CN116326412A - 调控苹果根际激活效应的方法 - Google Patents

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CN116326412A CN202310414065.XA CN202310414065A CN116326412A CN 116326412 A CN116326412 A CN 116326412A CN 202310414065 A CN202310414065 A CN 202310414065A CN 116326412 A CN116326412 A CN 116326412A
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张�杰
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Abstract

本发明提供一种调控苹果根际激活效应的方法，其包括：S1：筛选芳香植物作为苹果间作物；S2：间作物根系分泌物介导果树根系分泌物组成和丰度变化值并且依靠果树根系分泌物中豆科根际、非根际和果树根际分泌物的交互作用调节果树根际土壤有机质的降解过程；S3：间作根系物分泌物调控果树根际与非根际土壤微生物群落的组成、结构、多样性特征和酶活性；S4：调控作用改变果树根际土壤C组分、N组分、丰度变化值，促进果树利用N养分；S5：建立间作物对土壤生态因素、C与N循环、以及供肥因素的调控关系。本发明能够对大田条件下的间作方式模拟仿真，为促进苹果根际激活效应，优化苹果品质和产量提供了方法支撑。

Description

调控苹果根际激活效应的方法
技术领域
本发明涉及农业种植领域，特别涉及一种调控苹果根际激活效应的方法。
背景技术
苹果园行间种植绿肥等经济作物，或者自然生草是常见的果园土壤管理措施。许多研究表明，行间种植与生草可不同程度地改良果园土壤质地、增加土壤有机质、改善养分供应，影响土壤微生物群落结构、组成和酶活性。进一步研究表明，间作、混作及套作能够改变土壤微生物群落多样性，促进土壤碳(C)、氮(N)、磷(P)、硫(S)等组分的储备、平衡土壤—植物地球化学循环、降低大气CO2排放、调节植物生长、产量与质量。
间作是指在同一田块上大部分或全部生长期同时种植两种或两种以上作物或基因型的种植方式。合理的间套作能够集约利用光、热、水、肥等自然资源，稳定果园生态系统。间作研究的一个重要方面是避免不利的种间竞争，增加相邻植物的存活和生长。根系间的竞争机制有两种，一种是通过养分或水分的消耗(即掠夺式竞争)间接影响，另一种是通过化感物质的干扰直接(即干扰式竞争)竞争土壤资源。
面对果园土壤长期受化肥农药使用所造成的地力不足、污染严重等问题，实施果园土壤生态调控技术创新势在必行。鉴于此，本申请特提出一种调控苹果根际激活效应的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种调控苹果根际激活效应的方法、以及研究方法。
第一方面，本发明提供了一种调控苹果根际激活效应的方法，其具体步骤如下所示：
S1：筛选最优的芳香植物作为苹果间作物；
S2：间作物根系分泌物介导果树根系分泌物组成和丰度变化值，并且依靠果树根系分泌物中根际、非根际和果树根际分泌物的交互作用调节果树根际土壤有机质的降解过程；
S3：间作根系物分泌物调控果树根际与非根际土壤微生物群落的组成、结构、多样性特征和酶活性；
S4：调控作用改变果树根际土壤C组分、N组分和丰度变化值，促进果树利用N养分；
S5：建立间作物对土壤生态因素、C与N循环、以及供肥因素的调控关系。
在一种优选的实施方式中，所述苹果间作物包括芳香植物白三叶。
可优选的是，。
在一种优选的实施方式中，步骤S1中筛选芳香植物作为苹果间作物具体包括：
S11、通过豆科芳香植物根系分泌物对苹果根际土壤激活效应的调节，稳定土壤有机质的降解，平衡C组分的规律；
S12、苹果幼苗的氮积累特性；
S13、考察豆科芳香植物根系分泌物介导苹果根际与非根际土壤功能微生物群落特征、酶活性的差异；
S14、豆科芳香植物根系分泌物介导果树根际土壤—根系—叶片N利用方式，最终建立豆科芳香植物介导苹果根际土壤C与N循环利用模型。
在一种优选的实施方式中，步骤S1中筛选最优的芳香植物作为苹果间作物具体包括：
S11、筛选若干个芳香植物作为初始间作物；
S12：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述初始间作物,进行田间管理；
S13：3-5个月后，测定苹果幼苗中若干个被遮挡的叶片的相对叶绿素含量值并取平均值，得到平均相对叶绿素含量值；
