.7％(93/276)、29.2％(77/264)。
将3个载体转化得到的转基因阳性花生籽仁分别进行测序，结果如表2所示，pBGK041-AhA3U6-AhPEPC1载体的转基因籽仁中检测到2个发生在Aradu.A52DW基因的突变：其中1个突变为第1外显子核苷酸序列的第135位点插入一个碱基C而引起的移码突变，致使在第53位密码子出现终止密码子(TGA)使得翻译提前终止；另外一个突变为第1外显子核苷酸序列的第143位点碱基A突变为碱基G，致使在第48位氨基酸Q(CAG)变为氨基酸R(CGG)。pBGK041-AhB9U6-AhPEPC1载体的转基因籽仁中检测到1个突变，发生在Araip.RUX3H基因，该突变为第1外显子核苷酸序列的第134位点缺失一个碱基A而引起的移码突变，致使在第85位密码子出现终止密码子(TAA)使得翻译提前终止。而原载体pBGK041-GmU6-AhPEPC1所对应的转基因籽仁中未检测到编辑情况。
表2重组CRISPR-Cas9载体的籽仁转化率和编辑情况
Figure BDA0004093389570000151
综上，本发明构建的花生CRISPR-Cas9基因编辑载体可以通过发根农杆菌转化法和花粉管通道法对花生目标基因进行基因编辑。其中，花粉管通道法能够稳定遗传表达，但是，这种花生转化方法试验周期较长，并不适合花生CRISPR-Cas9载体编辑效率的快速检测。花生水培进行发根农杆菌遗传转化法，具有操作简单、周期短、成本低等特点，而且转化效率能达到80％左右。这种简单高效的花生发根转化体系将极大的简化花生转基因等相关研究，同时也可以快速的鉴定CRISPR-Cas9载体的编辑效率，为优化花生CRISPR-Cas9基因编辑体系提供便利。其次，发根农杆菌转化花生效率(81.7％)显著高于根癌农杆菌介导的花粉管通道法转化花生效率(31％)。产生这种差异的原因可能是，发根农杆菌的转化方法中添加了Basta筛选剂。此外，在花生中，内源启动子AhA3U6和AhB9U6所驱动的CRISPR-Cas9载体的编辑效率高于GmU6启动子所驱动的CRISPR-Cas9载体的编辑效率，且AhA3U6优于AhB9U6，因此，采用AhA3U6启动子为进一步提高花生的编辑效率，进而构建花生高效基因编辑系统奠定基础。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种花生U6启动子，其特征在于，所述花生U6启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.核酸序列如SEQ ID NO:1所示的启动子AhA3U6或核酸序列如SEQ ID NO:2所示的启动子AhB9U6在提高花生CRISPR-Cas9基因编辑效率中的应用。
3.一种花生CRISPR-Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中的启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求3所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体，其特征在于，是将pBGK041-GmU6载体中的GmU6启动子替换为AhA3U6或AhB9U6获得。
5.权利要求3或4所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体在花生基因编辑中的应用。
6.一种花生CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于，步骤如下：
将目标基因靶位点的核酸序列构建到权利要求3或4所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒；将CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒转化到农杆菌中，制备侵染液，侵染花生，筛选阳性转化株，实现花生目标基因的CRISPR-Cas9基因编辑。
7.根据权利要求6所述花生CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染花生的方法为发根农杆菌转化法或花粉管通道转化法。
8.根据权利要求7所述花生CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于，所述发根农杆菌转化法中采用的农杆菌为发根农杆菌，所述花粉管通道转化法中采用的农杆菌为根癌农杆菌。
9.一种花生PEPC1基因的编辑方法，其特征在于，设计花生PEPC1基因的靶位点序列，将靶位点的核酸序列构建到权利要求3或4所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒；将CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒转化到农杆菌中，制备侵染液，侵染花生，筛选阳性转化株，实现花生目标基因的CRISPR-Cas9基因编辑。
10.根据权利要求9所述花生PEPC1基因的编辑方法，其特征在于，所述花生PEPC1基因的靶位点序列是根据Aradu.A52DW和Araip.RUX3H基因序列设计的，两者共有的一段碱基序列；其中，所述Aradu.A52DW基因的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述Araip.RUX3H基因的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
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