CN116327746A

CN116327746A - 异甘草素在制备预防或治疗对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN116327746A
Application number: CN202310243321.3A
Authority: CN
Inventors: 翟晓涵; 席艳; 栗云明; 武宏; 孔祥晨; 郑芳芳; 姜鑫
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2023-03-14
Filing date: 2023-03-14
Publication date: 2023-06-27

Abstract

本发明涉及异甘草素的新用途，具体是甘草提取物异甘草素对对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的具有潜在的预防和治疗作用。本发明提出了异甘草素在改善APAP诱导的肝损伤中的应用。采用动物及细胞体内外相结合的模型充分证明异甘草素可以显著改善APAP诱导的肝损伤，且这种保护作用与异甘草素抗细胞凋亡和抗氧化应激的能力相关。为异甘草素作为预防或治疗APAP肝损伤的一种新型药物提供了依据。同时也为中医药治疗药物性肝损伤的药物的研发进行有益的探索与尝试。

Description

异甘草素在制备预防或治疗对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及异甘草素的新用途，具体是甘草提取物异甘草素对对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤具有潜在的预防和治疗作用。

背景技术

肝脏是机体非常重要的代谢器官，也是机体重要的解毒器官，对于维持机体正常的生理功能是十分重要的。近年来，由于各种外界原因导致的肝脏损伤成为威胁人类健康的主要原因。最常见的肝损伤包括酒精性肝损伤、非酒精性肝损伤及药物性肝损伤等，而与酒精性肝损伤及非酒精性肝损伤不同，药物性肝损伤与药物在体内的代谢过程相关，其主要原因是药物的活性代谢产物大量蓄积进而在肝脏中达到饱和，超过机体的清除能力而引发的肝损伤。

近年来，随着新药的不断问世，药物性肝损害的发生率也日益增高，在所有药物不良反应中，药物性肝损害约占10～15％。药物性肝损伤也是药物研发中化合物消耗及药物撤回、限制和项目终止的主要原因之一，而迄今仍缺乏简便、客观、特异性的诊断指标和特效治疗手段(Ware BR,Khetani SR.Engineered Liver Platforms for Different Phasesof Drug Development.Trends Biotechnol.2017；35(2):172-183.European Associationfor the Study of the Liver.Electronic address eee,Clinical Practice GuidelinePanel C,Panel m,representative EGB.EASL Clinical Practice Guidelines:Drug-induced liver injury.J Hepatol.2019；70(6):1222-1261.)。因此，深入研究药物性肝损伤的发病机制以及关键的调控因子，有针对性的进行干预和治疗，对降低本病的并发率和死亡率意义重大。

对乙酰氨基酚(扑热息痛，Acetaminophen，APAP)是目前应用最广泛的OTC类解热镇痛药，也是抗感冒复方中药制剂的常用成分。临床上主要用于普通或流行性感冒引起的发热以及缓解轻中度疼痛。治疗剂量的APAP疗效确切，用药安全。而过量的不当使用甚至即使短期过量服用即可造成急性肝损伤，严重时可引起肝衰竭进而导致患者死亡，是药物性肝损伤最常见的原因。治疗剂量时，APAP通过与硫酸或葡萄糖醛酸结合形成硫酸盐及葡萄糖醛酸酯排出体外。但当大剂量的APAP进入体内时，其代谢通路饱和，代谢为有毒的乙酰苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine,NAPQI)，使线粒体内的抗氧化物质谷胱甘肽(Glutathione,GSH)耗竭，肝脏清除NAPQI的能力降低，NAPQI与细胞内多种重要蛋白及具有生物活性的大分子物质结合，Ca²⁺-ATP酶失活，Ca²⁺跨膜内流增加，线粒体膜电势丧失，电子传递链电子外露增加，继而形成氧自由基，引起肝细胞脂质过氧化，产生肝毒性。