S14、选取不同的所述初始间作物并重复执行“S12-S13”，得到若干个所述平均相对叶绿素含量值，选取所述平均相对叶绿素含量值的最大值所对应的所述初始间作物作为苹果间作物。
第二方面，本发明提供一种苹果根际激活效应的调控方法，包括以下步骤：
S1：筛选芳香植物作为间作物；
S2：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述间作物,进行田间管理；
S3：3-5个月后，采集根际土壤样品，进行测定，考察不同间作物对苹果根系分泌物的调控；
S4：通过提取土壤DNA，对土壤微生物进行高通量测序，考察间作物根系调控果树根际与非根际土壤微生物的组成、多样性以及土壤C循环相关的酶活性。
在一种优选的实施方式中，所述间作物包括豆科芳香植物和非豆科芳香植物；所述豆科芳香植物包括白三叶和甘草；所述非豆科芳香植物包括孔雀草和罗勒。
在一种优选的实施方式中，在步骤S2中，在所述苹果幼苗的周围播种所述间作物时，所述苹果幼苗与所述间作物的种子数量之比为3:8-12。
在一种优选的实施方式中，在步骤S2中，在播种所述间作物之前，还包括对所述间作物的种子进行催芽的步骤。
在一种优选的实施方式中，所述催芽步骤包括：用次氯酸钠对所述间作物的种子表面进行消毒4-10min，用无菌水清洗后置于培养皿中，在湿润的滤纸上催芽12-36h。
在一种优选的实施方式中，在步骤S4中，对所述土壤微生物进行高通量测序的对象为细菌16S和真菌ITS；
对所述细菌16S进行测序的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；
对所述真菌ITS进行测序的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
芳香植物含有较多的抗氧化物质、抗菌物质、营养成分和微量元素，果园间作芳香植物在改善土壤养分、抑制有害昆虫和微生物、优化微域生态环境具有积极作用。豆科芳香植物不仅具有果园间作物的水分养分涵养作用，而且其根系兼具有豆科植物的固氮功能和芳香植物调节土壤微生物群落结构的功能。
因此，为了进一步调控苹果根际激活效应，本申请提出的研究方法可系统性地探究：(1)间作物根系主要分泌物如何介导果树根系分泌物组成和丰度变化值，豆科根际—非根际—果树根际分泌物的交互作用如何调节果树根际土壤有机质的降解过程；(2)间作物分泌物如何调控果树根际与非根际土壤微生物群落的组成、结构、多样性特征以及酶活性。这对于揭示间作物对果园土壤生态功能、C循环、供肥能力、生产能力的调控机制，建立果园良性生态环境。
本发明提供的这种调控苹果根际激活效应的方法，包括白三叶等芳香植物促进土壤二氧化碳交换，促进土壤有机质降解，把有机质分解成新鲜有机碳、惰性有机碳、易氧化有机碳，增加碳转化；促进微生物群落多样性、组成与结构，促进碳氮循环相关功能微生物活力，以及丛枝菌根真菌的菌丝丰度，以此促进碳氮氧分循环，向植物提供高效养分，同时抑制土壤病原菌和重金属污染。本发明能够对大田条件下的间作方式模拟仿真，为促进苹果根际激活效应，优化苹果品质和产量提供了方法支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的调控苹果根际激活效应的方法的流程示意图；
图2为本发明的调控苹果根际激活效应的方法中间作流程图；
图3为本发明的调控苹果根际激活效应的方法间作物种植图；
图4为本发明的调控苹果根际激活效应的方法效果对比图；
图5为本发明不同处理下苹果根系分泌物PLS-DA的得分图(左)和载荷图(右)，其中，2-a：清耕处理-苹果根际土；3-a：间作白三叶处理-苹果根际土；4-a：间作甘草处理-苹果根际土；5-a：间作罗勒处理-苹果根际土；6-a：间作孔雀草处理-苹果根际土；CK：裸土；椭圆代表样本的95％置信区间，红色数字表示代谢物代号；
图6为本发明裸土与不同处理下苹果根系分泌物PLS-DA的VIP图；注：2-a：清耕-苹果根际土；3-a：间作白三叶-苹果根际土；4-a：间作甘草-苹果根际土；5-a：间作罗勒-苹果根际土；6-a：间作孔雀草-苹果根际土；CK：裸土；
图7为本发明苹果根际土壤主要根系分泌物与细菌门级组成的RDA分析；
图8为本发明苹果根际土壤主要根系分泌物与真菌门级组成的RDA分析；
图9为本发明间作不同芳香植物对土壤有机质含量的影响；
图10为本发明不同间作处理下根际及非根际土壤微生物量碳含量。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的促进苹果根际激活效应的方法，如图1至图4所示，其包括：其包括以下步骤：
S1：筛选芳香植物作为苹果间作物；
S11、筛选若干个芳香植物作为初始间作物；
S12：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述初始间作物,进行田间管理；
S13：3-5个月后，测定苹果幼苗中若干个被遮挡的叶片的相对叶绿素含量值并取平均值，得到平均相对叶绿素含量值；
S14、选取不同的所述初始间作物并重复执行“S12-S13”，得到若干个所述平均相对叶绿素含量值，选取所述平均相对叶绿素含量值的最大值所对应的所述初始间作物作为苹果间作物；
S2：间作物根系分泌物介导果树根系分泌物组成和丰度变化值，并且依靠果树根系分泌物中豆科根际、非根际和果树根际分泌物的交互作用调节果树根际土壤有机质的降解过程；
S3：间作根系物分泌物调控果树根际与非根际土壤微生物群落的组成、结构、多样性特征和酶活性；
S4：调控作用改变果树根际土壤C组分、N组分、丰度变化值，促进果树利用N养分；
S5：建立间作物对土壤生态因素、C与N循环、以及供肥因素的调控关系。
本发明的苹果根际激活效应的调控方法，其包括：
S1：筛选芳香植物作为间作物；
S2：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述间作物,进行田间管理；
S3：3-5个月后，采集根际土壤样品，进行测定，考察不同间作物对苹果根系分泌物的调控；
S4：通过提取土壤DNA，对土壤微生物进行高通量测序，考察间作物根系调控果树根际与非根际土壤微生物的组成、多样性以及土壤C循环相关的酶活性。
下面结合本申请人的具体研究实例，对本发明的方法做详细说明。
步骤1：设置苹果间作模式，本发明以苹果砧木平邑甜茶幼苗作为试验材料，设置Bs(裸土-Bulk soil，不种植植物的空白对照)、CK(平邑甜茶/清耕)、Tr1(平邑甜茶/白三叶(Trifolium repens Linn.)；Tr2(果树/甘草间作)；Tr3(果树/罗勒间作)；Tr4(果树/孔雀草间作)；随机区组试验设计，每个处理各10盆，果树为3株/盆，单盆重复，共计60盆，间作。共6个处理，具体得栽培条件为：
a、壤土/蛭石/草炭＝1/1/1(体积比)，混匀后作为栽培基质装入盆内(8.00kg/每盆)。壤土取自温室外的空地，质地为粉沙质壤土。栽培基质：pH值为7.20、有机质3.98％、全氮1.24g/kg、全磷0.41g/kg、全钾16.83g/kg、碱解氮167.39mg/kg、有效磷25.83mg/kg、速效钾122.03mg/kg；栽培容器为圆形塑料盆：盆高26cm，上口径33cm(外径38cm)，下口径26cm，体积15L；
b、移栽大小一致的7-9片真叶的苹果砧木平邑甜茶幼苗60盆(3株/盆)。待平邑甜茶幼苗完全成活后播种芳香植物种子。播种前用3％(v/v)的次氯酸钠溶液对4种芳香植物的种子表面消毒5min，然后用无菌水清洗3次，置于一次性培养皿中，在湿润的滤纸上催芽24h，然后播种。10穴/盆，3粒/穴，待芳香植物种子出苗后间苗，留1株/穴，即芳香植物为10株/盆。
c、随机区组试验设计，每个处理各10盆，果树为3株/盆，单盆重复。
步骤2：采集根际土壤样品，进行测定，考察不同间作物对苹果根系分泌物的调控；
为了反映植株在土壤中的实际生长及根系分泌情况，更好的说明根系的实际生理状态，本研究采用土培法收集植株根部的根系分泌物。为了区分土壤本体与根系分泌的差别，采用未种植植物的裸土(Bs)作为空白对照。
a.土壤样品的具体采集方法如下：于栽植苹果120天后收获植株，首先将塑料盆剪破，小心的将苹果植株和芳香植物植株分别完整地从土壤中取出，然后，轻轻抖动植株根部，使非粘附在根表面的土掉落为非根际土(NR)；用毛刷轻轻刷下附着在苹果和芳香植物根表面的土壤，分别为苹果的根际土(MR)和芳香植物的根际土(AR)。同时采集苹果的根际土和芳香植物的根际土，每盆采集的MR及AR分别混匀，利用四分法随机取10g作为1份土壤样品，每盆取2份土样平行测定，每个处理取3盆，共计60个样品。收集完毕后放入冰盒带回实验室，去除植物根系等杂物，过2mm土壤筛后混合均匀，分装于50ml的冻存管，立即液氮速冻，干冰运输至公司用于根系分泌物的测定。
b.土壤样本GC-MS分析:根系分泌物采用GC-MS。称量1g样本至5mL离心管，加入3mL二氯甲烷浸泡24h，打开管盖置30℃干式加热器中将样本中二氯甲烷蒸干；将蒸干后的样本转移至2mL离心管，加入1200μL提取剂(乙腈/异丙醇/水，3/3/2，v/v/v)，加入5μL 3mg/mL肉豆蔻酸溶液，涡旋1min；4℃条件下13000rpm离心5min。取500μL上清液，氮气吹干。加入40mg/mL甲氧基吡啶盐酸盐溶液20μL，30℃衍生90min；接着加入90μL含1％TMCS的MSTFA(methyl-trimethyl-silyl-trifluoroacetamide，甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺)，37℃衍生30min，4℃条件下13000rpm，离心5min，取上清液60μL检测。