目前对于APAP肝损伤唯一能使用的解毒剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)只有在APAP中毒早期给药有效。虽然NAC减轻了APAP引起的肝损伤，但是在推荐剂量的患者也会出现不良反应甚至可能会发展为肝损伤(W.M.Lee,N.Kaplowitz,Alcohol,Fasting,and Therapeutic Dosing of Acetaminophen:A Perfect Storm,Hepatology.2021；73(5):1634-1636.P.Starkey Lewis,L.Campana,N.Aleksieva,J.A.Cartwright,A.Mackinnon,E.O'Duibhir,T.Kendall,M.Vermeren,A.Thomson,V.Gadd,B.Dwyer,R.Aird,T.Y.Man,A.G.Rossi,L.Forrester,B.K.Park,S.J.Forbes,Alternatively activated macrophages promote resolution of necrosis followingacute liver injury,J Hepatol.2020；73:349-360.)。鉴于APAP使用的普遍性及治疗的局限性，寻找和阐明预防和治疗APAP肝损伤的药物已成为亟待解决的重要社会公共卫生问题，具有良好的学术价值和临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供异甘草素在制备预防或治疗对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤中应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了异甘草素在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用。

所述异甘草素结构式如下：

上述技术方案中，进一步地，所述药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤。

本发明还提供了一种预防或治疗药物性肝损伤的药物组合物，所述药物组合物以异甘草素为活性成分。

上述技术方案中，进一步地，所述药物组合物以异甘草素为单一活性成分。

上述技术方案中，进一步地，所述药物组合物为口服制剂或注制剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明从中药的优势性特点出发，提出了异甘草素在改善APAP诱导的肝损伤中的应用。采用动物及细胞体内外相结合的模型充分证明异甘草素可以显著改善APAP诱导的肝损伤，且这种保护作用与异甘草素抗细胞凋亡和抗氧化应激的能力相关，为异甘草素作为预防或治疗APAP肝损伤的一种新型药物提供了依据。同时，本发明也为中医药治疗药物性肝损伤的药物的研发进行有益的探索与尝试，并为甘草及甘草复方制剂治疗药物性肝损伤提供进一步的实验依据，以期为传统中药的药效物质基础研究积累经验。

附图说明

图1异甘草素对小鼠APAP诱导急性肝细胞损伤的保护结果图；

图1A血清ALT活性，图1B血清AST活性，图1C H&E染色，n＝3；**p＜0.01，vs.control组，^#p＜0.05，vs.APAP组，^##p＜0.01，vs.APAP组，n＝6；

图2异甘草素对AML12细胞APAP诱导肝损伤的保护结果图；

图2A：APAP对AML-12细胞毒性的结果，**p＜0.01，vs.control组(n＝6)；图2B：异甘草素对AML-12细胞毒性的结果。*p＜0.05，vs.control组(n＝6)；图2C：异甘草素对AML-12细胞的保护作用，^*p＜0.05，vs.APA组，^**p＜0.01，vs.APAP组(n＝6)。

图3异甘草素对APAP诱导的氧化应激和细胞凋亡的影响；

图3A：异甘草素对血清GSH水平的影响；图3B：异甘草素对血清SOD水平的影响；**p＜0.01，vs.control组，^##p＜0.01，vs.APAP组，n＝6；图3C：异甘草素对小鼠肝组织Bcl2、BAX、Caspase3和SOD2蛋白的影响，**p＜0.01，vs.control组，^##p＜0.01，vs.APAP组，n＝3。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、实验方案：

1)体外实验：用浓度分别为5、10、20μM的异甘草素和5mM的APAP处理AML-12细胞(小鼠正常肝细胞)24h，并采用CCK-8试剂盒检测AML-12细胞活力，用western blot法检测细胞中Bcl2、Bax、caspase3、SOD2等细胞凋亡和氧化应激相关蛋白表达水平。

2)体内实验：健康雄性C57BL/6小鼠(18-22g)随机分为六组：(a)正常对照组、(b)异甘草素正常给药组(40mg/kg)、(c)APAP肝损伤模型组(300mg/kg)、(d)异甘草素低剂量预处理组(20mg/kg)、(e)异甘草素高剂量预处理组(40mg/kg)、(f)甘草酸二铵阳性药物预处理组(40mg/kg)。(b)、(d)、(e)及(f)组小鼠连续灌胃给予异甘草素或甘草酸二铵7天，(a)及(c)组给予等容量溶媒，(c)、(d)、(e)及(f)组第8天小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚(300mg/kg)，(a)及(b)组给予等容量溶媒，24h后处死动物，取血清、肝组织、原代肝细胞待测。采用相应试剂盒检测小鼠血清肝组织中肝功能、细胞凋亡和氧化应激等指标；采用HE染色观察肝组织损伤情况；采用western blot法检测肝组织中细胞凋亡和氧化应激相关蛋白Bcl2、Bax、caspase3、SOD2等表达水平。

2、实验结果：

2.1异甘草素在体内对APAP诱导急性肝损伤的保护作用

为了考察异甘草素对APAP急性肝损伤的保护作用，我们首先给与小鼠7天的异甘草素20mg/kg和40mg/kg的灌胃预处理，随后给与腹腔注射APAP(300mg/kg)进行肝损伤造模，建立急性肝损伤模型。结果显示，与空白对照组相比，给与APAP后，小鼠血清ALT、AST均显著升高，说明APAP可引起小鼠急性肝损伤；而给与异甘草素预处理后，可显著减轻APAP引起的ALT及AST的升高(图1A-B)。进一步通过HE染色，发现异甘草素可显著改善由APAP造成的肝组织细胞排列紊乱及炎性细胞浸润和坏死(图1C)。据此，我们通过小鼠体内实验初步证明异甘草素可对APAP诱导的急性肝损伤发挥保护作用。

2.2异甘草素在体外(AML12细胞)对APAP诱导肝损伤的保护作用

为了考察异甘草素在体外对APAP损伤的保护作用，我们通过应用不同浓度的APAP(0、1.25、2.5、5、10mM)与AML-12细胞共同孵育24h。根据实验结果我们选用5mM(细胞存活率60％作用)的APAP浓度作为体外诱导急性肝损伤模型的给药浓度(图2A)。同时，我们也考察了异甘草素对AML12细胞的毒性作用，通过将不同浓度的异甘草素(0、5、10、20、40μM)与AML-12细胞共同孵育24h，我们发现异甘草素给药浓度为5、10和20μM时没有显著的细胞毒性(图2B)。进一步地我们考察了异甘草素对APAP诱导的AML-12细胞损伤的保护作用，首先，我们将不同浓度的异甘草素(5、10、20μM)加入到AML-12细胞中进行预处理，24h后，除空白组外其余各组加入APAP(5mM)再孵育24h。结果如图2C所示，异甘草素可呈剂量依赖性地减轻APAP对AML12细胞诱导的损伤。据此，我们认为，异甘草素在体外也同样具有对APAP肝损伤的保护作用。

2.3异甘草素对APAP诱导氧化应激和细胞凋亡的影响

采用试剂盒检测异甘草素对APAP诱导氧化应激的影响，如图3A-B所示，与模型组相比，给予异甘草素(20μM、40μM)预处理组可显著升高血清中GSH和SOD水平。此外，为进一步考察异甘草素对APAP诱导的细胞凋亡和氧化应激的影响，我们采用western blot法评价小鼠肝细胞中Bcl2、BAX、Caspase3和SOD2蛋白表达的影响，如图3C所示，异甘草素可降低由APAP所致的BAX和Caspase3的蛋白表达的升高，而升高由APAP所致的Bcl2和SOD2蛋白表达的下调。通过以上实验显示，异甘草素可显著改善APAP肝损伤所致氧化应激和细胞凋亡。

综上所述，异甘草素可有效减轻APAP所致的肝损伤，这种保护作用可能与其抑制氧化应激和细胞凋亡等有关，异甘草素对APAP诱导的急性肝损伤具有潜在的预防或治疗作用。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims

1.异甘草素在制备预防或治疗药物性肝损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤。

3.一种预防或治疗药物性肝损伤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以异甘草素为活性成分。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以异甘草素为单一活性成分。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物性肝损伤为对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤。

6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂或注制剂。