c.结果与分析:
由图5的PLS-DA分析可以看出，各组GC数据之间有一定的重合区域，但又存在一定的差异，说明间作芳香植物后对苹果根际土壤的根系分泌物有一定的影响。在PLS-DA载荷图(图5图)中，反映的是代谢物对样本组间区分的贡献，离中心点越远，那么对区分样本组所做的贡献也越大。从载荷图中可以看出：1402、783、1404和962等多个代谢物对样本间的区分做出了重要贡献。
图6为PLS-DA的VIP图，该图是用以表示变量的重要程度以及它们在样本区分中的贡献。图中左侧坐标系中横坐标为VIP值，纵坐标为排名前15的差异代谢物，右侧颜色编码反映此代谢物在不同组中浓度的高低。VIP值越大说明它们在样本的区分中所作的贡献越大。使用PLS-DA的VIP值进行具体分析，其中具有显著性差异的代谢物是：D-α，α-海藻糖(1402)、α，β-海藻糖(1404)、D-松醇(724)、蔗糖(1335)和半乳糖醇(880)。
结果表明，根系分泌物中最主要的3种物质依次为糖类、有机酸类和醇类，它们占已检测到的根系分泌物的95％左右。与裸土相比，种植苹果以及间作芳香植物后苹果根际中的糖类含量显著上升，有机酸类的含量显著降低，并且间作芳香植物比清耕(单作)处理的变化程度更大。
此外，不同芳香植物与苹果间作后，对苹果根系分泌物的影响不同。豆科芳香植物白三叶、甘草与苹果间作差异显著的代谢物主要是1042(D-α，α-海藻糖)和1404(α，β-海藻糖)等，并且这几种物质在苹果根际土中显著的高于豆科芳香植物的根际土。而非豆科芳香植物罗勒、孔雀草与苹果间作差异显著的主要代谢物1404(α，β-海藻糖)，在罗勒和孔雀草根际土中的相对含量均显著的高于苹果根际土。影响土壤不同形态N素含量的前4种根系分泌物依次是：甾醇类、有机酸类、氨基酸类和生长因子。
步骤3：通过提取土壤DNA，对土壤微生物进行高通量测序，考察间作物根系调控果树根际与非根际土壤微生物的组成、多样性以及土壤C循环相关的酶活性。
在间作条件下，不同间作物根系分泌物组成及其量的不同势必产生不同的根际效应，进而引起细菌和真菌群落结构的变化。不同芳香植物与苹果间作，因其芳香植物的根系分泌物不同，将导致苹果根际土壤微生物也不相同。本步骤采用Illumina MiSeq技术对裸土、清耕和4种不同间作处理下的土壤微生物(细菌和真菌)群落进行深度分析：
a.于栽植苹果120天后收获植株，首先将塑料盆剪破，然后小心的将苹果植株和芳香植物植株分别完整地从土壤中取出，然后，轻轻抖动植株根部，使非粘附在根系表面的土掉落，为非根际土(NR)；用毛刷轻轻刷下附着在苹果和芳香植物根表面的土壤，则分别为苹果的根际土(MR)和芳香植物的根际土(AR)。同时采集非根际土、苹果的根际土和芳香植物根际土。并用裸土(未种植植物)作为样品的对照，每盆采集的3种土样(NR、MR、AR)分别混匀，四分法取10g左右作为1个土壤样品，每个处理3次重复，共计45个样品。收集完毕后放入冰盒带回实验室，去除植物根系等杂物，过2mm土壤筛后混合均匀，分装于50ml的冻存管，立即液氮速冻，干冰运输至基因测定单位用于土壤微生物(细菌和真菌)的测定。
b.DNA提取：利用天根土壤DNA提取试剂盒，从0.25g土壤中提取基因组DNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，NanoDrop检测样品浓度(A260/280比值)，保存于-20℃冰箱，用于后续实验。
c.土壤微生物高通量测序
PCR扩增与文库制备：细菌使用16S rRNA基因通用引物B341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和B785R(5’-GACTACHVGGTATCTAATCC-3’)，扩增其V3-V4区域；真菌使用引物对ITS3F(GATGAAGAACGYAGYRAA)和ITS4R(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增ITS2区域(表1)。PCR扩增反应在GeneAmp PCR System 9700(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)上进行。扩增反应体系(25μl)：12.5μl 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix，上下游引物各0.25μmol L-1，10ng DNA模板。扩增反应条件：95℃3min；95℃30s，Tm 30s，72℃30s，25cycles；72℃5min。Indexes序列位于Illumina Miseq测序接头和下游扩增引物之间，目的是区分不同的样本。
混合各样本的PCR产物构建PCR扩增子文库，即将PCR产物纯化后使用Agilent2100Bioanalyzer System(Santa Clara，CA，USA)对文库进行定量，等量混合建库。由北京源宜基因科技股份有限公司(北京)利用Illumina Miseq测序平台进行高通量测序。
表1.根际土壤微生物高通量测序引物
Figure BDA0004184257880000101
d.结果与分析:
(1)间作不同芳香植物对土壤微生物群落组成的影响
从45个土壤样本中，测序共得到了1,923,754条高质量序列，每个样本中平均序列是42,750(22,892-68,363，SE＝1,761)。大多数序列(99.73％)可以比对到门级水平，总OTU数目是9,678。土壤细菌高通量测序序列经物种注释后获得31个门、56个纲、109个目、175个科和297个属。相对丰度>1％的8个主要门是：变形菌门(Proteobacteria)、酸酐菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和浮门菌门(Planctomycetes)，占总序列数的82.57％(图5-6)。其中，Proteobacteria占总序列数的42.41％，主要包括：Alphaproteobacteria(19.67％)、Betaproteobacteria(8.09％)、Gammaproteobacteria(7.17％)和Deltaproteobacteria(6.63％)。此外，根瘤菌目Rhizobiales(6.39％)、红螺菌目Rhodospirillales(5.60％)和粘球菌目Myxococcales(5.16％)也以较高的丰度出现在根际及非根际土壤中。
在非根际土(NR)中，相对于未种植植物的裸土，种植苹果后降低了非根际土(NR)中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度，显著提高了放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度，间作后提高的效果更显著。同时，间作罗勒和孔雀草还显著提高了绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度。清耕和间作豆科芳香植物(Tr1和Tr2)均显著增加了芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度，而间作唇形科和菊科植物(Tr3和Tr4)则无显著影响。
在苹果根际土中，间作的效果与非根际土基本一致，即相对于清耕，间作芳香植物降低了Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度，显著增加了Actinobacteria的相对丰度，同时，间作罗勒和孔雀草还显著提高了绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度。但是不同芳香植物根际土壤的细菌在门级组成上差异较小，除甘草的Acidobacteria和Actinobacteria的相对含量略低于其他植物外，剩余细菌的门级组成无显著差异。
(2)不同间作处理中苹果根际土壤的主要差异菌分析
利用线性判别分析(LEfSe)找到不同处理间影响显著的微生物类群，选择LDAscore>2贡献较大的类群。LDA值分布柱状图的分析结果表明，与清耕相比，白三叶与苹果间作(Tr1)能显著提高放线菌门(Actinobacteria)，以及放线菌门中微酸菌纲(Acidimicrobiia)，微酸菌纲中微酸菌目(Acidimicrobiales)的相对丰度；同时能显著提高芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，芽单胞菌门中芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)，芽单胞菌纲中芽单胞菌目(Gemmatimonadales)，以及芽单胞菌目中芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)的相对丰度.
针对相对丰度大于1％的细菌群落，在清耕及4个不同的间作处理中，间作白三叶(Tr1)没有显著富集的细菌，清耕(CK)中变形菌门中的Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria，拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌门中的黄杆菌纲(Flavobacteriia)，以及黄杆菌纲中的黄杆菌目(Flavobacteriales)均显著高于其它处理。间作甘草(Tr2)处理中芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、芽单胞菌门中芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、以及芽单胞菌纲中芽单胞菌属(Gemmatimonas)，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)中的黄单胞菌目(Xanthomonadales)均显著高于其它处理。间作罗勒(Tr3)处理中，绿弯菌门(Chloroflexi)，以及绿弯菌门中KD4_96纲，Alphaproteobacteria中根瘤菌目(Rhizobiales)，以及根瘤菌目中生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)，生丝微菌科中Devosia属均显著高于其它处理。间作孔雀草(Tr4)处理中，放线菌门(Actinobacteria)、以及放线菌门中酸酐菌纲(Acidimicrobiia)、酸酐菌纲中微酸菌目(Acidimicrobiales)的相对丰度；绿弯菌门中热微菌纲(Thermomicrobia)，以及δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)中粘球菌目(Myxococcales)的相对丰度均显著高于其它处理。
(3)根系分泌物对苹果根际土壤微生物的影响
由图7和表2可知，影响土壤细菌门级组成的前4种根系分泌物依次是：酚酸类、甾醇类、氨基酸类和生长因子。酚酸类与拟杆菌门的相对丰度呈显著的正相关关系，其次与放线菌门和疣微菌门也呈正相关关系。甾醇类主要影响疣微菌门的相对丰度；氨基酸类和生长因子均与酸酐菌门和绿弯菌门呈正相关关系；糖类主要影响放线菌门、浮门菌门和芽单胞菌门的相对丰度。而酚类、有机酸类和烃类主要与疣微菌门呈正相关关系。
表2.影响细菌门级组成的主要根系分泌物
Figure BDA0004184257880000131
由图8和表3可知，影响土壤真菌门级组成的前4种根系分泌物依次是：酚酸类、生长因子、醇类和甾醇类。酚酸类和有机酸类物质主要与结合菌门(Zygomycota)的相对丰度呈显著的正相关关系；生长因子和醇类与子囊菌门呈正相关关系；酚类和糖类物质与壶菌门和担子菌门呈正相关关系。
表3.影响土壤N含量与植株N吸收量的主要细菌
Figure BDA0004184257880000132
在组成上，细菌主要由变形菌门(Proteobacteria)、酸酐菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和浮门菌门(Planctomycetes)组成。在苹果根际土中，相对于清耕，间作芳香植物降低了变形菌门和拟杆菌门的相对丰度，显著增加了放线菌门的相对丰度。真菌主要由子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和结合菌门(Zygomycota)组成。相对于清耕，间作白三叶增加了苹果根际及非根际土壤球囊菌门、球囊菌纲、球囊菌目和球囊菌科的相对丰度。
不同间作处理对土壤真菌功能营养型的影响不同，从而间接影响植株的生长。如在苹果根际土壤中，相对于清耕，间作白三叶(Tr1)降低了腐生营养型和病理营养型真菌的相对丰度，增加了共生营养型真菌的相对丰度，尤其是丛枝菌根真菌等有益菌，从而最利于苹果幼苗的生长。间作甘草和孔雀草后增加了苹果根际土中病原真菌的相对丰度，这可能是间作孔雀草和甘草后，苹果幼苗长势下降的原因之一。
影响土壤细菌和真菌门级组成的主要根系分泌物分别是：酚酸类、甾醇类、生长因子、醇类和氨基酸类。在细菌中，苹果植株的N吸收量、苹果+芳香植物的N吸收量、土壤中不同形态的N含量主要受芽单胞菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门的影响；在真菌中，苹果植株N吸收量、苹果+芳香植物的N吸收量主要受球囊菌门影响。
在本发明的一些实施例中，还包括如下步骤：
根据步骤1所设置的处理组及重复，测量土壤基本理化指标、碳含量等性质：
a、于栽植苹果120天后收获植株，首先将塑料盆剪破，然后分别小心的将苹果植株和芳香植物植株完整地从土壤中取出，然后，轻轻抖动植株根部，使非粘附在根系表面的土掉落，为非根际土(NR)；分别用毛刷轻轻刷下附着在苹果和芳香植物根表面的土壤，则分别为苹果的根际土(MR)和芳香植物的根际土(AR)。同时采集非根际土、苹果的根际土和芳香植物根际土。将每盆中3株苹果的根际土混匀作为1个苹果根际土样品(MR)，每盆10株芳香植物的根际土混匀作为1个芳香植物的根际土样品(AR)，将每盆非黏着在根系表面的大块土壤混匀后作为1个非根际土样品(NR)，未种植植物的裸土(Bulk soil，BS)为去除表层土后，整盆土壤混匀，利用4分法，留约200g的土壤作为一个BS样品。每个处理3次重复，共采集45个土壤样品。收集完毕后放入冰盒带回实验室，去除植物根系等杂物，过2mm土壤筛后混合均匀，一部分保存至-80℃冰箱用于DNA提取等分子生物学分析，一部分置于4℃冰箱用于土壤酶活性和土壤含水量的测定，一部分风干后常温保存，用于土壤基本理化性质的测定；
b、土壤含水量采用烘干法测定；土壤pH采用pH计测定，水土比为2.5:1；土壤有机质采用重铬酸钾氧化—外加热法测定；土壤全氮采用凯氏定氮法测定；全磷采用NaOH熔融—钼锑抗比色法测定；全钾采用NaOH熔融—原子吸收分光光度计法；碱解氮采用碱解扩散法测定；有效磷采用NaHCO3—钼锑抗比色法测定；速效钾采用NH4OAc浸提—火焰光度法测定；
c、土壤微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)、氮(microbial biomassnitrogen，MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法，浸提液用可溶性碳氮分析仪测定；
d、12种碳、氮循环相关的土壤酶：土壤蔗糖酶(Sucrase)、过氧化氢酶(CAT)、α葡萄糖苷酶(α-Glu)、β葡萄糖苷酶(β-glu)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、脲酶(Urease)、蛋白酶(Protease)、固氮酶(NITS)、硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)采用酶联免疫法测定。待测土样分成2分，第一份按照10％进行匀浆处理，离心取上清液待检；另一份用于土壤含水量的测定，用于计算每克干土样本中的酶活性。具体分别参照相应酶的ELISA试剂盒的说明书，利用酶标仪在相应的吸光度下测定。
e.结果与分析
(1)间作不同芳香植物对土壤基本理化性质的影响
由图9可知，相对于裸土，种植苹果(CK)后，显著降低了非根际土壤的有机质(SOM)含量。相对于清耕(CK)，间作4种芳香植物对NR土壤中SOM的影响不同，其中间作甘草和孔雀草(Tr2和Tr4)显著提高了NR中有机质含量，而间作白三叶和罗勒(Tr1和Tr3)则对NR中SOM含量无显著影响。与清耕(CK)相比，在苹果根际土(MR)中，间作白三叶、罗勒均显著降低了土壤的有机质含量，但是间作甘草和孔雀草则无显著影响。4种芳香植物根际土SOM含量为：孔雀草显著高于白三叶、罗勒和甘草，这可能与孔雀草根系细长且分布密集有关。根际及非根际土壤SOM的变化，说明在非根际土壤中，植物对SOM的吸收利用及其矿化减少了非根际土中的SOM含量，但是在苹果及芳香植物根际，根系分泌物会在一定程度上增加土壤SOM的含量，从而缓解因植物消耗而导致的有机质含量减少。
(2)间作不同芳香植物对土壤微生物量碳含量的影响
土壤微生物量碳在土壤中的含量很低，但对于土壤养分循环的作用不可忽视，可作为评价土壤质量和肥力的重要指标。由图10可知，间作不同芳香植物对苹果根际及非根际土土壤微生物量碳的影响不同。相对于裸土，种植苹果后(CK)，并没有显著的影响非根际土中微生物量C的含量。相对于CK(清耕)，间作4种不同芳香植物对非根际土微生物量C的影响不同，间作甘草无显著影响，间作白三叶、孔雀草和罗勒均显著的降低了非根际土壤中的微生物量C含量，且间作罗勒的降低程度最大。在苹果根际土中，相对于CK(清耕)，间作白三叶显著的降低了微生物量C的含量，而间作孔雀草对其无显著影响，间作甘草和罗勒显著增加了土壤微生物量C的含量。在4种芳香植物的根际土中，白三叶根际土的微生物量C显著的高于其它4种芳香植物。
(3)间作不同芳香植物对土壤酶活性的影响
由表4可知，与裸土相比，种植苹果(CK)后显著的增加了非根际土壤中参与土壤C循环的4种重要酶的活性，包括α葡萄糖苷酶(α-Glu)、β葡萄糖苷酶(β-glu)、蔗糖酶(Sucrase)和过氧化氢酶(CAT)。
表4.不同间作处理根际及非根际土壤C循环相关的酶活性
Figure BDA0004184257880000161
Figure BDA0004184257880000171
相对于清耕(CK)，间作豆科芳香植物(Tr1和Tr2)均显著增加了NR中α葡萄糖苷酶的活性，而间作非豆科芳香植物(Tr3和Tr4)均显著降低了NR中α葡萄糖苷酶的活性。间作白三叶、甘草和罗勒均显著增加了NR土壤中β葡萄糖苷酶的活性，以罗勒的增加程度最大，而间作孔雀草则显著降低了非根际土壤(NR)中β葡萄糖苷酶的活性；间作4种芳香植物均显著降低了NR土壤中蔗糖酶的活性，以间作罗勒的降低程度最大；间作白三叶显著增加了NR中过氧化氢酶的活性，但是剩余3种间作物则显著降低了其活性。
在苹果根际土(MR)中，间作白三叶和孔雀草显著增加了α葡萄糖苷酶的活性，但是间作甘草和罗勒显著降低了其活性；除间作白三叶显著降低了β葡萄糖苷酶的活性外，剩余间作处理对其无显著影响；间作甘草显著降低了蔗糖酶的活性，间作罗勒和孔雀草均显著增加了MR中蔗糖酶的活性；除间作甘草降低了过氧化氢酶的活性外，剩余3种芳香植物间作均显著增加了MR中过氧化氢酶的活性。
在4种芳香植物的根际土(AR)中，α葡萄糖苷酶和蔗糖酶在罗勒根际土中的活性最高、β葡萄糖苷酶在白三叶中的活性最高，过氧化氢酶在孔雀草根际土中的活性最高。
本发明提供一种调控苹果根际激活效应的方法，包括白三叶等芳香植物促进土壤二氧化碳交换，促进土壤有机质降解，把有机质分解成新鲜有机碳、惰性有机碳、易氧化有机碳，增加碳转化；促进有机氮转化为植物可利用的氮，促进微生物群落多样性、组成与结构，促进碳氮循环相关功能微生物活力，以及丛枝菌根真菌的菌丝丰度，以此促进碳氮氧分循环，向植物提供高效养分，同时抑制土壤病原菌、和重金属污染。本发明能够对大田条件下的间作方式模拟仿真，为促进苹果根际激活效应，优化苹果品质和产量提供了方法支撑。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种调控苹果根际激活效应的方法，其特征在于,通过根系分泌物影响土壤微生物从而促进植株的生长，其包括以下步骤：
S1：筛选最优的芳香植物作为苹果间作物；
S2：间作物根系分泌物介导果树根系分泌物组成和丰度变化值，并且依靠果树根系分泌物中根际、非根际和果树根际分泌物的交互作用调节果树根际土壤有机质的降解过程；
S3：间作根系物分泌物调控果树根际与非根际土壤微生物群落的组成、结构、多样性特征和酶活性；
S4：调控作用改变果树根际土壤C组分、N组分和丰度变化值，促进果树利用N养分；
S5：建立间作物对土壤生态因素、C与N循环、以及供肥因素的调控关系。
2.根据权利要求1所述的调控苹果根际激活效应的方法，其特征在于：所述苹果间作物包括芳香植物白三叶。
3.根据权利要求1所述的调控苹果根际激活效应的方法，其特征在于：步骤S1中筛选芳香植物作为苹果间作物具体包括：
S11、通过豆科芳香植物根系分泌物对苹果根际土壤激活效应的调节，稳定土壤有机质的降解，平衡C组分的规律；
S12、苹果幼苗的氮积累特性；
S13、考察豆科芳香植物根系分泌物介导苹果根际与非根际土壤功能微生物群落特征、酶活性的差异；
S14、豆科芳香植物根系分泌物介导果树根际土壤—根系—叶片N利用方式，最终建立豆科芳香植物介导苹果根际土壤C与N循环利用模型。
4.根据权利要求1所述的调控苹果根际激活效应的方法，其特征在于：步骤S1中筛选最优的芳香植物作为苹果间作物具体包括：
S11、筛选若干个芳香植物作为初始间作物；
S12：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述初始间作物,进行田间管理；
S13：3-5个月后，测定苹果幼苗中若干个被遮挡的叶片的相对叶绿素含量值并取平均值，得到平均相对叶绿素含量值；
S14、选取不同的所述初始间作物并重复执行“S12-S13”，得到若干个所述平均相对叶绿素含量值，选取所述平均相对叶绿素含量值的最大值所对应的所述初始间作物作为苹果间作物。
5.一种苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于,其包括以下步骤：
S1：筛选芳香植物作为间作物；
S2：移栽苹果幼苗，待成活后，在所述苹果幼苗的周围播种所述间作物,进行田间管理；
S3：3-5个月后，采集根际土壤样品，进行测定，考察不同间作物对苹果根系分泌物的调控；
S4：通过提取土壤DNA，对土壤微生物进行高通量测序，考察间作物根系调控果树根际与非根际土壤微生物的组成、多样性以及土壤C循环相关的酶活性。
6.根据权利要求5所述的苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于,所述间作物包括豆科芳香植物和非豆科芳香植物；所述豆科芳香植物包括白三叶和甘草；所述非豆科芳香植物包括孔雀草和罗勒。
7.根据权利要求5所述的苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于,在步骤S2中，在所述苹果幼苗的周围播种所述间作物时，所述苹果幼苗与所述间作物的种子数量之比为3:8-12。
8.根据权利要求5所述的苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于,在步骤S2中，在播种所述间作物之前，还包括对所述间作物的种子进行催芽的步骤。
9.根据权利要求8所述的苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于，所述催芽步骤包括：
用次氯酸钠对所述间作物的种子表面进行消毒4-10min，用无菌水清洗后置于培养皿中，在湿润的滤纸上催芽12-36h。
10.根据权利要求5所述的苹果根际激活效应的调控方法，其特征在于，在步骤S4中，对所述土壤微生物进行高通量测序的对象为细菌16S和真菌ITS；
对所述细菌16S进行测序的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示；
对所述真菌ITS进行测序的引物序列如SEQ ID NO.3-4所示。
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